Información

¿Qué es una fusión activadora en el marco?


En [1] está escrito que:

La secuenciación del ARN y del genoma completo identificó fusiones FGFR3-TACC3 activantes en marco recurrentes

¿Qué es una fusión activante en marco recurrente?

[1] Red de investigación del Atlas del genoma del cáncer, “Caracterización molecular integral del carcinoma de vejiga urotelial”, Nature, vol. 507, no. 7492, págs. 315-322, marzo de 2014.


Esto se explica en el artículo vinculado.

Encontramos varias translocaciones recurrentes de posible importancia patogénica, incluida una translocación intracromosómica en el cromosoma 4 que involucra a FGFR3 y TACC3 (n = 3). Los puntos de corte estaban en el intrón 16 (2 casos) o el exón 17 (1 caso) de FGFR3 y el intrón 10 de TACC3 (confirmado por secuenciación de ADN y RNA-seq). Los tres conducen a productos de ARNm de fusión cuyas proteínas predichas incluyen los 758 aminoácidos N-terminales de FGFR3 fusionados con los 191 aminoácidos C-terminales de TACC3 (Fig. 2a). Basándonos en la estructura de la proteína de fusión FGFR3-TACC3, predecimos que puede auto-dimerizarse, lo que lleva a la activación constitutiva del dominio quinasa de FGFR3. La fusión FGFR3-TACC3, que se describió recientemente tanto en el glioblastoma21 como en el cáncer de vejiga7,8, representa una diana terapéutica prometedora.

FGFR3 es un miembro de la familia de receptores del factor de crecimiento de fibroblastos. Es una quinasa transmembrana que normalmente se activa al unirse al ligando, lo que desencadena la dimerización. TACC3 es una proteína que puede dimerizarse a través de un dominio en espiral.

La fusión del gen FGFR3-TACC3 que se genera por las translocaciones intracromosómicas informadas genera así una versión del receptor que se predice que es constitutivamente activo porque puede dimerizarse en ausencia del factor de crecimiento.

Recurrente medio ocurriendo con frecuencia.


Gen de fusión

Introducción

Un gen de fusión se define como dos genes que se unen para que se transcriban y traduzcan como una sola unidad. Pueden ocurrir fusiones de genes en vivo, tanto de forma natural como como resultado de manipulaciones genéticas, y puede construirse in vitro utilizando técnicas de ADN recombinante. Ocurren en la naturaleza a lo largo de la evolución, por ejemplo, donde dos genes cuyos productos forman parte de una vía metabólica se fusionan, dando lugar a una proteína de fusión que lleva a cabo ambos pasos de la vía. También pueden ocurrir como resultado de reordenamientos cromosómicos: por ejemplo, el oncogén BCL-ABL, que causa leucemia mielógena crónica, es el resultado de una transposición cromosómica que fusiona los genes BCL y ABL. Finalmente, se pueden crear fusiones de genes. in vitro utilizando técnicas de ADN recombinante, a menudo para fusionar un gen indicador con un gen que se está estudiando para seguir su expresión.


Fondo

Las fusiones de genes son un mecanismo bien conocido para la activación de oncogenes en leucemias, linfomas y sarcomas, con el BCR-ABL gen de fusión en la leucemia mieloide crónica como ejemplo de prototipo [1, 2]. La reciente identificación de recurrentes ETS-translocaciones familiares en el cáncer de próstata [3] y EML4-ALK en el cáncer de pulmón [4] ahora sugiere que los genes de fusión pueden desempeñar un papel importante también en el desarrollo de cánceres epiteliales. La razón por la que no se detectaron previamente fue la falta de técnicas adecuadas para identificar aberraciones cromosómicas recurrentes equilibradas en los perfiles cariotípicos a menudo caóticos de los tumores sólidos.

La secuenciación de ARN masivamente paralela (RNA-seq) utilizando instrumentos de secuenciación de próxima generación permite la identificación de fusiones de genes en muestras de cáncer individuales y facilita la caracterización completa de los transcriptomas celulares [5-11]. Específicamente, las nuevas tecnologías de secuenciación permiten el descubrimiento de moléculas de ARN quiméricas, donde la misma molécula de ARN consta de secuencias derivadas de dos loci físicamente separados. La secuencia de ARN de extremos emparejados, en la que se secuencian de 36 a 100 pb desde ambos extremos de moléculas de ADN de 200 a 500 pb de longitud, es especialmente adecuada para la identificación de tales transcripciones de ARNm quimérico. La secuenciación de ADN del genoma completo (ADN-seq) también se puede utilizar para identificar reordenamientos potenciales que crean genes de fusión. Sin embargo, se espera que solo una fracción de las fusiones de genes predichas en base a DNA-seq genere un ARNm de fusión expresado, lo que hace que este enfoque sea tedioso para descubrir eventos de genes de fusión oncogénicos activados. Por el contrario, RNA-seq identifica directamente solo aquellos genes de fusión que se expresan, proporcionando una herramienta eficaz para identificar fusiones oncogénicas candidatas.

En el cáncer de mama, las fusiones de genes recurrentes solo se han identificado en subtipos raros, como ETV6-NTRK3 en el carcinoma secretor de mama [12] y MYB-NFIB en el carcinoma adenoide quístico de mama [13]. Aquí, demostramos la eficacia de la secuencia de ARN de extremo emparejado en la detección integral de genes de fusión. Combinado con una nueva estrategia bioinformática, que permitió una tasa de confirmación de & gt95% de los eventos de fusión identificados, identificamos varios genes de fusión novedosos en el cáncer de mama a partir de un solo carril de secuenciación en un instrumento Illumina GA2x. Validamos los eventos de fusión y demostramos su potencial significado biológico mediante RT-PCR, fluorescencia en el lugar hibridación (FISH) e interferencia de ARN (ARNi), destacando así la importancia de las fusiones de genes en el cáncer de mama.


Resultados

Diseño de CICERO

Para descubrir los diversos tipos de fusiones de genes impulsores en el cáncer, el diseño general de CICERO es integrar el mapeo de RNA-seq con características genómicas. Esto se implementó a través de los tres pasos clave descritos en la Fig.2a: (1) detección de fusión por ensamblaje local de novo en puntos de corte candidatos y análisis de lecturas de unión de empalme, (2) anotación de fusión que incluye una verificación del marco de lectura para los genes asociados de fusión, y (3) clasificación de fusiones candidatas basándose en la evidencia de apoyo en RNA-seq y coincidencias con fusiones conocidas. CICERO se puede ejecutar desde un clúster local o en St. Jude Cloud (https://platform.stjude.cloud/tools/rapid_rna-seq) que proporciona un fácil acceso a través de una interfaz interactiva de apuntar y hacer clic o la línea de comandos para enviar trabajos por lotes. Y lo que es más importante, la canalización de la nube gestiona eficazmente la ráfaga de computación necesaria para el mapeo de todo el genoma para evaluar la singularidad de cada fusión candidata. Esto permite completar todo el flujo de trabajo en la nube, desde el mapeo de RNA-seq hasta la detección de fusión en cuestión de horas, incluso en casos con un gran número de reordenamientos. Las fusiones de genes pronosticadas se pueden importar a FusionEditor para su curación manual y el archivo curado se puede exportar como los resultados finales (Fig. 2b).

Detección de fusión mediante CICERO. a Se etiqueta la descripción general del algoritmo CICERO, que consiste en la detección de fusión a través del análisis de los puntos de corte de SV candidatos y la unión de empalme, la anotación de fusión y los conjuntos de datos clave de clasificación utilizados en cada paso. B Flujo de trabajo de detección de fusión. Un usuario puede enviar un archivo BAM alineado o un archivo fastq sin procesar como entrada en un grupo de computadoras local o en St. Jude Cloud. La salida sin procesar se puede curar con FusionEditor y los resultados finales se pueden exportar como un archivo de texto

Curación manual con FusionEditor

FusionEditor, una extensión de nuestra herramienta de visualización ProteinPaint [23], importa la salida de CICERO generada a partir de una o varias muestras a un navegador interactivo (https://proteinpaint.stjude.org/FusionEditor/) para respaldar la curación manual. Dentro de cada muestra, las fusiones previstas se enumeran por grado de calidad, que incluyen alta calidad (HQ), baja calidad (LQ) o lectura completa, y se anotan con el estado dentro del marco / truncamiento para que un usuario pueda priorizar la curación de llamadas de alta confianza conservando la capacidad de revisar todas las fusiones previstas (Fig. 3).

Interfaz de visualización de FusionEditor para curar fusiones predichas a partir de una muestra. a Vista de tabla que muestra las cinco fusiones en marco “HQ” (alta calidad) predichas en una LLA infantil (SJINF011_D). Una fusión de 3 genes que involucra AFF1-RAD51B-KMT2A se reconoce automáticamente y se marca con un cuadro etiquetado como "multiseg". La fusión recíproca KMT2A-AFF1 también se identificó como una fusión en marco HQ. Las fusiones inter e intracromosómicas están etiquetadas con texto rojo y negro, respectivamente. Las fusiones conocidas están etiquetadas con texto violeta (por ejemplo, KMT2A-AFF1 y FLT3 ITD en este caso). B Vista gráfica que muestra los puntos de corte en los dominios proteicos de los tres genes asociados. Se muestra información adicional, como la relación de lecturas quiméricas para cada punto de ruptura de fusión, para respaldar la evaluación de la validez de cada fusión prevista.

Cada fusión puede verse gráficamente (Fig. 3, archivo adicional 1: Figura S1) que muestra el exón y la posición del aminoácido del punto de ruptura en cada gen socio o locus con respecto al modelo del gen de referencia. Esto permite la evaluación manual de los dominios proteicos retenidos dentro de la proteína de fusión. FusionEditor también puede representar puntos de interrupción dentro de las regiones UTR (archivo adicional 1: Figura S2), así como promotores o fusiones intergénicas para la revisión de eventos de secuestro de potenciadores (archivo adicional 1: Figura S3). También se pueden identificar y visualizar fusiones complejas que involucran ≥ 3 parejas (p. Ej., Fusión AFF1-RAD51B-KMT2A en la figura 3). Un usuario puede editar los atributos de fusión cambiando el grado de calidad y el tipo de fusión, y uniendo múltiples puntos de ruptura en una fusión de múltiples segmentos, o viceversa. Los resultados finales seleccionados se pueden exportar como un archivo plano para su análisis posterior.

La interfaz para examinar los resultados de CICERO de varias muestras permite la identificación rápida de fusiones de genes recurrentes en una cohorte de cáncer (archivo adicional 1: Figura S1). Específicamente, la recurrencia de cada fusión de genes se resume en una tabla (archivo adicional 1: Figura S1b) junto con el grado de calidad asignado. Un usuario también puede buscar fusiones que involucren un gen específico, por ejemplo, todas las fusiones que involucren TERT (como se muestra en el archivo adicional 1: Figura S1c). Para respaldar una mayor evaluación de los eventos de secuestro de potenciadores, los usuarios pueden cargar valores de expresión génica (por ejemplo, FPKM) de una cohorte para la inspección de una expresión aberrantemente alta en la muestra positiva de fusión seleccionada (archivo adicional 1: Figura S1d). A través de una interfaz de apuntar y hacer clic, el usuario puede acceder a detalles adicionales como la posición del punto de interrupción, la información del dominio, el recuento de lecturas recortadas y el nivel de expresión génica en la cohorte (archivo adicional 1: Figura S1d ye).

Comparación de CICERO con otros métodos de detección de fusiones de genes somáticos

El conjunto de datos de referencia consta de 184 fusiones de genes impulsores descubiertas en 170 muestras de leucemia (norte = 119), tumor sólido (norte = 13) y tumor cerebral (norte = 38) (Fig. 4a, Archivo adicional 2: Tablas S1 y S2) [3, 15, 21]. Estas 184 fusiones de genes, que afectan a oncogenes bien caracterizados en el cáncer pediátrico (Fig. 4b), se validaron ortogonalmente mediante WGS normal de tumor emparejado, secuenciación de captura, RT-PCR y / o FISH. Por lo tanto, sirven como un buen estándar de referencia para la detección de fusión de controladores, el caso de uso más común para la detección de fusión mediante RNA-seq. Las fusiones impulsoras se pueden clasificar en 4 categorías según las características genómicas y el estado de expresión: (1) fusiones quiméricas exón-a-exón altamente expresadas con FPKM & gt 5 para el gen asociado del extremo N (norte = 112) (2) fusiones quiméricas de baja expresión (norte = 18) (3) fusiones no canónicas (norte = 36), definido por uno de los puntos de corte de fusión que se encuentra en una región no codificante y representa principalmente eventos de secuestro de potenciadores y (4) ITD (norte = 18).

Comparación de CICERO con otros métodos de detección de fusión de controladores. a Distribución de leucemia, tumor sólido y tumor cerebral en las 170 secuencias de ARN utilizadas para la prueba de referencia. B Prevalencia de fusiones de genes recurrentes (≥ 3) en los conjuntos de datos de referencia estratificados por las siguientes cuatro clases: transcripción quimérica causada por la fusión exón-exón expresada en alto (& gt 5 FPKM) o bajo nivel, duplicación interna en tándem (ITD), y otras fusiones no canónicas que implican regiones intrónicas o intergénicas. C Comparación de la sensibilidad (panel superior) y clasificación de las fusiones del controlador entre todas las fusiones previstas (panel inferior) por CICERO y otros cinco métodos (ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion y Arriba) en las cuatro categorías de fusión del controlador. La clasificación de CICERO, denominada CICERO_raw, se basa únicamente en la puntuación de fusión sin incorporar coincidencias con el estado de fusión conocido. Las barras de error que representan la desviación estándar de la sensibilidad de detección en el panel superior se calcularon mediante el arranque de muestras con 100 iteraciones. D Verdaderos positivos (azul oscuro) y falsos positivos (azul claro) de fusiones somáticas predichas identificadas por CICERO y otros programas de detección de fusión. El número exacto de eventos se marca como (verdadero positivo / predicción total) bajo el nombre de cada método. Las predicciones de alta calidad de CICERO se comparan con las de STAR-fusion y Arriba (panel izquierdo) mientras que todas las predicciones de CICERO se comparan con las de FusionCatcher, deFuse y ChimeraScan (panel derecho)

Comparamos el rendimiento de CICERO con cinco métodos populares de detección de fusión: ChimeraScan [17], deFuse [16], FusionCatcher [18], STAR-Fusion [19] y Arriba [24]. Todos estos métodos producen un gran número de predicciones que incluyen verdaderas fusiones de genes, así como falsos positivos causados ​​por el mapeo de ambigüedad en regiones repetitivas, lectura transcripcional [25, 26] y otros artefactos. Por lo tanto, evaluamos el rendimiento en función de la sensibilidad de detección, la clasificación de las fusiones de controladores entre todas las predicciones por algoritmo (archivo adicional 2: Tabla S2) y la tasa de falsos positivos de todas las fusiones previstas. Para garantizar una comparación justa, utilizamos la clasificación CICERO basada únicamente en la puntuación de fusión (denominada CICERO_raw), que no incorpora la calificación de calidad basada en el conocimiento. Los eventos etiquetados como lectura completa se consideran artefactos y, por lo tanto, se excluyen en todos los métodos, excepto Arriba, ya que los eventos de lectura completa etiquetados por Arriba contienen fusiones oncogénicas altamente expresadas (por ejemplo, PR2Y8-CRLF2).

CICERO detectó el 95% de las fusiones de controladores con una clasificación promedio de 1.9, mientras que ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion y Arriba detectaron solo 63%, 66%, 77%, 63% y 78% con una clasificación promedio de 37.0, 9.0, 18.1, 4.4 y 2.9, respectivamente (Archivo adicional 2: Tabla S2). En la categoría de fusión quimérica canónica exón-a-exón, la tasa de detección es generalmente alta en todos los métodos para fusiones altamente expresadas (rango 88-100%, Fig. 4c) pero baja para fusiones quiméricas poco expresadas (rango 22-56 %, Figura 4c). En la categoría de fusiones no canónicas, CICERO detectó los 36 eventos, mientras que los otros métodos (ChimeraScan, deFuse, FusionCatcher, STAR-Fusion, Arriba) detectaron 6, 13, 23, 4 y 22, respectivamente (Fig. 4c) . En tres casos, las fusiones de controladores como IGH-EPOR e IGH-CRLF2 fueron detectadas exclusivamente por CICERO (Archivo adicional 2: Tabla S2). De los 18 eventos ITD en FLT3 o FGFR1, CICERO pudo detectar 17 (Fig. 4c). Ninguno de los otros cinco métodos admite la detección de ITD.

Para evaluar la tasa de falsos positivos de todas las fusiones predichas, consideramos las fusiones de ARN que coinciden con las variaciones estructurales somáticas derivadas de datos de WGS de ADN normal de tumor emparejados, disponibles para 80 muestras, como verdaderos positivos (métodos). Las fusiones de controladores detectadas están todas clasificadas como de alta calidad por CICERO, por lo tanto, comparamos las predicciones de alta calidad de CICERO con las llamadas de STAR-Fusion y Arriba, ya que estos métodos predijeron relativamente pocas fusiones de genes. Las predicciones de fusión de ChimeraScan, deFuse y FusionCatcher se compararon con todas las llamadas de CICERO. Para predicciones de alta calidad, la tasa de falsos positivos de CICERO, STAR-fusion y Arriba es 78%, 91% y 82%, respectivamente (Fig. 4d, panel izquierdo Archivo adicional 3). Al considerar predicciones de alta y baja calidad, la tasa de falsos positivos de CICERO, FusionCatcher, deFuse y ChimeraScan es del 95%, 97%, 95%, 99%, respectivamente (Fig. 4d, panel derecho Archivo adicional 3).

Análisis CICERO de RNA-seq de cáncer en adultos

Ejecutamos CICERO seguido de curación manual usando FusionEditor en datos de RNA-seq de The Cancer Genome Atlas Glioblastoma Multiforme (TCGA-GBM) que incluyó 167 muestras de pacientes adultos con GBM (Archivo adicional 2: Tabla S3) y comparamos los resultados con las fusiones de genes informadas por la Red de Investigación TCGA [27]. Nos centramos en las fusiones de genes que tenían al menos un gen asociado incluido en el censo de genes del cáncer de COSMIC [28]. De las 40 fusiones relacionadas con genes del cáncer informadas por TCGA, CICERO detectó 33, incluidos EGFR-SEPT14, FGFR3-TACC3 y NAA30-TERT (archivo adicional 2: Tabla S4).

La Red de Investigación TCGA no informó de 141 fusiones relacionadas con genes del cáncer adicionales detectadas por CICERO, 60 de las cuales involucraron EGFR, uno de los genes mutados con mayor frecuencia en GBM [27]. Las fusiones de EGFR adicionales incluyeron un ITD (TCGA-27-2523) que duplica el dominio de tirosina quinasa (TKD) codificado por los exones 18-25, que coincide con una duplicación de TKD previamente informada en dos líneas celulares de glioma [29]. Las fusiones de EGFR restantes surgen de reordenamientos intracromosómicos en regiones de 70 Kb a 30 Mb de distancia de EGFR o translocaciones intercromosómicas (archivo adicional 2: Tabla S5). El evento más prevalente, que totaliza 39 fusiones en 21 muestras, causa el truncamiento del dominio de autofosforilación C-terminal codificado por los exones 25-28 (fig. 5a). La pérdida C-terminal es también la fusión de EGFR más común informada por TCGA, todas estas también fueron detectadas por CICERO. En algunos casos, se pueden detectar múltiples transcripciones de fusión que conducen a un truncamiento del terminal C de EGFR en la misma muestra de tumor, lo que sugiere una posible heterogeneidad clonal [30]. Por ejemplo, CICERO predijo cinco transcripciones de fusión que causan el truncamiento del terminal C de EGFR en la muestra TCGA-06-2557 (archivo adicional 1: Figura S4). Mientras que una de estas cinco fusiones, una fusión EGFR-SEPT14 [27] en el marco con 8 lecturas de apoyo, fue previamente reportada por TCGA Research Network, las cuatro fusiones restantes, incluida la fusión predominante EGFR-SDK1 fuera del marco con un total de 357 lecturas positivas para fusión, no se informaron. En total, el 13% de las muestras de TCGA albergan fusiones que pueden causar truncamiento del terminal C, una tasa mucho más alta que el 4% (7 casos) detectado por la Red de Investigación TCGA [27].

Ejemplos de fusiones adicionales identificadas por CICERO de la cohorte TCGA-GBM. El dominio de la proteína del gen del cáncer involucrado en una fusión está etiquetado con una leyenda coloreada. a Comparación de las fusiones de genes que conducen al truncamiento del dominio de autofosforilación terminal EGFR C descubierto solo por CICERO con las informadas tanto por CICERO como por la Red de Investigación TCGA. Los sitios marcados como "Closs" se refieren a fusiones de truncamiento C-terminal fuera del marco, mientras que los marcados con un símbolo de gen se refieren a fusiones en marco. B Fusiones de genes que probablemente provoquen la activación de la quinasa. Para la fusión KLHL7-BRAF, seleccionamos la proteína codificada por la isoforma corta KLHL7 NM_001172428 porque el punto de ruptura de la fusión se produjo en el último exón exclusivo de esta transcripción. C Fusión CCDC127-TERT en TCGA-06-2564 que conduce a una sobreexpresión de TERT. El panel derecho muestra el valor FPKM de CCDC127 y TERT de toda la cohorte de GBM con el punto rojo que marca la muestra de fusión TCGA-06-2564

Ejemplos notables de fusiones no EGFR no reportadas por TCGA incluyen tres fusiones de quinasa en marco, es decir, KLHL7-BRAF, CEP85L-ROS1 y TMEM165-PDGFRA (Fig. 5b), y una fusión CCDC127-TERT (Fig. 5c) . Las tres fusiones de quinasa retienen todas el dominio de quinasa (Fig. 5b). Si bien KLHL7-BRAF no se ha informado anteriormente en GBM, se detectó en el carcinoma papilar de tiroides [31]. CEP85L-ROS1 y TMEM165-PDGFRA se informaron en un estudio anterior que define el panorama de las fusiones de quinasas en el cáncer [32]. La fusión CCDC127-TERT condujo a la activación de la expresión de TERT ya que la muestra positiva para la fusión (TCGA-06-2564) tiene la segunda expresión de TERT más alta de toda la cohorte de TCGA (Fig. 5c). Esta fusión también se informó en un estudio anterior que investigó el panorama de las fusiones de transcripciones asociadas al cáncer [10].


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Increased kinase signaling

Interleukin 7 (IL7) signaling is essential for normal T-cell development and is triggered by the interaction of IL7 with the heterodimeric IL7 receptor (IL7R). This interaction induces reciprocal JAK1 and JAK3 phosphorylation and subsequent recruitment and activation of STAT5. Upon phosphorylation, STAT5 dimerizes and translocates to the nucleus where it regulates the transcription of many target genes, including the antiapoptotic B-cell lymphoma 2 (BCL-2) family member proteins. 19,20 In addition to the JAK/STAT pathway, the RAS-MAPK and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathways are also activated by IL2, IL7, and stem cell factor (SCF) that act on the developing T cells (Figure 1).

Deregulation of the JAK-STAT signaling cascade in T-ALL. Representation of the different oncogenic mechanisms that lead to aberrant activation of the IL7 signaling in T-ALL. Interaction of IL7 with the heterodimeric IL7R induces reciprocal JAK1 and JAK3 phosphorylation and subsequent recruitment of STAT5. STAT5 dimerizes and translocates to the nucleus where it induces transcription of the prosurvival factor BCL2. IL7 also activates the RAS-MAPK and PI3K kinase pathways. IL7 signaling can indirectly be enhanced by abnormal NOTCH1 signaling, constitutive expression of ZEB2, or by increased presentation of IL7R on the cell surface of thymocytes due to impaired clathrin-dependent endocytosis caused by DNM2 mutations. Promising therapeutic agents targeting the oncogenic IL7-JAK-STAT cascade are indicated in red. *Proteins that are mutated in T-ALL.

Deregulation of the JAK-STAT signaling cascade in T-ALL. Representation of the different oncogenic mechanisms that lead to aberrant activation of the IL7 signaling in T-ALL. Interaction of IL7 with the heterodimeric IL7R induces reciprocal JAK1 and JAK3 phosphorylation and subsequent recruitment of STAT5. STAT5 dimerizes and translocates to the nucleus where it induces transcription of the prosurvival factor BCL2. IL7 also activates the RAS-MAPK and PI3K kinase pathways. IL7 signaling can indirectly be enhanced by abnormal NOTCH1 signaling, constitutive expression of ZEB2, or by increased presentation of IL7R on the cell surface of thymocytes due to impaired clathrin-dependent endocytosis caused by DNM2 mutations. Promising therapeutic agents targeting the oncogenic IL7-JAK-STAT cascade are indicated in red. *Proteins that are mutated in T-ALL.

Activando mutaciones en IL7R, JAK1, JAK3, and/or STAT5 are present in 20% to 30% of T-ALL cases (Table 1), 4,21,22 with a higher representation within TLX + , HOXA + , and ETP-ALL patient subgroups (Figure 2). 4,23 A small percentage of cases also show aberrations in phosphatases like PTPN2 and PTPRC, which, among other substrates, dephosphorylate and inactivate JAK kinases. 24,25 Interestingly, the IL7R signaling cascade can also be hyperactivated in patients who do not carry any genetic aberrations in the IL7R, JAK, o STAT5 genes, indicating that still other mechanisms exist to activate this pathway. 26,27 Indeed, only recently was it discovered that loss-of-function mutations in DNM2 lead to increased presentation of IL7R on the cell surface of thymocytes due to impaired clathrin-dependent endocytosis. 26 In addition, a rare translocation targeting the zinc finger E-box–binding homeobox 2 locus (ZEB2) has been recently described in T-ALL, and Zeb2 overexpression was shown to increase Il7r expression and Stat5 activation, promoting T-ALL cell survival in a mouse model. 27 Although most mutations seem to result in activation of JAK1 and JAK3, rare fusion transcripts involving JAK2 have also been described, and wild-type TYK2 may have an important role in activating survival pathways of T-ALL cells. 28,29

Representation of the cooperation of oncogenic events. The major subclasses of T-ALL are shown based on the expression of the transcription factors TAL1, TLX1, TLX3, HOXA genes, NKX2-1, o LMO2/LYL1. For each subclass, additional genes are shown that are most frequently mutated in that subclass. The PRC2 complex contains EZH2, SUZ12, and EED.

Representation of the cooperation of oncogenic events. The major subclasses of T-ALL are shown based on the expression of the transcription factors TAL1, TLX1, TLX3, HOXA genes, NKX2-1, o LMO2/LYL1. For each subclass, additional genes are shown that are most frequently mutated in that subclass. The PRC2 complex contains EZH2, SUZ12, and EED.

Aberrant activation of the PI3K-AKT pathway results in enhanced cell metabolism, proliferation, and impaired apoptosis. 30,31 Hyperactivation of the oncogenic PI3K-AKT pathway in T-ALL is mainly caused by inactivating mutations or deletions of the phosphatase and tensin homolog (PTEN), the main negative regulator of the pathway. 22,32-36 In addition, some T-ALL cases show gain-of-function mutations in the regulatory and catalytic subunits of PI3K, respectively, p85 and p110, or in the downstream effectors of the cascade such as AKT and mechanistic target of rapamycin (mTOR) (Table 1). 22,35,37 PI3K-AKT signaling activation is also achieved through IL7 stimulation or RAS activation. 22,31,38 A recent study on 146 pediatric T-ALL cases described that almost 50% of the patients harbored at least 1 mutation in the JAK-STAT, PI3K-AKT, or RAS-MAPK pathways, underscoring the importance of activation of those cascades for the leukemic cells. 22

In addition to the activation of the JAK kinases or the PI3K pathway, activation of the ABL1 kinase is observed in up to 8% of T-ALL cases, with 6% of patients expressing the NUP214-ABL1 fusion protein. 39 NUP214-ABL1 is a constitutively active tyrosine kinase that activates STAT5 and the RAS-MAPK pathway, but is much weaker as compared with BCR-ABL1. 39,40 Interestingly, the kinase activity of NUP214-ABL1 is dependent on its location to the nuclear pore 39,41 and its oncogenic properties rely on its interaction with MAD2L1, NUP155, and SMC4 and on the activity of the LCK, a member of the SRC family kinase. 42 All data collected to date suggest that the NUP214-ABL1 fusion kinase is a weak oncogene that cooperates with additional oncogenic events to drive leukemia development. In that sense, it is of interest to note that the NUP214-ABL1 fusion is always found together with TLX1 or TLX3 expression and is often associated with loss of PTPN2, a negative regulator of NUP214-ABL1. 25,39

RAS-activating mutations were recently described in 44% of diagnosis-relapse sample pairs, indicating an overrepresentation of these defects in high-risk ALL. Interestingly, KRAS mutations rendered lymphoblasts resistant toward methotrexate, while sensitizing them to vincristine. 43


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INTRODUCCIÓN

Endocytosis is the process mammalian cells utilize for the uptake of essential molecules from their external environment. This material is taken into cells by membranous vesicles derived from the plasma membrane (endocytic vesicles) and once internalized it is directed to a system of internal vesicles called endosomes [1 ]. In endosomes a number of important sorting events are carried out and include the separation and segregation of the material taken into the cell from the components of the endocytic vesicle. The latter components are returned (recycled) to the plasma membrane for use in subsequent rounds of endocytosis, whereas the endocytosed material is mostly sorted into lysosomes. The endosomal system is composed of a series of distinct elements, some of which are thought to perform sorting (rab5-positive endosomes) or recycling (rab11-positive endosomes) activities [2 ]. Late endosomes (rab7-positive endosomes) appear to participate in routing material destined for degradation from the rab5-positive sorting compartment to the lysosomal compartment.

Rab5 is an important regulator of early events in endocytosis and phagocytosis [3, 4 ]. Over-expression of wild-type rab5a or a constitutively activated rab5a mutant that is deficient in GTP hydrolysis (rab5a:Q79L) maximally stimulate endocytosis in fibroblasts [5 ]. This stimulation is in part a result of increased endosome fusion because rab5 is rate limiting for in vitro endosome-endosome [6 ] as well as in vitro endosome-phagosome fusion [7 ]. Rab5 activation and endosome fusion are further linked by the observation that cells expressing rab5a:Q79L develop giant rab5a-positive endosomal vesicles [5, 8 ]. Time-lapse recordings of cells expressing rab5a:Q79L have shown that the giant vesicles arise primarily by fusion of smaller rab5a-positive endosomal vesicles [8 ]. These observations support the idea that the stimulation of endocytosis caused by rab5 activation is dependent upon an increase in the size of the endosomal compartment.

It is becoming clear that rab5a activity is linked to the activation of an H-ras-linked signal transduction pathway. It has long been known that expression of oncogenic H-ras stimulates endocytosis in cells [9 ] but only recently has this been directly linked to rab5 activation [11, 12 ]. Previous work in our laboratory has shown that fluid-phase endocytosis is stimulated after activation of a signal transduction cascade that includes H-ras, phosphoinositide-3-kinase and protein kinase B [101112 ]. Furthermore, the stimulation of endocytosis by this signal transduction pathway requires rab5 activation, since a dominant-negative rab5a mutant deficient in GTP binding (rab5a:S34N) blocks the stimulation of endocytosis by this signaling pathway. In fibroblasts expressing H-ras:G12V [12 ] in epidermal growth factor (EGF)-stimulated fibroblasts [13 ], the increase in endocytosis is similar to that observed after overexpression of rab5a:Q79L. The mechanisms by which H-ras:G12V or EGF stimulation result in stimulation of endocytosis are currently unknown. Furthermore, whether H-ras:G12V or EGF activation of rab5a in living cells is sufficient to result in the formation of giant GFP-rab5a:wt-positive endosomes is also not known. Further work is required to determine the identity of the molecules that link receptor activation and giant endosome formation.

In this report we have explored the dynamic changes in the structure and activity of the rab5a-positive endosomal and phagosomal compartments in living cells after activation by either expression of H-ras:G12V (or exposure to EGF) and rhodamine-Escherichia coli, respectivamente. We used green fluorescent protein (GFP) tagged rab5a:wt and time-lapse confocal microscopy of living cells to examine the regulation of rab5a activation by H-ras:G12V and EGF. Rab5a activation by these agents results in the formation of giant GFP-rab5a:wt-positive vesicles and links stimulated endocytosis with enlargement of the early endosomal compartment. Furthermore, this approach has allowed real-time visualization of the changes in membrane dynamics that have been suggested by previous studies. In addition, the giant vesicles appeared to form by two distinct processes that include vesicle fusion and new vesicle (macropinosome) formation. These data illustrate the importance of rab5a:wt-mediated endosome fusion in stimulated endocytosis.


Discusión

It has been shown previously that functional yeast t-SNAREs marking the Golgi compartment, the plasma membrane, and the vacuole are each composed of a distinct heavy chain from the syntaxin family and, depending on the particular membrane, one or two nonsyntaxin light chains (Fukuda et al., 2000 McNew et al., 2000a Parlati et al., 2000). The architecture of the endosomal t-SNARE further establishes the generality of this concept with Tlg2p as the heavy chain and Tlg1p and Vti1p as its two light chains, respectively, functioning exclusively with Snc2p as its v-SNARE. Moreover, only one topological arrangement of these four proteins between two membranes results in a fusogenic complex, establishing their roles as t-SNARE and v-SNARE, and extending the concept of topological restriction (Parlati et al., 2000).

In yeast, the 21 SNARE proteins have been grouped into four different categories defined by the sequence homology in the SNARE motif: the syntaxins (Ufe1p, Sso1p, Sso2p, Sed5p, Pep12p, Tlg2p, and Vam3p), the Bet1p group (Sec9p-C, Spo20p-C, Vam7p, Bet1p, Sft1p, and Tlg1p), the Bos1p group (Sec9p-N, Spo20p-N, Vti1p, Bos1p, Gos1p, and Sec20p), and a fourth group termed R-SNAREs (Snc1p, Snc2p, Nyv1p, Sec22p, and Ykt6p) (Pelham, 2001 note Sec9p and Spo20p, like their animal homologue SNAP-25, have two SNARE motifs, C and N). All results to date indicate that fusogenic SNARE pins must contain one subunit from each group: t-Sso1p/Sec9p and v-Snc1p or v-Snc2p at the plasma membrane (McNew et al., 2000a) t-Sed5p/Sec22p,Bos1p and v-Bet1p at the Golgi compartment (Parlati et al., 2000) and t-Vam3p/Vam7p,Vti1p and v-Nyv1p at the vacuole (Fukuda et al., 2000). The endosomal t-SNARE also fits this rule, suggesting that it has a concrete structural basis which can be used to predict additional fusogenic SNARE complexes. However, the unique v-SNARE within a particular complex (i.e., based on topological restriction) can be drawn either from the R-SNARE group (Snc1p or Snc2p, Nyv1p) or from the Bet1p group (Bet1p, Sft1p) and potentially (given the limited number of results to date) from the Bos1p group.

Certainly, Tlg2p, Tlg1p, and Snc2p function in endocytosis, but there is also some evidence showing that they are involved in the retrieval of proteins to the TGN from the cell surface or endosomes (Abeliovich et al., 1998 Holthuis et al., 1998b Seron et al., 1998 Gurunathan et al., 2000 Lewis et al., 2000). These functions are of course related in that endosomes play an important role in maintaining the steady-state distribution of late Golgi membrane proteins (Conibear and Stevens, 1998). Therefore, it is possible that the fusogenic SNARE complex we have identified here, t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p and v-Snc1p or Snc2p, is involved in more than just one trafficking step. Indeed, this complex is also required in TGN homotypic fusion (Brickner et al., 2001, this issue).

Our results imply that the fusion activity of this endomal t-SNARE is intrinsically switched “off” due to auto-inhibition. Its fusion activity can be unleashed by binding a peptide corresponding to the COOH-terminal part of the cognate v-SNARE. The capacity to switch the endosomal t-SNARE “on” is specific for peptide derived from its cognate v-SNARE, and when activated the endosomal t-SNARE will only fuse with its cognate v-SNARE Snc1/2p and no other potential v-SNARE encoded in the genome of yeast. Most likely peptide binding conformationally switches the endosomal t-SNARE from “off” to “on” states when it binds, as it does for the neuronal exocytic t-SNARE (unpublished data).

The intrinsic inactivity of the endosomal t-SNARE is a significant finding because it implies that cells must possess mechanisms to activate it for fusion. Presumably, peptide binding throws the switch by tapping into a mechanism that is physiologically reserved for certain regulatory proteins. Indeed, a very recent study showed that Tlg2p is locked in an inactive state, unable to bind its light chains Tlg1p and Vti1p, unless Vps45p is present (Bryant and James, 2001). Interestingly, none of the other t-SNAREs tested to date show a strict requirement for peptides to be functional in the in vitro fusion assay (Fukuda et al., 2000 McNew et al., 2000a Parlati et al., 2000), suggesting that the endosomal t-SNARE might be auto-inhibited to a greater extent.

Of course, regulatory proteins in the cell could tip the balance further toward (or against) the “off” state. Snc1/2p is the sole example to date of a multifunctional v-SNARE. Snc2p is required in the endocytic pathway (in association with t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p) as well as for fusion of secretory vesicles with the plasma membrane (in association with t-Sso1p/Sec9p [McNew et al., 2000a]). Thus, a single v-SNARE suffices for fusion with the plasma membrane and with the two compartments with which the cell surface interfaces for endocytosis and secretion, early endosomes and late Golgi compartment. This neatly solves the problem of how the v-SNAREs are recycled among these compartments. If the only source of specificity for vesicle targeting in these pathways were SNARE pairings, this would imply that the pattern of transport among these compartments could be relatively random. Interestingly, this pattern is extremely complex (Pelham, 1999) and since, in contrast to the genes and organelles in the secretory pathway which are essential, the entire pathway is not essential in yeast (Holthuis et al., 1998b), it is not inconceivable that even a random pattern in these pathways might suffice and would certainly cause no harm. Therefore, it is unclear whether the large number of transport links among endocytic compartments (Pelham, 1999) is due to an equal number of uniquely specific fusion steps, or whether movement could be more random than that. The latter would require a smaller genetic load, but would also result in less overall efficiency in endocytosis.

If the transport pattern were precise, how could the cell direct Snc2p-containing v-SNARE vesicles to one versus another of its potential target membranes? The tight autoregulation of the endosomal t-SNARE, so that its fusion activity is intrinsically locked-up, would be important in this connection. If there is a lock then there is presumably a key, and a simple possibility is that Snc2p-containing vesicles in the cell have additional proteins encoding their origin that act as keys to preferentially unlock one or another different t-SNARE at one or another different target membrane, adding a further level of specificity. Such a “key–lock” system could certainly include such Sec1 family proteins as Vps45p, but also rab GTPase switch proteins or cognate tether proteins (Mellman and Warren, 2000 Zerial and McBride, 2001). Each of the two different t-SNAREs so far known to be fusogenic with v-Snc2p (or Snc1p) has a distinct Sec1 family member: t-Sso1p/Sec9p functions with Sec1p (Carr et al., 1999) and t-Tlg2p/Tlg1p,Vti1p with Vps45p (Nichols et al., 1998). Additional elements, such as cytoskeletal structures, may also play a less direct role in directing Snc2p-containing v-SNARE vesicles to different target membranes. Further studies are needed to establish the extent to which the plasma membrane–endosomal compartments–TGN network operates according to stochastic or deterministic principles.


Departamento de Biologia

Proper transcriptional regulation is essential for the establishment and maintenance of cellular identity. Consistent with its central role in cellular function, transcription is dysregulated in numerous human disorders, including cancer. We use genetic and genomic approaches to study the control of initiation, a critical step in transcription where numerous regulatory inputs are integrated. As many basic transcriptional mechanisms are conserved throughout evolution, we use the budding yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system.

We use genome-wide methodologies to study transcriptional regulation. We develoed chromatin endogenous cleavage followed by high-throughput sequencing (ChEC-seq) as a method to map the genome-wide binding of proteins with high spatiotemporal resolution. ChEC-seq involves fusion of micrococcal nuclease (MNase), a calcium-dependent exo-/endonuclease to a chromatin-associated protein of interest. Upon addition of exogenous calcium to cells, MNase cleaves DNA in proximity to binding sites for the factor of interest. Total DNA is then purified and small fragments are sequenced to reveal genomic loci bound by the fusion protein. ChEC-seq has numerous advantages relative to ChIP-based methods: it avoids artifacts associated with crosslinking, sonication, and poor antibody quality, is controlled by calcium, and provides high spatial resolution. We leveraged the inducible nature of MNase to characterize two classes of transcription factor binding sites in budding yeast. We found that sites displaying rapid cleavage displayed robust matches to known DNA motifs, while sites that were cleaved more slowly had no such sequences. We are currently testing ChEC-seq with additional classes of chromatin-binding proteins in budding yeast and are developing the method in metazoan systems.

We are particularly interested in the functions of the Mediator complex, a conserved, essential coactivator generally required for transcription by RNA Polymerase II (RNAPII). Studies of Mediator function in budding yeast have been complicated by conflicting data regarding its genome-wide localization as determined by ChIP-seq. We used ChEC-seq to map the binding of Mediator to the budding yeast genome and confirmed that, under normal growth conditions, it is confined to upstream activating sequences (UASs). We also found that its binding to UASs is generally uncoupled from transcriptional output and that its binding to chromatin is cooperative with that of TFIID, another coactivator complex that is part of the RNAPII pre-initiation complex (PIC). We are using a combination of budding yeast genetics and ChEC-seq to furthur elucidate the role of Mediator in PIC recruitment.

In addition to addressing questions related to basic transcription mechanisms, we are interested in the function of CCCTC-binding factor (CTCF), well known for its function in chromatin insulation. While CTCF is ubiquitously expressed, it has a paralog, brother of the regulator of imprinted sites (BORIS), that is expressed in germ and cancer cells and is comparatively poorly understood. Recent work has demonstrated the existence of clustered CTCF target sites (2xCTSes) that are occupied by CTCF homodimers in BORIS-negative cells but are occupied by CTCF/BORIS heterodimers or BORIS homodimers in BORIS-positive cells. In contrast to single CTCF target sites (1xCTSes), which are though to be involved in chromatin insulation, 2xCTSes are associated with active gene regulatory elements. We are investigating the mechanisms by which CTCF and BORIS influence transcription and chromatin architecture through these two classes of sites and are also exploring novel functions for CTCF and BORIS through mapping their protein-protein interaction landscapes.

Publicaciones

Tourigny JP, Saleh MM, Schumacher K, Devys D, Zentner GE (2018). Mediator is essential for small nuclear and nucleolar RNA transcription in yeast. Mol Cell Biol 38(24):e00296-18.


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