Información

Clase 13: Lectura de información en el genoma: transcripción, traducción y procesos postraduccionales - Biología


Clase 13: Lectura de información en el genoma: transcripción, traducción y procesos postraduccionales

Regulación postraduccional de la transición materno-cigótica

La transición de la madre al cigótico (MZT) es esencial para el control del desarrollo que se pasa de los productos maternos al genoma cigótico recién sintetizado en las primeras etapas de la embriogénesis, incluida la degradación del componente materno (ARNm y proteínas) y la activación del genoma cigótico (ZGA). Se han identificado varias modificaciones postraduccionales de proteínas durante la MZT, tales como fosforilación, metilación y ubiquitinación. Los mecanismos precisos de regulación postraduccional son esenciales para la transición oportuna del desarrollo embrionario temprano. En esta revisión, resumimos el progreso reciente con respecto a los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación postraduccional de la degradación del componente materno y ZGA durante el MZT y discutimos algunos temas importantes en el campo.

Esta es una vista previa del contenido de la suscripción, acceda a través de su institución.


Abstracto

Los análisis a escala del genoma nos han permitido avanzar más allá del estudio de la expresión génica a nivel de componentes individuales de un proceso dado al proporcionar información global sobre las conexiones funcionales entre genes, ARNm y sus proteínas reguladoras. Dichos análisis han aumentado en gran medida nuestra comprensión de la interacción entre diferentes eventos en la regulación de genes y han resaltado conexiones funcionales que antes no se apreciaban, incluido el acoplamiento entre procesos nucleares y citoplasmáticos. Los enfoques de todo el genoma también han revelado una amplia coordinación dentro de los niveles reguladores, como la organización de factores de transcripción en motivos reguladores. En general, estos estudios mejoran nuestra comprensión de cómo los muchos componentes de la célula eucariota funcionan como un sistema que permite tanto la coordinación como la versatilidad en la expresión génica.


Control de la expresión genética en eucariotas

Las células eucariotas tienen mecanismos similares para el control de la expresión génica, pero son más complejas. Considere, por ejemplo, que las células procariotas de una especie determinada son todas iguales, pero la mayoría de los eucariotas son organismos multicelulares con muchos tipos de células, por lo que el control de la expresión génica es mucho más complicado. No es sorprendente que la expresión génica en células eucariotas esté controlada por una serie de procesos complejos que se resumen en la siguiente lista.

  • Después de la fertilización, las células del embrión en desarrollo se vuelven cada vez más especializadas, en gran parte activando algunos genes y desactivando muchos otros. Algunas células del páncreas, por ejemplo, están especializadas para sintetizar y secretar enzimas digestivas, mientras que otras células pancreáticas (células & # 946 en los islotes de Langerhans) están especializadas para sintetizar y secretar insulina. Cada tipo de célula tiene un patrón particular de genes expresados. Esta diferenciación en células especializadas se produce en gran parte como resultado de la desactivación de la expresión de la mayoría de los genes en la célula. Es posible que las células maduras solo utilicen entre un 3 y un 5% de los genes presentes en el núcleo de la célula.
  • La expresión génica en eucariotas también puede regularse mediante alteraciones en el empaquetamiento del ADN, que modula el acceso de las enzimas de transcripción de la célula (p. Ej., ARN polimerasa) al ADN. La siguiente ilustración muestra que los cromosomas tienen una estructura compleja. La hélice de ADN se envuelve alrededor de proteínas especiales llamadas histonas, y estas se envuelven en fibras helicoidales apretadas. Luego, estas fibras se enrollan y doblan en estructuras cada vez más compactas que, cuando están completamente enrolladas y condensadas, dan a los cromosomas su aspecto característico en metafase.

  • De manera similar a los operones descritos anteriormente para los procariotas, los eucariotas también usan proteínas reguladoras para controlar la transcripción, pero cada gen eucariota tiene su propio conjunto de controles. Además, hay muchos más proteínas reguladoras en eucariotas y las interacciones son mucho más complejas.
  • En eucariotas, la transcripción tiene lugar dentro del núcleo unido a la membrana y la transcripción inicial se modifica antes de ser transportada desde el núcleo al citoplasma para su traducción en los ribosomas. La transcripción inicial en eucariotas tiene segmentos codificantes (exones) que se alternan con segmentos no codificantes (intrones). Antes de que el ARNm abandone el núcleo, los intrones se eliminan de la transcripción mediante un proceso llamado empalme de ARN (vea el gráfico y el video a continuación), y se agregan nucleótidos adicionales a los extremos de la transcripción, estas `` tapas '' y `` colas '' no codificantes protegen al ARNm de ataque por enzimas celulares y ayuda en el reconocimiento por los ribosomas.

  • La variación en la longevidad del ARNm brinda otra oportunidad más para el control de la expresión génica. El ARNm procariota tiene una vida muy corta, pero las transcripciones eucariotas pueden durar horas o, a veces, incluso semanas (p. Ej., ARNm para la hemoglobina en los glóbulos rojos de las aves).
  • El proceso de traducción ofrece oportunidades adicionales para la regulación de muchas proteínas. Por ejemplo, la traducción del ARNm de hemoglobina se inhibe a menos que haya hemo que contenga hierro en la célula.
  • También existen oportunidades para controles postraduccionales de la expresión génica en eucariotas. Algunos polipéptidos (proteínas) traducidos son cortados por enzimas en productos finales activos más pequeños. como se ilustra en la figura siguiente, que muestra el procesamiento postraduccional de la hormona insulina. La insulina se traduce inicialmente como un precursor grande e inactivo, se elimina una secuencia señal de la cabeza del precursor y se corta una gran parte central (la cadena C), dejando dos cadenas peptídicas más pequeñas que luego se unen entre sí por puentes disulfuro. La forma final más pequeña es la forma activa de insulina.
  • La expresión génica también puede modificarse mediante la degradación de las proteínas que se producen. Por ejemplo, algunas de las enzimas involucradas en el metabolismo celular se descomponen poco después de su producción, lo que proporciona un mecanismo para responder rápidamente a las demandas metabólicas cambiantes.
  • La expresión génica también puede verse influenciada por señales de otras células. Hay muchos ejemplos en los que una molécula señal (p. Ej., Una hormona) de una célula se une a una proteína receptora en una célula diana e inicia una secuencia de cambios bioquímicos (una vía de transducción de señales) que resultan en cambios dentro de la célula diana. Estos cambios pueden incluir una transcripción aumentada o disminuida, como se ilustra en la figura siguiente.

  • El sistema de interferencia de ARN (ARNi) es otro mecanismo por el cual las células controlan la expresión génica interrumpiendo la traducción del ARNm. El ARNi también se puede utilizar para detener la traducción de proteínas virales cuando una célula está infectada por un virus. El sistema RNAi también tiene el potencial de ser explotado terapéuticamente.

Algunos virus de ARN invadirán las células e introducirán ARN de doble hebra que utilizará la maquinaria celular para hacer nuevas copias de ARN viral y proteínas virales. El sistema de interferencia de ARN de la célula (ARNi) puede evitar que el ARN viral se replique. Primero, una enzima apodada "Dicer" corta cualquier ARN bicatenario que encuentre en trozos de aproximadamente 22 nucleótidos de largo. A continuación, los complejos de proteínas llamados RISC (complejo silenciador inducido por ARN) se unen a los fragmentos de ARN de doble hebra, lo enrollan y luego liberan una de las hebras, mientras retienen la otra. El complejo RISC-ARN luego se unirá a cualquier otro ARN viral con secuencias de nucleótidos que coincidan con las del ARN unido al complejo. Esta unión bloquea la traducción de proteínas virales al menos parcialmente, si no completamente. El sistema RNAi podría potencialmente usarse para desarrollar tratamientos para genes defectuosos que causan enfermedades. El tratamiento implicaría hacer un ARN de doble hebra a partir del gen enfermo e introducirlo en las células para silenciar la expresión de ese gen. Para obtener una explicación ilustrada de RNAi, consulte el breve módulo interactivo de Flash en http://www.pbs.org/wgbh/nova/body/rnai-explained.html

El sistema de interferencia de ARN también se explica de manera más completa en el siguiente video de Nature Video.

Contenido & # 1692018. Reservados todos los derechos.
Fecha de última modificación: 2 de febrero de 2018.
Creado por Wayne W. LaMorte, MD, PhD, MPH,


Clase 13: Lectura de información en el genoma: transcripción, traducción y procesos postraduccionales - Biología

Al igual que la transcripción, la traducción está controlada por proteínas que se unen e inician el proceso. En la traducción, antes de que pueda comenzar la síntesis de proteínas, debe completarse el ensamblaje de los ribosomas. Este es un proceso de varios pasos.

En el ensamblaje de ribosomas, las subunidades ribosómicas grandes y pequeñas y un ARNt iniciador (ARNtI) que contienen el primer aminoácido de la cadena polipeptídica final, todos se juntan en el codón de inicio de la traducción en un ARNm para permitir que comience la traducción. Primero, la pequeña subunidad ribosómica se une al ARNtI que transporta metionina en eucariotas y arqueas y transporta N-formil-metionina en bacterias. (Porque el tRNAI lleva un aminoácido, se dice que está cargado.) A continuación, la subunidad ribosómica pequeña con el ARNt cargadoI exploraciones aún enlazadas a lo largo de la cadena de ARNm hasta que alcanza el codón de inicio AUG, que indica dónde comenzará la traducción. El codón de inicio también establece el marco de lectura para la cadena de ARNm, que es crucial para sintetizar la secuencia correcta de aminoácidos. Un cambio en el marco de lectura da como resultado una mala traducción del ARNm. El anticodón del ARNtI luego se une al codón de inicio a través del emparejamiento de bases. El complejo que consta de ARNm, ARNt cargadoI, y la subunidad ribosómica pequeña se une a la subunidad ribosómica grande, que completa el ensamblaje del ribosoma. Estos componentes se unen con la ayuda de proteínas llamadas factores de iniciación que se unen a la pequeña subunidad ribosómica durante la iniciación y se encuentran en los tres dominios de la vida. Además, la célula gasta energía GTP para ayudar a formar el complejo de iniciación. Una vez que se completa el ensamblaje del ribosoma, el ARNt cargadoI se coloca en el sitio P del ribosoma y el sitio A vacío está listo para el siguiente aminoacil-tRNA. La síntesis de polipéptidos comienza y siempre avanza desde el N-terminal al C-terminal, llamado dirección N-a-C.

En eucariotas, varias proteínas del factor de iniciación eucariotas (eIF) ayudan en el ensamblaje de los ribosomas. El factor de iniciación eucariota-2 (eIF-2) es activo cuando se une al trifosfato de guanosina (GTP). Con GTP unido a él, la proteína eIF-2 se une a la pequeña subunidad ribosómica 40S. A continuación, el tRNA inicial cargado con metionina (Met-tRNAI) se asocia con el complejo de ribosoma GTP-eIF-2 / 40S, y una vez que todos estos componentes se unen entre sí, se denominan colectivamente complejo 43S.

Los factores de iniciación eucariotas eIF1, eIF3, eIF4 y eIF5 ayudan a traducir el complejo 43S a la tapa 5 & # 8242-m 7 G de un ARNm. Una vez unido al mRNA & # 8217s 5 & # 8242 m 7 G cap, el complejo 43S comienza a viajar por el mRNA hasta que alcanza el codón de iniciación AUG al comienzo del marco de lectura del mRNA & # 8217s. Las secuencias alrededor del AUG pueden ayudar a garantizar que se utilice el AUG correcto como codón de iniciación en el ARNm.

Una vez que el complejo 43S está en el AUG de iniciación, el tRNAi-Met se coloca sobre el AUG. El anticodón del ARNtI-Combina pares de bases con el codón AUG. En este punto, el GTP unido a eIF2 en el complejo 43S se hidroliza a GDP + fosfato y se libera energía. Esta energía se utiliza para liberar el eIF2 (con GDP unido a él) del complejo 43S, dejando la subunidad ribosómica 40S y el tRNA.I-Se encuentra en el sitio de inicio de la traducción del ARNm.

A continuación, eIF5 con GTP unido se une a la subunidad ribosómica 40S complejada con el ARNm y el ARNt.I-Reunió. El eIF5-GTP permite que la subunidad ribosómica grande 60S se una. Una vez que llega la subunidad ribosómica 60S, eIF5 hidroliza su GTP unido a GDP + fosfato y se libera energía. Esta energía impulsa el ensamblaje de las dos subunidades ribosómicas en el ribosoma 80S intacto, con tRNAi-Met en su sitio P mientras que también se empareja con el codón de iniciación AUG en el mRNA. La traducción está lista para comenzar.

La unión de eIF-2 a la subunidad ribosómica 40S está controlada por fosforilación. Si eIF-2 está fosforilado, sufre un cambio conformacional y no puede unirse a GTP. Por lo tanto, el complejo 43S no se puede formar correctamente y se impide la traducción. Cuando eIF-2 permanece sin fosforilar, se une a la subunidad ribosómica 40S y traduce activamente la proteína.

Complejo de iniciación a la traducción: La expresión génica puede controlarse mediante factores que se unen al complejo de iniciación de la traducción.

La capacidad de ensamblar completamente el ribosoma afecta directamente la velocidad a la que se produce la traducción. Pero la síntesis de proteínas también está regulada en varios otros niveles, incluida la síntesis de ARNm, la síntesis de ARNt, la síntesis de ARNr y la síntesis del factor de iniciación eucariota. La alteración en cualquiera de estos componentes afecta la velocidad a la que puede ocurrir la traducción.


Información del autor

Afiliaciones

Proteome Centre Tübingen, Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

Interacciones Organísmicas, Universidad de Tübingen, Tübingen, Alemania

Plataforma proteómica PISSARO, Universidad de Rouen, Rouen, Francia

Instituto de Biología Molecular y Biofísica, ETH Zurich, Zurich, Suiza

Laboratorio de Microbiología Molecular y Bioquímica Estructural, CNRS UMR 5086, Universidad de Lyon, Lyon, Francia

Sistemas y biología sintética, Universidad Tecnológica de Chalmers, Gotemburgo, Suecia

Centro de Biosostenibilidad de la Fundación Novo Nordisk, Universidad Técnica de Dinamarca, Kongens Lyngby, Dinamarca

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

Contribuciones

B.M. investigó datos para el artículo, diseñó el esquema y revisó y editó el manuscrito antes de su envío. B.M., K.F., J.H, E.W.-B., C.G. e I.M. contribuyeron sustancialmente a la discusión del contenido y escribieron el artículo.

Autor correspondiente


Fondo

Muchos aspectos de la investigación biológica moderna dependen de la identificación precisa de los genes codificadores de proteínas en cada genoma, así como de la naturaleza de los productos proteicos funcionales maduros, un proceso comúnmente conocido como anotación del genoma. Con el aumento exponencial en el número de genomas procarióticos secuenciados proporcionado por los avances en las tecnologías de secuenciación del genoma durante la última década, la anotación del genoma procariótico actual es esencialmente un proceso automatizado de alto rendimiento que se basa en gran medida en de novo programas de predicción genética [1-3].

Tiempo de novo Los programas de predicción de genes han mejorado significativamente para los genomas procariotas. Aún quedan desafíos considerables [4], como determinar el sitio preciso de inicio y parada de un gen, predecir con precisión genes cortos y determinar un codón de terminación que representa un aminoácido alternativo en lugar de una verdadera parada. sitio. A medida que se amplíen los esfuerzos para secuenciar más ramas del árbol de la vida, el nivel de precisión de los programas actuales de predicción de genes entrenados en conjuntos de datos de proteobacterias disminuirá notablemente, lo que conducirá a un aumento de las predicciones incorrectas de genes codificadores de proteínas [4]. Lo que agrava el problema es la falta de evidencia experimental en apoyo de las regiones codificantes de proteínas predichas para la inmensa mayoría de los genomas anotados. Cuando está disponible, la evidencia experimental se basa típicamente en secuencias de ARN expresadas, como las de experimentos de microarrays o RNA Seq. Sin embargo, estos análisis centrados en el genoma no determinan de forma independiente e inequívoca si un gen que codifica una proteína predicho se traduce en una proteína o, lo que es más importante, proporciona información confiable sobre el procesamiento postraduccional.

La proteómica ascendente ofrece la capacidad de medir directamente péptidos que surgen de proteínas expresadas que representan la mejor opción actual para identificar de forma independiente e inequívoca al menos un subconjunto importante de genes que codifican proteínas en un genoma y se puede utilizar para validar experimentalmente anotaciones de genes [4 -9]. En un enfoque de abajo hacia arriba, las proteínas dentro de una mezcla compleja se digieren típicamente con una proteasa, después de lo cual los péptidos resultantes se separan por métodos cromatográficos y luego se analizan usando espectrometría de masas en tándem (MS / MS) [10,11]. Cada espectro de MS / MS es una medida de las masas de los fragmentos, idealmente a partir de una única secuencia de péptidos de

6-50 aminoácidos. Este conjunto de valores de masa es análogo a una "huella dactilar" que identifica el péptido. La interpretación de los espectros de péptidos de MS / MS se logra 1) mediante el uso de algoritmos como X! Tandem [12], SEQUEST [13] o Mascot [14] para comparar las masas medidas con un conjunto de masas teóricas de posibles secuencias de proteínas o 2) con menos frecuencia, por de novo análisis, que no depende de un conocimiento previo de las posibles secuencias [15,16]. Similar a la búsqueda de espectros de MS / MS contra un conjunto de secuencias de proteínas predichas, también es posible (y factible para genomas simples) identificar los genes que codifican proteínas en un genoma mediante la búsqueda de espectros de MS / MS contra una traducción de seis marcos de la secuencia de ADN genómico, lo que excluye los sesgos inherentes derivados de los métodos de predicción de genes. Observamos que la ampliación a una base de datos exponencialmente más grande, como resultado de la traducción de seis marcos de una secuencia de ADN genómico, hace que las búsquedas sean más lentas en potencialmente órdenes de magnitud. Además, también da como resultado una mayor posibilidad de identificaciones falsas positivas, ya que la tasa de descubrimiento falso aumenta con el tamaño de la base de datos en aumento, lo que reduce en gran medida los desafíos de gemelos de sensibilidad que solo se pueden cumplir de manera factible con recursos informáticos dedicados / sofisticados que impiden el uso de rutina en la actualidad.

La proteómica ascendente también proporciona una vía para obtener información biológicamente relevante sobre modificaciones postraduccionales. Incluso para sistemas biológicos relativamente simples como los procariotas, los eventos de modificación postraduccional (PTM) se reconocen cada vez más como importantes, pero están mal caracterizados con respecto a los sitios o la función. Si bien la información de PTM obtenida de los conjuntos de datos de MS / MS a escala del genoma puede beneficiar la comprensión biológica de los organismos bacterianos, importantes desafíos tecnológicos dificultan la inclusión rutinaria de esta valiosa información en las anotaciones primarias. Esta situación se ejemplifica en un solo informe de conjuntos de datos de MS / MS a escala genómica que se utilizan para anotar de manera integral los eventos de modificaciones postraduccionales en una secuencia del genoma [17]. Sin embargo, la baja resolución de los conjuntos de datos MS / MS hace que la asignación de modificaciones, incluido fundamentalmente el sitio de modificación, sea menos segura y no sea adecuada para el uso de rutina. Por ejemplo, la diferencia de masa de 0,036 Dalton entre Gln (Q) y Lys (K) no se puede resolver en espectros MS / MS de baja resolución, lo que aumenta el número de posibles péptidos candidatos a emparejar y reduce la confianza en las asignaciones. Por otro lado, la precisión de secuenciación que ofrecen los espectros MS / MS de alta resolución puede resolver residuos con pequeñas diferencias de masa como Gln y Lys, lo que reduce el espacio de búsqueda y, por lo tanto, la carga computacional y aumenta la confianza en las asignaciones.

En este estudio, empleamos un enfoque de proteómica ascendente complementado con un método descrito recientemente. de novo Metodología de secuenciación que utiliza datos de MS / MS de alta resolución y alta precisión de medición de masas [18,19] para descubrir con precisión el panorama traslacional y las características postraduccionales del patógeno bacteriano. Salmonella enterica serovar Typhimurium (STM) 14028. Salmonela Typhimurium es una de las principales causas de gastroenteritis bacteriana y se utiliza ampliamente como modelo para investigar los mecanismos genéticos básicos, así como la interacción entre patógenos bacterianos y huéspedes mamíferos. A pesar de la relevancia clínica y científica básica de Salmonela Typhimurium no se ha realizado un análisis exhaustivo para proporcionar apoyo experimental de su en silicoanotación genómica basada en para facilitar el análisis a nivel de sistemas. Nuestros datos proporcionan una validación experimental a nivel de proteína para aproximadamente la mitad de los genes que codifican proteínas pronosticados en STM 14028 y sugieren revisiones de 47 genes asignados a sitios de inicio de traducción incorrectos, incluido un posible nuevo codón de inicio alternativo. Además, descubrimos 12 genes no anotados omitidos por los programas de predicción de genes, así como evidencia que sugiere un papel para uno de estos nuevos ORF en Salmonela Patogénesis. También caracterizamos las características postraduccionales en el genoma de STM 14028, incluidas las modificaciones químicas y las escisiones proteolíticas. Descubrimos que las bacterias tienen un repertorio de modificaciones químicas mucho más grande y complejo de lo que se pensaba anteriormente, incluidas varias modificaciones novedosas. Nuestro en vivo Los datos de proteólisis identificaron más de 130 eventos de escisión de péptidos señal y metionina N-terminal críticos para la función de las proteínas.

Al contrario de la abrumadora mayoría de los análisis de proteogenómica que utilizan datos de proteómica para mejorar la calidad y la integridad de los genomas anotados previamente, este estudio representa uno de los primeros en utilizar datos de proteómica "como parte de un proceso de anotación de alto rendimiento y en gran parte automatizado directamente en el etapa primaria de anotación del genoma "[20].


M 6 A modula el metabolismo del ARNm

norte La metilación de la 6-adenosina afecta a casi todas las etapas del metabolismo del ARNm, desde el procesamiento en el núcleo hasta la traducción y descomposición en el citoplasma. Se han identificado dos modos distintos de funcionamiento para los lectores m 6 A: lectura indirecta y lectura directa. La lectura indirecta implica alteraciones de m 6 A en las estructuras secundarias del ARN, lo que hace que el ARN sea accesible a un conjunto único de proteínas de unión al ARN (RBP). La lectura directa implica la unión selectiva de m 6 A a RBP con diversas funciones celulares (TABLA 1).

M 6 A altera el plegamiento y la estructura del ARN

El grupo metilo en el norteLa posición 6 de m 6 A no cambia el emparejamiento de bases de Watson & # x02013Crick A & # x02022U pero debilita el ARN dúplex hasta en 1,4 kcal por mol 68. En posiciones no apareadas, m 6 A se apila mejor que una base no modificada, estabilizando así las estructuras de ARN circundantes 69,70 o promoviendo el plegamiento de secuencias de ARN adyacentes 71. El mapeo de la estructura de ARN de todo el transcriptoma ha confirmado que las regiones de ARN metilado prefieren estructuras monocatenarias a estructuras bicatenarias 70, 72 & # x0201374. Además, un informe reciente reveló que m 6 A dentro de las regiones de codificación podría inducir restricciones estéricas que desestabilizan el emparejamiento entre codones y anticodones de tRNA, afectando así la dinámica de traducción 75.

Debido a estos efectos termodinámicos, la remodelación estructural provocada por m 6 A puede cambiar la accesibilidad de los motivos de interacción RBP al ARN, un fenómeno denominado interruptor m 6 A 67. La metilación de un motivo RRACH en una estructura de tallo en varios genes, por ejemplo, en la transcripción 1 de adenocarcinoma pulmonar asociado a metástasis (MALAT1) y CDP-diacilglicerol sintasa 2 (CDS2), provoca su desestabilización y la apertura del dúplex. A continuación, se expone un tracto en U monocatenario, que puede ser reconocido por HNRNPC para regular el corte y empalme de estos transcritos 67, 76 (Figura 2a). Los conmutadores m6A pueden estar muy extendidos a través del transcriptoma y, por lo tanto, pueden tener un papel importante en la mediación de interacciones entre el ARN y las RBP 67,76.

a| Después de ser depositado por los componentes catalíticos del núcleo de metiltransferasa de tipo metiltransferasa 3 (METTL3) y METTL14, norte La 6-metiladenosina (m 6 A) es reconocida por varias proteínas lectoras. En el núcleo, la ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (HNRNPC) funciona como un lector indirecto de m 6 A uniendo regiones de cambio de m 6 A no estructuradas y regulando el empalme, mientras que el dominio 1 de homología YT521-B (YTH) (YTHDC1) regula el empalme alternativo mediante uniendo m 6 A directamente y reclutando los factores de corte y empalme serina y el factor de corte y empalme rico en arginina 3 (SRSF3) mientras bloquea la unión por SRSF10. HNRNPA2B1 también media en el empalme alternativo de una manera similar a YTHDC1. En el citoplasma, YTHDF1 media el inicio de la traducción de las transcripciones que contienen m 6 A uniéndose directamente a m 6 A y reclutando el factor de iniciación eucariota 3 (eIF3), lo que facilita la carga de la subunidad ribosómica pequeña eucariota (40S). YTHDF2 promueve la desintegración del ARNm uniéndose a la subunidad 1 del complejo de transcripción CCR4 & # x02013NOT (CNOT1), lo que facilita el reclutamiento del complejo CCR4 & # x02013NOT e induce la desadenilación acelerada. B | Las proteínas lectoras pueden clasificar las transcripciones metiladas en una vía rápida (derecha) para su procesamiento, traducción y desintegración. Esta aceleración agrupa eficazmente las transcripciones con propiedades marcadamente diferentes para garantizar su traducción y degradación oportuna y coordinada, posiblemente generando un & # x02018pulso & # x02019 agudo de expresión génica para satisfacer la necesidad de ráfagas de traducción y la posterior eliminación de estas transcripciones.

M 6 A afecta la maduración del ARNm

El procesamiento de pre-mRNA a mRNA maduro consta de tres pasos principales: taponamiento 5 & # x02032, poliadenilación 3 & # x02032 y empalme. Se propuso inicialmente que m 6 A funcionara como un regulador de corte y empalme, ya que los primeros estudios encontraron que era más abundante en el pre-mRNA que en el mRNA maduro 77, con muchos sitios m 6 A concentrados en los intrones 78,79. Los ARNm que se someten a un empalme alternativo también tienen más sitios de unión a METTL3 y más norte Sitios de metilación de 6-adenosina 39,49. Los escritores y borradores de m 6 A se localizan predominantemente en motas nucleares 39,43,44,63, que son sitios de empalme y almacenamiento de ARNm. Los datos de PAR-CLIP (entrecruzamiento e inmunoprecipitación mejorados con ribonucleósidos fotoactivables) mostraron que la mayoría de los sitios de unión a METTL3 residen en los intrones 39, y el agotamiento de Mettl3 en células madre embrionarias de ratón (células madre embrionarias de ratón) generalmente favorece la omisión de exones y la retención de intrones 80. Estos resultados indican que el reclutamiento de METTL3 a pre-ARNm es un evento de cotranscripción, con metilación que puede preceder e influir en el corte y empalme. FTO también modula el empalme alternativo eliminando m 6 A alrededor de los sitios de empalme y evitando la unión del factor de empalme 2 rico en serina y arginina (SRSF2) 81. Los lectores m 6 A también afectan el empalme. YTHDC1 recluta SRSF3 mientras bloquea la unión por SRSF10, lo que conduce a la inclusión del exón 63 (Figura 2a). HNRNPA2B1 y HNRNPC también son reguladores de empalme activos 67,82,83. HNRNPA2B1 regula los eventos de empalme alternativo de manera similar a METTL3 (REF. 66), así como la biogénesis de microARN (miARN) a partir de secuencias intrónicas, que es un proceso estrechamente acoplado con el empalme 66,84 (Información complementaria S2 (recuadro)).

La poliadenilación alternativa (APA) se acopla al empalme del último intrón 85 y se asocia con el ARNm norte Metilación de 6-adenosina. Dos tercios de los sitios m 6 A en el último exón se encuentran en la UTR 3 & # x00374, donde residen los sitios APA 56, y la caída de los escritores m 6 A puede causar APA 56. Estudios recientes de isoformas de ARNm de APA han revelado que las isoformas con m 6 A tienden a utilizar sitios APA proximales y tienen UTR 3 & # x02032 más cortas en comparación con las isoformas 86 no metiladas. En conjunto, estos resultados demuestran que la metilación de m6A está íntimamente ligada al procesamiento temprano del ARNm.

M 6 A mejora el procesamiento nuclear y la exportación de ARNm

La exportación nuclear de ARNm es un proceso clave que conecta la transcripción y el procesamiento en el núcleo con la traducción en el citosol, y puede modular selectivamente la expresión génica 87. norte Se sugirió la metilación de 6-adenosina para promover la exportación de ARNm: agotamiento de METTL3 Inhibió la exportación de ARNm 88, mientras que el agotamiento de ALKBH5 aumento de la exportación de ARNm al citoplasma 44. Los detalles mecanicistas aún no se han informado, pero es concebible que los lectores nucleares tengan un papel activo en este proceso. Facilitar la exportación de ARNm al citoplasma podría ser un mecanismo importante por el cual m 6 A regula la expresión génica.

M 6 A promueve la traducción de ARNm

La traducción es promovida por norte Metilación de la 6-adenosina a través de varios mecanismos. YTHDF1 promueve globalmente la traducción de mRNA metilados en m 6 A uniendo mRNA modificado con m 6 A y reclutando factores de iniciación de la traducción, mejorando así significativamente la eficiencia de la traducción dependiente de la tapa 61. YTHDF1 no sólo acopla transcritos metilados con ribosomas, sino que también recluta el factor de iniciación eucariota del complejo 3 del factor de iniciación de la traducción (eIF3) (Figura 2a) para promover la etapa de limitación de la velocidad de traducción. Se demostró recientemente que METTL3 también funciona como un lector de m6A mejorando la traducción dependiente de eIF4E en un subconjunto específico de ARNm mediante el reclutamiento de eIF3 durante el inicio de la traducción 89. Este efecto fue independiente de su actividad metiltransferasa o de la ruta 89 de YTHDF1 & # x02013eIF3. Dos estudios recientes han indicado además que la presencia de m 6 A en el 5 & # x02032 UTR mejora la traducción independiente del casquete 52,90, y se propuso que eIF3 interactúe con m 6 A y facilite la carga de ribosomas 90. En conjunto, estos hallazgos sugieren varios mecanismos distintos mediante los cuales m 6 A promueve la traducción del ARNm.

M 6 A marca el ARNm para la desintegración

La descomposición es el paso final en el metabolismo del ARNm, durante el cual el ARNm se desestabiliza y degrada. m 6 A se ha relacionado con una estabilidad reducida del ARNm, ya que la METTL3 y METTL14 en células humanas y de ratón se ha demostrado que conduce a aumentos en la expresión de sus respectivos ARNm diana 37,38. Aunque la mayoría de los sitios m 6 A parecen acelerar la descomposición del ARNm, el impacto en el transcriptoma, incluidos los transcritos tanto metilados como no metilados, puede ser más complejo. Este razonamiento se debe a que muchos ARNm que codifican represores de la transcripción son sustratos diana del complejo de metiltransferasa, la metilación reducida de estas transcripciones podría causar represión de la transcripción.

Los estudios mecanicistas del lector citoplásmico de m 6 A YTHDF2 (REFS 49,60) proporcionaron la primera evidencia directa de una ruta de desintegración del ARNm dependiente de m 6 A 60. Similar a YTHDF1, YTHDF2 es una proteína de dos dominios: el dominio YTH carboxi-terminal se une selectivamente a las transcripciones metiladas, mientras que el dominio funcional amino-terminal entrega las transcripciones unidas a YTHDF2 a la maquinaria de desintegración del ARN citoplásmico para la degradación dedicada 60. El derribo de YTHDF2 prolongó la estabilidad de sus ARNm diana, lo que indica que promueve la descomposición del ARNm de norte Metilación de 6-adenosina. Se demostró que YTHDF2 se asocia con la subunidad 1 del complejo de transcripción CCR4 & # x02013NOT (CNOT1) 60, que facilita el reclutamiento del complejo CCR4 & # x02013NOT e induce la desadenilación acelerada del ARNm 91 unido a YTHDF2. La degradación dependiente de YTHDF2 de norte Los ARNm metilados de 6-adenosina representan un papel crucial para m 6 A, que está de acuerdo con el aumento de la expresión génica observada con la caída de los escritores de m 6 A 37,38.

Además, los sitios m 6 A unidos a YTHDF2 también pueden ser reconocidos por otros efectores de la estabilidad del ARNm, como la proteína de unión al ARN tipo ELAV 1 (ELAV1 también conocida como HuR) 38,92, los miARN 93 y el receptor tipo Toll ( TLR) miembros de proteínas de la familia TLR3 y TLR7 (REF.94). Teniendo en cuenta el papel propuesto de m 6 A en la biogénesis de miARN (información complementaria S2 (recuadro)), estas vías podrían cruzarse para controlar de manera cooperativa la estabilidad de los ARNm diana. La desintegración de las transcripciones metiladas parece ser un factor importante en la promoción de la diferenciación de células ES de ratón y en la facilitación de la embriogénesis de ratón 80. In summary, m 6 A generally functions as a destabilizer of mRNAs and facilitates the degradation of methylated transcripts in various biological contexts.

M 6 A sorts transcripts into a fast track for mRNA metabolism

The life cycle of mRNAs is regulated by transcriptional and post-transcriptional regulatory processes, including processing, export, translation and decay. Recent studies have revealed that m 6 A and its related factors influence each of these steps. As these processes are generally coupled, we propose that mediators of norte 6 -adenosine methylation may work in concert to shape the methylation pattern and protein binding of specific transcripts, thereby affecting their metabolism. One example of such cooperation is the co-regulation of translation and decay by YTHDF1 and YTHDF2 of their shared targets 61 . Both the translation efficiency and the degradation of these mRNAs are reduced by double knockdown of YTHDF1 and YTHDF2. The combined function of the YTHDF1-dependent translation promotion and YTHDF2-dependent decay may result in a spike in protein production 61 ( FIG. 2b ). This effect, along with other m 6 A-mediated effects such as accelerated export of certain methylated mRNA, suggests a critical function for m 6 A-based gene regulation: writers and erasers dictate the levels of target-specific m 6 A. In turn, readers decode these messages and may functionally sort methylated mRNAs into distinct functional groups. During cell differentiation and development, when the translation of groups of transcripts is accomplished within a short time span, methylation could sort these transcript groups into a fast track for processing, translation and decay. Methylation could be particularly beneficial in grouping and synchronizing the expression of hundreds to thousands of mRNAs that otherwise may possess markedly different properties with varied stabilities and translation efficiencies. Such a mechanism may also help in generating translation ‘pulses’ to satisfy the need for bursts of protein synthesis as well as rapid decay to regulate cell differentiation during early development ( FIG. 2b ).


Lecture 13: Reading information in the genome: transcription Translation and post-translational processes - Biology

C2006/F2402 '11 OUTLINE OF LECTURE # 12

(c) 20 11 Dr. Deborah Mowshowitz, Columbia University, New York, NY . Last update 03/02/2011 11:49 AM

Handouts: 12A -- procesamiento de ARNm
12B
-- Alternative processing of mRNA
12C
-- Signal Hypothesis -- Co-translational Import
12
D -- How proteins insert into ER membrane.

I. Wrap up TFs and Development -- What is the molecular basis of testes cell fate determination? See handout 11A, bottom.

1. Is master regulatory gene for Testes

2. Is expressed in Sertoli cells

3. Gene is on Y chromosome

B. What Sry turns on, either directly or indirectly:

2. Signaling molecules:

una. From Sertoli Cells -- Paracrines

-Paracrine that turns on enzymes for testosterone production in Leydig cells

B. From Leydig cells -- Testosterone (endocrine)


II. Overview of Regulation of Euk. Síntesis de proteínas

A. If cells make different proteins, how is that regulated? Is the difference due entirely to differences in transcription?

1. Transcription es different in different cells.

una. How could it be otherwise? It could be that all cells transcribe all genes, but only some RNA's are exported to the cytoplasm and the remaining nuclear RNAs are degraded. Este es no the case. Only selected genes are transcribed in each cell type, and RNA's from those genes are processed to make mRNA. (For an experiment that shows this, see figure 23-19 in Becker.)

B. A consequence -- cDNA libraries. cDNA = complementary DNA = DNA made in vitro by enzymes (including reverse transcriptase), from an mRNA template. Since mRNA is different in different tissues, you can get tissue specific sequences from a cDNA library. (cDNA library = collection of all cDNA's from a particular cell type.) DNA from each cell type is the same mRNA and therefore cDNA is not. See Becker fig. 23-20.

For a problem about DNA & cDNA libraries, see 14A-6.

2. Processing can be different: Splicing and processing of same primary transcripts can be different (in different cells or at different times). Different mRNA's (& therefore proteins) can be produced from the same transcript by alternative splicing and/or poly A addition. Details & example below.

B. How can amount of protein synthesized be controlled? If cell makes more or less protein, which step(s) are regulated?

1. In prokaryote (for comparison) -- process relatively simple.

una. Most regulation at transcription.

B. Translation in same compartment as transcription translation follows automatically.

C. Most mRNA has short half-life.

2. In eukaryote -- Gene expression has many more steps & complications than in prokaryotes -- more additional points of regulation -- not just at transcription. See Becker fig. 23-11 or Sadava fig. 16.13 (14.12).

una. Transcription is main point of control, but other steps are often regulated too.

B. Transcription & translation occur in separate compartments. Translation does not follow automatically.

(1). 2. Transcript must be processed (capped, spliced, polyadenylated, etc.) -- any of these steps can be regulated, and there is more than one way to process most primary transcripts.

(2). mRNA must be transported to cytoplasm.

(3). Translation can be regulated (independently of transcription) -- can control usage and/or fate of mRNA, not just supply of mRNA. For any particular mRNA, can regulate 1 or both of following:

(a). Rate of initiation -- can control how often ribosomes attach and start translation.

(b). Rate of degradation -- can control half life of mRNA.

C. Different eukaryotic mRNAs have different half-lives. Some mRNA's are long lived and some have a very short half life.

To review regulation, try Problems 4-11 & 4-12.


III. Post Translational Regulation. Don't forget: regulation occurs after translation too -- after proteins are made, their activity can be modulated. Many examples of post translational modification have already come up and more will be discussed later. Here is a summary (mostly review):

A. Covalent Modification. Proteins can be modified covalently either reversibly (for ex. by phosphorylation and dephosphorylation), or permanently (for ex. by removal of N-terminal met., addition of sugars -- glycosylation, etc.)

B. Noncovalent Modification. Proteins can be activated or inhibited by reversible noncovalent binding of other factors -- small molecule allosteric effectors, other proteins such as calmodulin (an important Ca 2+ binding protein to be discussed later), etc.

C. Degradation. Proteins can be selectively destroyed or 'turned over'.

1. Half Lives Vary. Not all proteins have the same half life.

2. Importancia: Important example of a family of proteins that all have a short half life = cyclins control progression through cell cycle. Different cyclins control transitions from G1 to S, G2 to M etc. Cyclins are made as needed and degraded immediately after use. (Note: Both mRNA's for cyclins and cyclins themselves are degraded after use. More on this when we cover the details of the cell cycle.)

D. Location. Proteins can activated or inhibited by a change of location. For example, transporters like GLUT4 only work if positioned in the plasma membrane if they are sequestered in vesicles they are inactive. Transport of glucose into the cell can be regulated by moving the GLUT4 in and out of the membrane.


IV. Processing of Eukaryotic mRNA transcripts Once transcription gets started, what does it take to get a functioning eukaryotic mRNA? All necessary details are included here and on handout, but splicing was discussed last term and will be covered only briefly in class.

A. Caps and poly A -- See handout 12A.

Most eukaryotic transcripts that will be used as mRNA must be modified on both ends (as well as spliced) before they can be transported to the cytoplasm and used for translation. A "cap" is usually added to the 5' end and a "poly A tail" to the 3' end. The steps involved are shown on handout 12A. (Numbers below match steps on handout.)

(1) Beginning of transcription.

una. The start of transcription is usually indicated by a bent arrow.

B. The boxed areas of the DNA = exons plain DNA between them = intron.

una. A modified G is added to the 5' end of the transcript shortly after transcription begins, while the transcript is still being made.

B. The G is added "backwards" so there is a 5' to 5' connection. (For the curious: The structure of the cap and how it is connected to the transcript is shown in your texts see fig. Becker 21-18.)

C. The cap is represented on the handout as a filled circle.

(3) Transcription continues to or slightly beyond the end of the gene or transcription unit.

una. There may be no fixed stop for transcription in eukaryotes (for production of most mRNA) the addition of poly A (see below) may determine the exact 3' end of the transcript.

B. Most but not all eukaryote mRNA's contain poly A.

C. Reminder: in eukaryotes production of rRNA & tRNA are carried out by different RNA polymerases which have somewhat different properties. these RNA's do not have poly A. (For details see texts.)

una. A poly A tail -- a string of A's a few hundred long -- is added to the 3' end of the RNA.

B. Growth of AA. is 5' to 3' using ATP, enzyme, and splitting off pyrophosphate as usual. No template is used.

C. The sequence AAUAAA is the signal for the appropriate enzyme to cut the transcript a bit downstream and add the string of A's. (Downstream = in the 3' direction on the mRNA or sense strand.)

D. Note that the A's on the 3' end and the G of the cap are not encoded in the template DNA.

mi. On the handout cleavage of transcript = step 4 addition of poly A = step 5. These two steps may occur simultaneously.

(6) Set up for Splicing. Nothing has happened to the RNA in step 6 except that it has been labeled to indicate exons and introns (so we can explain splicing).

una. By the time the transcript is released from the DNA it already has a cap on the 5' end and a poly A tail on the 3' end. This RNA -- modified on both ends but not spliced -- is usually called the primary transcript or pre-mRNA.

B. Some texts refer to unmodified RNA as the primary transcript, but such a state doesn't really exist, since the pre-mRNA is modified before it is released from the DNA.

C. The RNA is now ready for splicing (steps 7-9 on handout). See also Becker fig. 21-22 (21-23) or Sadava fig. 14.10.

Note: Splicing may begin prior to polyA addition see below.

B. Splicing of Eukaryotic mRNA -- Review from last term

1. A typical picture of a gene with introns and exons (for reference) . The picture below shows a section of the sense strand of the DNA that includes a gene with 3 exons and 2 introns. (The picture on the handout has 2 exons and one intron.) Conventions:

The picture on the handout shows double stranded DNA, but genes are often shown as in the picture below, with only the sense strand actually drawn in.

Transcription would start at the 5' (left) end of exon 1 and go to the right.

Important features of intron: Branch point, 5' splice site (also called the donor site) and 3' splice site (also called acceptor site). These are shown for the first intron only. (See also fig. 21-22 (21-23) in Becker or 14.11 in Sadava.)

Also note that the region to the left of exon 1 is NOT an intron -- it is not part of the gene. It is part of a spacer in between this gene and the previous one.


2. Splicing Details -- See bottom of handout 12A.

(1). Splicing out of each intron occurs in 3 steps (see handout 12A, steps 7-9). At each step the parts of the transcript are held in place by the spliceosome. The steps are repeated for splicing of each intron -- many RNA's have many introns. Details are below.

(2). Terminología The splice junction at the 5' end of an intron is called the 5' or donor site the splice junction at the 3' end of an intron is called the 3' or acceptor site.

B. Steps of splicing. See handout 12A at bottom. See also Becker fig. 21-24 or Sadava 14.11 (14.10). All the steps are catalyzed by the spliceosome. Steps on handout are as follows:

(7) RNA transcript forms loop for removal of intron.

(8). Cut at 5' end of intron

(a). 5' splice site (donor site) is cleaved

(b). loose end of intron (5' end of intron) attaches to branch point in the middle of the intron, forming lariat-shaped structure.

(a). The 5' donor site attaches to the 3' acceptor site, joining the two exons and releasing the intron in the form of lariat.

(b). The lariat will be degraded and the nucleotides will be recycled.

(c). The RNA containing the exons (without the introns) will be transported to the cytoplasm and translated.

C. N.B: Prokaryotes do not have introns and lack the machinery needed to remove them.

3. Do exons and translated regions coincide? See diagram at bottom of 12A. Review from last term:

una. Exons = sections of genes that are represented in the mRNA.

Exons include untranslated 5' and 3' regions as well as the translated regions.

Exons and amino acid coding regions do not coincide, because there are extra untranslated sections in the mRNA.

Exons and mRNA regions do coincide.

B. Exons are not = protein coding sequences , as some texts imply. (The diagram in Sadava fig. 14.7 (14.5) is incorrect.) Exons include protein coding sequences, but also include sequences (UTRs) that are represented in the mRNA but do not code for amino acids. (The Sadava diagrams have no UTRs.)

(1). Leaders. At the 5' end of the mRNA, there is a 5' untranslated region (UTR) or leader before translation begins (before the first AUG). The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 5' UTR is encoded in one or more exons.

( 2). Trailers. At the 3' end of the mRNA, there is a 3' UTR or trailer that is after the stop codon. The DNA coding for this region is transcribed, and the RNA is not spliced out, but this region of the mRNA is not translated. The 3'UTR is encoded in one or more exons.


V. Regulation at Splicing -- Results of Alternative Processing

A. There are two ways to get a collection of similar proteins

1. Gene families -- multiple, similar genes exist due to duplication and divergence of genes. Example: the globin genes constitute a family. Different family members code for myoglobin, beta-chains, alpha-chains, delta-chains, etc. Other gene families include the GLUT, SGLT, and IF families.

2. Alternative splicing or processing (See below) -- only one gene, but primary transcript spliced in more than one way. Examples: fibronectin, soluble and membrane bound antibodies.

B. The Genome vs the Proteome -- You can get many different mRNAs from a single gene by the processes listed below. Therefore the number of possible proteins (the proteome) greatly exceeds the number of possible genes (the genome).

1. Starting transcription at different points

2. Ending transcription (adding poly A) at different points

3. Splicing out different sections (exons as well as introns) of the primary transcript -- alternative splicing.

C. An example of alternative processing -- Production of antibody (immunogloblin) in B cells. See handout 12B and Becker fig. 23-31 -- how to get either soluble or membrane-bound antibody from alternative processing of the same transcript. (See Sadava fig. 16.22 (14.21) for another example.)

1. Antibody can be membrane bound or secreted. Fate of antibody depends on whether peptide has a hydrophobic sequence near one end or not. Hydrophobic sequence can anchor the protein in the membrane -- becomes a transmembrane (TM) sequence.

una. If Ab has a potential TM sequence : Hydrophobic section locks into membrane of ER as protein is made. Vesicle buds off ER and protein travels through cell as part of vesicle. Protein remains in membrane of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab stays in membrane.

B. If Ab has no TM : Ab enters lumen of ER as protein is made. Vesicle buds off ER, and protein ends up in lumen of vesicle. When vesicle fuses with plasma membrane, Ab is secreted.

2. Gene has two alternative polyA addition sites. Which one is used determines final location of protein.

una. Opción 1: If poly A addition site #1 (at start of 'intron 4') is used, protein contains no hydrophobic potential TM sequence, and protein is secreted. (Note: 'intron 4' is spliced out in option 2, but the beginning of 'intron 4' is included in the mRNA in option 1.)

B. Opcion 2: If other poly A addition site (at end of exon 6) is used, protein contains hydrophobic sequence encoded by exons 5 & 6, and protein stays in plasma membrane.

3. mRNA can be spliced and/or poly A added in two alternate ways. Location of protein (antibody) depends on whether splicing of intron 4 or poly A addition happens first. Think of it as a competition. Cualquiera

una. Poly A adding enzymes get there before the spliceosome. In that case, poly A is added to site #1 near end of exon 4, and rest of intron 4 (and rest of gene) is never transcribed, or

B. The spliceosome gets there first . In that case, Intron 4 is transcribed and spliced out before poly A can be added. (In this case, poly A is added at the end of exon 6 instead.)

4. Why are 2 forms of antibody needed?

una. Membrane-bound form of antibody: Serves as receptor for antigen = trap to detect when antigen is present. Binding of antigen (ligand) to antibody (receptor) serves as trigger to start secreting antibody.

B. Secreted (soluble) form: Acts as effector -- carries out major function of immune system -- binds to soluble antigen in body fluids and triggers destruction of antigen in multiple ways.

To review regulation & alternative splicing, try problems 4-13 & 4-14.

VI. Regulation at translation.

A. How to control rate of translation? In principle:

1. Can regulate half life of mRNA (control rate of degradation).

una. In prokaryotes most mRNA's have a short 1/2 life in eukaryotes this is not necessarily so.

B. Different eukaryotic mRNA's have very different half lives.

2. Can regulate rate of initiation of translation (control how effectively translation starts).

B. Some Famous Examples of Regulation of Translation. (The principles are important we will not go into the details.)

  • Function: Ferritin is an intracellular protein that stores excess iron. (Transferrin & its receptor were discussed in the section on RME.)
  • Overall: Regulatory system is similar to induction/repression, but it is translation, not transcription, that is affected by the regulatory protein.
  • This is another example of coordinate control. There is one trans-acting factor here (regulatory protein), but both mRNA's have the same cis acting sequence.
  • See Becker, figs. 23-33 & 23-34 if you are curious about the details.

*A question to think about: Regulatory protein binds to mRNA for protein A at 5' end (blocking initiation) and to mRNA for protein B at 3' end (blocking degradation). Given the information above, which is protein A, and which is protein B? Which one is ferritin and which one is the transferrin receptor? You can check your answer in Becker or using this diagram.

  • In the absence of heme, inhibition occurs, and translation is blocked. No globin produced.
  • Heme blocks the inhibition. Therefore, in the presence of heme translation proceeds. Heme relieves the block in translation, and globin is made.

2. Use of a regulatory RNA -- RNA interference (RNAi)

una. Trans acting factors can be RNA . Not all regulatory factors are protein -- some are short RNA's. (These are usually derived from double stranded RNA -- See Becker figs. 23-35 & 23-36.)

B. How does a short RNA affect translation?

(1). Inhibition (usual case): Small RNA binds to mRNA → Formation of double stranded RNA. This triggers degradation &/or inhibition of translation of the mRNA.

(2). Stimulation: Some recent cases have been discovered in which small RNA binds to mRNA and 'up regulates' translation. Mechanism so far unknown.

C. Use in Regulation: Cells naturally produce micro-RNA's that bind to mRNA's and regulate translation as above. The use of short regulatory RNA's to block translation appears to be important during regulation of development. (See Becker 23-36.)

D. Use in the Lab as a tool: Called RNAi = RNA interference. The use of artificially added short double stranded (ds) RNA to block transcription * /translation and turn genes off is very common. (See Becker 23-35.) Enzymes of cell convert added ds RNA into short single stranded RNA that interferes with translation and/or transcription* as in b. Same effect as adding antisense RNA (but works better).

* We have concentrated on effects of RNAi on translation. However, some short RNAs inhibit transcription by affecting the state of chromatin -- they stimulate methylation of the histones and/or DNA.

VII. ER -- How does Co-translational Import Work?

A. Signal hypothesis -- How ribosomes get to the ER & Protein enters ER -- See handout 12C. Steps listed below refer to handout. See Becker fig. 22-16 or Sadava fig. 14.21 (12.16).

  • Role: temporarily blocks translation ferries nascent protein to ER.
  • Structure: SRP contains proteins + RNA = Large particle containing both ribonucleic acid & protein like a ribosome or spliceosome .
  • Helps attach ribosome to ER, so growing chain can enter pore (translocon) in ER.

3. How does Growing Chain enter ER? Takes two steps (3 & 4)

a . ER has SRP receptor . Receptor is also called docking protein. SRP binds to SRP receptor/docking protein, not directly to pore. (Step 3.)

B. ER has Translocon (gated pore or channel through membrane) which allows growing chain to pass through membrane as chain is made. Pore is closed until ribosome with growing chain gets into position.

Note on terminology: The term "translocon" is used in (at least) 2 different ways. Sometimes it is used to mean only the channel itself, and sometimes it is used to mean the whole complex of proteins required for translocation of proteins across the membrane -- the channel, SRP receptor, etc. It should be clear from context which usage is meant at any one time.

C . Ribosome/translocon complex formation occurs. (step 4 = complex step involving several events)

  • SRP is released, recycles -- GTP split
  • Ribosome binds to pore/translocon
  • Translocon opens & peptide enters (as loop).
  • Ribosome resumes translation.

D. Role of Middleman. Middleman needed for entry into ER through translocon or entry into nucleus through nuclear pores. Processes probably similar. In each case there is a protein system with three components -- Protein with LS (NLS or SP) binds to "middle man" or "ferry proteins" (importins or SRP) which bind to pore. Additional proteins (that we will ignore) are required as well, and GTP is used to drive transport in both cases. See Becker fig. 18-30 for a model.

*A middle man protein is required to enter or exit the nucleus, but different ones are used in for entry vs exit. Exportin is needed to get out of the nucleus, while importin is needed to get in.

** This is how soluble nuclear proteins are imported into the nucleus. Integral (transmembrane) proteins of the nuclear membrane (nuclear envelope) are probably made on the ER, and slide laterally into the outer & inner nuclear membranes (continuous with the ER). Once in place, TM proteins are anchored by binding to lamins or other internal nuclear proteins.

4. How does a new protein end up in the lumen?

Now try problem 3-13, especially part D. (If some of the parts are not obvious, wait until later.)

B. How do proteins cross or enter the ER membrane? (See handout 12D and/or fig. 22-17 of Becker)

1 . How proteins enter/pass through the membrane -- important points

una. SP probably forms loop not arrow. Loop enters channel (translocon) in membrane. SP loop is probably what opens (gates) the channel on the cytoplasmic side.

B. Protein enters as it is made. In humans, growing protein chains usually enter the ER as the chains are synthesized (co-translational import).

Note: In unicellular organisms, soluble proteins destined for the ER lumen often enter the ER after they are finished (post-translational import). Post translational import into the ER will be ignored here, but is covered at length in cell biology.

C . How do transmembrane proteins get anchored in the membrane? A hydrophobic sequence may trigger opening of the pore sideways, so protein slides out of pore, laterally, into lipid bilayer. These hydrophobic sequences are usually called 'stop-transfer' sequences and/or 'anchor' sequences.

D. Where will protein end up? Protein can go all the way through the membrane and end up as a soluble protein in the lumen (as in example above, on 12B) o protein can go part way through and end up as a transmembrane protein. Depends on sequence of protein.

2 . Types of Proteins that can result (see handout 12D)

una. Soluble protein in lumen . Happens if protein passes all the way through the membrane and SP (on amino end) is removed, as above.

B. Integral membrane protein anchored in membrane by SP with no cytoplasmic domain. This happens if SP is on the amino end and is not removed.

C. Single Pass transmembrane protein -- get one of 2 possibilities:

(1). Type 1: Amino end is on lumen side of membrane (on E side) Carboxyl end is in cytoplasm (on P side of membrane)
One way this could happen: If SP is on amino end, and SP removed, and there is a hydrophobic sequence (acting as a stop-transfer or anchor sequence) in the middle of the peptide.

(2). Type 2: Carboxyl end is on lumen side of membrane (on E side) Amino end is in cytoplasm (on P side)
One way this could happen: If SP is in the middle, not on amino end. SP in this case is not removed -- it becomes the transmembrane domain of the protein. (SP doubles as stop-transfer or anchor sequence.)

D. Multipass transmembrane protein. (Requires one SP and several hydrophobic (start/stop) sequences.

(1). Hydrophobic sequences can stop the process (of moving through pore) and anchor protein in membrane, as explained above.

(2). Hydrophobic sequence s in the middle of the peptide can restart looping → multipass protein. These are usually called "start-transfer" sequences (see 4).

(3). 'Start-transfer' and 'stop-transfer' sequences are probably equivalent. Role depends on where in protein they occur. (Both start- and stop-transfer sequences are also called 'topogenic sequences' as they determine the topology of the finished peptide.)

(4) A sequence that starts or restarts passage of a protein through the translocon is usually called a 'start transfer sequence' even if it also doubles as a stop or anchor in the membrane.

mi. Lipid Anchored Proteins (FYI): Proteins to be anchored to lipids on the fuera de of the plasma membrane are generally made as follows: Protein is made on RER and inserted into the ER membrane. After the protein reaches the plasma membrane, the extracellular domain is detached from the rest of the protein and attached to lipid. (Proteins to be anchored to the plasma membrane on the dentro are made on cytoplasmic ribosomes.) See Becker if you are curious about the details.

By now you should be able to do problems 3-1 to 3-3 & 3-4, A-B.

Next time -- What else happens in/on the ER? What happens in the Golgi?


Transcriptional networks in the nitrate response of Arabidopsis thaliana

Systems analyses allowed for the identification of TGA1/TGA4 and NAC4, important transcription factors controlling root system architecture in response to nitrate.

Nitrate controls rapid changes in transcript levels by post-translational activation of transcription factors including NLP7 and bZIP1.

Nitrate promotes nuclear retention of NLP7 to regulate gene transcriptional changes.

Nitrate induces rapid binding and transient interaction of bZIP1 and its targets.

Root system architecture modification in response to nitrate depends partly on transcriptional changes mediated by a network of nitrate-dependent transcription factors.

Nitrogen is an essential macronutrient for plants and its availability is a key determinant of plant growth and development and crop yield. Besides their nutritional role, N nutrients and metabolites are signals that activate signaling pathways that modulate many plant processes. Because the most abundant inorganic N source for plants in agronomic soils is nitrate, much of the work to understand plant N-signaling has focused on this nutrient. Over the last years, several studies defined a comprehensive catalog of nitrate-responsive genes, involved in nitrate transport, metabolism and a variety of other processes. Despite significant progress in recent years, primarily using Arabidopsis thaliana as a model system, the molecular mechanisms by which nitrate elicits changes in transcript abundance are still not fully understood. Here we highlight recent advancements in identifying key transcription factors and transcriptional mechanisms that orchestrate the gene expression response to changes in nitrate availability in A. thaliana.


Ver el vídeo: REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN CELULAR (Enero 2022).