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¿Qué enzima de restricción usaría?


El plásmido pBr322 incluye dos genes que confieren resistencia a los antibióticos: un gen para ampicilina y un gen para tetraciclina. El sitio de corte para la enzima de restricción BamH1 está en el medio del gen de resistencia a la tetraciclina. El sitio de corte para la enzima de restricción Pvu1 está en el medio del gen de resistencia a ampicilina.

Si estuviera usando una placa de cultivo celular que contuviera ampicilina, ¿qué enzima de restricción (BamH1 o Pvu1) usaría para cortar el plásmido y escindir el gen que desea insertar?

Intento:

Supongo que necesita usar Pvu1 ya que el sitio de corte está en el gen de resistencia a la ampicilina, pero la respuesta correcta es BamH1. ¿Por qué?

¡Cualquier ayuda sería increíble! ¡Gracias!


Recuerda que Pvu1 cortes en el medio de AmperioR, y cuando inserte su gen, interrumpirá su función, lo que significa que las colonias transformadas ya no podrán crecer en medios que contengan Amp. Es por eso que desea cortar con BamH1: la interrupción del TetR El gen es irrelevante y deja la resistencia Amp en su lugar.

El objetivo de cultivar en medios que contienen antibióticos es seleccionar las células que han absorbido su plásmido; las células que no lo han hecho no pueden crecer.


Yo iría con la enzima BamH1 ya que el sitio de corte en pBr322 es BamHI 375 y si lo está colocando en una placa de ampicilina, necesita que el gen resistente a ampicilina esté intacto para la detección, por lo que al usar BamHI no interrumpirá el gen resistente a Amp


Enzima restrictiva

A enzima restrictiva, endonucleasa de restricción, o restrictasa es una enzima que escinde el ADN en fragmentos en o cerca de sitios de reconocimiento específicos dentro de moléculas conocidas como sitios de restricción. [1] [2] [3] Las enzimas de restricción son una clase del grupo más amplio de enzimas endonucleasas. Las enzimas de restricción se clasifican comúnmente en cinco tipos, que difieren en su estructura y si cortan su sustrato de ADN en su sitio de reconocimiento o si los sitios de reconocimiento y escisión están separados entre sí. Para cortar el ADN, todas las enzimas de restricción hacen dos incisiones, una vez a través de cada cadena principal de azúcar-fosfato (es decir, cada hebra) de la doble hélice del ADN.

Estas enzimas se encuentran en bacterias y arqueas y proporcionan un mecanismo de defensa contra los virus invasores. [4] [5] Dentro de un procariota, las enzimas de restricción cortan selectivamente extranjero ADN en un proceso llamado digestión de restricción mientras tanto, el ADN del huésped está protegido por una enzima de modificación (una metiltransferasa) que modifica el ADN procariótico y bloquea la escisión. Juntos, estos dos procesos forman el sistema de modificación de restricciones. [6]

Se han estudiado en detalle más de 3.000 enzimas de restricción y más de 800 de ellas están disponibles comercialmente. [7] Estas enzimas se utilizan habitualmente para la modificación del ADN en los laboratorios y son una herramienta vital en la clonación molecular. [8] [9] [10]


5.7: Enzimas de restricción

  • Contribuido por John W. Kimball
  • Profesor (jubilado) en la Universidad de Tufts y Harvard

Las enzimas de restricción son enzimas que cortan el ADN que se encuentran en las bacterias (y se extraen de ellas para su uso). Debido a que cortan dentro de la molécula, a menudo se les llama endonucleasas de restricción. Para poder secuenciar el ADN, primero es necesario cortarlo en fragmentos más pequeños. Muchas enzimas que digieren el ADN (como las del líquido pancreático) pueden hacer esto, pero la mayoría de ellas no sirven para el trabajo de secuencia porque cortan cada molécula al azar. Esto produce una colección heterogénea de fragmentos de diferentes tamaños. Lo que se necesita es una forma de escindir la molécula de ADN en unos pocos sitios ubicados con precisión para que se produzca un pequeño conjunto de fragmentos homogéneos. Las herramientas para esto son las endonucleasas de restricción. Cuanto más raro sea el sitio que reconoce, menor será el número de piezas producidas por una endonucleasa de restricción determinada.

Figura 5.7.1: Resumen de restricciones

Una enzima de restricción reconoce y corta el ADN solo en una secuencia particular de nucleótidos. Por ejemplo, la bacteria Hemophilus aegypticus produce una enzima llamada HaeIII que corta el ADN dondequiera que encuentre la secuencia

Figura 5.7.2: Enzimas de restricción

El corte se hace entre los adyacentes G y C. Esta secuencia particular ocurre en 11 lugares en la molécula circular de ADN del virus & phiX174. Por tanto, el tratamiento de este ADN con la enzima produce 11 fragmentos, cada uno con una longitud y una secuencia de nucleótidos precisas. Estos fragmentos se pueden separar unos de otros y se puede determinar la secuencia de cada uno. HaeIII y AluI cortan directamente a través de la doble hélice produciendo extremos "romos". Sin embargo, muchas enzimas de restricción cortan de forma compensada. Los extremos del corte tienen un trozo de ADN monocatenario que sobresale. Estos se denominan "extremos pegajosos" porque pueden formar pares de bases con cualquier molécula de ADN que contenga el extremo pegajoso complementario. Cualquier otra fuente de ADN tratada con la misma enzima producirá tales moléculas. Mezcladas, estas moléculas pueden unirse entre sí mediante el emparejamiento de bases entre sus extremos pegajosos. La unión puede hacerse permanente mediante otra enzima, una ADN ligasa, que forma enlaces covalentes a lo largo de la columna vertebral de cada hebra. El resultado es una molécula de ADN recombinante (ADNr).

La capacidad de producir moléculas de ADN recombinante no solo ha revolucionado el estudio de la genética, sino que ha sentado las bases de gran parte de la industria de la biotecnología. La disponibilidad de insulina humana (para diabéticos), factor VIII humano (para hombres con hemofilia A) y otras proteínas utilizadas en la terapia humana fueron posibles gracias al ADN recombinante.


Biología REA

El ADN se puede cortar endonucleasas de restricción ( RE ). Las endonucleasas son enzimas que pueden hidrolizar el polímero de ácido nucleico rompiendo el fosfodiéster enlace entre el fosfato y la pentosa en la columna vertebral del ácido nucleico. Este es un enlace covalente muy fuerte, mientras que los enlaces de hidrógeno más débiles mantienen sus interacciones y su doble hebra.

Como su nombre lo indica, las endonucleasas de restricción (o enzimas de restricción) son y ldquorestringido& rdquo en su capacidad para cortar o digerir el ADN. La restricción que es útil para los biólogos suele ser palíndromo Secuencias de ADN. Las secuencias palindrómicas son la misma secuencia hacia adelante y hacia atrás. Algunos ejemplos de palíndromos: COCHE DE CARRERAS, CIVIC, UN HOMBRE A PLAN A CANAL PANAMÁ. Con respecto al ADN, hay 2 hebras que corren antiparalelas entre sí. Por lo tanto, el complemento inverso de una hebra es idéntica a la otra. Los biólogos moleculares también tienden a usar estas tijeras moleculares especiales que reconocen palíndromos de 6 u 8. Al usar cortadores de 6 u 8 cortadores, las secuencias ocurren a lo largo de grandes tramos rara vez, pero con la frecuencia suficiente para ser de utilidad.

EcoRI genera puntas pegajosas de cohesión SmaI genera extremos romos

Las enzimas de restricción hidrolizan los enlaces de fosfodiéster covalentes del ADN para dejar los extremos "quosticky / cohesive" o "ldquoblunt". Esta distinción en el corte es importante porque una EcoRI El extremo adhesivo se puede usar para unir un trozo de ADN cortado con la misma enzima para pegarlos o ligarlos nuevamente. Mientras que las endonucleasas cortan el ADN, ligasas únalas de nuevo. ADN digerido con EcoRI se puede ligar de nuevo junto con otro trozo de ADN digerido con EcoRI, pero no a una pieza digerida con SmaI. Otro cortador contundente es EcoRV con una secuencia de reconocimiento de GAT | ATC.


Usos tradicionales de la clonación de ADN

La clonación de ADN tradicional utilizando endonucleasas restrictivas tiene múltiples usos. El ADN recombinante expresado (secuencias de ADN que codifican la síntesis de proteínas), cuando se inserta en la información genética de las bacterias, estimula a las bacterias a producir la proteína objetivo.

Este es el método mediante el cual los ingenieros genéticos de las empresas farmacéuticas fabrican insulina humana, albúmina humana, algunas vacunas, anticuerpos monoclonales y hormona del crecimiento humano a un costo mucho menor que la extracción de estos productos de organismos multicelulares. El ADN recombinante también se utiliza para diagnosticar enfermedades hereditarias y producir antibióticos a gran escala.

El análisis de genes es un sector amplio en el que los ingenieros genéticos insertan secuencias de ADN recombinante (ADNr) escindidas para ayudarnos a comprender qué hacen los genes específicos. Al comprender los genes, tenemos los datos que necesitamos para hacer ajustes que potencialmente pueden erradicar la enfermedad.

Los cultivos genéticamente modificados son el resultado de técnicas tradicionales de clonación molecular donde la resistencia a insectos y herbicidas y más producto por hectárea cuadrada son los principales objetivos. Este método también mejora la fijación de nitrógeno en plantas y cultivos.

La industria de la restauración utiliza ADN recombinante en los procesos de fermentación y elaboración de queso, y también para detectar la presencia de bacterias y hongos patógenos en las superficies utilizadas para la preparación de alimentos.

Sin embargo, para producir resultados que puedan mejorar nuestra salud o nuestras fuentes de alimentos, nuestro conocimiento de la función de cada gen es esencial. Solo una vez que se ha descubierto la función de una secuencia de ADN se puede utilizar correctamente. La clonación de ADN tradicional fue la primera técnica utilizada en el campo del mapeo del genoma que, durante muchos años, nos ha enseñado cómo se expresan los genes. Con las nuevas enzimas de restricción artificiales, solo se puede esperar que la ingeniería genética avance en las próximas décadas.


¿Cómo se elige qué enzimas de restricción usar al clonar un gen?

Depende del vector que utilizará y del fragmento que desee clonar.

Explicación:

Primero, debe seleccionar el mejor vector para clonar.
En mis días, usábamos pBR322 (un plásmido), M13 o #phi X # 174

Cualquiera que sea el vector que use, tendrá algunos puntos de inserción óptimos para clonar su fragmento y definirá el RE que debe usar.

Eso sí, dejé el negocio de la clonación a finales de los 80 y el tiempo ha pasado sin duda, pero la naturaleza no cambia.

Usted empalma el vector con el ER de su elección (como EcoR1 o Hin DIII en el caso de los Vectores mencionados anteriormente), empalma el ADN que se va a probar con el mismo RE, Heatshock ambas muestras, purifica, combina y combina con ADN Ligasa . Purificar nuevamente y amplificar usando el Fragmento Klenow de ADN Polimerasa 1 (de E. Coli)

Debido a que se conoce el genoma vectorial (M13, #phi X # 174 y pBR322 han sido bien documentados en los años 70), sabrá dónde está el punto de inserción y la secuenciación no será un problema.


Enzimas de restricción

El ADN se puede cortar endonucleasas de restricción ( RE ). Las endonucleasas son enzimas que pueden hidrolizar el polímero de ácido nucleico rompiendo el fosfodiéster enlace entre el fosfato y la pentosa en la columna vertebral del ácido nucleico. Este es un enlace covalente muy fuerte, mientras que los enlaces de hidrógeno más débiles mantienen sus interacciones y su doble hebra.

Como su nombre lo indica, las endonucleasas de restricción (o enzimas de restricción) son "restringido”En su capacidad para cortar o digerir el ADN. La restricción que es útil para los biólogos suele ser palíndromo Secuencias de ADN. Las secuencias palindrómicas son la misma secuencia hacia adelante y hacia atrás. Algunos ejemplos de palíndromos: COCHE DE CARRERAS, CIVIC, UN HOMBRE A PLAN A CANAL PANAMÁ. Con respecto al ADN, hay 2 hebras que corren antiparalelas entre sí. Por lo tanto, el complemento inverso de una hebra es idéntica a la otra. Los biólogos moleculares también tienden a usar estas tijeras moleculares especiales que reconocen palíndromos de 6 u 8. Al usar cortadores de 6 u 8 cortadores, las secuencias ocurren a lo largo de grandes tramos rara vez, pero con la frecuencia suficiente para ser de utilidad.

EcoRI genera puntas pegajosas de cohesión

SmaI genera extremos romos

Las enzimas de restricción hidrolizan los enlaces fosfodiéster covalentes del ADN para dejar extremos “pegajosos / cohesivos” o extremos “romos”. Esta distinción en el corte es importante porque una EcoRI El extremo adhesivo se puede usar para unir un trozo de ADN cortado con la misma enzima para pegarlos o ligarlos nuevamente. Mientras que las endonucleasas cortan el ADN, ligasas únalas de nuevo. ADN digerido con EcoRI se puede ligar de nuevo junto con otra pieza de ADN digerido con EcoRI, pero no a una pieza digerida con SmaI. Otro cortador contundente es EcoRV con una secuencia de reconocimiento de GAT | ATC.


Arber, W. y Linn, S., Ana. Rev. Büchern., 38, 467 (1969).

Meselson, M., Yuan, R. y Heywood, J., Ana. Rev. Biochem., 41, 447 (1972).

Smith, H. O. y Wilcox, K. W., J. Mol. Biol., 51, 379 (1970).

Kelly, junio, T. J. y Smith, H. O., J. Mol. Biol., 51, 393 (1970).

Arber, W. y Morse, M. L., Genética, 51, 137 (1965).

Hedgpeth, J., Goodman, H. W. y Boyer, H. W., Proc. US Nat. Acad. Sci., 69, 3148 (1972).

Dana, K., Sack, G. y Nathans, D., J. Mol. Biol. (en la prensa).

Yoshimori, R. N., tesis, Universidad de California (1971).

Meselson, M. y Yuan, R., Naturaleza, 217, 1110 (1968).

Studier, F. W., J. Mol. Biol., (en la prensa).

Novogrodsky, A. y Hurwitz, J., J. Biol. Chem., 241, 2923 (1966).

Richardson, C. G., Proc. US Nat. Acad. Sci., 54, 158 (1965).

Murray, K., Biochem. J., 131, 569 (1973).

Wu, R. y Kaiser, A. D., J. Mol. Biol., 35, 523 (1968).

Southern, E. M. y Mitchell, A., Biochem. J., 123, 613 (1971).

Mertz, J. E. y Davis, R. W., Proc. US Nat. Acad. Sci., 69, 3370 (1972).

Bernardi, G., Avances en enzimología, 31, 1 (1968).

Weigl, P. H., Englund, P. T., Murray, K. y Old, R. W., Proc. US Nat. Acad. Sci., 70, 1151 (1973).

Murray, K. y Murray, N. E., Naturaleza Nueva Biología, 243, 134 (1973).

Gierer, A., Naturaleza, 212, 1480 (1966).

Bannister, D. y Glover, S. W., Biochem. y Biophys. Res. Comun., 30, 735 (1968).

Durwald, H. y Hoffman-Berling, H., J. Mol. Biol., 34, 331 (1968).

Jacob, F. y Wollman, E. L., Ana. Inst. Pasteur, 87, 653 (1954).

Goldberg, A. P. y Howe, M., Virología, 38, 200 (1969).

Wood, W. B., J. Mol. Biol., 16, 118 (1966).

Clausen, T., Anal. Biochem., 22, 70 (1967).

Sanger, F., Brownlee, G. G. y Barrell, B. G., J. Mol. Biol., 13, 373 (1965).


Uso de QTL en el desarrollo de tolerancia al estrés abiótico en el arroz

43.1 Introducción

El descubrimiento de las enzimas de restricción por Luria y Human (1952) hizo posible cortar y pegar ADN. Esto facilitó además una forma posible de definir un gran número de loci de marcadores polimórficos conocido como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP Botstein et al., 1980). Esto permitió, por primera vez en la historia, la asociación directa de secuencias de ADN con su efecto sobre un fenotipo (Martinville et al., 1982). La utilización de mapas de ligamiento basados ​​en RFLP (Lander y Botstein, 1986, 1987, 1989) para localizar genes responsables de la variación en los fenotipos sentó las bases para el análisis de ligamiento moderno y los estudios de asociación de todo el genoma. Esto permitió, por primera vez en la historia, la asociación directa de secuencias de ADN con su efecto sobre un fenotipo mediante el mapeo RFLP de la enfermedad de Huntington en humanos (Gusella et al., 1983). Con la evolución de marcadores de la primera generación como RFLP, polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP Orita et al., 1989), sitios marcados con secuencia (STS Olson et al., 1989) y polimorfismo de longitud de fragmento amplificado (AFLP Vos et al. ., 1995), etc., a la nueva generación de marcadores polimorfismo de un solo nucleótido (SNP Wang et al., 1998), polimorfismo amplificado relacionado con la secuencia (SRAP Li y Quiros, 2001), inserciones-deleciones (InDels Mills et al. , 2006), y el polimorfismo amplificado de intrón-retrotransposón (IRAP Kalendar y Schulman, 2006), junto con un avance en la capacidad informática de las computadoras, se hizo posible construir mapas de ligamiento genético de alta densidad en casi todas las especies. Por lo tanto, los genetistas han agregado una nueva herramienta a su arsenal con la que podrían etiquetar fenotipos fácilmente.

La variación genética en la naturaleza a menudo toma la forma de un rasgo cuantitativo (QT), con una distribución aproximadamente normal, en lugar de fenotipos discretos con los que estamos familiarizados, según nuestra comprensión de los principios genéticos mendelianos. La variación genética subyacente a los fenotipos cuantitativos, como el rendimiento y la altura de la planta, la pigmentación, el número de granos, la tolerancia al estrés abiótico, etc., resulta de la segregación de numerosos loci QT, abreviados como QTL (Mackay 2001). Dado que las proporciones genéticas mendelianas se disfrazan en QT, deben tratarse de manera diferente a los rasgos simplemente heredados y el mapeo de QT requiere diferentes metodologías. Para comprender el mapeo de QTL, es importante comprender la media [efecto y valores genéticos (VB) recuadro 43.1] y los componentes de varianza de las poblaciones, además de los fundamentos del mapeo de poblaciones, y la base genética y las propiedades de los marcadores de ADN (moleculares).

Terminologías básicas en mapeo QTL

Efecto adictivo de un QTL se refiere al cambio en el valor medio del fenotipo tras la sustitución del alelo QTL de un padre por el otro padre. De manera similar, el efecto de dominancia se refiere al efecto del alelo QTL cuando los alelos marcadores están en condición heterocigótica.

Explicación de la varianza fenotípica: Cada QTL explica una parte de la variación total del fenotipo y esta proporción es la popular R 2 valor.

Heredabilidad (H) Es proporcional a la varianza fenotípica (Vicepresidente) que se explica por la variación genética (Vg) [H=Vg/Vicepresidente].

Logaritmo de probabilidades es un registro10 razón de probabilidad. En el análisis de vinculación, esto representa la probabilidad de que los loci vinculados no tengan vinculación. En el análisis de QTL, representa la probabilidad de la presencia de QTL a no QTL.

Intervalo de confianza (IC) de la ubicación de QTL se puede calcular utilizando la fórmula dada por Darvasi y Soller (1997) donde, CI = 3000 /mNd 2 , metro = número relativo de meiosis informativa, norte = tamaño de la población, y D = efecto de sustitución de alelos. También se puede calcular por 530 /Nevada fórmula donde v es la proporción de varianza explicada.

BV es la suma de los efectos promedio de sus alelos. Efecto promedio de los alelos (α) se puede definir como "la desviación media de la media de la población de individuos que recibieron ese alelo de uno de los padres, y el otro alelo procede al azar de la población".

El arroz es un modelo representativo de cultivos alimentarios de cereales y es el alimento básico de una gran parte de la población mundial, especialmente en el sudeste asiático. Las áreas de cultivo de arroz abarcan los trópicos, subtrópicos, trópicos semiáridos y regiones templadas. Sin embargo, es susceptible a diversos estreses abióticos como la sequía, la salinidad y el estrés por calor que obstaculizan su potencial de rendimiento de grano (GY) y su estabilidad en varios ecosistemas (Munns y Tester, 2008). La domesticación y la reproducción para un alto rendimiento causaron la erosión genética de los alelos que confieren tolerancia al estrés abiótico. Por lo tanto, ahora se están realizando esfuerzos para reconstituir la diversidad alélica para la tolerancia al estrés abiótico en las variedades modernas de alto rendimiento de cultivares y germoplasma adaptados localmente. Al ser una herencia compleja, es importante diseccionar genéticamente los QTL para diversas tolerancias de estrés abiótico entre los antecedentes de élite de alto rendimiento (IR64, IR72, Swarna, Way Rarem, Nipponbare e IR29) y los cultivares adaptados localmente y tolerantes al estrés (Nagina 22, Apo, DK 151, Pokkali, Nona Bokra, CSR27, Bala y el cultivar 996). Muchos alelos favorables para la tolerancia al estrés abiótico han sido aportados por genotipos / padres sensibles al estrés (Lanceras et al., 2004 Bernier et al., 2007 Sandhu et al., 2014 2015 Tiwari et al., 2016), lo que indica la importancia de la genética. antecedentes de un genotipo sobre su desempeño bajo estrés. El uso de QTLS en la tolerancia al estrés abiótico también es una cuestión de protocolos robustos de detección y evaluación, interacción gen × trasfondo genético e interacción gen × entorno. La mayoría de los QTL funcionan bien en condiciones de estrés controlado, pero fallan en condiciones de campo y, por lo tanto, MAS para la tolerancia al estrés abiótico no es sencillo. La combinación de datos de expresión del genoma completo, información de QTL y análisis de meta-QTL ha surgido como una herramienta competente para reducir la búsqueda de genes candidatos para la tolerancia al estrés abiótico (Jansen y Nap, 2001 Yano et al., 2012 Sandhu et al. , 2017). Hay muchas historias de éxito de introgresión de QTL para la tolerancia al estrés abiótico, y muchas variedades se encuentran en la etapa avanzada de senderos de campo (Singh et al., 2016) para la tolerancia a la sequía, la salinidad y el calor por separado o en combinación.


[6] - Enzimas de restricción: propiedades y uso

La mayoría de los experimentos en biología molecular implican el uso de enzimas de restricción en alguna etapa de los experimentos. La capacidad de estas enzimas para cortar el ADN en una secuencia específica de bases ha estimulado en gran medida el crecimiento de la tecnología del ADN recombinante. Este capítulo trata sobre todas las enzimas disponibles comercialmente, sus propiedades generales, los procedimientos básicos para su uso y las formas de solucionar los problemas encontrados en su uso. La mayoría de las enzimas se pueden utilizar con éxito sin la ayuda de kits prefabricados, gráficos coloridos, tampones complejos o equipos especializados. La secuencia del ADN en la mano o el diseño del experimento pueden influir en la elección de la enzima. Para la mayoría de las secuencias de bases, hay más de una enzima disponible que reconoce esa secuencia. Una enzima que genera un saliente de cuatro nucleótidos es preferible a su isosquizómero que crea un saliente de dos nucleótidos si los extremos van a ligarse a extremos cohesivos generados de manera similar. Por el contrario, si el experimento requiere la ligadura de extremos generados por enzimas que reconocen diferentes secuencias, las enzimas que generan extremos romos serían preferibles a las que crean un saliente.


Ver el vídeo: Enzima de restricción (Enero 2022).