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6.4A: Enriquecimiento y aislamiento - Biología


Objetivos de aprendizaje

  • Enumere las fases de crecimiento de los microorganismos y los diferentes tipos de medios de crecimiento disponibles para cultivarlos.

Los medios de crecimiento más comunes para los microorganismos son los caldos nutritivos y las placas de agar; se requieren medios especializados para algunos microorganismos. Algunos, denominados fastidioso organismos, requieren entornos especializados debido a los complejos requisitos nutricionales. Los virus, por ejemplo, son parásitos intracelulares obligados y requieren un medio de crecimiento que contenga células vivas.

Medios de crecimiento: definidos frente a indefinidos

Una distinción importante entre los tipos de medios de crecimiento es la de medios definidos frente a medios no definidos.

Un medio definido tendrá cantidades conocidas de todos los ingredientes. Para los microorganismos, esto consiste en proporcionar oligoelementos y vitaminas requeridas por el microbio, y especialmente, una fuente definida tanto de carbono como de nitrógeno. La glucosa o el glicerol se utilizan a menudo como fuentes de carbono y las sales o nitratos de amonio como fuentes de nitrógeno inorgánico.

Un medio indefinido tiene algunos ingredientes complejos, como el extracto de levadura o el hidrolizado de caseína, que consisten en una mezcla de muchas, muchas especies químicas en proporciones desconocidas. A veces, los medios no definidos se eligen en función del precio y, a veces, por necesidad; algunos microorganismos nunca se han cultivado en medios definidos.

Tipos de medios

Los medios enriquecidos contienen los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de organismos, incluidos algunos de los más exigentes. Se utilizan comúnmente para recolectar tantos tipos diferentes de microbios como estén presentes en la muestra. El agar sangre es un medio enriquecido en el que la sangre entera rica en nutrientes complementa los nutrientes básicos. El agar chocolate está enriquecido con sangre tratada térmicamente (40-45 ° C), que se vuelve marrón y le da al medio el color que le da nombre.

Los medios selectivos se utilizan para el crecimiento de solo microorganismos seleccionados. Por ejemplo, si un microorganismo es resistente a un determinado antibiótico, como ampicilinao tetraciclina, luego se puede agregar ese antibiótico al medio para evitar que otras células, que no poseen la resistencia, crezcan. Los genetistas solían utilizar medios que carecían de un aminoácido, como la prolina junto con E. coli incapaz de sintetizarlo, antes de la aparición de la genómica para mapear los cromosomas bacterianos.

Los medios diferenciales / indicadores distinguen un tipo de microorganismo de otro que crece en el mismo medio. Este tipo de medio utiliza las características bioquímicas de un microorganismo que crece en presencia de nutrientes o indicadores específicos (como rojo neutro, rojo fenol, eosina o azul de metileno) añadidos al medio para indicar visiblemente las características definitorias de un microorganismo. Este tipo de medio se utiliza para la detección de microorganismos y por los biólogos moleculares para detectar cepas recombinantes de bacterias. El agar hierro con triple azúcar (TSI) es uno de los medios de cultivo utilizados para la diferenciación de la mayoría de las enterobacterias.

El crecimiento en sistemas de cultivo cerrados, como un cultivo por lotes en caldo LB, donde no se agregan nutrientes adicionales y no se eliminan los productos de desecho, el crecimiento bacteriano seguirá una curva de crecimiento prevista y se puede modelar.

Fases de crecimiento

Durante la fase de retraso, las bacterias se adaptan a las condiciones de crecimiento. Es el período en el que las bacterias individuales están madurando y aún no pueden dividirse. Durante la fase de retraso del ciclo de crecimiento bacteriano, se produce la síntesis de ARN, enzimas y otras moléculas.

La fase exponencial (a veces llamada fase logarítmica o logarítmica) es un período caracterizado por la duplicación de células. El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la población actual. En condiciones controladas, las cianobacterias pueden duplicar su población cuatro veces al día. Sin embargo, el crecimiento exponencial no puede continuar indefinidamente porque el medio pronto se agota de nutrientes y se enriquece con desechos.

La fase estacionaria se debe a un factor limitante del crecimiento; esto es principalmente el agotamiento de un nutriente y / o la formación de productos inhibidores como los ácidos orgánicos.

En la fase de muerte, las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.

Cultura

El cultivo por lotes es el método de crecimiento de laboratorio más común en el que se estudia el crecimiento bacteriano, pero es solo uno de muchos. El cultivo bacteriano se incuba en un recipiente cerrado con un solo lote de medio.

En algunos regímenes experimentales, parte del cultivo bacteriano se retira periódicamente y se agrega a un medio estéril nuevo. En el caso extremo, esto conduce a la renovación continua de los nutrientes. Esto es un quimiostato, también conocido como cultivo abierto o continuo: un estado estable definido por las tasas de suministro de nutrientes y crecimiento bacteriano. En comparación con el cultivo por lotes, las bacterias se mantienen en una fase de crecimiento exponencial y se conoce la tasa de crecimiento de las bacterias. Los dispositivos relacionados incluyen turbidostatos y auxostatos. El crecimiento bacteriano se puede suprimir con bacteriostáticos, sin necesariamente matar las bacterias.

En una cultura sinecológica, una situación natural en la que está presente más de una especie bacteriana, el crecimiento de microbios es más dinámico y continuo.

Puntos clave

  • Los medios de crecimiento más comunes para los microorganismos son los caldos nutritivos y las placas de agar.
  • Los cultivos abiertos permiten la reposición de nutrientes y una reducción de la acumulación de desechos en el medio.
  • Los medios selectivos se utilizan para el crecimiento de solo microorganismos seleccionados.
  • Los medios diferenciales o medios indicadores distinguen un tipo de microorganismo de otro que crece en el mismo medio.

Términos clave

  • cultura cerrada: Un cultivo cerrado no tiene nutrientes adicionales agregados al sistema y los productos de desecho no se eliminan. Los cultivos en un sistema cerrado seguirán una curva de crecimiento prevista.
  • Medios enriquecidos: Contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de organismos.
  • cultura abierta: Un cultivo continuo en el que periódicamente se extrae parte del cultivo bacteriano y se agrega a un medio estéril nuevo.

Enfoques recientes en la producción de nuevas enzimas a partir de muestras ambientales mediante cultivo de enriquecimiento y enfoque metagenómico

19.2 Producción de nuevas enzimas a partir de muestras ambientales mediante cultivo de enriquecimiento

El cultivo de enriquecimiento es básicamente una técnica de aislamiento diseñada para hacer que las condiciones de crecimiento sean muy favorables para un organismo de interés y al mismo tiempo tener un entorno desfavorable para cualquier competencia. Es el uso de ciertos medios de crecimiento para favorecer el crecimiento de un microorganismo en particular sobre otros, enriqueciendo una muestra para el microorganismo de interés. Este enriquecimiento se realiza generalmente mediante la introducción de nutrientes o condiciones ambientales que solo permiten el crecimiento de un organismo de interés. Se utilizan técnicas de cultivo de enriquecimiento para aumentar un pequeño número de los organismos deseados a niveles detectables. Esto permite la detección e identificación de microorganismos con una variedad de necesidades nutricionales (Liu et al., 2016). El cultivo de enriquecimiento se emplea a menudo para aislar especies microbianas de interés del suelo y los hábitats marinos. El cultivo de enriquecimiento incluye dos métodos dependiendo del tipo de medio utilizado: uno es sumergido (medio líquido), que es fácil de controlar y optimizar los parámetros ambientales y nutricionales, y el otro es la fermentación en estado sólido en la que se utilizan materias sólidas (crudas o procesadas) se utilizan como sustratos (Mahitha y Madhuri, 2016). La producción de nuevas enzimas dependientes del enriquecimiento en el método de fermentación líquida comúnmente implica la utilización de parámetros físicos como temperatura, pH, tiempo de incubación, condiciones estáticas y de agitación y / o propiedades químicas como fuentes de carbono y nitrógeno y concentración de sustrato e inóculo como factores determinantes para la aislamientos productores de enzimas, lo que brinda la oportunidad de crecer y proliferar solo las especies que se adaptan al factor físico y / o químico determinante (Shah y Patel, 2014). Si el caso es la utilización de medios sólidos, ciertos factores no tienen influencia ya que no se mantienen como estática y agitación del medio de fermentación, y algunos factores nuevos entran en juego como el tipo de sustrato (crudo o procesado) (Figs. 19.1 y 19.2). .

Figura 19.1. (A) Actividad de despolimerasa indicada por la formación de una zona de halo alrededor de la colonia utilizando plástico como fuente de nutrientes al final de la séptima semana. (B) Actividad de despolimerasa en muestra purificada al final de 1 semana de incubación.

Figura 19.2. Purificación de la enzima asparaginasa mediante cromatografía de filtración en gel.

La técnica de cultivo de enriquecimiento emplea principalmente sustratos que son económicos (las semillas de Jambul se procesan por enzimas como despolimerasa, glutaminasa, asparaginasa y efluente de destilería de bagazo: asparaginasa de desechos lácteos de suero y desechos de alimentos fermentados para la fibroquinasa) ya que el proceso general de aislamiento debe ser económico y repetible hasta la especie objetivo está aislada (Siddiqui et al., 2015 Vijayaraghavan et al., 2017). La técnica de enriquecimiento también difiere en el procedimiento de aislamiento basado en el tipo de enzima como extracelular o intracelular en la naturaleza si es extracelular, la presencia de un sustrato soluble es un método universalmente utilizado ya que da la indicación de la actividad enzimática a través del desarrollo de halo o zona clara que es fácil de distinguir cuando se compara con intracelular donde a menudo requiere la destrucción de la célula, la adición de múltiples reactivos y la adición separada de sustrato o sustrato secundario para evaluar si la actividad diana está presente o no. El método de enriquecimiento de aislamiento fue una técnica poderosa que se utilizó en muchas aplicaciones como el enriquecimiento selectivo, imitando el hábitat para enriquecer microbios de hábitats extremos en la búsqueda de muchos metabolitos, antibióticos y enzimas que son cruciales en muchos sectores. La efectividad prospectiva de los métodos se multiplicó muchas veces al agregar características como la optimización del método de selección, innovaciones en la tecnología de fermentación y modificaciones secundarias de los organismos seleccionados inicialmente. La funcionalidad del compuesto activo final también se puede mejorar aumentando la pureza del compuesto mediante precipitación con sulfato de amonio, diálisis y separación cromatográfica junto con la determinación del peso molecular usando el método SDS-PAGE. Pero, dicho esto, la desventaja fundamental que conlleva es la dependencia del método de la cultivabilidad del microorganismo que se está estudiando, lamentablemente, solo una fracción (& lt 1%) de la diversidad microbiana total en un hábitat dado es cultivable, dejando de lado el resto. estando enderezado (Fig. 19.3).

Figura 19.3. Caracterización de la enzima azoreductasa purificada mediante zimograma SDS-PAGE.


Enriquecimiento dirigido CRISPR-Cas9 sin amplificación y secuenciación SMRT de las regiones genómicas causantes de la enfermedad de repetición y expansión

La secuenciación dirigida ha demostrado ser un medio económico de obtener información de secuencia para una o más regiones definidas de un genoma más grande. Sin embargo, la mayoría de los métodos de enriquecimiento de diana requieren amplificación. Algunas regiones genómicas, como las que tienen un contenido de GC extremo y secuencias repetitivas, son recalcitrantes a una amplificación fiel. Sin embargo, muchos trastornos genéticos humanos son causados ​​por expansiones repetidas, incluida la dificultad de secuenciar repeticiones en tándem.

Hemos desarrollado una técnica de enriquecimiento novedosa y sin amplificación que emplea el sistema CRISPR-Cas9 para la focalización específica en múltiples loci genómicos. Este método, junto con lecturas largas generadas mediante secuenciación de molécula única en tiempo real (SMRT) y cobertura imparcial, permite el enriquecimiento y la secuenciación de regiones genómicas complejas que no se pueden investigar con otras tecnologías. Utilizando muestras de ADN genómico humano, demostramos la focalización exitosa de los loci causantes de la enfermedad de Huntington (HTT Repetición CAG), síndrome de X frágil (FMR1 Repetición CGG), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y demencia frontotemporal (C9orf72 Repetición GGGGCC) y ataxia espinocerebelosa tipo 10 (SCA10) (ATXN10 repetición variable ATTCT). El método, susceptible de multiplexación a través de múltiples loci genómicos, utiliza un enfoque sin amplificación que facilita el aislamiento de cientos de moléculas individuales en el objetivo en una sola célula SMRT y una secuenciación precisa a través de largos tramos de repetición, independientemente del porcentaje extremo de GC o la complejidad de la secuencia. contenido. Nuestro novedoso método de secuenciación dirigida abre nuevas puertas a los análisis genómicos independientes de la amplificación por PCR que facilitarán el estudio de los trastornos de expansión repetidos.


Kits de ProteoExtract ®

Los kits ProteoExtract ® cubren los diferentes pasos en la preparación de muestras proteómicas, desde la extracción de proteínas y la eliminación abundante de proteínas hasta la concentración de mezclas de proteínas, la eliminación de sustancias interferentes, la digestión de proteínas, la captura selectiva de péptidos fosforilados y el enriquecimiento selectivo para clases de proteínas específicas. Todos los kits son compatibles entre sí.

  • Extracción de proteínas eficiente y reproducible
  • Los cócteles de inhibidores de proteasa mejoran los resultados en los análisis posteriores
  • Mejor resolución de manchas facilitada por la digestión de ácidos nucleicos con nucleasa Benzonase® libre de proteasas
  • Diseñado para ser compatible con muchas aplicaciones, incluidos ensayos de actividad, transferencias Western, PAGE 1D y 2D y espectrometría de masas.
  • Protocolos optimizados para diferentes muestras biológicas

Consejos para evitar el aislamiento

Durante las edades de 20 a 30, es posible que experimente una "crisis de un cuarto de vida". Muchos adultos jóvenes todavía están averiguando quiénes quieren ser y qué quieren hacer con sus vidas. Las relaciones íntimas pueden ayudarlo a apoyarlo mientras continúa explorando su identidad. Si encuentra que está aislado, tómese un tiempo para evaluar por qué y cómo puede acercarse más a las personas en su vida:

Habla ahora con las personas de tu círculo sobre las relaciones y las expectativas. Las conversaciones abiertas y honestas son el primer paso para una relación más cercana.

Si alguien no te brinda las cosas que necesitas en una amistad, considera priorizar tu tiempo en personas que te apreciarán más.

¿Necesitas ampliar tu círculo? Únase a reuniones o grupos de personas que comparten sus intereses. ¡No tengas miedo de acercarte o programar una reunión por tu cuenta!

Comuníquese con un terapeuta de relaciones. Los problemas de etapas anteriores pueden dejarlo con desconfianza, culpa o sentimientos de inferioridad. Esto puede tener un impacto grave en su capacidad para ser vulnerable con los demás y formar parte de un grupo. Un terapeuta de relaciones puede ayudarlo a desentrañar estas experiencias pasadas y seguir adelante.


Aislamiento de mutantes microbianos: 4 técnicas | Microbiología

Los siguientes puntos destacan las cuatro técnicas principales utilizadas para el aislamiento de mutantes microbianos. Las técnicas son: 1. Observación directa 2. Técnica de enriquecimiento 3. Técnica de réplica de placas 4. La prueba de Ames.

1. Técnica de observación directa:

En algunos casos, una colonia que crece en una placa de agar puede verse fácilmente como diferente del tipo parental normal (tipo salvaje). Por ejemplo, si la cepa parental está pigmentada, la observación de colonias no pigmentadas puede indicar la presencia de mutantes. También se pueden incorporar indicadores al medio para detectar microorganismos con y sin capacidades metabólicas particulares.

Por ejemplo, los indicadores de pH se pueden utilizar en el medio para detectar la producción de productos ácidos. La indicación de producción de ácido por una cepa microbiana y no por otro de los mismos microorganismos que crecen en condiciones idénticas mostraría la presencia de un mutante.

2. Técnica de enriquecimiento:

La técnica de enriquecimiento se emplea especialmente para aislar mutantes resistentes a fagos, antibióticos o productos químicos tóxicos. Los mutantes resistentes a fagos pueden aislarse simplemente colocando la población microbiana mutagenizada expresada fenotípicamente en placas que contienen partículas de fagos.

Las células que expresan el fenotipo de tipo salvaje parental se destruyen y sólo los mutantes resistentes a fagos se convierten en colonias. Estas colonias están aisladas. De manera similar, los mutantes resistentes a un antibiótico o una sustancia química tóxica pueden aislarse colocando en placa la población microbiana con el antibiótico o la sustancia química.

3. Técnica de réplica de placas:

La técnica de placa de réplica se usa a menudo para aislar mutantes nutricionales (auxótrofos) así como otros tipos de mutantes, por ejemplo, mutantes resistentes a antibióticos.

Por conveniencia, si uno desea aislar mutantes nutricionales empleando técnicas de replicación en placas (figura 29.13), debe seguir los siguientes pasos:

(i) Los cultivos bacterianos se diluyen y las células se extienden sobre la superficie de un medio de agar nutritivo semisólido en una placa Petri (denominada & # 8220 placa maestra & # 8221). El medio en la placa maestra es un medio completo, es decir, que contiene todos los componentes nutricionales requeridos por la población bacteriana. Después de un período de incubación suficiente, cada bacteria produce una colonia visible en la superficie del agar en la placa maestra.

(ii) Se extiende un trozo de tela de terciopelo estéril sobre un bloque cilíndrico de madera o metal que tiene un diámetro ligeramente más pequeño que las placas de Petri utilizadas en el proceso.

(iii) La placa maestra ahora se invierte y se presiona suavemente sobre terciopelo estéril. Dado que las fibras del terciopelo actúan como una fina aguja de inoculación, algunas células de cada colonia de la placa maestra se adhieren al terciopelo.

(iv) Se toma otra placa de Petri (llamada & # 8220 placa de réplica & # 8221) que contiene un medio mínimo, es decir, un medio deficiente con un componente nutricional específico,

(v) La placa de réplica se invierte ahora y se presiona suavemente sobre el terciopelo, estampando así las células bacterianas en la superficie de su medio mínimo. La placa réplica está orientada idénticamente a la aplicación sobre el terciopelo con respecto a la marca colocada en su borde de modo que las colonias que aparecen en la placa réplica después de la incubación ocupen posiciones congruentes con las de sus hermanos en la placa maestra.

(vi) Después de una incubación suficiente, se observa que una colonia que se desarrolla en el medio completo de la placa maestra no se desarrolla en el medio mínimo de la placa maestra que carece de un componente nutricional específico. Dicha colonia está marcada en la placa maestra y se aísla; representa un mutante para ese componente nutricional específico que no se usa en el medio mínimo de la placa de réplica.

La técnica de placas de réplica fue desarrollada por Joshua y Esther Lederberg en 1952 con el fin de proporcionar evidencia directa de la existencia de mutaciones preexistentes originadas espontáneamente en microorganismos.

4. La prueba de Ames:

Esta prueba fue desarrollada por Ames y colaboradores y se basa en mutantes auxotróficos de Salmonella typhimurium que requieren histidina (his & # 8211). Diferentes mutantes his & # 8211 llevan diferentes tipos de mutaciones, es decir, transiciones, transversiones y cambios de marco.

En la prueba de Ames, la frecuencia de reversión a su + (prototrofia) se puntúa en los mutantes his & # 8211 especialmente construidos. Esto se hace colocando un número conocido de células mutantes en un medio que carece de histidina y puntuando el número de colonias formadas. La frecuencia de las células que forman colonias da la frecuencia de reversión. La frecuencia de reversión espontánea a su + es bastante rara, es decir, 10 -8.

La prueba de Ames se utiliza habitualmente para investigar la mutagenicidad de varios productos químicos. Algunas de las sustancias químicas pueden volverse mutagénicas solo cuando las enzimas hepáticas actúan sobre ellas.

Por ejemplo, los nitratos en sí mismos no son mutagénicos ni cancerígenos. Pero en las células eucariotas, los nitratos se convierten en introsaminas, que son altamente mutagénicas y cancerígenas. Además, algunos productos químicos pueden ser mutagénicos solo para replicar el ADN.

La prueba de rutina de Ames aborda ambas necesidades de la siguiente manera:

1. Las células his & # 8211 se siembran en un medio que contiene trazas de histidina, que es suficiente para permitir algunas divisiones celulares, pero inadecuado para la formación de colonias visibles.

2. La sustancia problema se incuba con extracto de hígado de rata que contiene las enzimas hepáticas, es decir, la fracción microsomal. Esto permite la modificación de la sustancia química de la misma manera que lo haría en el hígado de los animales.

El procedimiento de la prueba de Ames es el siguiente. Las células bacterianas his & # 8211 se incuban con el extracto de hígado y luego se siembran en un medio que contiene trazas de histidina que sirve como placa de control.

Las placas de prueba contienen el mismo medio pero las células his & # 8211 no se tratan con extracto de hígado. La sustancia problema se trata con extracto de hígado de rata y se empapa un disco de papel de filtro en esta solución. El disco de papel de filtro se coloca en el medio de la placa de prueba (Fig. 29.14).

La sustancia química presente en el papel de filtro actúa sobre las células his & # 8211 que crecen en la placa de prueba. Se comparan la frecuencia de colonias formadas en la placa de control y la placa de prueba. Un aumento de la frecuencia en el caso de la placa de ensayo indicará que la sustancia problema es mutagénica.

Para aumentar la eficiencia de la prueba, las cepas his & # 8211 utilizadas en la prueba son defectuosas en la reparación del ADN y tienen una mayor permeabilidad a los productos químicos. Se ha observado que más del 90% de las sustancias químicas mutagénicas también son cancerígenas.


Protocolo de enriquecimiento de ARNm, excluyendo ARNm de Globina, de ARN total de sangre total

Este protocolo describe el enriquecimiento de ARNm de poli (A) seguido de ARNm de globina y agotamiento de ARNr amp (Sección 1 y 2). El ARN enriquecido contiene solo ARNm (excluida la globina) y no ARN no codificante. El ARN enriquecido se utiliza luego como entrada para la preparación de la biblioteca de ARN direccional para secuenciar en un instrumento Illumina (Sección 3).

Este protocolo requiere los siguientes productos NEBNext:

  • Módulo de aislamiento magnético de ARNm poli (A) NEBNext (NEB # E7490)
  • NEBNext Kit de reducción de globina y ARNr (humano / ratón / rata) con perlas de purificación de muestras de ARN (NEB # E7755)
  • Preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina con perlas de purificación de muestras (NEB # E7765)

Requisitos de las muestras de ARN

Integridad del ARN:
Evalúe el tamaño y la calidad del ARN de entrada ejecutando la muestra de ARN en un chip Nano / Pico Agilent Bioanalyzer RNA 6000 para determinar el número de integridad del ARN (RIN). Para el enriquecimiento de ARNm de poli (A), se requiere ARN de alta calidad con RIN Score & gt7.

Muestra de ARN:
La muestra de ARN debe estar libre de sales (p. Ej., Mg 2+ o sales de guanidinio) u orgánicos (p. Ej., Fenol y etanol). El ARN debe estar libre de ADN. El ADNg es un contaminante común en las preparaciones de ARN. Puede ser transferido de la interfase de extracciones orgánicas o cuando la matriz de sílice de los métodos de purificación de ARN en fase sólida está sobrecargada. Si la muestra de ARN total puede contener contaminación de ADNg, trate la muestra con DNasa I (no incluida en este kit) para eliminar todos los rastros de ADN. Después del tratamiento, la DNasa I debe eliminarse de la muestra. Cualquier ADNasa I residual puede degradar los oligos necesarios para el enriquecimiento.

Cantidad de entrada:

Este protocolo ha sido probado con 100 ng de ARN total de sangre humana (sin ADN) en un máximo de 50 & microlitros de agua libre de nucleasas, cuantificado mediante un método fluorométrico asistido por colorante específico de ARN (Qubit & reg) y calidad verificada por Bioanalyzer .

Mantenga todos los tampones en hielo, a menos que se indique lo contrario.

1.0. Enriquecimiento de ARNm de poli (A) mediante el módulo de aislamiento magnético de ARNm de poli (A) NEBNext (NEB # E7490)

1.1. Diluir el ARN total con agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 50 µl en un tubo de PCR de 0,2 ml sin nucleasas y mantener en hielo.

1.2. Para lavar las perlas de Oligo (dT), agregue los componentes de la tabla siguiente a un tubo sin nucleasas de 1,5 ml. Si prepara múltiples bibliotecas, se pueden agregar perlas para hasta 10 muestras a un solo tubo de 1,5 ml para lavados posteriores (use el imán NEB # S1506 para tubos de 1,5 ml). El propósito de este paso es llevar las perlas del tampón de almacenamiento al tampón de unión. No es necesario diluir el tampón de unión 2X para este paso.

NEBNext RNA Binding Buffer (2X)

Volumen total

1.3. Lave las perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces.

1.4. Coloque el tubo sobre el imán e incube a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

1.5. Retire y deseche todo el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no alterar las cuentas.

1.6. Retire el tubo de la rejilla magnética.

1.7. Agregue 100 & mul RNA Binding Buffer (2X) a las perlas y lávelas pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces. Si prepara múltiples bibliotecas, agregue 100 & microlitros de tampón de unión de ARN (2X) por muestra. El Binding Buffer no tiene que diluirse.

1.8. Coloque los tubos en el imán e incube a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

1.9. Retire y deseche el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no alterar las cuentas.

1.10. Agregue 50 & mul RNA Binding Buffer (2X) a las perlas y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta que las perlas sean homogéneas. Si prepara múltiples bibliotecas, agregue 50 & mul RNA Binding Buffer (2X) por muestra.

1,11. Agregue 50 & mul perlas a cada muestra de ARN del paso 1.1. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo seis veces. Este paso de unión elimina la mayor parte del ARN no objetivo.

1.12. Coloque el tubo en un termociclador y cierre la tapa. Calentar la muestra a 65 ° C durante 5 minutos y enfriar a 4 ° C con la tapa térmica ajustada a & ge 75 & degC. Este paso desnaturalizará el ARN y facilitará la unión del ARNm a las perlas.

1,13. Retire el tubo del termociclador cuando la temperatura alcance los 4 ° C.

1,14. Mezcle bien pipeteando arriba y abajo seis veces. Coloque el tubo en la mesa e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que el ARNm se una a las perlas.

1,15. Coloque el tubo en la rejilla magnética a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

1,16. Retire y deseche todo el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las cuentas.

1,17. Retire el tubo de la rejilla magnética.

1,18. Para eliminar el ARN no unido, agregue 200 µl de tampón de lavado al tubo. Pipetee suavemente todo el volumen hacia arriba y hacia abajo 6 veces para mezclar bien.

1.19 Gire el tubo hacia abajo brevemente para recoger el líquido de la pared y la tapa del tubo.

Nota: Es importante girar el tubo hacia abajo para evitar el arrastre del tampón de lavado en los pasos siguientes.

1.20. Coloque el tubo en la rejilla magnética a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

1,21. Retire y deseche todo el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no alterar las perlas que contienen el ARNm.

1,22. Retire el tubo de la rejilla magnética.

1,24. Agregue 11 & mul de agua libre de nucleasas a cada tubo. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo 6 veces para mezclar bien.

1,25. Coloque el tubo en el termociclador. Cierre la tapa y caliente las muestras a 80 ° C durante 2 minutos, luego enfriar a 25 ° C con la tapa calentada fijada a & ge 90 & degC para eluir el ARNm de las perlas.

1,26. Retire el tubo del termociclador cuando la temperatura alcance los 25 ° C.

1.27 Coloque inmediatamente el tubo sobre el imán a temperatura ambiente hasta que la solución sea transparente (

1,28. Recolecte el ARNm purificado transfiriendo 10 & mul del sobrenadante a un tubo de PCR limpio sin nucleasas.

1,29. Coloque el ARN en hielo y proceda a la Depleción de Globina y ARNr en la Sección 2.

2.0. Agotamiento de globina y rRNA con el kit de agotamiento de rRNA y globina NEBNext (NEB # E7750 / E7755)

2.1 Hibridación de sonda a ARN

2.1.2. Reúna la siguiente reacción de hibridación de ARN / sonda en hielo:

REACCIÓN DE HIBRIDACIÓN DE ARN / SONDA

(blanco) ARNm en agua sin nucleasas (Paso 1.29)

(blanco) NEBNext Solución de agotamiento de globina y ARNr

(blanco) NEBNext Probe Hybridization Buffer

Volumen total

2.1.3. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Nota: Es crucial mezclar bien en este paso.

2.1.4. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga para recoger el líquido del costado del tubo.

2.1.5. Coloque el tubo en un termociclador precalentado y ejecute el siguiente programa con la tapa calentada a 105 ° C. Este programa tardará aproximadamente entre 15 y 20 minutos en completarse:

2.1.6. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga y colóquelo en hielo. Proceder inmediatamente a la digestión con RNasa H.

2.2. Digestión de RNasa H

2.2.1. Reúna la siguiente reacción de digestión de RNasa H en hielo:

(blanco) NEBNext Thermostable RNase H

(blanco) Tampón de reacción de ARNasa H

Volumen total

2.2.2. Mezcle bien pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

2.2.3. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga.

2.2.4. Incube el tubo en un termociclador precalentado durante 30 minutos a 50 ° C con la tapa puesta a 55 ° C.

2.2.5. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga y colóquelo en hielo. Proceder inmediatamente a la digestión de DNasa I.

2.3. Digestión de DNasa I

2.3.1. Reúna la siguiente reacción de digestión de DNasa I en hielo:

REACCIÓN DE DIGESTIÓN DNASE I

ARN tratado con RNasa H (paso 1.2.5)

(blanco) Tampón de reacción de DNasa I

(blanco) NEB Next DNase I

Volumen total

2.3.2. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

2.3.3. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga.

2.3.4. Incube el tubo en un termociclador precalentado durante 30 minutos a 37 ° C con la tapa puesta a 40 ° C o apagada.

2.3.5. Gire brevemente hacia abajo el tubo en una microcentrífuga y colóquelo en hielo. Proceda inmediatamente al paso de purificación de ARN.

2.4. Purificación de ARN con microesferas Agencourt RNAClean XP o microesferas de purificación de muestras de ARN NEBNext

2.4.1. Agite en el vórtex las microesferas Agencourt RNAClean XP o las microesferas de purificación de muestras de ARN NEBNext para resuspender.

2.4.2. Agregue cuentas de 90 & mul (1.8X) a la muestra de ARN del paso 2.3.5 y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.

2.4.3. Incube el tubo durante 15 minutos en hielo para unir el ARN a las perlas.

2.4.4. Coloque el tubo en una rejilla magnética para separar las perlas del sobrenadante.

2.4.5. Una vez que la solución esté clara, retire con cuidado y deseche el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las perlas que contienen el ARN.

2.4.6. Agregue 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado al tubo mientras está en la rejilla magnética. Incubar a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego retirar con cuidado y desechar el sobrenadante. Tenga cuidado de no alterar las perlas, que contienen el ARN.

2.4.7. Repita el paso 2.4.6 una vez para un total de dos lavados.

2.4.8. Retire completamente el etanol residual y seque al aire las perlas durante un máximo de 5 minutos mientras el tubo está en la rejilla magnética con la tapa abierta.

Precaución: No seque demasiado las perlas. Esto puede resultar en una menor recuperación del ARN objetivo. Eluir las muestras cuando las perlas todavía sean de color marrón oscuro y de aspecto brillante, pero cuando todo el líquido visible se haya evaporado. Cuando las perlas se vuelven de color marrón más claro y comienzan a agrietarse, están demasiado secas.

2.4.9. Retire el tubo de la rejilla magnética. Eluir el ARN de las perlas agregando 7 & mul de agua libre de nucleasas. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces y haga girar brevemente el tubo.

2.4.10. Incube el tubo durante 2 minutos a temperatura ambiente.

2.4.11. Coloque el tubo en la rejilla magnética hasta que la solución sea transparente (

2.4.12. Retire 5 & microlitros del sobrenadante que contiene ARN y transfiera a un tubo libre de nucleasas.

2.4.13. Coloque el tubo en hielo y proceda con la construcción de la biblioteca RNA-Seq (protocolo a continuación) u otra aplicación posterior. Alternativamente, la muestra se puede almacenar a -80 ° C.

Nota: El siguiente paso proporciona un tiempo de incubación de fragmentación que da como resultado un inserto de ARN de

200nt. Consulte el Apéndice (Sección 4 del Manual de preparación de bibliotecas de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina) para conocer las condiciones de fragmentación si está preparando bibliotecas con inserciones grandes (& gt200 bp).

3.1.3. Incube la muestra durante 15 minutos a 94& gradosC en un termociclador con la tapa calentada a 105 ° C.

3.1.4. Transfiera inmediatamente el tubo a hielo durante 1 minuto.

3.1.5 Realice un giro rápido para recoger todo el líquido de los lados del tubo y continúe con la síntesis de ADNc de la primera hebra.

3.2. Síntesis de ADNc de la primera hebra

3.2.1. Ensamble la reacción de síntesis de la primera hebra en hielo agregando los siguientes componentes al fragmentado
y ARN cebado del Paso 3.1.5:

REACCIÓN DE SÍNTESIS DE LA PRIMERA HILA

ARN fragmentado y cebado (paso 3.1.5)

(marrón) NEBNext Strand Especificidad Reactivo

(lila) NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix

Volumen total

3.2.2. Mezcle bien pipeteando arriba y abajo 10 veces.

3.2.3. Incubate the sample in a preheated thermocycler with the heated lid set at &ge 80°C as follows:

Note: If you are following recommendations in Section 4 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual for libraries with longer inserts (>200 bases), increase the incubation at 42°C from 15 minutes to 50 minutes at Step 2 below.

3.2.4. Proceed directly to Second Strand cDNA Synthesis.

3.3. Second Strand cDNA Synthesis

3.3.1. Assemble the second strand cDNA synthesis reaction on ice by adding the following components into the first strand synthesis product from Step 3.2.4.

SECOND STRAND SYNTHESIS REACTION

First-Strand Synthesis Product (Step 3.2.4)

(orange) NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer
with dUTP Mix (10X)

(orange) NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix

Total Volume

3.3.2. Keeping the tube on ice, mix thoroughly by pipetting up and down at least 10 times.

3.3.3. Incubate in a thermocycler for 1 hour at 16°C with the heated lid set at &le 40°C (or off).

3.4. Purification of Double-stranded cDNA Using SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads

3.4.1. Vortex SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads to resuspend.

3.4.2. Add 144 &mul (1.8X) of resuspended beads to the second strand synthesis reaction (

80 &mul). Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

3.4.3. Incubate for 5 minutes at room temperature.

3.4.4. Briefly spin the tube in a microcentrifuge to collect any sample on the sides of the tube. Place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear, carefully remove and discard the supernatant. Be careful not to disturb the beads, which contain DNA. Caution: do not discard beads.

3.4.5. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

3.4.6. Repeat Step 3.4.5 once for a total of 2 washing steps.

3.4.7. Air dry the beads for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with lid open.

Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

3.4.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute the DNA from the beads by adding 53 &mul 0.1X TE Buffer (provided) to the beads. Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times. Quickly spin the tube and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube on the magnetic rack until the solution is clear.

3.4.9. Remove 50 µl of the supernatant and transfer to a clean nuclease-free PCR tube.

Note: If you need to stop at this point in the protocol samples can be stored at &ndash20°C.

3.5. End Prep of cDNA Library

3.5.1. Assemble the End Prep reaction on ice by adding the following components to the second strand synthesis product from
Step 3.4.9.

Second Strand cDNA Synthesis Product (Step 3.4.9)

(green) NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer

(green) NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix

Total Volume

If a master mix is made, add 10 µl of master mix to 50 µl of cDNA for the End Prep reaction.

3.5.2. Set a 100 &mul or 200 &mul pipette to 50 &mul and then pipette the entire volume up and down at least 10 times to mix thoroughly. Perform a quick spin to collect all liquid from the sides of the tube.

Note: It is important to mix well. The presence of a small amount of bubbles will not interfere with performance.

3.5.3. Incubate the sample in a thermocycler with the heated lid set at &ge 75°C as follows.

3.5.4. Proceed immediately to Adaptor Ligation.

3.6. Adaptor Ligation

Note: If you are selecting for libraries with larger insert size (>200 nt) follow the size selection recommendations in Appendix, Section 4 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual.

3.7.1. Add 87 &mul (0.9X) resuspended SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads and mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

3.7.2. Incubate for 10 minutes at room temperature.

3.7.3. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (

5 minutes), discard the supernatant that contains unwanted fragments. Caution: do not discard beads.

3.7.4. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

3.7.5. Repeat Step 3.7.4 once for a total of 2 washing steps.

3.7.6. Briefly spin the tube and put the tube back in the magnetic rack.

3.7.7. Completely remove the residual ethanol, and air-dry beads until the beads are dry for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

3.7.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute DNA target from the beads by adding 17 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex or by pipetting up and down. Quickly spin the tube and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnet until the solution is clear.

3.7.9. Without disturbing the bead pellet, transfer 15 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and proceed to PCR enrichment.

Note: If you need to stop at this point in the protocol, samples can be stored at &ndash20°C.

3.8. PCR Enrichment of Adaptor Ligated DNA

Check and verify that the concentration of your oligos is 10 &muM on the label.

Use Option A for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in tubes. These kits have the forward and reverse primers supplied in separate tubes.

Use Option B for any NEBNext Oligos kit where index primers are supplied in a 96-well plate format. These kits have the forward and reverse primers (i7 and i5) combined.

3.8.1. Set up the PCR reaction as described below based on the type of oligos (PCR primers) used.

3.8.1A. Forward and Reverse Primers Separate

Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

(blue) NEBNext Ultra II Q5 ® Master Mix

Universal PCR Primer/i5 Primer*,**

Total Volume

* NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
for determining valid barcode combinations.

** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample.

3.8.1B. Forward and Reverse Primers Combined

Adaptor Ligated DNA (Step 2.11.9)

(blue) NEBNext Ultra II Q5 Master Mix

Index (X) Primer/i7 Primer Mix*

Total Volume

* NEBNext Oligos must be purchased separately from the library prep kit. Refer to the corresponding NEBNext Oligo kit manual
for determining valid barcode combinations.

** Use only one i7 primer/ index primer per sample. Use only one i5 primer (or the universal primer for single index kits) per sample

3.8.2. Mix well by gently pipetting up and down 10 times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge.

3.8.3. Place the tube on a thermocycler with the heated lid set to 105°C and perform PCR amplification using the following PCR cycling conditions (refer to Table 3.8.3A and Table 3.8.3B):

* The number of PCR cycles should be adjusted based on RNA input.

** It is important to limit the number of PCR cycles to avoid overamplification.
If overamplification occurs, a second peak

1,000 bp will appear on the Bioanalyzer trace (See Figure 5.2 of the NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep for Illumina Manual).

Table 3.8.3B: Recommended PCR cycles based on total RNA input amount:

* The PCR cycles are recommended based on high quality human whole blood total RNA. To prevent over-amplification, the number of cycles may require optimization based on the sample quality and the fraction of globin mRNA. For RNA where globin mRNA is > than 50% of the transcripts (once rRNA is removed), follow the higher cycle recommendation for that input.

3.9. Purification of the PCR Reaction using SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads

3.9.1. Vortex SPRIselect Beads or NEBNext Sample Purification Beads to resuspend.

3.9.2. Add 45 &mul (0.9X) of resuspended beads to the PCR reaction (

50 &mul). Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down at least 10 times.

3.9.3. Incubate for 5 minutes at room temperature.

3.9.4. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and place the tube on a magnetic rack to separate beads from the supernatant. After the solution is clear (about 5 minutes), carefully remove and discard the supernatant. Be careful not to disturb the beads that contain DNA targets. Caution: do not discard beads.

3.9.5. Add 200 &mul of freshly prepared 80% ethanol to the tube while in the magnetic rack. Incubate at room temperature for 30 seconds, and then carefully remove and discard the supernatant.

3.9.6. Repeat Step 3.9.5 once for a total of 2 washing steps.

3.9.7. Air dry the beads for up to 5 minutes while the tube is on the magnetic rack with the lid open.

Caution: Do not over-dry the beads. This may result in lower recovery of DNA target. Elute the samples when the beads are still dark brown and glossy looking, but when all visible liquid has evaporated. When the beads turn lighter brown and start to crack they are too dry.

3.9.8. Remove the tube from the magnetic rack. Elute the DNA target from the beads by adding 23 &mul 0.1X TE (provided) to the beads. Mix well on a vortex mixer or by pipetting up and down ten times. Quickly spin the tube in a microcentrifuge and incubate for 2 minutes at room temperature. Place the tube in the magnetic rack until the solution is clear.

3.9.9. Transfer 20 &mul of the supernatant to a clean PCR tube and store at &ndash20°C.

3.10. Library Quantification

3.10.1. Use a Bioanalyzer or TapeStation to determine the size distribution and concentration of the libraries.

3.10.2. Check that the electropherogram shows a narrow distribution with a peak size approximately 300 bp.

80 bp (primers) or 128 bp (adaptor-dimer) is visible in the bioanalyzer traces, bring up the sample volume (from Step 3.9.9) to 50 &mul with 0.1X TE buffer and repeat the SPRIselect Bead or NEBNext Sample Purification Bead Cleanup Step (Section 3.9).

Figure 3.9.1 Example of RNA library size distribution on a Bioanalyzer.


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Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4 Engineering Drive 3, Block E4, #04-08, Singapore 117583, Singapore

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