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7.4: Desentrañar la estructura de los ácidos nucleicos - Biología


Saber que el material genético era ADN supuso un gran avance, pero dejó un misterio: cómo se almacenaba y se replicaba la información genética. La base nitrogenada está unida al carbono 1 'y el fosfato está unido al carbono 5'. El ARN se diferencia del ADN en que hay un grupo hidroxilo unido al carbono 2 'de la ribosa, este hidroxilo está ausente en el ADN, ¡por eso es ácido "desoxi" ribonucleico! Tomamos nota en particular de los grupos 5 'fosfato e hidroxilo 3' porque están directamente involucrados en el enlace de nucleótidos para formar polímeros de ácido nucleico.


Deterioro del potencial de la membrana mitocondrial, la respiración y la integridad de la membrana mediada por polietilenimina: implicaciones para la administración de ácidos nucleicos y la terapia génica

La polietilenimina ramificada (PEI) de 25 kDa es un policatión sintético altamente eficaz que se utiliza en protocolos de transfección, pero también desencadena procesos de muerte celular apoptótica mediada por mitocondrias en los que los problemas mecánicos se comprenden poco. Ahora demostramos que la PEI de una manera dependiente de la concentración y el tiempo puede afectar las funciones (potencial de membrana, hinchazón y respiración) y la integridad ultraestructural de las mitocondrias de hígado de rata recién aisladas. La concentración umbral para la detección del deterioro de las funciones mitocondriales del hígado de rata mediado por PEI es de 3 μg / ml; sin embargo, los niveles más bajos de PEI aún ejercen algunos efectos sobre la morfología y la respiración mitocondrial, y estos pueden estar relacionados con las propiedades perturbadoras de la membrana inherentes de este policatión. . La fase de inflamación mitocondrial mediada por PEI es bifásica, con un período inicial de rápida descomposición (más prominente a partir de 4 μg / ml de PEI) seguido de una respuesta de inflamación lineal más lenta. La fase lenta es presumiblemente el resultado de una apertura de la permeabilidad de transición dependiente del tiempo en las mitocondrias inicialmente resistentes a la hinchazón / despolarización, pero puede estar relacionada además con defectos estructurales a nanoescala inducidos por PEI y / o formación de poros en la membrana externa. Las evaluaciones de la respiración sugirieron además que la PEI en presencia de ADP exógeno se comporta de manera similar a un compuesto inhibidor de acción lenta. El PEI muestra además una propiedad de desacoplamiento que es detectable a bajas tasas de respiración. Se discute la relevancia de estos hallazgos para la iniciación de la vía apoptótica intrínseca mediada por PEI.


Introducción

El uso de poros artificiales o biológicos con dimensiones a nanoescala es una estrategia exitosa para la detección de moléculas de tamaño similar, como ADN, ARN, péptidos, proteínas y polisacáridos 1,2,3. El gran éxito de su aplicación en la secuenciación de cadenas largas de ADN ha encendido un interés de investigación generalizado en los campos de la biología, la física, la química y la nanociencia 4. Más recientemente, la tecnología de nanoporos ha mostrado un gran potencial para aplicaciones proteómicas de una sola molécula 5,6. Por ejemplo, las mediciones de corriente iónica a través de nanoporos llenos de electrolitos se han utilizado para determinar la forma, volumen, carga, coeficiente de difusión rotacional y momento dipolar de proteínas individuales 7. Por lo tanto, para satisfacer la demanda de detección de varias moléculas, se han explorado varios materiales, incluidas las proteínas transmembrana 8, los poros de estado sólido 9,10 y el origami de ADN / péptido 11,12. Los nanoporos biológicos han encabezado el enfoque, ya que son superiores en sensibilidad y pueden manipularse con precisión mediante modificaciones químicas o ingeniería genética.

Aerolisina de Aeromonas hydrophila es producida por bacterias como una toxina formadora de poros β (β-PFT). Después de años de investigación, la aerolisina es actualmente una de las mejor caracterizadas entre todas las β-PFT, ya que tenemos un profundo conocimiento molecular de la estructura de este poro cuando se incrusta en la membrana del huésped. Mientras que la aerolisina se secreta en una forma inactiva, se activa tras la escisión proteolítica del péptido C-terminal, siendo reclutada en la membrana del huésped por proteínas ancladas a GPI 13. En este punto, la aerolisina se oligomeriza en un poro heptamérico maduro que presenta un pliegue nuevo y único, constituido por dos barriles β concéntricos formados por 2 hebras β internas y 3 hebras β externas por protómero, que se mantienen unidas principalmente por interacciones hidrófobas 14. Este pliegue desarrollado durante el proceso de formación de poros es probablemente responsable de la ultraestabilidad del poro de aerolisina. Es importante destacar que la aerolisina es el miembro prototípico de una gran familia de β-PFT cuyos miembros se encuentran distribuidos entre organismos eucariotas y procariotas y comparten una estructura y un modo de ensamblaje similares [15].

Además de su relevancia microbiológica, se ha descubierto que la aerolisina es un candidato nanoporo prometedor, que exhibe una alta sensibilidad para la detección de ADN 16, péptidos 17 y polímeros 18, proporcionando una excelente separación de corriente y un rango de tiempo de permanencia adecuado para un procesamiento de señal preciso. . Beneficiándose de su canal muy estrecho, la aerolisina es capaz de discriminar directamente nucleobases 19 individuales, aminoácidos 20 individuales y citosinas metiladas en la muestra 21 de suero en su conformación de tipo salvaje (wt). Por lo tanto, la ingeniería de su estructura tiene el potencial de mejorar la precisión de la secuenciación del ADN y desarrollar nuevas estrategias proteómicas de una sola molécula. Sin embargo, mientras que la resolución temprana del poro de la α-hemolisina (α-HL) y otros poros más recientes han promovido su amplia adopción en las técnicas emergentes de detección de nanoporos, casi ningún estudio se ha centrado en la relación estructura-función de la capacidad de la aerolisina para sintiendo. Aquí, una serie de mutantes se han diseñado y estudiado racionalmente utilizando modelos y simulación moleculares basados ​​en estructuras y modelos de aerolisina recientes 14. A continuación, se han expresado, purificado y reconstituido mutantes prometedores en membranas de bicapa lipídica para experimentos de registro de un solo canal y translocación molecular. Mediante la integración completa de datos experimentales y computacionales, podríamos comprender cómo la conductancia iónica, la selectividad iónica y las propiedades de translocación del poro de aerolisina se controlan a nivel molecular. Hemos revelado que la relación corriente-voltaje de los poros diseñados está determinada por la electrostática en la región de la tapa donde se encuentra el doble barril β. Curiosamente, el tiempo de permanencia de la translocación molecular está estrictamente correlacionado con el diámetro de la constricción más estrecha del poro de aerolisina, lo que demuestra la importancia del impedimento estérico para la translocación molecular. En conjunto, los determinantes de detección de la aerolisina están controlados principalmente por residuos en la tapa distintiva del doble cilindro β, por lo que cualquier modificación del poro debe preservar esta estructura de detección única.


Discusión

Nuestros experimentos han confirmado la dependencia del comportamiento elástico del ADN de los detalles de su unión terminal (4): la transición de sobreestiramiento ocurre a diferentes fuerzas, dependiendo de si hay una muesca o un extremo libre disponible (ADN unido 3′-3 ′) o no (ADN unido 3′5′-5′3 ′). Probamos la estructura del ADN en la transición de sobreestiramiento tomando instantáneas después de aplicar sondas específicas de ADN monocatenario y bicatenario. Para ambas geometrías de unión, los experimentos demostraron la aparición de ssDNA, lo que confirma que el ADN se funde gradualmente durante la transición de sobreestiramiento.

En nuestros experimentos sobre la transición de sobreestiramiento a 65 pN de ADN unido 3'-3 ', observamos que el sobreestiramiento se inicia en las extremidades del ADN. En cada extremo del ADN, solo una de las hebras de la doble hélice está unida a la microesfera, de modo que cada hebra está unida a una sola cuenta. Aparentemente, las extremidades del dsDNA forman un punto de nucleación favorable: en otras palabras, la transición de sobreestiramiento a 65 pN es un deshilachado inducido por la fuerza cooperativa (26). En algunos casos, observamos nucleación adicional dentro de una molécula de ADN (ver Fig.2A imagen 3 y Fig.4B). Nuestros experimentos que combinan tinción YOYO y mtSSB (ver Fig.4B) reveló que esto es causado por mellas de una sola hebra. La notable procesividad del estiramiento excesivo que observamos a lo largo de la secuencia heterogénea de miles de pares de bases no se había anticipado en estudios anteriores, donde se sugirió que el estiramiento excesivo se iniciara en pequeños dominios ricos en AT a lo largo de la molécula de ADN (8, 10, 27). Nuestras observaciones descartan la ocurrencia a gran escala de tales "burbujas" de fusión de una sola hebra en el interior cuando un extremo libre está disponible para la nucleación. Aparentemente, la penalización de energía por una nueva burbuja de nucleación es mayor que un progreso gradual del frente de fusión desde los extremos o desde una muesca, independientemente de la secuencia. Esto puede entenderse al darse cuenta de que la fusión en estos lugares permite que una de las hebras de ssDNA recién formadas se relaje y libere energía elástica.

La situación es bastante diferente para el ADN unido 3′5′-5′3 ′, que carece de puntos de nucleación energéticamente preferidos en los extremos del ADN. Para este ADN, la nucleación de la fusión inducida por la fuerza se asemeja más a la fusión térmica (ver Fig.5B), que se originó predominantemente en regiones interiores pequeñas (ricas en AT) (28). De hecho, mostramos que RPA y POPO-3 se unen a través del ADN sobreestirado (ver Fig.5B). Además, medimos que el ADN unido 3′5′-5′3 ′ se sobreestira a fuerzas de 110 pN, de acuerdo con estudios previos sobre ADN con restricción de extremos y torsión (4). En particular, cuando el ADN está completamente estirado (ver Fig.5A, Derecha), La RPA se une de manera homogénea a lo largo del ADN, en contraste con las predicciones anteriores de que la estructura del ADN constreñido por torsión completamente sobreestirado es bifásica para conservar el número de enlace (29). La explicación más sencilla de la unión homogénea de RPA es que la nueva estructura, generada durante el estiramiento excesivo a 110 pN, consta de dos cadenas de ADN simples que carecen de enlaces de hidrógeno entre las bases, envueltas entre sí con un número de enlace cercano al del dsDNA relajado. De acuerdo con esta hipótesis, se podría especular que la estructura del ADN con una vuelta por cada 35 bases que se obtiene cuando el ADN constreñido por torsión bajo herida se estira a 50 pN (4), también se compone de dos hebras de ADNss fundidas y envueltas. Para resolver cómo estos experimentos se relacionan con nuestros hallazgos, se requerirán más estudios que combinen imágenes de fluorescencia, control de fuerza y ​​control de torsión del ADN.

Como se mencionó en la introducción, un argumento en contra de la interpretación de la fusión inducida por la fuerza para las moléculas de ADN unidas en 3'-3 'ha sido la estabilidad informada del ADN más allá de la transición a 65 pN. Nuestro enfoque de visualización directa arrojó una observación sorprendente que nos permite explicar directamente esta paradoja. Como se ve en la imagen 6 de la Fig.2A, en fuerzas más allá de la transición de sobreestiramiento, permanece un segmento pequeño, transitoriamente estable etiquetado con YOYO y, por lo tanto, de doble hebra. Presumimos que el mecanismo de estiramiento excesivo es cualitativamente similar al descomprimido mecánico del ADN, donde el ADN se derrite separando las dos hebras en un lado de un ADN de doble cadena (29). En estos experimentos, se demostró que la energía para abrir el dúplex de ADN aumenta con la disminución de la rigidez de la construcción. Lo mismo ocurre durante la transición de sobreestiramiento debido a la fracción creciente de ssDNA más blando. Aparentemente, se necesita más tiempo para superar las barreras de energía más altas para fundir los últimos cientos de pares de bases y la transición ya no está en equilibrio en escalas de tiempo experimentales (17). Esto puede explicar por qué la molécula de ADN puede permanecer intacta al menos transitoriamente a fuerzas superiores a 65 pN. Se llegó a una conclusión similar del modelado termodinámico (10), que indicó que el ADN se mantiene unido por varias regiones pequeñas de ADN bicatenario. Curiosamente, sin embargo, encontramos que solo una única región no fundida mantiene conectadas las hebras de ADN. Esta región parece estar posicionada de manera consistente asimétrica a lo largo de la molécula (en lugar de en el centro), lo que podría sugerir que la mitad rica en GC del ADN lambda (2) es la última parte en derretirse, como se esperaba. De acuerdo con un pequeño tramo de dsDNA restante, las propiedades elásticas del DNA más allá de la transición OS pueden describirse mediante una combinación lineal de ssDNA y una sola fracción de dsDNA que desaparece lentamente, lo que indica un comportamiento fuera de equilibrio (Fig. S4) .

En conclusión, hemos revelado que, independientemente de los detalles de la unión de la hebra, el estiramiento excesivo del ADN comprende sin ambigüedades una conversión gradual de dsDNA en ssDNA. Visualizamos directamente dsDNA usando colorantes intercalados y ssDNA usando proteínas de unión monocatenarias, al mismo tiempo que las medidas de extensión de fuerza. Por lo tanto, nuestra interpretación no se basa en modelos y supuestos termodinámicos, mecanoquímicos u otros. Además, la insensibilidad de la fusión inducida por la fuerza observada a la fuerza iónica nos lleva a concluir que el proceso genérico que gobierna la transición de OS es la fusión de los pares de bases. Anticipamos que nuestros resultados proporcionarán una base para la comprensión fundamental de la termodinámica del ADN y las interacciones ADN-proteína.


2 PROPIEDADES FUNDAMENTALES DE LAS TRIPLES HELICES DE ARN

2.1 Sistema de clasificación de las triples hélices de ARN

En la naturaleza, se han observado hélices triples de surco mayor y menor. Una triple hélice de surco menor se forma cuando la tercera hebra interactúa a lo largo del borde del surco menor, en lugar del surco mayor, de un dúplex de ARN (ver [Devi, Zhou, Zhong, Toh y Chen, 2015 Lescoute y Westhof, 2006] para una revisión). El motivo A-minor es un conocido triple de base de surco menor y esta interacción terciaria estabiliza grandes estructuras de ARN, como los intrones auto-empalmados y el ribosoma, así como los pseudonudos de cambio de marco ribosómico (Adams, Stahley, Kosek, Wang y Strobel , 2004 Lescoute y Westhof, 2006 Nissen, Ippolito, Ban, Moore y Steitz, 2001 Su, Chen, Egli, Berger y Rich, 1999 Szewczak, Ortoleva-Donnelly, Ryder, Moncoeur y Strobel, 1998 Toor et al., 2008). Las triples hélices de ARN de surco mayor de origen natural, como el ARN de telomerasa, a veces son adyacentes a una triple hélice de surco menor o tienen triples de bases de surco menor intermedias (Theimer et al., 2005). Es importante destacar que las hélices triples de surco menor generalmente no son estables de forma aislada, por lo tanto, esta revisión se centrará en las hélices triples de ARN de surco mayor.

Las hélices triples de surco mayor se definen como paralelas o antiparalelas. Esta nomenclatura se refiere a la polaridad 5′-3 ′ de la tercera hebra con respecto a la hebra de polipurina del dúplex Watson-Crick: una orientación paralela establece interacciones Hoogsteen mientras que una orientación antiparalela establece interacciones Hoogsteen inversas (Figura 1b). Las hélices triples también se pueden marcar como motivo pirimidina o purina, y esta nomenclatura refleja la nucleobase predominante en la tercera hebra: el motivo pirimidina es rico en U o C, mientras que el motivo purina es rico en A o G. En general, el motivo pirimidina favorece una orientación paralela mientras que el motivo purina favorece una orientación antiparalela (Figura 1b). Dentro de las estructuras de ARN plegadas, el motivo de pirimidina se encuentra comúnmente dentro de pseudonudos de tipo H o I (Figura 1c). Es de destacar que existe evidencia experimental que respalda (Kalwa et al., 2016 Mondal et al., 2015 O'Leary et al., 2015 Zhao, Senturk, Song, & Grummt, 2018) y no respalda (Escude et al. , 1993 Morgan & Wells, 1968 Semerad & Maher 3rd., 1994) la formación de triples hélices con motivos purina cuando la tercera hebra es ARN. Finalmente, las triples hélices de ARN se definen por su molecularidad: intramolecular es donde las tres hebras pertenecen a la misma transcripción e intermolecular es donde las tres hebras se originan a partir de dos o tres transcripciones diferentes. El enfoque principal de este artículo de revisión serán las triples hélices de ARN con motivo pirimidina intramolecular.

2.2 Composición de nucleótidos de las triples hélices de ARN

Las triples hélices de ARN de surco mayor con motivo de pirimidina se componen más comúnmente de las dos triples de bases canónicas: U • A-U y C + • G-C (Figura 1a y Tabla 1). A diferencia del triple de base U • A-U, el triple de base C + • G-C es sensible al pH, para el pKa en la posición N3 de la citosina es

4.6 (Levene, Bass y Simms, 1926). Para un par de bases Hoogsteen C + • G, la protonación en la posición N3 de la citidina establece un enlace de hidrógeno con N7 de la guanosina de modo que dos enlaces de hidrógeno estabilizan la cara de Hoogsteen, similar a U • A (Figura 1a). Por lo tanto, no es sorprendente que las triples hélices que contienen C • G-C sean más estables a un pH más bajo (es decir,

Como triples de bases canónicas, U • AU y C + • GC son los triples de bases de surcos mayores más estables, aunque casi todas las combinaciones de triples de bases posibles (N • NN, donde N = A, C, G o U) se han observado en Estructuras de ARN tridimensionales (Abu Almakarem, Petrov, Stombaugh, Zirbel y Leontis, 2012 Firdaus-Raih, Harrison, Willett y Artymiuk, 2011). La mayoría de estos triples de bases se detectaron en el ARNr a partir de estructuras tridimensionales (3D) del ribosoma, por lo tanto, estos triples de bases son triples de bases de surcos menores o son instancias aisladas, lo que significa que no se apilan entre sí para formar un mayor - triple hélice de surco. En el contexto de una triple hélice de ARN de surco mayor rico en U • A-U, se están realizando gradualmente estudios sistemáticos para comprender mejor la estabilidad de los triples de bases de ARN no canónicos, que es cualquier triple de bases que no sea U • A-U o C + • G-C. Aquí, la composición de nucleótidos de un triple de base única varía dentro de una triple hélice de ARN MALAT1 de origen natural (Brown et al., 2016a) o una triple hélice de ARN de origen no natural (Kunkler et al., 2019). Estos estudios emplearon ensayos de desplazamiento de gel nativo y un ensayo indicador de β-globina sin intrón basado en células para medir la estabilidad relativa de las triples de bases. A pesar de las diferentes secuencias de ARN y contextos estructurales, surgieron varios temas notables: Los triples de bases canónicos U • AU y C • GC son más estables, los triples de bases no canónicos son más estables cuando una pirimidina llena la posición de Hoogsteen (p. Ej., U • GC, U • GU, C • CG, U • CG) y cuatro triples de base consecutivos de U • AU, C • GC o U • GC apoyan la formación de una triple hélice. Otro estudio intercambió la composición de nucleótidos de la hebra completa, en lugar de una triple base única, y encontró que poli (inosina • AU), poli (inosina • inosina-C) y poli (G • GC) forman hélices triples, aunque no naturales. Se han identificado contrapartes hasta la fecha (Letai, Palladino, Fromm, Rizzo y Fresco, 1988). Curiosamente, los ribonucleótidos modificados amplían aún más la variedad de triples de bases. Los riboconmutadores emplean nucleobases, ribonucleósidos y ribonucleótidos modificados de ligandos naturales en la formación triple de bases para completar el apilamiento helicoidal coaxial (Tabla 1 y ver la Sección 3.3 para más detalles). Con 143 ribonucleósidos modificados actualmente conocidos (McCown et al., 2020), existe la posibilidad de que triples de bases químicamente diversas residan en triples de ARN naturales aún por descubrir.

2.3 Parámetros estructurales finos de las triples hélices de ARN

Los parámetros estructurales de las hélices dobles de ADN y ARN se han establecido rigurosamente, extrapolando los primeros parámetros estructurales de los datos de difracción de fibra de rayos X y, finalmente, de las estructuras cristalinas de rayos X de alta resolución (Drew et al., 1981 Schindelin et al., 1995). Para las hélices triples de ARN, los parámetros estructurales de las estructuras poli (U • AU) se derivaron de modelos generados utilizando una combinación de datos de difracción de fibra de rayos X y modelado computacional (Arnott & Bond, 1973 Arnott et al., 1976 Chandrasekaran, Giacometti, Y Arnott, 2000 Raghunathan, Miles y Sasisekharan, 1995). Más recientemente, se resolvió una estructura de cristal de rayos X para una triple hélice de ARN rico en U • A-U que abarca 11 triples de bases consecutivos, revelando así los parámetros estructurales globales y locales (Figura 2 y Tabla 2 Ruszkowska et al., 2020). En general, la triple hélice de ARN de la mano derecha, que tiene una base central C • GC triple flanqueada en ambos lados por cinco triples de bases U • AU, es un conformador de la familia A y es cuantitativamente similar a A′-RNA, que es efectivamente una forma subwoundida de A-RNA (Tabla 2 Arnott, Hukins, Dover, Fuller y Hodgson, 1973 Ruszkowska et al., 2020 Tanaka et al., 1999). A pesar de la presencia de una hebra de Hoogsteen, la triple hélice de ARN tiene un diámetro de 24 Å, que es casi idéntico a los de las hélices dobles (Tabla 2). Similar a los valores determinados a partir de modelos basados ​​en difracción de fibra de rayos X de hélices triples de poli (U • AU), el paso helicoidal (es decir, la altura de una vuelta completa) es relativamente alto a 35,1 Å con triples de base adyacentes espaciados 2,9 Å. verticalmente y girado sobre el eje helicoidal en un

Torsión de 30 ° (Tabla 2 Arnott & Bond, 1973 Arnott et al., 1976). Por lo tanto, una vuelta helicoidal completa contiene 12 triples de bases, que es mayor que el número de pares de bases por vuelta tanto en A-RNA como en B-DNA (Tabla 2). Este desenrollado helicoidal se adapta a la hebra de Hoogsteen. Aquí, el ancho del surco mayor aumenta de 3,1 Å en A-RNA a 9,2 Å para la doble hélice de la triple hélice de RNA (Figura 2 y Tabla 2). Esta expansión de la ranura principal es posible gracias a un ángulo de inclinación reducido (es decir, la inclinación del par de bases con respecto al eje helicoidal) a 8,4 °, lo que permite que la hebra de Hoogsteen ocupe casi toda la ranura principal (es decir, el ancho de la ranura principal es de solo 2,3 Å entre las hebras de Hoogsteen y Crick (Figura 2 y Tabla 2). Es importante destacar que esta estructura de una triple hélice de ARN rico en U • A-U muestra definitivamente que las tres hebras tienen enlaces glicosídicos en el anti-conformación y ribosas que favorecen al C3′-endo conformación de fruncido de azúcar, que es consistente con las estructuras resueltas para las triples hélices de ARN de origen natural. Se necesitan estudios futuros para determinar cómo se comparan los parámetros estructurales finos de esta triple hélice de ARN rica en U • AU con los de otras triples hélices, en particular una triple hélice de ARN rica en C + • GC o una triple hélice de ADN rica en T • AT . En conjunto, la comprensión de los principios bioquímicos y estructurales fundamentales de las hélices triples de ARN proporciona información sobre la estructura estructural que sería posible para las hélices triples de ARN de origen natural.

Parámetro Triple hélice de ARN a a Todos los valores se calcularon utilizando sólo la porción de doble hélice de la triple hélice de ARN excepto el paréntesis 2.3, que es el ancho de surco principal entre las hebras de Hoogsteen y Crick.
Doble hélice de A-RNA Doble hélice de A′-ARN Doble hélice de B-DNA
Sentido helicoidal Diestro Diestro Diestro Diestro
Diámetro (Å) 24 22.9 24 23.9
Paso de hélice (Å) 35.1 27.5 32.8 33.7
Elevación helicoidal por par de bases o triple de bases (Å) 2.9 2.6 2.9 3.4
Giro helicoidal (°) 29.7 33.7 31.4 36.2
Pares de bases por vuelta helicoidal o triples de base por vuelta helicoidal 12 10.7 11.5 10
Desplazamiento axial (Å) −5.0 −3.9 −4.9 0.3
Dimensiones de la ranura mayor
Ancho (Å) 9.2 (2.3) 3.1 8.4 11.4
Profundidad (Å) 11.0 9.2 9.3 4.5
Dimensiones de la ranura menor
Ancho (Å) 9.0 9.9 9.7 4.9
Profundidad (Å) 1.5 0.5 0.5 5.3
Ángulo de inclinación (°) 8.4 17.6 13.6 −0.5
Conformación del enlace glucosídico Anti Anti Anti Anti
Conformación de fruncido de azúcar C3 ′ endo C3 ′ endo C3 ′ endo C2 ′ endo
  • Nota: Valores obtenidos de Ruszkowska et al. (2020).
  • a Todos los valores se calcularon utilizando solo la porción de doble hélice de la triple hélice de ARN, excepto el paréntesis 2.3, que es el ancho del surco principal entre las hebras de Hoogsteen y Crick.

Figura 3

Figura 3. Instantáneas de la distribución de la doxorrubicina en la estructura de la fibroína de seda a 0 y 50 ns en las simulaciones de dinámica molecular a los valores de pH indicados de 4 y 7,4. El análisis de posprocesamiento del sistema seda-doxorrubicina se presenta como la distribución del número de moléculas de doxorrubicina a diferentes distancias (nm) de las estructuras de fibroína de seda a 50 ns y el número de enlaces de hidrógeno de todos los sistemas seda-doxorrubicina sobre un 50 tiempo de simulación ns. Las estructuras de doxorrubicina y fibroína de seda se visualizaron utilizando el paquete de software Visual Molecular Dynamics α-helix = red, β-sheet = cyan, turn = green, random-coil = white y doxorrubicin = red.

A continuación, se utilizaron LIGPLOT y Discovery Studio para generar un diagrama de interacción 2D y para controlar qué aminoácidos de la fibroína de seda interactuaban con la doxorrubicina a 50 ns. El diagrama 2D del LIGPLOT detalla los enlaces de hidrógeno (líneas verdes) y las interacciones hidrófobas (arcos grises) entre la fibroína de seda y la doxorrubicina (Figura S8). La molécula de doxorrubicina en LIGPLOT se seleccionó entre las que mostraban las energías de interacción más altas con el modelo de fibroína de seda a 50 ns. En general, el número de enlaces de hidrógeno y el número de aminoácidos responsables de la interacción de la doxorrubicina de la fibroína de seda fueron mayores a pH 7,4 que a pH 4 (Figura S8 y Tabla S5). Para la estructura de fibroína de seda con el mayor contenido de hoja β, la interacción entre la seda y la doxorrubicina a pH 4 estuvo dominada por interacciones hidrofóbicas (Figura S8A), mientras que la interacción a pH 7,4 estuvo dominada por enlaces de hidrógeno. Para otros sistemas de modelos de seda-doxorrubicina, el diagrama bidimensional de LIGPLOT no mostró diferencias significativas en respuesta a los cambios de pH.

En general, el pH influyó en la afinidad de unión de la doxorrubicina hacia la fibroína de seda porque los residuos de aminoácidos ionizables (especialmente ácido glutámico y aspártico) en la estructura de la fibroína proporcionaron un mayor número de cargas negativas a pH 7,4 que a pH 4 (mostrado en rojo en la Tabla S5). Esto se correlaciona bien con experimentos previos de laboratorio húmedo que muestran la liberación del fármaco dependiente del pH (4,7,8,11,36) e indica que la modulación del número de grupos ionizables podría ser un enfoque útil para un mayor refinamiento del diseño de sustancias químicas. sedas modificadas o recombinantes destinadas a la administración de fármacos. (14)

En resumen, la simulación metadinámica bien templada nos permitió explorar & gt1000 estructuras de fibroína de seda cristalina amorfa y produjo varias conformaciones de seda útiles, incluidas estructuras de seda nuevas y reportadas anteriormente (todas estas estructuras ahora están disponibles para descargar gratuitamente). La interacción molecular entre estas estructuras de fibroína de seda y la doxorrubicina mostró efectos dependientes del pH. Se demostró que el dominio N-terminal es un "interruptor" importante que controla la unión y liberación del fármaco en respuesta al pH. Este control del pH se atribuyó a residuos de aminoácidos ionizables, especialmente ácido glutámico. Las interacciones electrostáticas debidas a los enlaces de hidrógeno fueron de importancia crítica para la carga y liberación de fármacos. En general, este estudio demostró importantes relaciones estructura-función que ayudarán en el desarrollo de sedas recombinantes con características mejoradas de unión y liberación de fármacos.


Simulaciones de dinámica molecular de interacciones ADN-ADN y ADN-proteína

Los campos de fuerza estándar prescriben interacciones ADN-ADN y ADN-proteína demasiado atractivas.

Los campos de fuerza recientemente mejorados permiten simulaciones que reproducen y predicen experimentos.

La parametrización mejorada junto con algoritmos numéricos avanzados ahora permiten el modelado preciso de una amplia gama de sistemas de proteínas y ácidos nucleicos.

El método de dinámica molecular de todos los átomos puede caracterizar las interacciones a nivel molecular en sistemas de ADN y ADN-proteína con una resolución sin precedentes. Los avances recientes en las tecnologías computacionales han permitido que el método revele el comportamiento insesgado de tales sistemas en la escala de tiempo de microsegundos, mientras que los enfoques de muestreo mejorados han madurado lo suficiente como para caracterizar la energía libre de interacción con precisión cuantitativa. Aquí, describimos el progreso reciente hacia el aumento del realismo de tales simulaciones mediante el refinamiento de la precisión del campo de fuerza de la dinámica molecular, y destacamos la aplicación reciente del método a sistemas de interés biológico excepcional.


3.1 Sándwich Apt-LFA

El método de ensayo sándwich es el Apt-LFA más utilizado, especialmente para la detección de analitos de gran peso molecular como las proteínas [30]. En un sándwich típico Apt-LFA, después de cargar las muestras en la almohadilla de muestra, las moléculas diana son capturadas en primer lugar por un aptámero de detección (a menudo conjugado con una molécula informadora), lo que da como resultado la formación de un complejo aptámero / diana conjugado con informador en el conjugado. almohadilla. Tras la migración a la línea de prueba, la molécula diana en el complejo puede ser reconocida por un agente de afinidad secundario y forma una estructura sándwich con las moléculas diana en el medio (entre el aptámero conjugado con reportero y el agente de afinidad secundario). Por el momento, se han propuesto tres tipos diferentes de LFA Apt-sándwich.

3.1.1 Sandwich Apt-LFA usando aptámeros duales

En 2009, Xu y sus colegas introdujeron un Apt-LFA en sándwich para la detección de trombina [30], con un formato idéntico a los LFA convencionales basados ​​en anticuerpos. Como se muestra en la Figura 3, se emplearon un par de aptámeros dirigidos a diferentes sitios de la molécula de trombina. En primer lugar, uno de los aptámeros, a saber, el aptámero de detección, se conjugó con las nanopartículas de oro (AuNP) mediante tiolación y se cargó en la almohadilla conjugada, que actúa como elemento de reconocimiento. El segundo aptámero se biotiniló e inmovilizó en la línea de prueba mediante unión de estreptavidina-biotina (se recubrió previamente con estreptavidina la membrana de nitrocelulosa), sirviendo como aptámero de captura. Después de que las muestras que contienen trombina se carguen y migren a la almohadilla de conjugado por acción capilar, se formó un complejo de aptámero de detección conjugado con trombina / AuNP. Luego, el complejo continuó migrando a lo largo de la tira hasta la zona de prueba, donde el complejo fue capturado por un aptámero de captura y dio como resultado la agregación de AuNP (muestra un color rojo característico, Figura 3A). El exceso de complejos luego pasó más allá de la línea de prueba y luego fue capturado por secuencias de oligonucleótidos fijas complementarias a una región específica del aptámero de detección en la línea de control dando como resultado otra banda roja. En ausencia de trombina, se mostró una banda roja distinta solo en la línea de control (Figura 3B).

Posteriormente, siguiendo un procedimiento similar, se notificaron diferentes Apt-LFA en sándwich para detectar varios tipos de dianas que van desde proteínas [31, 32], virus [33] hasta células cancerosas completas [34]. Indeed, with two different aptamers immobilized on the conjugate pad and test line respectively to recognize different sites of the target analytes, many of the reported assays demonstrate high specificity and sensitivity in both target spiked buffer and clinical samples (Table 1).

3.1.2 Sandwich Apt-LFA using a combination of aptamer and antibody

One of the major shortcomings of sandwich Apt-LFA is the difficulty in identifying dual aptamers targeting different sites of a target molecule, especially for small molecules with limited binding domains for aptamer recognition. To address this issue, in addition to improving the SELEX procedure for selecting aptamer pairs, the combined use of antibody and aptamer has been exploited. In 2017, this strategy was explored by Minagawa and colleagues for salivary α-amylase (sAA) detection [35]. In this work, using a 75-mer DNA aptamer as the detection aptamer (conjugated with AuNP for signal readout), and a commercial anti-sAA antibody loaded on the test zone for sAA/AuNP-conjugated aptamer complex capturing, the authors developed an aptamer/antibody sandwich LFA allowing specific sAA detection in 0.1% (v/v) human saliva. However, the incorporation of the unstable and expensive antibodies contradicts the advantage of the integration of aptamers in LFA. Therefore, the application and further commercialization of such a format may not be feasible.

3.1.3 Sandwich Apt-LFA using split aptamers

To address the issue of lacking dual aptamers for LFA development, the concept of split aptamers was introduced by exploiting the structural flexibility of aptamers [36, 37]. The mechanism of split aptamer design is based on the target-induced reassembling of aptamer fragments. As shown in Figure 5A, in the presence of target molecules, two separate aptamer fragments could regain the three-dimensional structure and recover the affinity property of the parent aptamer. By conjugating one fragment of the aptamer to a signal reporter (e.g. AuNPs) and immobilizing the other fragment onto the test zone (serving as capturing agent), a sandwich LFA could be created (Figure 5B).

The first split aptamer-based biosensor was developed in 2009. In this work, via designing separate segments of two aptamers, Zuo and colleagues developed an effective electrochemical assay for cocaine and ATP detection [38]. The idea of using split aptamers for biosensor development soon became popular, with various types of targets, including thrombin (exciton energy transfer-based fluorescent sensing) [39], 17β-estradiol (absorption-desorption colourimetric detection) [40], and D-vasopressin (electrochemical biosensor) [41]. In 2016, a sandwich LFA based on split aptamers was pioneered for ATP detection [42]. In this work, the authors designed a pair of split oligonucleotides based on a previously reported ATP aptamer. While the signalling element was produced via labelling one of the aptamer fragments onto AuNPs and loaded onto the conjugate pad, the test zone was prepared by adding the second aptamer split onto the nitrocellulose membrane via streptavidin-biotin interaction. The developed Apt-LFA displayed a linear concentration-signal response within a wide range from 0.5 nM to 5 mM. When tested with solutions spiked with other nucleotides, including UTP, CTP and GTP, non-specific detection was not observed.

Notably, the application of split aptamers has been especially useful in the area of small molecule detection. As previously discussed, many of the small molecules are either not compatible with antibody development or lack a second binding site for dual aptamer identification. Theoretically, a split aptamer pair can be designed by dividing any aptamer into two separate fragments. However, split aptamers generated from different cutting sites of the parental aptamer could display vastly different binding affinities [43]. Although investigations have been conducted to elucidate the influence factors for optimised split aptamer design [36, 43], a general principle is still not available. As suggested, to ensure the efficiency of split aptamer-based biosensors, the split sites have to be experimentally tested [43].

In conclusion, although both combined aptamer/antibody and split aptamer strategies have been exploited in recent years, dual aptamer-based sandwich LFA is preferred for highly-sensitive and specific LFA development. Further progress in aptamer identification techniques including the usage of efficient and diverse initial libraries (e.g. G-quadruplex library) [44], next-generation sequencing (NGS) based candidate identification [45], as well as rational counter selection strategies (e.g. using aptamer binding sites inhibitors) [46] would help to facilitate the development of high-quality dual aptamer-based LFA.


Agradecimientos

We would like to thank Dr Andreas Heyland and Sandy Smith for help with microscopy Jonathan Krieger and the SPARC BioCentre at SickKids as well as Dr Dyanne Brewer at the University of Guelph Advanced Analysis Centre for help with mass spectrometry analysis Shannon Ferraro, Dr Janet Wood, Dr Shenhui Lang, and Dr Todd Gillis for their help and suggestions with the protein biochemistry and André Hupé for his comments and feedback. We would also like to thank Matt Cornish and Mike Davies at the Hagen Aqualab for help with the care of the hagfish used for this study. Dr Gaurav Jain, Stacey Zuppa, and Sara Siwiecki assisted with collecting images of skeins swelling.


6. Conclusión y perspectivas

Since the development of the first LFA by Unipath in 1985, different types of LFAs have been reported for the detection of a wide range of target analytes including pathogens of infectious diseases (e.g. virus infection, malaria), toxins (e.g. endotoxins, snake venom), environmental pollutants (e.g. antibiotics, pesticides, heavy metals), small molecule drugs (e.g. cocaine) and metabolites (e.g. ATP) 133 . However, despite huge market potential and popularity, the conventional LFA faces challenges such as batch-to-batch variation and instability 133 . This is mainly due to the fact that conventional LFAs rely heavily on animal-derived antibodies, which display inter-batch variation due to the physiological variation among animals.

The rapid progress in aptamer (chemical antibodies) technologies over the past three decades provide a valuable opportunity to solve many of the obstacles faced by the conventional antibody-based LFAs 53 , 134 . Aptamers are identified via in vitro procedures which do not require the use of animals, and compatible with chemical modifications 11 . This not only allows developing aptamers against non-immunogenic molecules (i.e. metal ions) or toxic molecules (e.g. toxins) that are not feasible for animal-based antibody development, but also, allows exploiting various nucleic acid-based analytical techniques (e.g. displacement assays, non-enzyme amplification techniques). Importantly, while the application of antibodies is limited to close to physiological conditions, aptamers could be selected and applied in non-physiological conditions akin to the real-world application (e.g. detecting reducing agents). These features, together with high affinity, small size, superior stability, ease of synthesis and freedom to incorporate chemical modifications, collectively make aptamers excellent recognition agents for biosensor development 135 . Furthermore, the aptamer technique allows identification of targets even when detailed knowledge about the target is not available. The recently developed Cell-SELEX is an example 136 . By employing intact cells as targets, coupling with optimized selection controls, Cell-SELEX allows researchers to identify aptamers to target cells in the absence of information about their surface structure which is very useful for the detection of new infectious diseases. Accordingly, aptamer industry reaches 245 million USD by 2020 with a compound annual growth rate of

17.9% and there is a huge potential for the application of aptamers in LFA for POCT development 137 .

However, it should be noticed that changes in assay conditions such as metal ions, buffer system and pH value could dramatically affect the binding property of aptamers and cause reduced detection efficiency 138 , 139 . As demonstrated by a recent study, when an aptamer-based sensor was tested under different settings, compared with PBS (where the aptamer was identified), the binding affinity of the aptamer could be reduced significantly from 32.49 nM to 1964.4 nM in 50% beer 140 . Consequently, incorporating chemical modifications (e.g. 2'-amino pyrimidine, 2'-fluoropyrimidine, 2'-O-methyl and locked nucleic acid) to stabilize the tertiary structure of aptamers, or developing aptamers under the intended assay conditions rather than the commonly used buffer systems (e.g. PBS) are highly recommended 11 .

Based on the nucleic acid nature of aptamer, various types of competitive Apt-LFAs have been introduced. Among them, the target molecule (on the test line) mediated aptamer competition is generally preferred. However, it does come with additional costs (for target immobilization) and potential stability issues (depending on the nature of the target). It is worth mentioning that many of the published competitive Apt-LFAs involve the integration of additional bases at the end of the aptamers, with complementary sequences of the additional bases immobilised on the control line for assay validation. However, these tails not only potentially interrupt the binding capacity of the aptamer and resulting in reduced detection efficiency, but also raise concerns for control line design of the competitive Apt-LFA, especially when a low amount of aptamers were immobilized on the conjugate pad. In such a case, when the amount of targets was low in the sample, all the aptamers may bind to the immobilised targets or oligonucleotides, with no aptamer available for control line binding (results in invalid assay control). In contrast, a high target concentration may cause all the aptamers being occupied by target molecules in the sample and again, no aptamer would be available for control line binding. Therefore, for effective competitive Apt-LFA development, the amount of aptamers, competitive targets/competitive oligonucleotides, as well as the complementary sequences in the control line have to be experimentally tested 10 . In fact, as previously mentioned, for more effective experimental control, full complementary sequences of the aptamers could be immobilized at the control line for aptamer recognition.

Although aptamers are suitable for detecting small molecules which are not accessible to antibody development, to our knowledge, only limited efforts have been made in this area, with Apt-LFAs reported only for the detection of AFB1, E2, bisphenol A (BPA), ATP, p-amino hippuric acid, Ochratoxin A, dopamine, ampicillin, cocaine and mercury. This is mainly because of the difficulty in developing high-affinity and specific aptamers for small molecule recognition. Despite novel strategies such as the crosslink mediated reporter aggregation (Figure ​ (Figure11) 11 ) and the cross-recognition aptamer-based detection 58 have shed light on this area, further investigation is still imperative for efficient small molecule detection. This is especially true given the growing interest in the small endogenous metabolites-based disease diagnosis.

As discussed above, the sandwich format is preferred for Apt-LFA development, with one aptamer immobilised at the test line and an additional aptamer linked to a signal reporter for target detection. However, in many cases, developing a pair of aptamers targeting different sites of a target is difficult, especially for small molecules with limited binding motifs. Although the combined application of aptamers and antibodies offers opportunities for sandwich format LFA development, the inclusion of costly and less stable antibodies compromises the inherent advantages of aptamer-based LFAs. Applying split aptamers is an alternative solution for sandwich LFA design when only a single aptamer is available. However, splitting an aptamer into two separate fragments causes reduced binding properties as recorded in our recent LDL-R aptamer development 21 . As a result, selecting a pair of aptamers targeting different sites of the target is highly desirable for efficient Apt-LFA development. To this end, strategies such as employing high-efficiency initial libraries or blocking aptatopes (aptamer binding sites) have been suggested 11 . The recent integration of next-generation sequencing and computer-based machine learning approaches for aptamer identification also provides a great opportunity for efficient aptamer identification, by in-depth evaluation of the binding motif of aptamers against the target of interest 11 .

Whilst various types of Apt-LFA have been developed over the past decades, it should be noticed that a commercial Apt-LFA device is still not available. The relatively low LOD can be the main reason for this shortfall. Although novel strategies such as integrating isothermal amplification techniques and fluorescent readers can dramatically improve the detection sensitivity of LFA, the involvement of additional procedures significantly compromises its simplicity. Therefore, further advances in reducing the complexity of the current signalling readout approaches are required to develop highly sensitive Apt-LFAs. Towards this, a smartphone-based portable quantitative Apt-LFAs powered by the ever-progressing telecommunication techniques and integrated image processing applications hold great potential for the development of novel Apt-LFAs with improved efficiency.


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