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¿Traducción de ARNm?

¿Traducción de ARNm?



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Insertamos un gen de insulina de humano en bacteria. ¿Ocurrirá la traducción del gen (formación de proteínas) en las bacterias? Si se produce una traducción, entonces, ¿por qué ocurre, dé una razón para ello?


Sí, las bacterias producirán proteínas humanas (o de cualquier organismo) si introduce su material genético, pero hay algunas cosas a considerar.

Primero, los intrones deben eliminarse de la secuencia genética humana. Las bacterias no tienen la maquinaria para empalmar intrones después de la transcripción. Por lo general, esto se hace mediante el uso de una proteína viral para realizar la transcripción inversa del ARNm, del que ya se han eliminado los intrones, en ADN que se puede utilizar para transformar bacterias.

En segundo lugar, debe insertar una secuencia Shine-Dalgarno. Esto permite que los ribosomas bacterianos se unan al ARNm que producirán y traduzcan la proteína deseada. Esta secuencia no se encuentra en genes eucariotas, por lo que debe asegurarse de que esté incluida en el vector o en los cebadores de PCR que utilizó para amplificar la secuencia del gen.


Aunque el código genético está casi conservado entre los organismos hay algunas cuestiones a tener en cuenta, entre las que se encuentran:

  • Cada organismo tiene el suyo uso de codones, es decir, las diferencias en la frecuencia de aparición de codones sinónimos en el ADN codificante (que reflejan la composición de las abundancias de ARNt). Entonces, por ejemplo, los codones UUU y UUC codifican fenilalanina pero, lo estoy inventando, UUU es común en humanos pero raro en coli, mientras que UUC es lo contrario. Si la secuencia de codificación de la insulina es rica en UUU, probablemente necesite cambiar el codón UUU a UUC para evitar una traducción lenta.
  • También el abundancia de aminoácidos puede ser muy variable entre dos organismos. Una de las formas en que puede manejar las diferencias es "sintonizando" la expresión de los aminoácidos. Aquí una tabla de abundancia de aminoácidos en coli.
  • los secuencias reguladoras en coli no son los mismos que en humanos. De hecho, la iniciación de la traducción procariótica necesita una secuencia rica en purina corriente arriba del codón de iniciación AUG (normalmente) llamado Shine Dalgarno. Esta secuencia es complementaria al ARN 16S en la subunidad del ribosoma 30S.
  • A menudo, las cadenas de péptidos están sujetas a diversas modificaciones postraduccionales. El péptido de insulina, por ejemplo, una vez sintetizado se escinde mediante peptidasas específicas y se forman enlaces disulfuro. Debido a que los mecanismos de modificación postraduccional humanos y de coli no son los mismos, esto puede ser un problema difícil de manejar. En lugar de intentar reproducir exactamente la proteína con todas sus modificaciones, a menudo las personas buscan proteínas funcionalmente (y no estructuralmente) idénticas.
  • También el proceso de plegado puede ser diferente, tanto asistido (por acompañantes) como espontáneo (sin acompañantes). El plegamiento puede verse influenciado por una serie de factores como el apiñamiento molecular, el pH, ...
  • Muchos genes eucariotas tienen intrones: secuencias eliminadas antes de la traducción. Una vez que se conocen los sitios de empalme, este problema se resuelve fácilmente utilizando una secuencia sin intrones.

Todos los organismos comparten un ancestro común y han evolucionado a partir de él. Por tanto, comparten la misma maquinaria de transcripción y traducción. Los codones también se interpretan de la misma manera en casi todos los organismos.

Entonces, sí, la traducción debería ocurrir (suponiendo que el gen se haya clonado de la manera correcta).


Funciona, y de hecho se hace para producir toda la insulina "humana" que utilizan los pacientes con diabetes en la actualidad. Esto se debe a que el código genético se conserva casi por completo (con muy pocas excepciones en la naturaleza), por lo que las bacterias usan los mismos codones para codificar un aminoácido que en los humanos. Entonces, con un vector adecuado (un anillo de ADN que lleva información genética extracromosómica) que tiene la capacidad de replicarse independientemente de la célula y que tiene los promotores correctos (puntos de inicio) para iniciar la transcripción en células bacterianas, básicamente puede clonar y expresar cualquier gen humano.


Como cualquier polimerización en una célula, la traducción ocurre en tres pasos: iniciación trae un ribosoma, mRNA y un iniciador tRNA juntos para formar un complejo de iniciación. Alargamiento es la adición sucesiva de aminoácidos a un polipéptido en crecimiento. Terminación es señalado por secuencias (uno de los codones de terminación) en el ARNm y la proteína factores de terminación que interrumpen el alargamiento y liberan un polipéptido terminado. Los eventos de traducción ocurren en momentos específicos. A, PAG y mi sitios en el ribosoma (vea el dibujo a continuación).


Transferencia de ARN

Durante la traducción, cada uno de los 20 aminoácidos debe alinearse con sus codones correspondientes en la plantilla de ARNm. Todas las celdas contienen una variedad de ARNt que sirven como adaptadores para este proceso. Como era de esperar, dada su función común en la síntesis de proteínas, diferentes ARNt comparten estructuras generales similares. Sin embargo, también poseen secuencias de identificación únicas que permiten que el aminoácido correcto se una y se alinee con el codón apropiado en el ARNm.

Los ARN de transferencia tienen una longitud aproximada de 70 a 80 nucleótidos y tienen estructuras características en forma de hoja de trébol que resultan del emparejamiento de bases complementarias entre diferentes regiones de la molécula (Figura 7.1). Los estudios de cristalografía de rayos X han demostrado además que todos los ARNt se pliegan en formas compactas de L similares, que probablemente sean necesarias para que los ARNt encajen en los ribosomas durante el proceso de traducción. La función adaptadora de los ARNt implica dos regiones separadas de la molécula. Todos los ARNt tienen la secuencia CCA en su terminal 3 & # x000b4, y los aminoácidos están unidos covalentemente a la ribosa de la adenosina terminal. La plantilla de ARNm es luego reconocida por el bucle anticodón, ubicado en el otro extremo del ARNt plegado, que se une al codón apropiado por apareamiento de bases complementarias.

Figura 7.1

Estructura de los ARNt. La estructura del ARNt de fenilalanilo de levadura se ilustra en forma abierta (A) para mostrar el apareamiento de bases complementarias. Las bases modificadas se indican como mG, metilguanosina mC, metilcitosina DHU, dihidrouridina (más.)

La incorporación de los aminoácidos correctamente codificados en proteínas depende de la unión de cada aminoácido a un ARNt apropiado, así como de la especificidad del emparejamiento de bases codón-anticodón. La unión de aminoácidos a ARNt específicos está mediada por un grupo de enzimas llamadas aminoacil ARNt sintetasas, que fueron descubiertas por Paul Zamecnik y Mahlon Hoagland en 1957. Cada una de estas enzimas reconoce un solo aminoácido, así como el ARNt correcto (o ARNt) al que debe unirse ese aminoácido. La reacción procede en dos pasos (Figura 7.2). Primero, el aminoácido se activa por reacción con ATP para formar un intermedio de aminoacil AMP sintetasa. A continuación, el aminoácido activado se une al extremo 3 & # x000b4 del ARNt. Las aminoacil tRNA sintetasas deben ser enzimas altamente selectivas que reconozcan tanto aminoácidos individuales como secuencias de bases específicas que identifiquen los tRNA aceptores correctos. En algunos casos, la alta fidelidad del reconocimiento de aminoácidos resulta en parte de una función de corrección de pruebas mediante la cual los AMP de aminoacilo incorrectos se hidrolizan en lugar de unirse al ARNt durante el segundo paso de la reacción. El reconocimiento del ARNt correcto por la aminoacil ARNt sintetasa también es altamente selectivo; la sintetasa reconoce secuencias de nucleótidos específicas (en la mayoría de los casos, incluido el anticodón) que identifican de forma única cada especie de ARNt.

Figura 7.2

Unión de aminoácidos a ARNt. En el primer paso de reacción, el aminoácido se une al AMP, formando un intermedio aminoacil AMP. En el segundo paso, el aminoácido se transfiere al extremo CCA 3 & # x000b4 del ARNt aceptor y se libera AMP. (más. )

Después de unirse al ARNt, un aminoácido se alinea en la plantilla de ARNm mediante apareamiento de bases complementarias entre el codón del ARNm y el anticodón del ARNt. El emparejamiento de bases codón-anticodón es algo menos estricto que el emparejamiento de bases estándar A-U y G-C discutido en capítulos anteriores. La importancia de este apareamiento de bases inusual en el reconocimiento de codón-anticodón se relaciona con la redundancia del código genético. De los 64 codones posibles, tres son codones de terminación que señalan la terminación de la traducción, los otros 61 codifican aminoácidos (ver Tabla 3.1). Por tanto, la mayoría de los aminoácidos están especificados por más de un codón. En parte, esta redundancia es el resultado de la unión de muchos aminoácidos a más de una especie de tRNA. mi. coli, por ejemplo, contienen alrededor de 40 ARNt diferentes que sirven como aceptores de los 20 aminoácidos diferentes. Además, algunos ARNt son capaces de reconocer más de un codón en el ARNm, como resultado del apareamiento de bases no estándar (llamado oscilación) entre el anticodón del ARNt y la tercera posición de algunos codones complementarios (Figura 7.3). El apareamiento relajado de bases en esta posición se debe en parte a la formación de pares de bases G-U y en parte a la modificación de guanosina a inosina en los anticodones de varios ARNt durante el procesamiento (véase la figura 6.38). La inosina puede emparejarse con C, U o A en la tercera posición, por lo que su inclusión en el anticodón permite que un solo ARNt reconozca tres codones diferentes en moldes de ARNm.

Figura 7.3

Emparejamiento de bases codón-anticodón no estándar. El emparejamiento de bases en la posición del tercer codón se relaja, lo que permite que G se empareje con U, y la inosina (I) en el anticodón se empareje con U, C o A. Dos ejemplos de emparejamiento de bases anormales, lo que permite que el ARNt de fenilalanilo (Phe) (más .)


Afiliaciones

Departamento de Anatomía y Biología Estructural, Albert Einstein College of Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Sulagna Das y Robert H. Singer

Centro de Biofotónica Gruss-Lipper, Facultad de Medicina Albert Einstein, Nueva York, NY, EE. UU.

Sulagna Das y Robert H. Singer

Departamento de Bioquímica, Universidad McGill, Montreal, Quebec, Canadá

Campus de investigación Janelia del HHMI, Ashburn, VA, EE. UU.

Valentina Gandin y Robert H. Singer

Laboratorio de Biología de Sistemas, Instituto de Ciencias Moleculares y de la Vida de Ámsterdam (AIMMS), Vrije Universiteit Ámsterdam, Ámsterdam, Países Bajos

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Contribuciones

S.D., V.G., E.T. y M.V. datos investigados para Review S.D., R.H.S., E.T. y M.V. hizo una contribución sustancial a la discusión del contenido, todos los autores escribieron el artículo y S.D., R.H.S. y E.T. revisó y editó el manuscrito antes de su envío.

Autores correspondientes


Control de calidad

Las moléculas de ARNm defectuosas pueden producirse por mutaciones en el gen, así como por errores introducidos durante la transcripción (aunque a una velocidad notablemente baja). Además de producir ARNm con codones incorrectos para aminoácidos, estos errores pueden producir moléculas de ARNm que tienen

  • Codones de terminación prematura (PTC) es decir, la introducción de un codón STOP antes del final normal del mensaje. La traducción de estos ARNm produce una proteína truncada que probablemente sea ineficaz y puede ser dañina. A veces, el problema puede resolverse mediante la descomposición del ARNm mediada por factores sin sentido (NMD).
  • no DETENER el codón. Estos producen transcripciones "ininterrumpidas". El problema puede resolverse mediante la descomposición ininterrumpida de ARNm.

Desintegración de ARNm mediada por sinsentidos (NMD)

Los codones de terminación prematura (PTC) pueden generarse mediante mutaciones sin sentido, cambios de marco y errores de procesamiento de ARN (eliminación de intrones). También son una consecuencia inevitable de la creación de receptores de antígenos en las células B y en las células T.

Mecanismos

  • Durante el procesamiento del ARN dentro del núcleo, se agregan complejos de proteínas en cada punto donde se empalman los exones adyacentes. (Estas son señales importantes para exportar el ARNm al citoplasma).
  • En el citoplasma, a medida que el ribosoma desciende por el ARNm, estos complejos se eliminan (y se envían de regreso al núcleo para su reutilización).
  • Si el ribosoma encuentra un codón de terminación prematura, las etiquetas exón-exón finales no se eliminan, y esto marca el ARNm defectuoso para su destrucción (en los cuerpos P).

Las mutaciones que introducen codones de terminación prematura son responsables de algunos casos de enfermedades humanas hereditarias como la fibrosis quística y la distrofia muscular de Duchenne (DMD).

Una droga, designada PTC124 o ataluren, hace que el ribosoma omita los PTC al mismo tiempo que permite la terminación normal de la traducción. El PTC124 se ha mostrado prometedor en modelos animales de fibrosis quística y DMD, y ahora se están llevando a cabo ensayos clínicos de fase II en humanos.

Desintegración continua del ARNm

Las transcripciones continuas ocurren cuando no hay un codón STOP en el mensaje. Como resultado, el ribosoma no puede reclutar el factores de liberación necesario para dejar el ARNm. Las transcripciones ininterrumpidas se forman durante el procesamiento del ARN, por ejemplo, colocando la cola poli (A) antes de que se alcance el codón STOP.

Mecanismos

Los eucariotas y las bacterias manejan el problema de la ausencia de codón STOP de manera diferente.

  • En eucariotas, cuando el ribosoma se detiene al final de la cola de poli (A), proteinas son reclutados para liberar el ribosoma para su reutilización y degradar el mensaje defectuoso.
  • En bacterias, una molécula de ARN especial y mdash llamada tmRNA salvar el dia. Se llama tmRNA porque tiene las propiedades de un ttransferir ARN y un metroARN mensajero. La parte de transferencia agrega alanina al sitio A del ribosoma. El ribosoma luego pasa a la parte del mensajero que codifica 10 aminoácidos que se dirigen a la molécula para su destrucción (y libera el ribosoma para su reutilización).

El código genético

Para resumir lo que sabemos hasta este punto, el proceso celular de transcripción genera ARN mensajero (ARNm), una copia molecular móvil de uno o más genes con un alfabeto de A, C, G y uracilo (U). La traducción de la plantilla de ARNm convierte la información genética basada en nucleótidos en un producto proteico. Las secuencias de proteínas constan de 20 aminoácidos que ocurren comúnmente, por lo tanto, se puede decir que el alfabeto de proteínas consta de 20 letras. Cada aminoácido está definido por una secuencia de tres nucleótidos llamada codón triplete. La relación entre un codón de nucleótidos y su correspondiente aminoácido se denomina código genético.

Dados los diferentes números de & # 8220 letras & # 8221 en los alfabetos de ARNm y proteínas & # 8220, & # 8221 combinaciones de nucleótidos correspondían a aminoácidos individuales. El uso de un código de tres nucleótidos significa que hay un total de 64 (4 × 4 × 4) combinaciones posibles, por lo tanto, un aminoácido dado está codificado por más de un triplete de nucleótidos ([Figura 2]).

Figura 2: Esta figura muestra el código genético para traducir cada triplete de nucleótidos, o codón, en el ARNm en un aminoácido o una señal de terminación en una proteína naciente. (crédito: modificación del trabajo por NIH)

Tres de los 64 codones terminan la síntesis de proteínas y liberan el polipéptido de la maquinaria de traducción. Estos tripletes se denominan codones de terminación. Otro codón, AUG, también tiene una función especial. Además de especificar el aminoácido metionina, también sirve como codón de inicio para iniciar la traducción. El marco de lectura para la traducción lo establece el codón de inicio AUG cerca del extremo 5 & # 8242 del ARNm. El código genético es universal. Con algunas excepciones, prácticamente todas las especies utilizan el mismo código genético para la síntesis de proteínas, lo que es una prueba poderosa de que toda la vida en la Tierra comparte un origen común.


Parte 2: Cuerpos P y el ciclo del ARNm

00: 00: 00.00 Hola. Mi nombre es Roy Parker. Soy profesor en la Universidad de Arizona,
00: 00: 04.08 y un investigador del Instituto Médico Howard Hughes.
00: 00: 06.26 En mis dos charlas de hoy, hablaré sobre la vida del ARNm eucariota.
00: 00: 10.29 En mi primera charla, hablé de los mecanismos por los cuales se traducen los ARNm,
00: 00: 15.11 localizado y degradado en células eucariotas. En esta charla, hablaré sobre los cuerpos P,
00: 00: 22.01 y lo que llamamos el ciclo del ARNm.
00: 00: 25.01 Y qué nos dice eso sobre la regulación de los ARNm eucariotas.
00: 00: 31.23 Esta diapositiva muestra una célula de hígado humano en cultivo,
00: 00: 37.26 y puedes ver estas regiones brillantes en el citoplasma y estos puntos rojos.
00: 00: 42.03 Y estos son los que llamamos cuerpos P, o cuerpos de procesamiento citoplasmático.
00: 00: 46.23 Y lo que hemos aprendido al estudiar estos cuerpos de procesamiento,
00: 00: 50.11 es que nos hablan de un ciclo dinámico de ARNm en el citoplasma,
00: 00: 54.15 que afecta su función.
00: 00: 55.27 Y ese ciclo se dibuja en esta diapositiva y tiene las siguientes propiedades clave.
00: 01: 01.14 Primero, los ARNm pueden existir en un estado de traducción, donde están asociados con ribosomas,
00: 01: 06.05 haciendo proteínas.
00: 01: 07.05 Pero bajo ciertas condiciones pueden salir de ese estado,
00: 01: 09.29 pierden sus factores de traducción y ribosomas,
00: 01: 13.04 y ensamblar lo que llamamos un mRNP de cuerpo P,
00: 01: 15.20 que es un mRNP reprimido traslacionalmente,
00: 01: 17.29 Que pueden acumularse en estos cuerpos P más grandes.
00: 01: 20.28 Los ARNm dentro de los cuerpos P pueden destruirse,
00: 01: 25.00 o pueden volver a la traducción mediante el montaje de un nuevo complejo de iniciación de la traducción,
00: 01: 30.04 y luego reclutamiento de un ribosoma.
00: 01: 33.02 Ahora, hay tres características de este ciclo en los cuerpos P
00: 01: 37.11 que encuentro particularmente interesante y digno de estudio.
00: 01: 41.10 Primero, las transiciones entre estos diferentes estados
00: 01: 44.19 en la celda es muy probable que juegue un papel importante en la regulación de la traducción
00: 01: 49.17 y degradación, y quizás incluso localización de ARN en la célula.
00: 01: 53.16 Obviamente, si los ARNm están asociados con ribosomas y factores de traducción
00: 01: 57.15 pueden producir proteínas. Pero cuando se ensamblan en complejos de represión de traducción
00: 02: 01.23 y asociado con complejos degradantes de ARN,
00: 02: 05.02 es más probable que sean blanco de destrucción.
00: 02: 07.10 Además, también creemos que esto podría desempeñar algún papel en la localización,
00: 02: 11.09 porque estos componentes en estas estructuras de cuerpo P,
00: 02: 14.06 en realidad muestran similitudes con los gránulos de transporte de ARN en una variedad de casos diferentes.
00: 02: 20.24 Así que este ciclo, probablemente juega un papel importante solo en la regulación
00: 02: 24.21 de traducción, degradación y localización de ARN en las células.
00: 02: 29.04 Una segunda característica interesante de este ciclo,
00: 02: 33.01 es que los cuerpos P, un componente clave de este ciclo,
00: 02: 37.07 muestran superposición con otros gránulos de proteína de ARN que son muy importantes en biología.
00: 02: 42.08 Por ejemplo, gránulos de ARN materno o gránulos germinales,
00: 02: 47.00 son complejos de ARNm maternos y proteínas que se encuentran en los ovocitos o los embriones,
00: 02: 53.12 de una amplia variedad de especies. Y esos ARNm maternos
00: 02: 56.11 son hechos por la madre y luego durante el desarrollo del embrión,
00: 02: 59.28 se traducen en lugares específicos y en momentos específicos,
00: 03: 03.21 con el fin de impulsar el desarrollo de ese embrión temprano.
00: 03: 07.04 Y así, el almacenamiento y la traducción posterior,
00: 03: 09.18 en el momento y lugar adecuados es extremadamente importante.
00: 03: 11.16 Y esos gránulos comparten muchos componentes con los cuerpos P,
00: 03: 16.03 que se encuentran en todas las células somáticas que se han examinado hasta ahora,
00: 03: 19.07 de la levadura a los humanos.
00: 03: 22.00 Del mismo modo, en los gránulos neuronales,
00: 03: 23.19 que juegan un papel importante en la plasticidad sináptica,
00: 03: 25.29 y transportan ARN a varias sinapsis, también comparten componentes
00: 03: 32.02 con cuerpos P Y también compartir componentes con gránulos germinales.
00: 03: 35.20 Entonces, estos tres tipos de gránulos de ARN están relacionados,
00: 03: 38.21 y probablemente tengan una función subyacente, similar, bioquímica y composicional.
00: 03: 46.17 Finalmente, la tercera razón por la que encuentro estos interesantes,
00: 03: 49.07 son conexiones entre los virus y el ciclo del ARNm.
00: 03: 52.01 Entonces, en varios casos, componentes de cuerpos P,
00: 03: 55.19 o gránulos de estrés, otro gránulo en este ciclo del que hablaremos,
00: 03: 58.21 son necesarios para los ciclos de vida virales.
00: 04: 00.21 Por ejemplo, los componentes de los cuerpos P son necesarios para
00: 04: 04.29 retrotransposones, que son elementos similares a retrovirales en la levadura.
00: 04: 09.25 Y componentes de gránulos de estrés,
00: 04: 11.20 como la proteína llamada DDX-3, es necesaria para la traducción del VIH
00: 04: 16.13 ARN genómico, así como para los ciclos de vida del virus de la hepatitis C.
00: 04: 22.00 Y creemos que estos roles genéticos son realmente importantes,
00: 04: 26.08 porque en algunos casos los complejos virales o factores antivirales del hospedador
00: 04: 32.19 se acumulan en estas estructuras. Por ejemplo, lo que estamos viendo aquí,
00: 04: 36.11 estas son células de levadura, y las verdes son en realidad marcadores de cuerpos P,
00: 04: 40.25 y el rojo aquí, en realidad muestran partículas virales recién ensambladas
00: 04: 46.17 para este retrotransposón Ty3. Y puede ver, aunque no se superponen completamente,
00: 04: 52.08 estas partículas virales tienden a encontrarse junto con una superposición parcial con los cuerpos P.
00: 04: 59.20 Entonces mi laboratorio se interesó en tratar de comprender
00: 05: 02.20 cuáles son las propiedades y funciones de los cuerpos P,
00: 05: 05.29 y cómo se relaciona con estas transiciones dinámicas que pueden sufrir los ARN,
00: 05: 09.16 en la regulación de su traducción y degradación.
00: 05: 15.15 Ahora, el trabajo de una amplia variedad de laboratorios ha identificado muchos de los componentes
00: 05: 21.05 en cuerpos P, aunque todavía no entendemos todo el complejo
00: 05: 24.14 que está presente en estas partículas.
00: 05: 26.28 Entonces, desde la levadura hasta los mamíferos, hay un conjunto básico de proteínas,
00: 05: 30.27 que incluyen enzimas desencadenantes,
00: 05: 33.03 como mencioné en mi otra charla, juega un papel en la degradación de ARN
00: 05: 37.10 descapotando. Así como varias proteínas que pueden reprimir la traducción,
00: 05: 41.08 o promover la eliminación, así como una exonucleasa,
00: 05: 44.14 que degrada el ARN después de la descomposición.
00: 05: 46.26 En algunas células de metazoos, los componentes de microARN también pueden estar presentes en los cuerpos P,
00: 05: 52.17 o en una estructura relacionada, denominada cuerpo GW,
00: 05: 56.19 que es similar a los cuerpos P y puede mostrar cierta superposición.
00:06:01.03
00: 06: 03.21 Ahora los cuerpos P son proporcionales al conjunto de ARN sin traducir,
00: 06: 07.09 y solo quiero ilustrar esto, mostrando la dinámica de estas estructuras.
00: 06: 11.15 Así que esto está observando las células de levadura durante el crecimiento medio logarítmico.
00: 06: 15.02 Y puede ver que hay algunos cuerpos P de tamaño moderado,
00: 06: 17.10 en esas celdas. Sin embargo, si privamos de glucosa a esas células,
00: 06: 21.13 esto conduce a una rápida pérdida de traducción, y puede ver que los cuerpos P
00: 06: 25.18 hacerse un poco más grande. Por el contrario, si tratamos células con ciclohexamida,
00: 06: 31.09 que atrapa ARNm en polisomas,
00: 06: 33.16 que está asociado con los ribosomas, los cuerpos P desaparecen.
00: 06: 37.15 Y este tipo de observaciones son algunos de los datos que han llevado al modelo
00: 06: 43.07 que los ARN se dividen entre la traducción o los cuerpos P, dependiendo de si
00: 06: 48.08 están asociados con los ribosomas o con estos componentes de las estructuras del cuerpo P.
00: 06: 55.00 Los cuerpos P también contienen ARN, y podemos detectar que ya sea por hibridación in situ,
00: 07: 00.07 o mediante una técnica común que utiliza la capacidad de unir GFP a un ARN específico,
00: 07: 06.14 a través de proteínas de unión a ARN específicas de secuencia.
00: 07: 09.00 Esencialmente fabricando una molécula de ARN etiquetada con GFP.
00: 07: 11.13 Y si haces eso, y lo expresas en células que están creciendo felizmente,
00: 07: 16.13 aquí, el ARN tiende a distribuirse alrededor del citoplasma,
00: 07: 19.28 porque se dedica a la traducción.
00: 07: 22.06 Y podemos ver que debido a que esto es lo que se llama un rastro polisómico,
00: 07: 25.07 donde el mayor de estas series de picos aquí, son ARN asociado con los ribosomas.
00: 07: 29.26 Cuanto más grande es este pico aquí, más traducción se está produciendo en la celda.
00: 07: 33.10 Ahora, si privamos de glucosa a esa célula durante unos minutos,
00: 07: 36.06 puedes ver que la traducción declina dramáticamente, estos polisomas ahora se han ido.
00: 07: 40.22 Y ahora puedes ver que estos ARNm se acumulan
00: 07: 43.15 en estos focos discretos dentro de la celda. Y esos focos se superponen con marcadores de cuerpos P.
00: 07: 48.09 Entonces, los cuerpos P contienen ARN, y esos ARN realmente pueden
00: 07: 51.21 abandona reversiblemente los cuerpos P y vuelve a entrar en la traducción.
00: 07: 55.29 A través de varios experimentos diferentes
00: 07: 57.17 mostrado por Muriel McGees y Daniella Texiera en mi laboratorio hace varios años.
00: 08: 02.25 Y puede ver que si vuelve a agregar glucosa,
00: 08: 04.17 estos cuerpos P se encogen y los polisomas se restauran.
00:08:09.01
00: 08: 11.15 Los cuerpos P no solo contienen ARN, sino que también requieren ARN para su formación.
00: 08: 16.02 Aquí hay un experimento realizado por Marco Valencia Antonio Sánchez en mi laboratorio hace unos años,
00: 08: 22.01 donde purificó los cuerpos P mediante centrifugación diferencial,
00: 08: 25.01 y luego, si trató esos cuerpos P con RNase, puede ver que se desmoronaron.
00: 08: 29.17 Y así no solo los cuerpos P. por lo que los cuerpos P son complejos que se forman en ARN que no se traduce,
00: 08: 36.11 que contienen este conjunto discreto de proteínas, y requieren ese ARN para su formación.
00: 08: 43.22 Así que una de las preguntas en las que mi laboratorio se ha interesado es tratar de comprender,
00: 08: 46.21 ¿cómo se ensamblan estas proteínas en el ARN?
00: 08: 50.11 y cómo se ensamblan en un cuerpo P de orden superior.
00: 08: 52.06 ¿Y qué nos dice eso sobre la función de estos complejos?
00: 08: 54.26 Entonces, un enfoque que hemos estado adoptando para esto,
00: 08: 57.09 es purificar todos estos componentes diferentes,
00: 08: 59.15 y luego probar sus interacciones entre ellos.
00: 09: 02.10 Y hemos realizado varios experimentos diferentes en los que purificamos
00: 09: 06.00 versiones comunes de estos componentes centrales y luego probar su unión in vitro.
00: 09: 10.20 Por ejemplo, aquí, tomamos dos proteínas diferentes y las mezclamos,
00: 09: 14.07 purificamos esta proteína Dhh1 de regreso,
00: 09: 17.28 y preguntamos si viene este.
00: 09: 19.16 Y si haces muchos de este tipo de experimentos de co-inmunoprecipitación,
00: 09: 22.14 que puede ver, hay una gran cantidad de interacciones entre
00: 09: 27.08 estos componentes centrales del cuerpo P, y entre sí.
00: 09: 30.07 Y con la molécula de ARN.
00: 09: 33.13 Entonces, esta caricatura muestra todos estos componentes, usando proteínas purificadas,
00: 09: 39.09 mostrando las interacciones directas proteína-proteína que ocurren,
00: 09: 42.15 entre estos diferentes componentes centrales de los cuerpos P.
00: 09: 45.13 Y lo que pueden ver es que hay una densa red de interacciones.
00: 09: 48.02 Y dentro de eso, muchas de estas proteínas también son proteínas de unión de ARN,
00: 09: 52.09 y para que estas proteínas no solo puedan ensamblarse entre sí,
00: 09: 54.25 también pueden unirse a la molécula de ARN para formar un complejo ARN-proteína.
00:09:59.10
00: 10: 03.00 Ahora, todavía no sabemos realmente cómo se unen para formar el complejo definitivo.
00: 10: 09.00 Ese es uno de nuestros objetivos en los próximos años.
00: 10: 12.05 Pero, actualmente tenemos dos modelos de cómo se ven estas estructuras.
00: 10: 16.03 Uno es lo que llamamos ciclo cerrado.
00: 10: 19.00 donde se juntan los extremos 5 primos y 3 primos del ARN
00: 10: 21.21 por interacciones proteína-proteína con estos diferentes componentes centrales,
00: 10: 25.07 preferentemente unido a la tapa, o al extremo 3-primo del ARNm.
00: 10: 29.00 Y este tipo de modelo de ciclo cerrado es análogo a los modelos para complejos de traducción,
00: 10: 34.07 donde la tapa y la cola poli-A se unen por interacciones proteína-proteína,
00: 10: 38.15 factores de iniciación unidos a esos dos sitios, para promover la carga de ribosomas.
00: 10: 45.02 El otro modelo posible es lo que llamamos un nucleosoma,
00: 10: 48.19 o cuentas en una cuerda, donde tenemos este complejo central, y se encuentra en varios lugares del ARN,
00: 10: 54.16 y, por lo tanto, la región codificante también se recubrirá con estas proteínas diferentes,
00: 10: 58.27 y los experimentos actuales en mi laboratorio están dirigidos a tratar de identificar las diferencias, para determinar
00: 11: 04.17 cuál de estos complejos se forma realmente en el ARN.
00:11:09.05
00: 11: 12.08 Ahora entendemos cómo estos ARN se unen en estructuras de orden superior,
00: 11: 15.05 de nuestro análisis de estas interacciones entre estas proteínas.
00: 11: 19.00 Entonces, existen estos mRNP de cuerpo P que se unen para formar una estructura más grande,
00: 11: 24.28 a través de dos dominios de interacción personal.
00: 11: 26.23 Así que uno de estos dominios de interacción está en la proteína EDC3,
00: 11: 30.18 que en realidad puede dimerizarse consigo mismo, por lo que si interrumpe esa interacción,
00: 11: 36.00 lo que puedes ver es que pierdes. el número de cuerpos P desciende drásticamente.
00: 11: 40.16 Aunque todavía puedes formar algunos.
00:11: 42.08 Así que esta sería una célula de tipo salvaje, donde la hemos matado de hambre para hacer cuerpos P realmente grandes,
00:11: 46.04 y ahora, cuando eliminamos esa proteína EDC3, pueden ver que todavía hay algunas formadas.
00:11: 51.11 Pero los que se formaron dependen de otra interacción, que está en la proteína LSM-4,
00: 11: 56.13 que en su cola C-terminal contiene lo que se llama un dominio "prión".
00: 12: 00.10 OK. Y un dominio de priones es análogo a lo que pensamos en la enfermedad de las vacas locas,
00: 12: 05.19 o la enfermedad de Kuru humana, que es un dominio de autoensamblaje,
00: 12: 09.12 que, al menos en el estado de enfermedad, puede ser irreversible.
00: 12: 13.09 Pero, este es un ejemplo en el que estos tipos de dominios priónicos no solo forman un agregado,
00:12: 21.02 pero eso es realmente un ensamblaje reversible, así que no es un estado patógeno.
00: 12: 24.20 Y si obtiene tanto la proteína EDC3 como el dominio priónico en la proteína LSM4,
00: 12: 30.15 aquí abajo, ves que ya no se forman cuerpos P.
00: 12: 34.03 Ahora, ¿es tan interesante que en realidad exista este dominio de priones,
00: 12: 39.25 ¿o lo que a menudo se llama un dominio Q / N involucrado en la agregación de estos complejos de ARN-proteína?
00: 12: 44.26 Solo quiero hacer algunos puntos sobre esto,
00:12: 47.19 porque creo que en realidad es un aspecto muy interesante de la biología,
00: 12: 50.20 que podría tener un significado más amplio.
00: 12: 52.16 Primero, muchas proteínas involucradas en la traducción y degradación del ARN
00: 12: 57.22 tienen este tipo de dominios Q / N.
00: 12: 59.21 Por ejemplo, si busca el genoma de la levadura,
00: 13: 02.26 hay alrededor de 100 proteínas que tienen el potencial
00: 13: 05.23 para formar este tipo de agregados a través del dominio Q / N o priónico.
00: 13: 10.10 De esos 100, 50 están involucrados en la traducción o degradación del ARN.
00: 13: 15.20 Así que más de la mitad. Y muchos de los otros no sabemos lo que hacen
00: 13: 18.11 para que ellos también estén involucrados.
00: 13: 20.03 Creo que esta será una característica común de muchas de estas proteínas,
00: 13: 23.21 en la traducción y degradación del ARN
00: 13: 26.16 y sugiere que luego pueden tener una tendencia a formar este tipo de agregados,
00:13: 31.04 por razones biológicas que aún no entendemos.
00:13:33.09
00: 13: 35.24 De acuerdo con eso, diferentes tipos de estos dominios
00: 13: 39.13 pueden crear diferentes tipos de estructuras, o diferentes tipos de cuerpos P, por ejemplo.
00: 13: 45.17 Y no se comprende bien qué tan específicos pueden ser estos diferentes dominios Q / N,
00: 13: 52.09 pero en algunos casos parece que pueden tener interacciones específicas entre sí,
00: 13: 57.08 y en otros casos general. Entonces, lo que eso significa son diferentes tipos de dominios Q / N
00: 14: 00.28 entonces también podría impulsar diferentes tipos de dominios, o tipos de gránulos de proteína de ARN.
00: 14: 05.17 Y de acuerdo con eso, también sabemos que los dominios Q / N
00: 14: 08.07 están involucrados en el montaje de otro
00: 14: 10.11 Gránulo de proteína de ARN en levadura y en células humanas llamado gránulo de estrés.
00:14: 14.19 De lo que hablaré en unos minutos.
00:14:16.11
00: 14: 19.00 Finalmente, el hecho de que los dominios Q / N pueden ser irreversibles,
00: 14: 22.23 les permite funcionar como elementos epigenéticos. Y lo que eso significa entonces
00: 14: 26.23 es que si ensambla gránulos de proteína de ARN a través de estos dominios priónicos,
00: 14: 32.00 tienes el potencial de tener un estado genético hereditario, por eso.
00: 14: 37.18 Y así, un modelo de Kazeksai y Eric Kandel ha propuesto que este tipo de ensamblaje impulsado por priones
00: 14: 46.05 puede jugar un papel en la plasticidad sináptica en la formación de la memoria.
00:14:49.20
00:14:52.17 And then finally, it is striking that several of the neuro-degenerative diseases
00:14:57.16 involve the expansion of poly-glutamine
00:15:01.14 tracts in proteins which are normally components of P-bodies or stress granules.
00:15:05.04 So for example, Huntington's:
00:15:08.01 the protein which gives rise to the neuro-degenerative disease has a polyQ tract in it
00:15:16.14 and it is normally a component of P-bodies. And that is probably why it has the polyQ tract,
00:15:21.06 because part of its biology requires it to assemble into that complex,
00:15:25.04 but when that tract expands too big, it leads to the formation of cytoplasmic aggregates.
00:15:31.09 And it's controversial as to whether those are toxic or protective,
00:15:34.21 but there is a striking correlation between some of these neuro-degenerative diseases,
00:15:38.18 having expansions of these tracts, and the formation of these aggregates,
00:15:43.08 which are probably related in some manner to P-bodies and/or stress granules.
00:15:50.00
00:15:54.16 Alright. So, we understand somewhat then how these P-bodies assemble.
00:16:00.03 And we understand how they aggregate into larger structures.
00:16:03.10 So, this allows us to do an experiment, then to test what is the significance
00:16:08.01 of making these larger structures. Is this larger structure important
00:16:12.24 for these RNAs to stop translation, or is it important for them to be degraded?
00:16:16.24 So, the experiment we have done then, is to simply look at what happens, to RNA-degradation
00:16:24.19 in a mutant that can no longer assemble these larger structures.
00:16:27.25
00:16:29.21 And what we observed then,
00:16:31.16 if we look at degradation of RNAs, is that RNAs tend to degrade pretty normally.
00:16:36.13 So here we are looking at specific reporter mRNA MFA2.
00:16:40.11 We block transcription at 0 time,
00:16:42.06 and you can see that in wild-type cells the RNA degrades with a half life of about 3 minutes.
00:16:46.22 And in the mutant, which can't make large P-bodies, we see a similar decay rate.
00:16:52.08
00:16:55.09 So in other words, formation of these larger scale structures is not required,
00:16:59.17 at least for the degradation of a few reporter mRNAs.
00:17:03.01 And so, that suggests that the formation of these individual mRNPs,
00:17:07.02 at least under the conditions that we have examined so far,
00:17:10.10 is sufficient for allowing RNAs to be degraded, for allowing them to exit translation,
00:17:16.03 and enter this translationally repressed state. So this raises the question then,
00:17:21.27 why do cells make these larger structures?
00:17:25.12 In fact, one has to anticipate that these structures have roles,
00:17:29.24 because they are conserved throughout eukaryotic cells that have been looked at.
00:17:33.16 So, why make these larger structures?
00:17:36.04 The simplest explanation is that you make these larger structures to promote interactions,
00:17:43.15 between components when those components are limiting.
00:17:45.20 And it is very likely under the conditions that we have examined so far in the lab,
00:17:49.29 the components that we are testing, under the conditions that we are examining in the lab,
00:17:56.00 the key components that trigger RNA-degradation, or translation repression, are not limiting.
00:18:02.09 Alternatively, it could be that some mRNAs require aggregation for their regulation.
00:18:07.28 It could be that you aggregate to protect against, to limit other interactions.
00:18:13.13 For example, aggregation of RNA into these structures might protect them from other nucleases,
00:18:18.03 which are not present in those. And then, it could be that aggregation plays important roles
00:18:24.08 in cellular organization, and or transport. As we have suggested in neurons or in germ cells.
00:18:32.10 But this is actually an ongoing area of interest, trying to understand the larger role of assembly,
00:18:40.09 of these large structures in eukaryotic cells. And I want to point out,
00:18:44.20 that this is not a problem that is limited to the study of P-bodies and
00:18:48.14 the regulation of translation in the cytoplasm.
00:18:50.21 In fact, as we have studied more about the organization of cells,
00:18:54.24 what we have learned is that there is a diversity of RNA-protein granules,
00:18:58.08 that form in eukaryotic cells.
00:19:01.04 So, in the cytoplasm we have talked about P-bodies, and a little bit about stress granules.
00:19:05.18 But in the nucleus, there are a lots of other RNA-protein complexes.
00:19:09.15 Nuclear speckles which contain splicing factors, and also Cajal bodies,
00:19:15.02 which contain components of snRNA, small nuclear RNA protein complexes.
00:19:21.04 And actually the work of Carl Neuberger has really shown that the function of these Cajal bodies,
00:19:25.17 is to increase the rate of the assembly of these protein RNA-complexes.
00:19:30.06 And so I think, that one think we should expect as we go forward,
00:19:33.17 as we study these different RNA-protein complexes,
00:19:37.23 is that their general role might be to increase the assembly rates
00:19:42.00 of components within them, simply by providing higher level concentration of those factors.
00:19:49.26
00:19:50.24 Now, P-bodies often dock, or overlap, with these RNA-granules referred to as stress granules.
00:19:59.06 So here, we are looking at a mammalian cell.
00:20:01.15 The blue represents a stress granule structure.
00:20:04.18 And the yellow or red here, represents a P-body.
00:20:08.19 And you can see they are often docked together, near each other.
00:20:11.08 A similar phenomenon occurs in yeast,
00:20:13.12 although in that case, and in many cases, the P-body and stress granule actually overlap.
00:20:19.04 So here, in this particular image in yeast, P-bodies would be red
00:20:23.11 and stress granules would be green.
00:20:26.04 So if they are overlapped, the will be yellow.
00:20:27.16 And you can see that many of these components are in fact yellow.
00:20:30.10
00:20:32.08 So, what are stress granules?
00:20:34.18 So stress granules, again, are an RNA-protein complex containing untranslating RNAs.
00:20:39.21 But in contrast to the decay, and translation repressors present in P-bodies,
00:20:44.24 stress granules contain translation initiation factors,
00:20:47.22 RNA-binding proteins, and, in some cases, they can contain the 40s subunit.
00:20:54.17 Stress granules form when translation initiation is slow,
00:20:58.23 and so the simplest model is that these stress granules represent a population of mRNAs,
00:21:05.16 which are entering or exiting translation.
00:21:07.24 And that is they have assembled a translation initiation complex,
00:21:11.04 but they haven't entered the elongation phase of translation.
00:21:16.16 It's not known whether they are really entering or exiting translation,
00:21:20.02 although in some cases I'm going to argue that they are perhaps entering translation.
00:21:25.01
00:21:27.20 Now, these interactions between P-bodies and stress granules,
00:21:31.06 have lead to the suggestion that mRNAs exchange between these two.
00:21:34.29 And so the logic here is that, while these two different granules interact,
00:21:39.03 they can contain the same mRNA,
00:21:42.28 and we know that mRNAs which are in P-bodies can return to translation.
00:21:46.24 So at some level, those mRNAs must be able to re-associate with translation initiation factors.
00:21:51.20 And so one hypothesis then,
00:21:54.04 is that mRNAs are exchanging between stress granules, and P-bodies.
00:21:57.28
00:22:00.00 And there is really two models for how this could be occurring.
00:22:03.12 So in the first model, mRNAs, when they are engaged in translation,
00:22:10.15 when they cease translation they assemble into this stress granule structure.
00:22:14.08 And within this stress granule, different mRNAs would assemble different complexes.
00:22:19.06 Some RNAs would be targeted for degradation and would be sent to a P-body,
00:22:22.29 for destruction.
00:22:24.14 And other RNAs would reassemble a new translation complex and return to polysomes.
00:22:28.20 The other possibility is, in fact, RNAs when they exit translation they travel to a P-body,
00:22:36.18 and within that P-body some RNAs would be sorted for destruction.
00:22:40.19 Or other RNAs, presumably due to their composition or sequence features,
00:22:45.05 would reassemble a new translation complex,
00:22:47.26 and then would return back to the translated pool.
00:22:50.15 A few years ago, Ross Buck in my lab wanted to try to distinguish between these two models,
00:22:56.28 and so it's relatively a simple experiment,
00:22:59.19 cause he is going to analyze how defects in the ability to assemble P-bodies or stress granules
00:23:04.08 affect the other structures.
00:23:06.16 So for example in this model, you would have to assemble a stress granule
00:23:11.13 in order to make a P-body. Where as in this model, you might have to make a P-body
00:23:15.22 in order to make a stress granule.
00:23:17.02 And so, here's what those kinds of experiments look like.
00:23:21.09 Here we are using yeast cells,
00:23:23.00 where we have a mutation which can prevent the formation of either stress granules or P-bodies.
00:23:27.16 And this is a wild type cell, and again you can see lots of stress granules in green,
00:23:32.13 many P-bodies in red. And they are generally overlapping the stress granule markers,
00:23:37.05 so they are yellow.
00:23:38.16 If you get rid of the ability to form stress granules,
00:23:42.04 you still make P-bodies, and you make about the same number,
00:23:46.02 and the same brightness and the same size of P-bodies.
00:23:51.03 So, mutations reducing stress granules do not affect the formation of P-bodies,
00:23:55.27 at least in yeast cells.
00:23:57.16 However, if we do the converse experiment, where we get rid of P-bodies,
00:24:02.26 and here we are using those mutations we talked about earlier,
00:24:05.10 the EDC3 protein gone and deleting the prion domain on this Lsm4 protein.
00:24:10.16 Now what you see, is that we don't make any P-bodies,
00:24:14.00 but we also don't make any stress granules.
00:24:15.17
00:24:17.04 So our interpretation of that, is in fact, that stress granules form,
00:24:22.07 from pre-existing P-bodies. Now of course, there is two possible views of this:
00:24:28.14 one view is, in fact, that this effect is really an indirect effect.
00:24:32.25 But if you get rid of P-bodies, you have all kinds of changes in the regulation of mRNAs,
00:24:37.13 and that changes the proteins which affect stress granule formation.
00:24:41.03 And therefore you can't make stress granules for some indirect reason.
00:24:44.09 And the other model, is that there in fact, that P-bodies provide an assembly site,
00:24:49.12 where in this model, when RNAs stop translating,
00:24:53.27 they first assemble into these complexes that aggregate in P-bodies, and that with time,
00:24:59.24 some of these RNAs are targeted for translation,
00:25:03.08 so they assemble new translation factors on them,
00:25:06.18 and some are targeted for degradation, and they might go away,
00:25:08.26 and so in this intermediate time we kind of have an overlap,
00:25:12.07 and then with more time, these RNAs are being destroyed, are gone,
00:25:16.26 and these RNAs, which are going to re-enter translation,
00:25:20.06 will become a greater component of the total pool.
00:25:23.23 So in order to look at this, distinguish these possibilities,
00:25:28.18 Ross did an experiment where he basically looked to see if stress granules form
00:25:36.20 by maturation of P-bodies. And so what he is going to do is just follow a time course
00:25:40.29 of the formation of P-bodies and stress granules during a glucose deprivation.
00:25:45.26 So he is going to grow a culture, he's going to starve it for glucose for a short period of time,
00:25:50.13 and then take images over a variety of time,
00:25:53.24 and see what happens to P-bodies and stress granules.
00:25:56.01 And so when he does that experiment, these are the results:
00:26:00.12 The important observations, I'm just going to highlight.
00:26:03.26 The first is, that the first thing you see is that P-bodies get very big.
00:26:08.01 So, from zero time here is before the stress,
00:26:11.27 there are some small P-bodies you can't see under these kind of exposure conditions.
00:26:15.09 But by seven minutes of stress they are quite large,
00:26:18.01 and very bright.
00:26:20.05 So P-bodies form first.
00:26:21.29 The second thing you see, is that the first stress granules you can see,
00:26:26.04 there is a few of them here at this seven-minute time-point,
00:26:29.13 they are always in association with a P-body.
00:26:32.14 So if you look down here in the merge, they always overlap.
00:26:35.04 So stress granules first appear in conjunction with a P-body.
00:26:39.21 And then the third thing you see, is if you follow with more time,
00:26:43.27 some of these P-bodies mature from being a P-body to being primarily like a stress granule.
00:26:50.08 So if you look at this one here, at the early time points, it's primarily a P-body
00:26:54.15 with very little stress granule marker. And then by half an hour later,
00:26:58.18 the amount of Dcp2, a P-body marker there has declined dramatically,
00:27:03.15 and the amount of poly-A binding protein, a stress granule marker has increased,
00:27:07.27 suggesting that these, in fact, are maturing from a P-body state into a stress granule state.
00:27:13.02 And that suggests that there is really a directionality in the movement of RNAs,
00:27:18.29 between these different types of complexes. That they go from translation,
00:27:23.14 to a repressed state, generally in the formation of a P-body, type of complex.
00:27:30.24 And those RNAs can then re-enter translation by forming a new translation complex,
00:27:35.09 which can associate into these larger structures referred to as stress granules,
00:27:39.07 and go back into translation. Although I'm focusing on these individual RNA-protein complexes,
00:27:47.11 we can observe that in the microscope really is a summation of that total population
00:27:52.00 is in these aggregates that are visible in the light microscope.
00:27:56.13
00:28:00.23 Now, so what then are stress granules?
00:28:03.14 So at least under these kind of conditions,
00:28:06.06 this suggest that stress granules are primarily RNAs,
00:28:09.12 which are being primed for re-entering translation.
00:28:12.00 And that then, maybe stress granules should be thought of as sites of assembly,
00:28:18.07 of translation initiation complexes.
00:28:20.06 And the argument here for this is that they form when initiation is limiting,
00:28:24.04 they form from non-translating RNAs, and they contain translation factors.
00:28:28.25 And so maybe they are not necessarily sites where RNAs are targeted for repression,
00:28:32.16 but they are sites where RNAs have their high local concentration of translation factors,
00:28:38.00 and therefore allow for the efficient assembly of these translation initiation complexes
00:28:42.05 which can then go on and enter translation.
00:28:44.17 And this is an area of further research in my lab, as well as other labs, as well.
00:28:50.05
00:28:55.09 Now, I want to step back and just say a few words about RNA granules.
00:28:59.22 Because those of you who work in this area, or read about it,
00:29:04.19 it's easy to become confused about the diversity of different types of RNA granules,
00:29:09.06 which are described in the literature.
00:29:10.24 And, what I'd like to argue is in fact, that maybe these granules are all related,
00:29:16.03 in a simple kind of model where there are different stages
00:29:19.04 of movements of RNAs through this mRNA cycle.
00:29:24.08 Now, so for example, under some conditions you can see granules that accumulate,
00:29:32.25 which contain EIF4e, EIF4g, the cap-binding complex, and poly-A binding protein,
00:29:37.25 that are missing other components,
00:29:40.12 like 40s subunits which form under a different stress.
00:29:44.13 So, a simple way of thinking about these, is that they are simply blocked,
00:29:49.12 they simply have different rate limiting steps in the transitions
00:29:52.13 between these different pools in the mRNA cycle.
00:29:55.09 So if you block this step here,
00:29:57.04 in response to a various cue, these RNAs accumulate with these complexes,
00:30:01.25 then you will get a stress granule of that composition. Whereas if you block over here,
00:30:05.28 you'll accumulate with this type of RNA-protein complex,
00:30:09.02 and you'll get a stress granule which contains these other factors.
00:30:12.06 So, these aren't fundamentally different particles perhaps,
00:30:17.07 they are simply different stall points on a continuum of exchange points.
00:30:22.21 And so when one thinks about that kind of model then,
00:30:26.19 the diversity and the composition of granules observed in the cell
00:30:30.23 can also be affected by the behavior of different mRNA sub-populations.
00:30:36.06 So for example, under some stresses you get both P-body increasing,
00:30:42.20 and stress granules. But probably because there are some mRNAs which are stalled at this stage,
00:30:48.21 and they are assembled with these P-body components, you see a large formation of P-bodies,
00:30:54.01 but other mRNAs are stalled at a different site.
00:30:56.09 Perhaps over here after they have a small subunit,
00:31:00.11 and so you will also see stress granules accumulate.
00:31:02.22 And so one of the things we don't understand very well,
00:31:05.04 is what is the diversity of different types of mRNAs, and mRNA protein complexes,
00:31:09.12 and then how they lead to the accumulation of different particles under different conditions.
00:31:17.15
00:31:19.16 But one thing consistent with this, is if we look in the literature,
00:31:23.15 what we can see is that there is really a continuum of RNA-protein granules,
00:31:27.07 which span from a classical P-body as defined by the initial papers, to a classical stress granule.
00:31:34.19 And so this is just a cartoon of that, and the important thing to look at here,
00:31:38.26 is underneath each of these particles, is shown a list of the proteins found in them,
00:31:44.09 and in green would be components which are only seen in P-bodies.
00:31:47.28 So this would be a P-body which has only components of P-bodies.
00:31:51.13 Yellow are proteins which can be seen in either P-bodies or stress granules.
00:31:55.21 And red would be components which are only seen in stress granules.
00:31:59.11 And if you look around the literature, dendritic P-bodies,
00:32:03.16 these are RNA-protein complexes found
00:32:06.10 at the dendritic side of synapses in various neurons.
00:32:10.08 They have a mixture of both P-bodies and stress granule components.
00:32:14.10 Transport particles in neurons in Drosophila have a mixture again.
00:32:21.10 In C. elegans, different types of granules can again have a mixture.
00:32:25.11 Although in many cases we do not know the complete composition of each of these granules,
00:32:29.12 what you begin to see is that there is no such thing as, there are two boundary conditions,
00:32:35.02 but then there is a wide range of different intermediate forms.
00:32:39.14 And that we should perhaps think of these then,
00:32:42.25 all as different stall points on this mRNA cycle,
00:32:45.22 or different sub-populations of mRNAs stalled at a mixture of sites.
00:32:49.25
00:32:51.24 Alright. So in summary then, I just want to try to highlight the main points that I've tried to say
00:32:58.16 which is that, in cells, mRNAs can exist in at least two predominate mRNP states
00:33:04.12 those that are translating, and those that are repressed.
00:33:07.13 Those repressed mRNAs typically accumulate in RNA-protein granules,
00:33:11.11 such as P-bodies and stress granules.
00:33:13.21 These different biochemical compartments, can have different rates of translation,
00:33:20.08 deadenylation, and mRNA degradation, depending upon where the mRNA is in the cell,
00:33:25.22 and what proteins it is associated with.
00:33:27.07 P-bodies may also be related to RNA transport particles,
00:33:31.09 and therefore play some role in localization,
00:33:33.02 and that there are mechanisms which move RNAs between these compartments,
00:33:36.24 which I haven't had time to talk about today,
00:33:39.03 which are discreet and involve various types of proteins and enzymes.
00:33:43.15
00:33:45.20 There are lots of unanswered questions in this area.
00:33:48.15 How do mRNAs actually cease translation and assemble into P-bodies?
00:33:52.19 How do mRNAs get out of P-bodies and reassemble a new translation complex?
00:33:56.25 And get back into the translating pool?
00:33:59.05 How do they determine which mRNAs are going to do which?
00:34:01.23 And why do you actually form these large scale aggregates?
00:34:05.03 The prediction is, to promote interactions between limiting components,
00:34:08.21 but there is no direct demonstration of that for P-bodies or stress granules yet.
00:34:14.16 And then, how does this cycle relate to the localization of mRNAs to certain regions of the cell
00:34:19.15 and the biogenesis of mRNAs in the nucleus,
00:34:21.26 and their entry into the cytoplasm and beginning to translate and function?
00:34:26.18 And with that, I'd like to thank you all for your attention.
00:34:30.29

  • Part 1: mRNA Localization, Translation and Degradation

Traducción

The synthesis of proteins is one of a cell’s most energy-consuming metabolic processes. In turn, proteins account for more mass than any other component of living organisms (with the exception of water), and proteins perform a wide variety of the functions of a cell. The process of translation, or protein synthesis, involves decoding an mRNA message into a polypeptide product. Amino acids are covalently strung together in lengths ranging from approximately 50 amino acids to more than 1,000.

The Protein Synthesis Machinery

In addition to the mRNA template, many other molecules contribute to the process of translation. The composition of each component may vary across species for instance, ribosomes may consist of different numbers of ribosomal RNAs (ARNr) and polypeptides depending on the organism. However, the general structures and functions of the protein synthesis machinery are comparable from bacteria to human cells. Translation requires the input of an mRNA template, ribosomes, tRNAs, and various enzymatic factors ([link]).

En E. coli, there are 200,000 ribosomes present in every cell at any given time. Un ribosoma es una macromolécula compleja compuesta de ARNr estructurales y catalíticos, y muchos polipéptidos distintos. In eukaryotes, the nucleolus is completely specialized for the synthesis and assembly of rRNAs.

Ribosomes are located in the cytoplasm in prokaryotes and in the cytoplasm and endoplasmic reticulum of eukaryotes. Ribosomes are made up of a large and a small subunit that come together for translation. The small subunit is responsible for binding the mRNA template, whereas the large subunit sequentially binds tRNAs, a type of RNA molecule that brings amino acids to the growing chain of the polypeptide. Each mRNA molecule is simultaneously translated by many ribosomes, all synthesizing protein in the same direction.

Depending on the species, 40 to 60 types of tRNA exist in the cytoplasm. Sirviendo como adaptadores, los ARNt específicos se unen a secuencias en la plantilla de ARNm y agregan el aminoácido correspondiente a la cadena polipeptídica. Therefore, tRNAs are the molecules that actually “translate” the language of RNA into the language of proteins. For each tRNA to function, it must have its specific amino acid bonded to it. In the process of tRNA “charging,” each tRNA molecule is bonded to its correct amino acid.

The Genetic Code

To summarize what we know to this point, the cellular process of transcription generates messenger RNA (mRNA), a mobile molecular copy of one or more genes with an alphabet of A, C, G, and uracil (U). La traducción de la plantilla de ARNm convierte la información genética basada en nucleótidos en un producto proteico. Protein sequences consist of 20 commonly occurring amino acids therefore, it can be said that the protein alphabet consists of 20 letters. Each amino acid is defined by a three-nucleotide sequence called the triplet codon. The relationship between a nucleotide codon and its corresponding amino acid is called the codigo genetico.

Given the different numbers of “letters” in the mRNA and protein “alphabets,” combinations of nucleotides corresponded to single amino acids. Using a three-nucleotide code means that there are a total of 64 (4 × 4 × 4) possible combinations therefore, a given amino acid is encoded by more than one nucleotide triplet ([link]).

Tres de los 64 codones terminan la síntesis de proteínas y liberan el polipéptido de la maquinaria de traducción. Estos trillizos se llaman codones de parada. Otro codón, AUG, también tiene una función especial. Además de especificar el aminoácido metionina, también sirve como codón de inicio para iniciar la traducción. El marco de lectura para la traducción lo establece el codón de inicio AUG cerca del extremo 5 'del ARNm. The genetic code is universal. With a few exceptions, virtually all species use the same genetic code for protein synthesis, which is powerful evidence that all life on Earth shares a common origin.

The Mechanism of Protein Synthesis

Just as with mRNA synthesis, protein synthesis can be divided into three phases: initiation, elongation, and termination. The process of translation is similar in prokaryotes and eukaryotes. Here we will explore how translation occurs in E. coli, a representative prokaryote, and specify any differences between prokaryotic and eukaryotic translation.

Protein synthesis begins with the formation of an initiation complex. En E. coli, this complex involves the small ribosome subunit, the mRNA template, three initiation factors, and a special initiator tRNA. The initiator tRNA interacts with the AUG start codon, and links to a special form of the amino acid methionine that is typically removed from the polypeptide after translation is complete.

In prokaryotes and eukaryotes, the basics of polypeptide elongation are the same, so we will review elongation from the perspective of E. coli. The large ribosomal subunit of E. coli consists of three compartments: the A site binds incoming charged tRNAs (tRNAs with their attached specific amino acids). The P site binds charged tRNAs carrying amino acids that have formed bonds with the growing polypeptide chain but have not yet dissociated from their corresponding tRNA. The E site releases dissociated tRNAs so they can be recharged with free amino acids. The ribosome shifts one codon at a time, catalyzing each process that occurs in the three sites. With each step, a charged tRNA enters the complex, the polypeptide becomes one amino acid longer, and an uncharged tRNA departs. The energy for each bond between amino acids is derived from GTP, a molecule similar to ATP ([link]). Amazingly, the E. coli translation apparatus takes only 0.05 seconds to add each amino acid, meaning that a 200-amino acid polypeptide could be translated in just 10 seconds.

Termination of translation occurs when a stop codon (UAA, UAG, or UGA) is encountered. When the ribosome encounters the stop codon, the growing polypeptide is released and the ribosome subunits dissociate and leave the mRNA. After many ribosomes have completed translation, the mRNA is degraded so the nucleotides can be reused in another transcription reaction.

Transcriba un gen y traduzcalo en proteína mediante el emparejamiento complementario y el código genético de este sitio.

Resumen de la sección

The central dogma describes the flow of genetic information in the cell from genes to mRNA to proteins. Genes are used to make mRNA by the process of transcription mRNA is used to synthesize proteins by the process of translation. The genetic code is the correspondence between the three-nucleotide mRNA codon and an amino acid. The genetic code is “translated” by the tRNA molecules, which associate a specific codon with a specific amino acid. The genetic code is degenerate because 64 triplet codons in mRNA specify only 20 amino acids and three stop codons. This means that more than one codon corresponds to an amino acid. Almost every species on the planet uses the same genetic code.

The players in translation include the mRNA template, ribosomes, tRNAs, and various enzymatic factors. The small ribosomal subunit binds to the mRNA template. Translation begins at the initiating AUG on the mRNA. The formation of bonds occurs between sequential amino acids specified by the mRNA template according to the genetic code. The ribosome accepts charged tRNAs, and as it steps along the mRNA, it catalyzes bonding between the new amino acid and the end of the growing polypeptide. The entire mRNA is translated in three-nucleotide “steps” of the ribosome. When a stop codon is encountered, a release factor binds and dissociates the components and frees the new protein.


Translation / Protein Synthesis

Protein synthesis is the process where cells create proteins.

Explicación:

There are two steps in protein synthesis. They are transcription and translation.

During transcription, mRNA (Messenger RNA) is formed in the nucleus of the cell. After mRNA has been made, it leaves the nucleus and goes to the ribosomes in the cytoplasm, where translation occurs. (DNA never leaves the nucleus.)

During translation, mRNA attaches itself to the ribosome. Then, tRNA (Transfer RNA) reads the mRNA codons (a codon is a sequence of three nucleotides that code for a protein) and attaches amino acids accordingly. This continues until tRNA reaches a stop codon.

Respuesta:

Codons are three letter genetic words: and the language of genes use 4 letters (=nitrogenous bases). Hence 64 words are there in genetic dictionary, to represent 20 amino acids that the biological organisms use.

Explicación:

And you must note that more than one codon may code for the same amino acid. Esto se conoce como degeneración of the code.

For example, three amino acids are coded by any of six different codons, and that alone uses up 18 of the 64 combinations.

Three of the codons are codones de parada.

They do not code for any amino acid.

Instead, they act as signals to end the genetic message carried by messenger RNA .

The number of amino acids coded by codons is

#1 " codon" × color(white)(l)2 " amino acids" = color(white)(ll)2 " codons"#
#2 " codons" × 9 " amino acids" = 18 " codons"#
#3 " codons" × 1 " amino acid" = color(white)(X)3 " codons"#
#4 " codons" × 5 " amino acids" = 20 " codons"#
#6 " codons" × 3 " amino acids" = 18 " codons"#
#color(white)(XXXXXXXXXXXXXXXX)3" stop codons"#
#stackrel(—————————————————————————)(color(white)(XXXXXXXXXl)"TOTAL" = 64 " codons")#

Here's a chart that gives the codon assignments for the amino acids.

Respuesta:

Translation occurs when ribosomes use information from RNA to build proteins.

Explicación:

Translation is the second phase of protein synthesis. It follows transcription, in which the information in DNA is "rewritten" into mRNA. During translation, the mRNA attaches to a ribosome. Transfer RNA (tRNA) molecules then "read" the mRNA code and translate the message into a sequence of amino acids. Every three nucleotides in the mRNA make up one codon, which corresponds to one amino acid in the resulting protein. The ribosome tracks along the mRNA until it reaches a stop codon, signaling the assembly of mRNA and ribosome to break apart.

Below is a stop-motion Vine video that summarizes the steps of translation.

The video below provides a summary of how the processes of transcription and translation occur using the Shockwave tutorial DNA Workshop from PBS.


The Protein Synthesis Machinery

In addition to the mRNA template, many other molecules contribute to the process of translation. However, the general structures and functions of the protein synthesis machinery are comparable from bacteria to human cells. Translation requires the input of an mRNA template, ribosomes, tRNAs, and various enzymatic factors (Figura 6).

Figura 6: The protein synthesis machinery includes the large and small subunits of the ribosome, mRNA, and tRNA. (crédito: modificación del trabajo por NIGMS, NIH)

Ribosomas are the part of the cell which reads the information in the mRNA molecule and joins amino acids together in the correct order. En E. coli, there are 200,000 ribosomes present in every cell at any given time. A ribosome is a very large, complex macromolecule. Ribosomes are located in the cytoplasm in prokaryotes and in the cytoplasm and endoplasmic reticulum of eukaryotes. Ribosomes are made up of two subunits that come together for translation, rather like a hamburger bun comes together around the meat (the mRNA). The small subunit is responsible for binding the mRNA template, whereas the large subunit sequentially binds tRNAs, a type of RNA molecule that brings amino acids to the growing chain of the polypeptide. Each mRNA molecule can be simultaneously translated by many ribosomes, all synthesizing protein in the same direction.

Depending on the species, 40 to 60 types of ARNt exist in the cytoplasm. Sirviendo como adaptadores, los ARNt específicos se unen a secuencias en la plantilla de ARNm y agregan el aminoácido correspondiente a la cadena polipeptídica. Therefore, tRNAs are the molecules that actually “translate” the language of RNA into the language of proteins. For each tRNA to function, it must have its specific amino acid bonded to it. In the process of tRNA “charging,” each tRNA molecule is bonded to its correct amino acid.

Figure 7: Translation begins when a tRNA anticodon recognizes a codon on the mRNA. The large ribosomal subunit joins the small subunit, and a second tRNA is recruited. As the mRNA moves relative to the ribosome, the polypeptide chain is formed. Entry of a release factor into the A site terminates translation and the components dissociate.


Ver el vídeo: Traducción de ARNm a las proteínas. Biología. Khan Academy en Español (Agosto 2022).