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¿Puede el oxaloacetato atravesar la membrana mitocondrial externa?


Soy consciente de la lanzadera malato-aspartato, pero algo no me queda claro y distintas fuentes parecen contradecirse. Algunos muestran que el oxaloacetato (OAA) se reduce a malato en el espacio entre membranas mitocondriales (IMS), mientras que otros muestran que la reducción ocurre en el citosol.

¿Dónde ocurre la reducción de OAA → malato? es decir, ¿puede OAA cruzar la membrana mitocondrial externa (desde el citosol al IMS) para que pueda reducirse en el IMS, o debe reducirse en el citosol antes de cruzar cualquiera de las dos membranas mitocondriales?


En general, se cree que la membrana mitocondrial externa es básicamente permeable (a través de porinas) a moléculas pequeñas como OAA. Como es típico en biología, la situación en realidad puede ser más compleja; consulte, por ejemplo, este documento. Pero creo que la suposición predeterminada es que los metabolitos cruzan libremente la membrana externa mitocondrial.

También puede preguntar si es probable que la enzima MDH mitocondrial o la enzima MDH citoplásmica se encuentre o esté activa dentro del espacio intermembrana.


El oxaloacetato (OAA) no puede atravesar la membrana mitocondrial interna.

El proceso de fosforilación oxidativa y el sistema de transporte de electrones (ETS) ocurren en la mitocondria, mientras que $ ce {NADH} $ generado por la reducción de $ ce {NAD +} $ en la glucólisis está en el citoplasma. El problema es que la membrana mitocondrial interna no es permeable a $ ce {NADH} $, por lo que se requiere un sistema de lanzadera para el transporte de los equivalentes reductores a través de la membrana mitocondrial. Hay dos de estos, uno de los cuales es el transbordador 'Malate-Aspertate'.

En el proceso (ver arriba) el oxalacetato (OAA) toma los equivalentes reductores de $ ce {NADH} $ para formar malato en una reacción catalizada por malato deshidrogenasa. La membrana mitocondrial interna es permeable al malato, que pasa a través de las proteínas transportadoras (malato - transportador $ alpha $ -ketogluterate) a la matriz mitocondrial donde se convierte de nuevo en OAA. Cuando esto sucede, la concentración de OAA disminuye en el espacio entre membranas y, dado que el OAA no puede pasar directamente a través de la membrana mitocondrial interna, se convierte en aspartato en la matriz mitocondrial al reaccionar con glutamato para producir $ alpha $ -cetoglutarato y aspartato. El aspartato luego viaja al espacio entre membranas a través de transportadores específicos (transportador de glutamato-aspartato). En el espacio entre membranas, el aspartato se combina con $ alpha $ -ketoglutarate para formar glutamato y OAA (lo contrario de lo que sucedió en la matriz mitocondrial). Por tanto, la concentración de OAA se mantiene en el espacio entre membranas y la reacción continúa.

Conclusión

La OAA se convierte en malato en el espacio entre membranas. En la matriz mitocondrial, el malato se convierte nuevamente en OAA, como se ilustra en la siguiente ilustración.

Fuente de la imagen: Malate-Aspartate Shuttle, Wikipedia


Mitocondrias & # x2014hubs para regular la bioquímica celular: conceptos y redes emergentes

Las mitocondrias son estructuras icónicas en bioquímica y biología celular, tradicionalmente conocidas como la central eléctrica de la célula debido a un papel central en la producción de energía. Sin embargo, las mitocondrias de hoy en día son reconocidas como actores clave en la biología de las células eucariotas y se sabe que regulan procesos celulares cruciales, incluida la señalización del calcio, el metabolismo celular y la muerte celular, por nombrar algunos. En esta revisión, discutiremos el conocimiento fundamental en biología mitocondrial y proporcionaremos instantáneas de avances recientes que muestran cómo la función mitocondrial regula otras respuestas celulares.

1. Introducción

Se cree que todos los eucariotas de hoy en día han surgido de un antepasado primordial que engulló una α-protobacteria con capacidad para respirar [1]. Este evento dio lugar a las mitocondrias modernas, un evento que ahora está profundamente integrado en la homeostasis y la supervivencia de las células eucariotas. Las mitocondrias son redes dinámicas capaces de remodelar su morfología y actividad. Proporcionan energía y biomoléculas para la célula, además de contribuir a las vías del estrés celular, las respuestas inmunitarias, la señalización intra e intercelular, el control del ciclo celular y la muerte celular. La biología única de las mitocondrias sustenta su influencia en la célula y la capacidad de calibrar su estructura y proteoma es un medio eficaz para adaptar su función. Como tal, comenzaremos con un breve esbozo de tres conceptos fundamentales en biología mitocondrial: (i) ultraestructura mitocondrial (ii) importación de proteínas mitocondriales y (iii) dinámica mitocondrial. Esto informará la discusión posterior sobre las mitocondrias como actores clave en roles amplios y diversos, incluido el metabolismo, la transducción de señales, la inmunidad, el ciclo celular, la diferenciación celular, la muerte celular y el estrés.

2. Ultraestructura mitocondrial, dinámica e importación de proteínas

2.1. Ultraestructura mitocondrial

Las mitocondrias tienen una doble membrana que define cuatro compartimentos: la membrana externa, el espacio intermembrana, la membrana interna y la matriz. La arquitectura de la membrana interna es maleable y típicamente convoluta en invaginaciones plegadas, llamadas crestas, que dictan la disposición espacial de las proteínas [2]. La remodelación de la estructura de las crestas de las crestas también puede alterar el flujo enzimático entre los compartimentos, de acuerdo con las diversas estructuras de las crestas observadas en los tipos celulares con diferentes demandas metabólicas [2]. El complejo MICOS recientemente descrito (sitio de contacto mitocondrial y sistema de organización de las crestas) es necesario para mantener la morfología de las crestas [3] (figura 1). La pérdida del ensamblaje de MICOS elimina las uniones de las crestas y manifiesta graves defectos en el metabolismo energético, la manipulación del calcio y el tráfico de lípidos [4]. Sin embargo, no está claro cómo MICOS está regulado por las condiciones celulares para producir diversas morfologías de crestas. Curiosamente, la interrupción de MICOS altera la actividad y / o abundancia de proteínas de morfología mitocondrial [5, 6]. Las perturbaciones en la función de los orgánulos se han asociado durante mucho tiempo con grandes cambios morfológicos en la red mitocondrial, por lo tanto, la reorganización de las crestas mediante el ensamblaje / desensamblaje de MICOS puede ser un intermediario entre la función y la dinámica. Las asociaciones identificadas recientemente entre MICOS y los complejos de importación de proteínas apuntan a la amplia influencia de MICOS en la función mitocondrial [7, 8].

Figura 1. Las proteínas mitocondriales con codificación nuclear son importadas por translocasas de múltiples subunidades. Las proteínas mitocondriales sintetizadas en el citosol se importan a las mitocondrias después de la traducción. El complejo TOM en la membrana externa sirve como puerta de entrada de proteínas general. hTom40 forma el poro de la translocasa, mientras que hTom20, hTom22 y hTom70 funcionan como receptores. hTom22 juega un papel adicional en el montaje del complejo. hTom5, hTom6 y hTom7, denominados colectivamente pequeños TOM, regulan la dinámica y el ensamblaje del complejo. El complejo TIM22 en la membrana interna media la importación de proteínas transmembrana de múltiples pasadas a la membrana interna. hTim22 forma el poro a través del cual se insertan las proteínas, mientras que AGK y hTim29 funcionan como receptores y en ensamblaje complejo. El complejo TIM23 puede trasladar proteínas precursoras a la matriz o la membrana interna. hTim23 y hTim17 forman el poro del canal, y hTim50 funciona como receptor de precursores. El complejo central se asocia con un motor de importación que ayuda a trasladar las proteínas a la matriz de una manera dependiente de ATP. El complejo MIA media la importación de proteínas espaciales intermembrana solubles catalizando la formación de enlaces disulfuro. hMia40 lleva a cabo la formación del enlace disulfuro y se ancla a la membrana interna a través de una interacción con AIF. ALR elimina electrones de hMia40 para que pueda sufrir más rondas de catálisis. El complejo SAM de la membrana externa media la inserción de proteínas de barril β en la membrana externa. hSam50 se asocia con MTX1 y MTX2. Cristae, las grandes invaginaciones de la membrana mitocondrial interna, se estabilizan mediante un complejo de múltiples subunidades llamado MICOS. Mic60 es la subunidad principal de MICOS, que además contiene Mic10, Mic13, Mic14, Mic19, Mic25, Mic26 y Mic27. MICOS también se asocia con el complejo SAM en la membrana externa para formar una estructura conocida como complejo de puente de espacio intermembrana mitocondrial (MIB).

(Lectura adicional recomendada sobre crestas, MICOS y ultraestructura: [2,9,10].)

2.2. Importación de proteínas mitocondriales

Desde sus orígenes endosimbiontes, las mitocondrias humanas han retenido solo 37 genes en un pequeño genoma circular conocido como ADN mitocondrial (ADNmt), que codifica 13 polipéptidos, 22 ARNt y 2 ARNr. Las restantes 1000-1500 proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo y deben importarse y clasificarse en el compartimento mitocondrial relevante después de la síntesis en el citosol. Básicamente, la importación de proteínas mitocondriales está mediada por complejos de proteínas multiméricos conocidos como translocasas, que se encuentran en las mitocondrias (figura 1). En resumen, dos translocases principales residen en la membrana externa de las mitocondrias: el complejo Translocase of the Outer Membrane (TOM) y la maquinaria de clasificación y ensamblaje (SAM). El complejo TOM es el punto de contacto inicial para casi todos los precursores mitocondriales y proporciona un medio de entrada al orgánulo. Después de la translocación a través de TOM, las rutas de importación de precursores divergen según la información de orientación y la ubicación final dentro del orgánulo. Las proteínas de barril β de la membrana externa se clasifican en el complejo SAM para su integración en la membrana. Hay dos translocases incrustados en la membrana interna de las mitocondrias: los complejos Translocase of the Inner Membrane (TIM) 22 y 23 (TIM22 y TIM23). TIM22 media la inserción de proteínas de membrana politópica no escindibles en la membrana interna, mientras que el complejo TIM23 es responsable de importar precursores a través de la membrana interna a la matriz o, en algunos casos, puede liberar lateralmente precursores transmembrana en la membrana interna. Finalmente, la maquinaria de Ensamblaje del Espacio Intermembrana Mitocondrial (MIA) media la importación de pequeñas proteínas espaciales intermembrana ricas en cisteína y acopla su importancia a su oxidación [11]. Estas vías y máquinas de importación se han caracterizado predominantemente en organismos fúngicos; sin embargo, en años más recientes, el análisis en eucariotas superiores ha descubierto importantes consecuencias fisiológicas debido a perturbaciones en la importación de proteínas. Específicamente, las mutaciones en genes que codifican subunidades de importación de proteínas causan distintas enfermedades mitocondriales con fenotipos que van desde defectos musculares graves hasta neurodegeneración y defectos congénitos del crecimiento [12].

(Lectura adicional recomendada sobre la importación de proteínas mitocondriales: [13-15].)

2.3. Dinámica mitocondrial: sitios de contacto de fisión, fusión y orgánulos

Como red de orgánulos, las mitocondrias se someten a fisión y fusión para replicarse, reciclarse y alterar su bioenergética. La fusión de la membrana externa está mediada por interacciones homotípicas entre las GTPasas Mfn1 y Mfn2 en las mitocondrias adyacentes (figura 2) [16], pero los dominios implicados y el mecanismo de fusión escalonado todavía se debaten. La fusión de la membrana interna está controlada por Opa1, que existe como cinco isoformas generadas por empalme de ARNm y escisión proteolítica (figura 2) [17]. Se cree que la estequiometría de estas isoformas gobierna las interacciones de Opa1 con la cardiolipina lipídica específica de las mitocondrias y, posteriormente, los eventos de fusión [18]. La fusión mitocondrial se asocia con una mayor producción de ATP por fosforilación oxidativa y protege contra el estrés oxidativo y proteostático [19]. Por el contrario, la fisión mitocondrial es concomitante con la dependencia de la glucólisis y precede al recambio mitocondrial. La fisión depende en gran medida de la proteína citosólica y relacionada con dinamina Drp1, que se oligomeriza alrededor y contrae los túbulos mitocondriales (figura 2). El reclutamiento de Drp1 del citosol requiere proteínas adaptadoras en la membrana externa mitocondrial, incluidas Mff, Mid49 y Mid51 [20,21], aunque el Fis1 humano puede promover la fragmentación mitocondrial independiente de Drp1 mediante la inhibición de proteínas de fusión [22] (figura 2) . Si bien se han propuesto modelos contradictorios de reclutamiento de Drp1, se sabe que su localización y actividad están reguladas por numerosas modificaciones postraduccionales [23]. La capacidad de escisión de los oligómeros Drp1 está limitada estéricamente a túbulos de hasta 250 nm de diámetro, lo que indica que se requiere preconstricción para mitocondrias más grandes [24]. Esto se logra mediante el retículo endoplásmico (RE), que envuelve y contrae los túbulos para marcar los futuros sitios de fisión y ayudar a la partición correcta del contenido mitocondrial [25, 26].

Figura 2. Mecanismos celulares que median la fisión mitocondrial, la fusión y la formación de sitios de contacto con el retículo endoplásmico. Las mitocondrias se someten continuamente a fisión y fusión. La fisión está mediada por la GTPasa Drp1, que puede ser reclutada en la membrana mitocondrial externa por una variedad de receptores, incluidos Mff, Fis1, Mid49 y Mid51. Drp1 en la membrana externa puede oligomerizarse en fibrillas que constriñen las mitocondrias para iniciar la fisión. La fusión mitocondrial se inicia mediante la unión de las mitocondrias a través de interacciones homotípicas entre Mfn1 y Mfn2 en mitocondrias opuestas. La fusión de la membrana interna está mediada por OPA1, que existe como formas largas y cortas generadas a través de la proteólisis. Los sitios de contacto entre las mitocondrias y el retículo endoplásmico (RE) se establecen y mantienen mediante interacciones proteína-proteína. Las interacciones ocurren entre las moléculas Mfn2 en la membrana del RE y la membrana mitocondrial externa, y entre VAPB en la membrana del RE y RMDN3 en la membrana externa mitocondrial. También se producen interacciones entre IP3R3, un canal de calcio en la membrana del RE, y VDAC1 y hTom70 en la membrana externa mitocondrial.

Las mitocondrias también participan en extensos contactos dinámicos entre orgánulos que coordinan los intercambios funcionales entre las mitocondrias y otros componentes celulares [27]. En particular, los sitios de contacto ER-mitocondrias (ERMC) facilitan una multitud de funciones que incluyen la fisión mitocondrial, la biosíntesis de la coenzima Q, la transferencia de lípidos, la transferencia de Ca 2+, la replicación del mtDNA y la autofagia [25,26,28-31]. La estructura de encuentro ER-mitocondria (ERMES) ha sido bien caracterizada en Saccharomyces cerevisiae [32], sin embargo, no se ha identificado ningún equivalente humano [33]. El trabajo preliminar en humanos sugiere que los ERMC de metazoos están unidos por interacciones entre hTom70 e IP3R3, VDAC1 e IP3R3, RMDN3 y VAPB, homodímeros de Mfn2, Vps13a y Pdzd8 con un compañero desconocido (figura 2) [34-39]. Además, se han propuesto "pistas" de microtúbulos acetilados para mantener estos contactos a pesar de los movimientos y la remodelación de las dos redes orgánicas [40]. Se han descrito otros contactos entre orgánulos entre las mitocondrias y el aparato de Golgi [27,41], peroxisomas [42], lisosomas [43], gotitas de lípidos [44] y la membrana plasmática [45]. La interconectividad de las mitocondrias con los componentes celulares permite una interacción significativa a través de varias vías, ejemplos de los cuales destacaremos a lo largo de esta revisión (tabla 1).

Tabla 1. Nombres completos e identificadores de proteínas discutidos en esta revisión.

(Lectura adicional recomendada sobre la dinámica mitocondrial: [46-48] sobre contactos de orgánulos: [49-51].)

3. Mitocondrias y metabolismo

Las mitocondrias son bien conocidas por proporcionar energía a la célula, predominantemente mediante el acoplamiento del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) con la fosforilación oxidativa. El ciclo de TCA es una serie de ocho reacciones enzimáticas que ocurren en la matriz para recolectar electrones del citrato y sus intermediarios catabólicos (figura 3a). La entrada típica al ciclo es la acetil-CoA, que se puede producir a partir de glucosa (mediante glucólisis), ácidos grasos (mediante β-oxidación) y aminoácidos (mediante desaminación) (figura 3).a). Los electrones capturados a lo largo del ciclo son transferidos por NADH y FADH2 a los complejos de la cadena de transporte de electrones. Los complejos I-IV de los electrones lanzadera de la cadena de transporte de electrones utilizan su energía para bombear protones hacia el espacio intermembrana y establecer un gradiente electroquímico a través de la membrana interna. El complejo V (ATP sintasa) libera los protones nuevamente en la matriz, utilizando la energía del gradiente electroquímico para producir ATP, la moneda de energía de la célula (figura 3a) [52]. Aunque normalmente es eficaz, la fosforilación oxidativa está regulada negativamente por la acumulación de su subproducto tóxico, las especies reactivas de oxígeno (ROS). Si no se controla, las ROS pueden dañar las mitocondrias, inducir la agregación de proteínas e introducir mutaciones en el ADN [53-55]. Los avances recientes en la microscopía crioelectrónica han revelado que los complejos I, III y IV pueden ensamblarse para formar supercomplejos que se cree reducen la cantidad de ROS producidos durante el transporte de electrones, así como mejoran las tasas de respiración [56].

Figura 3. Las mitocondrias coordinan procesos metabólicos esenciales. (a) Las mitocondrias son más conocidas por albergar la maquinaria proteica necesaria para generar ATP. Cuando hay oxígeno disponible, la mayoría de las células generarán ATP a través de la fosforilación oxidativa, donde los electrones recolectados a través de reacciones catabólicas se utilizan para alimentar la ATP sintasa. Los electrones se obtienen a través del ciclo TCA, que ocurre en la matriz y consta de ocho reacciones enzimáticas. La acetil-CoA es la entrada principal para el ciclo del TCA y se puede obtener mediante el metabolismo de la glucosa, los ácidos grasos y los aminoácidos. Los electrones extraídos durante el ciclo de TCA se cargan en NAD + y FAD 2+. Los electrones se transfieren posteriormente desde NADH y FADH2 sobre los complejos I y II de la cadena de transporte de electrones. Los electrones pasan a través de los complejos III y IV, que transportan protones al espacio intermembrana. Se permite que los protones regresen a la matriz a través de la ATP sintasa (Complejo V), que utiliza la energía del gradiente de protones para convertir ADP en ATP. (B) El metabolismo mitocondrial de un carbono (1C) comprende una serie de reacciones paralelas y reversibles que ocurren en el citosol y la matriz mitocondrial. En las células en proliferación, la reacción normalmente procede en una dirección específica, de modo que el formiato producido dentro de las mitocondrias puede usarse para procesos biosintéticos en el citosol. Dentro de las mitocondrias, SHMT2, MTHFD2 y MTHFD1 L actúan secuencialmente sobre THF y serina importadas del citosol para producir formiato, que se exporta de nuevo al citosol. El MTHFD1 citosólico carga formato en THF para formar intermedios de folato cargados que se pueden usar para sintetizar nucleótidos de purina y pirimidina.El metabolismo mitocondrial 1C también es una fuente importante de glicina. (C) La matriz mitocondrial funciona como un importante lugar de almacenamiento de iones calcio. La captación de calcio mitocondrial a menudo ocurre en los sitios de contacto con ER, donde se pueden liberar grandes volúmenes de Ca 2+ a través de IP3R3. El calcio puede pasar libremente a través de la membrana externa a través de los canales VDAC y se transporta a través del espacio intermembrana y la membrana interna a través de la función coordinada de un dímero MICU1 / MICU2 que se acopla a la MCU en la membrana interna. El calcio puede salir de la matriz mitocondrial a través de LETM1 o SLC8B1 (a cambio de H + o Na +, respectivamente) y puede cruzar la membrana externa a través de VDAC o NCX3.

Las mitocondrias también producen ácidos grasos, aminoácidos, nucleótidos y grupos hemo para la célula a través de vías biosintéticas [57-59]. Uno de estos procesos, el metabolismo de un carbono (1C), produce glicina, metionina, nucleótidos, fosfatidilcolina y unidades 1C (grupos similares al metilo) a partir del catabolismo de la serina a través de la química redox del folato y sus derivados (figura 3).B) [60]. Estas unidades 1C cobran al donante de metilo universal S-adenosilmetionina necesaria para la metilación de proteínas y cromatina [61]. En la actualidad existe evidencia significativa de enzimas metabólicas y metabolitos que alteran la expresión génica como indicadores de condiciones ambientales (disponibilidad de nutrientes, hipoxia, estrés oxidativo) o disfunción mitocondrial. Esto se ha demostrado para acetil-CoA, intermedios de TCA, cetonas, lactato, ácidos grasos y aminoácidos [62-68]. Los estudios emergentes también indican que la detección de nutrientes y energía celular por parte de la quinasa mTOR regula la biogénesis mitocondrial y la síntesis de proteínas [69]. A través de los efectores posteriores de la transcripción y la traducción, mTORC1 estimula la biogénesis mitocondrial y el metabolismo oxidativo para satisfacer la demanda de energía del anabolismo [70-72]. Curiosamente, el supresor de tumores p53 inhibe el crecimiento y la proliferación mediados por mTOR para prevenir la oncogénesis [73,74]. La actividad de p53 aumenta la eficacia de la cadena de transporte de electrones [75], la estabilidad del mtDNA [76,77] y la reducción de los niveles de glutatión (GSH) [78] para limitar la producción de ROS e inhibir la glucólisis [79,80], lo que contribuye al potencial replicativo de células tumorales [79,81,82]. Por tanto, el metabolismo está íntimamente integrado con otras vías celulares, pero no es la única contribución de las mitocondrias a los mecanismos de señalización.

(Lectura adicional recomendada sobre el metabolismo: [60,83] sobre la señalización de metabolitos: [68,84] sobre mTOR / p53: [85,86].)

4. Señalización

4.1. Las mitocondrias controlan la homeostasis del calcio

Los iones de calcio son comunes a diversas vías de señalización. La membrana mitocondrial externa es permeable al Ca 2+, en parte debido a las proteínas VDAC que forman canales [87] y se exportan a través de SLC8A3 [88]. El complejo uniportador de calcio de la membrana interna mitocondrial (MCU) regula el transporte hacia la matriz (figura 3C). La permeabilidad del complejo MCU se calibra mediante dos subunidades reguladoras, MICU1 y MICU2, que están unidas por un enlace disulfuro intermolecular introducido por hMia40 [89,90]. La capacidad de las mitocondrias para acumular Ca 2+ en concentraciones hasta 20 veces más altas que el citosol les permite funcionar como sistemas tampón y restablecer la homeostasis después de estallidos de Ca 2+ [91,92]. Las explosiones de Ca 2+ en el citosol, a través de la membrana plasmática o las reservas intracelulares, pueden iniciar la liberación de neurotransmisores, la contracción de las fibras musculares y la regulación transcripcional. En las neuronas, el tampón de Ca 2+ mitocondrial modula tanto la propensión como la duración de la liberación de neurotransmisores [93,94]. En el músculo cardíaco, la contracción se acopla a una mayor producción de ATP mitocondrial a través de las actividades aumentadas de Ca 2+ de las enzimas del ciclo del TCA, el Complejo V y el transportador de ADP / ATP [95-98], un efecto maximizado por las concentraciones locales de Ca 2+ en los ERMC [29 , 99] (figura 3C). Además, la regulación del Ca 2+ mitocondrial influye en la secreción hormonal [100], la regeneración tisular [101] y la señalización del interferón-β a través de la proteína de señalización antiviral mitocondrial, MAVS [102].

(Lectura adicional recomendada sobre la señalización de Ca 2+ mitocondrial: [92,103,104].)

4.2. Funciones de las mitocondrias en las respuestas inmunitarias

La contribución de las mitocondrias a las respuestas inmunitarias es un área de investigación en crecimiento. La señalización inmune autónoma de la célula es impulsada por MAVS en la membrana externa, que actúa como un punto de retransmisión para la transducción de señales inmunes. Los receptores tipo rig en el citosol experimentan cambios conformacionales al detectar ARN o ADN viral y son reclutados para MAVS, particularmente en ERMCs [105]. MAVS luego se dimeriza para permitir la unión de múltiples adaptadores de señalización aguas abajo, incluidos TRADD, TRAF3 y STING para activar la transcripción NF-κB e IRF-3/7 de interleucinas y citocinas proinflamatorias [106-108] (figura 4).a). Curiosamente, los dímeros MAVS y muchos de sus adaptadores inmunoprecipitan conjuntamente con hTom70 del complejo TOM, cuya sobreexpresión aumenta la respuesta de señalización [109]. La señalización de MAVS también se ve afectada por ROS y regulada negativamente por Nlrx1, un socio de unión del Complejo III y MAVS [110,111] (figura 4a). Como la importación de proteínas mitocondriales y el metabolismo oxidativo pueden ser secuestrados por factores de virulencia [112], estas interacciones pueden hacer que los MAVS sean sensibles a las consecuencias de la infección. Por último, si las mitocondrias se ven comprometidas por una infección, el aumento de ROS y la liberación de mtDNA en el citosol pueden activar el inflamasoma NLRP3 para provocar una respuesta inflamatoria [113,114] (figura 4).a).

Figura 4. Las mitocondrias hacen contribuciones cruciales a diversos procesos celulares. (a) La membrana externa mitocondrial es el sitio de importantes eventos de señalización durante la respuesta inmune innata. La detección de ácidos nucleicos virales por receptores tipo Rig (RLR) induce la dimerización de MAVS, una proteína de la membrana externa mitocondrial. MAVS dimerizado recluta adaptadores de señalización que inician la activación aguas abajo de IRF3 / 7 y NF-κB, factores de transcripción que inducen la expresión de interferones de tipo I y citocinas proinflamatorias. MAVS está regulado por NLRX1, una proteína que regula negativamente MAVS cuando se localiza en la membrana externa, pero activa MAVS cuando está en la membrana interna al interactuar con el Complejo III para inducir la producción de ROS. La liberación de mtDNA durante la infección también puede activar el inflamasoma NLRP3. (B) La mitofagia es un proceso que permite identificar y destruir las mitocondrias dañadas. En condiciones normales, PINK1 se importa a las mitocondrias y PARL lo degrada. Cuando se dañan las mitocondrias, la importación se ve afectada y PINK1 se acumula en el complejo TOM en la membrana externa. El PINK1 autofosforilado y activo en la membrana externa fosforila las moléculas de monoubiquitina en las proteínas de la membrana externa, reclutando y activando la ubiquitina ligasa E3 Parkina. La parkina activada sintetiza cadenas de poliubiquitina que reclutan receptores de autofagia para iniciar la mitofagia. (C) El estrés proteostático mitocondrial se detecta a través de la partición del factor de transcripción ATF5 entre las mitocondrias y el núcleo. En condiciones normales, ATF5 se importa y se secuestra dentro de las mitocondrias. Si la importación de proteínas mitocondriales se ve comprometida, ATF5 se transmite al núcleo, donde regula al alza la expresión de genes que mejoran la proteostasis. (D) Las mitocondrias juegan un papel crucial en el inicio de la apoptosis. En respuesta a estímulos proapoptóticos, Bax y Bak se oligomerizan en la membrana externa para formar poros que permiten la salida de proteínas apoptógenas (citocromo C, Diablo, AIF y Endonucleasa G) desde el espacio intermembrana hacia el citosol. Citocromo C se une a Apaf-1 para inducir la formación del apoptosoma y la activación de caspasas. Diablo bloquea los inhibidores de la apoptosis (IAP) que de otro modo mitigarían el efecto de las caspasas. El AIF y la endonucleasa G se traslocan al núcleo donde contribuyen a la destrucción del genoma.

El metabolismo mitocondrial también dirige cambios rápidos a las células inmunes especializadas durante la infección. Los cambios en el potencial de membrana pueden activar o suprimir los macrófagos M2 [115,116] y los macrófagos M1 derivan intermedios del ciclo TCA para generar óxido nitroso, IL-1β y el ácido itacónico antibacteriano [117,118]. Además, las capacidades fagocíticas de los macrófagos dependen de la producción de ROS mitocondriales para destruir patógenos internalizados [119]. Las células T ingenuas muestran aumentos en la masa mitocondrial, el número de copias del mtDNA, la glucólisis y el metabolismo de la glutamina durante la diferenciación para una rápida proliferación y para escapar de la inactividad [120,121]. La remodelación metabólica también decide el destino maduro de las células T [122,123], alterando la arquitectura de las crestas [124] o por efecto directo de los metabolitos sobre la regulación de la transcripción epigenética [125].

(Lectura adicional recomendada sobre la señalización inmunitaria mitocondrial: [106,118,126].)

5. Ciclo celular, diferenciación y muerte

Las mitocondrias están implícitamente ligadas al control del ciclo celular como proveedores de energía y nucleótidos, sin embargo, también coordinan puntos de control y responden a señales de proliferación. Para satisfacer la demanda metabólica de la mitosis, la masa mitocondrial y el potencial de membrana aumentan de G1/ S hasta el estadio mitótico tardío [127]. De hecho, la hiperpolarización y el aumento de la producción de ATP inhiben la AMP quinasa para permitir la entrada mediada por ciclinaE en la fase S [128]. En la etapa tardía de G2 de dividir S. cerevisiae, el complejo ciclinaB1 / Cdk1 se transmite a las mitocondrias para fosforilar las subunidades del Complejo I y Tom6, estimulando el metabolismo oxidativo tanto directa como indirectamente a través del aumento de la importación de proteínas [129,130]. Durante la mitosis, una red mitocondrial muy fusionada y reticular se fragmenta progresivamente en pequeños orgánulos tubulares que se segregan en previsión de la citocinesis [127,131]. Las mitocondrias también pueden retrasar la progresión del ciclo celular para aumentar su biogénesis [132], debido a una producción insuficiente de nucleótidos [133] o debido a la acumulación de ROS [134]. Además, el mediador de fusión Mfn2 puede secuestrar tanto Ras como Raf para inhibir la señalización proliferativa [135].

La diferenciación de células madre también se basa en las mitocondrias como un "interruptor metabólico". Las células madre embrionarias humanas son glucolíticas, sin embargo, desarrollan crestas maduras, replican rápidamente el mtDNA y aumentan la producción de ATP tras la diferenciación [136]. En la diferenciación de células madre hematopoyéticas, la regulación a la baja de Pdk2, un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa, libera la supresión de la producción de acetil-coA y permite la fosforilación oxidativa [137]. El consiguiente aumento de la producción de ROS y la fosforilación oxidativa durante la diferenciación impulsa la regulación positiva de las proteínas antioxidantes mitocondriales por los factores de transcripción Oct4, Sox2 y Nanog [138]. Se cree que la fusión mitocondrial facilita estos cambios metabólicos, aunque la importancia de proteínas específicas y el equilibrio de fisión / fusión puede ser específico del tipo celular [139-141]. Esto está respaldado por estudios de reprogramación de células somáticas que muestran que la deleción de Mfn2 permite la pluripotencia a medida que la glucólisis se vuelve predominante sobre la fosforilación oxidativa [142], logrando el mismo efecto la activación del factor de pluripotencia ZFP42 de Drp1 [143].

Si las condiciones celulares o las agresiones externas son demasiado duras, las mitocondrias pueden desencadenar múltiples formas de muerte celular. La apoptosis, o muerte celular programada, puede ser provocada por la señalización extrínseca a través de los receptores Fas, TRAIL y TNFα o por agresiones intrínsecas como daño al ADN, sobrecarga de Ca 2+, ROS y estrés del RE [144]. Las mitocondrias contribuyen a la vía extrínseca pero son el nexo de la vía apoptótica intrínseca. En la última vía, el Bax proapoptótico citosólico se oligomeriza con Bak en la membrana externa para permeabilizar las mitocondrias y liberar proteínas proapoptóticas, incluido el citocromo. C, Diablo, Htra2, Endonucleasa G y AIF (figura 4D) [145]. En el citosol, citocromo C nuclea la formación del apoptosoma y la activación de las caspasas que desmantelan la célula de manera inmunológicamente silenciosa. Cytosolic Diablo y Htra2 bloquean los inhibidores de la activación de caspasa, que de otro modo protegerían a la célula del citocromo basal C fuga [146,147]. La endonucleasa G y AIF se trasladan al núcleo para fragmentar el ADN (figura 4D), El AIF requiere en primer lugar la escisión proteolítica de su dominio transmembrana [148-150]. El AIF es normalmente parte de la maquinaria de importación del espacio intermembrana, o complejo MIA, que ancla la oxidorreductasa hMia40 a la membrana interna. La proteína de la membrana externa VDAC2 protege contra la apoptosis secuestrando a Bak [151,152], aunque nuevas pruebas sugieren que puede ser necesaria para la apoptosis mediada por Bax [153]. La investigación emergente también implica a las mitocondrias en vías alternativas y menos estudiadas de muerte celular, como la necrosis inducida por ROS [154], la necroptosis inmuno-activada [155], la ferroptosis [156,157] y la partenotosis [158].

(Lectura adicional recomendada sobre las mitocondrias en el ciclo celular: [159,160] sobre la diferenciación [161-163] sobre la muerte celular: [164,165].)

6. Control de calidad mitocondrial

La pérdida de la función mitocondrial tiene profundos efectos negativos en la salud celular, por lo que se han desarrollado múltiples mecanismos de control de calidad y respuesta al estrés. La respuesta de la proteína mitocondrial desplegada (mtUPR) detecta el estrés proteostático dentro de las mitocondrias [166]. El factor central de la mtUPR es el factor de transcripción ATF5. Cuando el estrés causa importación de proteínas y / o disfunción de la cadena de transporte de electrones, el ATF5 se acumula en el núcleo para transcribir los genes de proteasa y chaperonas mitocondriales (figura 4).C) [167,168]. los Caenorhabditis elegans También se ha demostrado que el homólogo ATFS-1 reprime la traducción de la subunidad de la cadena de transporte de electrones y las proteínas de ensamblaje de los genomas tanto mitocondriales como nucleares [169]. La traducción de ATF5 está parcialmente controlada por su homólogo ATF4, ambos regulados positivamente en la respuesta integrada al estrés (ISR) [170,171]. El ISR puede desencadenarse por estrés en el RE, falta de aminoácidos o degradación de hTim17A, una subunidad del complejo TIM23 [172,173]. El ISR se caracteriza por la fosforilación de eIF2α, lo que conduce a la reducción global de la traducción y la inducción selectiva de genes citoprotectores que incluyen proteínas de autofagia y MCL1 pro-supervivencia. Esto ilustra la preferencia por la eliminación de orgánulos defectuosos sobre la muerte celular controlada, aunque la respuesta puede alterar con el tipo de célula o la agresión [174].

El aclaramiento autofágico selectivo de las mitocondrias se denomina mitofagia y está controlado por la proteína quinasa serina / treonina mitocondrial PINK1 y la ubiquitina ligasa E3 Parkin. PINK1 se importa constitutivamente a las mitocondrias sanas a través del complejo TOM y se libera lateralmente en la membrana interna por TIM23 [175] antes de la escisión por la proteasa PARL (figura 4B) [176]. La despolarización de la membrana interna en las mitocondrias defectuosas evita la importación de PINK1, lo que hace que se oligomerice en el complejo TOM de la membrana externa [177], donde se autofosforila [178]. Esto desencadena la fosforilación fosfo-PINK1 de la monoubiquitina de la membrana externa basal y recluta a Parkin para que rápidamente poliubiquitinen las proteínas de la membrana externa para el reclutamiento de factores autofagosomas (figura 4).B) [179,180]. Datos recientes sugieren que las mitocondrias pueden identificar e iniciar la mitofagia de túbulos específicos [181], mientras que la mitofagia inducida por la fosforilación CSNK2 / CK2 de hTom22, FUNDC1 y BCL2L13 sugiere una posible influencia o vía citoplásmica [182-185]. Además, las observaciones de la mitofagia transcelular en los astrocitos ilustran que aún se desconoce mucho en estos procesos [186].

Están surgiendo nuevas respuestas al estrés que demuestran la comunicación recíproca entre las mitocondrias y el citoplasma. Ablación de las vías de importación de MIA en S. cerevisiae activa el proteasoma para mitigar la acumulación de precursores mitocondriales en el citosol [187]. Esto se correlaciona con la mtUPR específica del espacio intermembrana de mamíferos (mtUPRSOY S) donde la actividad transcripcional ERRα regula al alza las proteasas del espacio intermembrana y activa el proteasoma [188,189], ya que se ha demostrado previamente que el proteasoma degrada las proteínas del espacio intermembrana desplegadas que se retrotranslocan al citosol [190]. En S. cerevisiae, el proteasoma también es utilizado por Ubx2 para eliminar los precursores de proteínas mitocondriales detenidos durante la translocación, bloqueando el complejo TOM [191]. Recíprocamente, las mitocondrias pueden degradar proteínas defectuosas para ayudar a la proteostasis citosólica. En S. cerevisiae, la Vms1 citosólica puede eliminar los precursores mitocondriales mal traducidos de los ribosomas estancados y dirigir su importación para la degradación intramitocondrial [192] y las proteínas citosólicas propensas a la agregación pueden importarse para la degradación intramitocondrial si las Hsp70 citosólicas fallan [193]. Intrigantes para futuras investigaciones son los informes de fusión lisosomal de vesículas derivadas de mitocondrias enriquecidas con proteínas oxidadas de forma no nativa [194,195] y la eliminación extracelular de agregados por neuronas de C. elegans [196].

(Lectura adicional recomendada sobre el control de calidad mitocondrial: [197-199] sobre mitofagia: [200,201].)

7. Observaciones finales

Esta revisión ilustra la importancia de las mitocondrias para las funciones celulares eucariotas. Como biólogos mitocondriales, con frecuencia nos sorprenden las nuevas vías o redes de proteínas que involucran mitocondrias y / o proteínas mitocondriales. La importación de proteínas mitocondriales y la dinámica estructural proporcionan los medios para alteraciones rápidas en la actividad para facilitar las respuestas biológicas a las moléculas de señalización, la disponibilidad de nutrientes y la agresión patógena. La coordinación temporal de la energía mitocondrial y su capacidad biosintética impulsa la proliferación y diferenciación celular. Sin embargo, la bioquímica altamente reactiva compartimentada en el orgánulo lo hace capaz de inducir la muerte celular y necesita mecanismos de control de calidad. Por lo tanto, comprender esta interacción entre las funciones mitocondriales y sus diversas implicaciones celulares es fundamental para un modelo holístico integral de homeostasis y bioquímica celular. La importancia de esto es evidente en la aparición cada vez mayor de mitocondrias en la investigación médica posgenómica [202]. Aunque las mitocondrias son sin lugar a dudas centros de bioquímica celular, se requiere más investigación fundamental. En particular, dilucidar cómo la mitocondria regula e integra las diversas vías con las que está asociada, en tipos de células / tejidos especializados y en el contexto de la salud y la enfermedad, ayudará a descubrir la verdadera profundidad de influencia que este asombroso orgánulo tiene en las células eucariotas.


Fosforilación oxidativa

Movimiento de electrones desde el NADH citoplásmico al ETC mitocondrial

Las membranas mitocondriales intactas son impermeable a NADH y NAD +, y para que continúe la glucólisis, NAD + debe regenerarse continuamente en el citoplasma (ver Capítulo 26).Por lo tanto, los equivalentes reductores (es decir, los electrones) del NADH, en lugar del NADH mismo, se transportan a través de las membranas mitocondriales por cualquiera de los dos malato (Mal) o glicerol 3-fosfato ( Figura 36-1 ), lo que permite la reformación citoplásmica de NAD + y para NADH y / o FADH2 utilización en el ETC mitocondrial. En el Mal lanzadera, reduciendo equivalentes de NADH son aceptadas por oxaloacetato (OAA), formando así Mal que atraviesa las membranas mitocondriales a través de un α-cetoglutarato (α-KG = )-Mal antiporter. Dentro de las mitocondrias, NADH se regenera de Mal, y OAA, que tampoco puede atravesar las membranas mitocondriales, se devuelve al citoplasma mediante conversión reversible a aspartato (Áspid véanse los capítulos 9 y 35). los grupo amina de Áspid se transfiere a α-KG = en el citoplasma, formando así glutamato (Glu), que se devuelve a las mitocondrias a través de un Antiportador Asp-Glu. Dentro de las mitocondrias, Glu transfiere su grupo amina para OAA, reformando así Áspid y completando la lanzadera.

Otro portador de equivalentes reductores es glicerol 3-P, que, como Mal y Asp, atraviesa fácilmente las membranas mitocondriales. Esta lanzadera transfiere electrones desde NADH para fosfato de dihidroxiacetona (DHAP), formando así glicerol 3-P (y NAD +) en el citoplasma. Glicerol 3-P luego cruza la membrana mitocondrial externa y se reoxida a DHAP por el MODA grupo protésico de glicerol 3-P deshidrogenasa. FADH2 se forma así en la membrana mitocondrial interna, y DHAP se difunde de nuevo en el citosol para completar la lanzadera. En algunas especies, la actividad de este transbordador disminuye después de la tiroidectomía. Aunque está presente en el músculo de vuelo de los insectos, el cerebro, el tejido adiposo marrón, el tejido muscular blanco y el hígado de los mamíferos, en otros tejidos (por ejemplo, el músculo cardíaco), mitocondrial glicerol 3-P deshidrogenasa es deficiente. Por tanto, se cree que el lanzadera de malato es de utilidad más universal que el lanzadera de glicerol 3-P, particularmente desde 3 en vez de 2 ATP se puede generar por átomo de O2 consumido (ver más abajo).


2. Metabolismo compartimentado de aminoácidos

2.1. Glutamina

En condiciones fisiológicas, la glutamina es uno de los aminoácidos más abundantes en circulación [4,5]. El suministro de glutamina se deriva tanto de fuentes dietéticas como de síntesis de novo, la última de las cuales requiere glutamato y amoníaco y es catalizada por la glutamina sintetasa (GS) en el citosol. La actividad de GS está bien descrita en el cerebro como un medio para eliminar el exceso de amoníaco por los astrocitos, y el metabolismo disfuncional del amoníaco puede provocar encefalopatía hepática y edema cerebral [6,7]. En células con altas tasas de proliferación (p. Ej., Células cancerosas, linfocitos T activados), la demanda de glutamina supera la oferta y el acceso ambiental se vuelve & # x0201ccondicionalmente esencial & # x0201d [8,9,10,11,12]. Cuando los nutrientes se vuelven limitados localmente, varios cánceres, incluidos el de páncreas, glioblastoma y ovario, secuestran la síntesis de glutamina estromal como una línea de suministro alternativa para satisfacer sus demandas aumentadas [13,14,15]. Además, la privación de glutamina suprime la expansión de los linfocitos T activados, y la competencia por los nutrientes dentro de los tejidos puede afectar las respuestas inmunitarias a estados patológicos que exhiben aumentos característicos en el consumo de nutrientes (p. Ej., Infección viral, cáncer) [10,16,17,18].

La abundancia de glutamina en circulación refleja su robusta versatilidad para satisfacer los requisitos metabólicos más allá de la traducción de proteínas (Figura 1). La glutaminólisis representa una de las principales vías catabólicas importantes para la generación de intermediarios de TCA, ácidos grasos, equivalentes reductores necesarios para la fosforilación oxidativa y aminoácidos no esenciales. El primer paso de la glutaminólisis ocurre en las mitocondrias y es catalizado por la enzima glutaminasa (GLS), que convierte la glutamina en glutamato. Hay dos isoenzimas de GLS, la de tipo renal (GLS1) y la de tipo hepático (GLS2) [19]. El glutamato producido mitocondrialmente cumple una serie de funciones metabólicas directas e indirectas. Por ejemplo, el glutamato puede ser oxidado por la enzima glutamato deshidrogenasa (GLUD1) dependiente de NAD (P) + o contribuir con su nitrógeno amino para la síntesis de aminoácidos no esenciales por transaminasas citosólicas y / o mitocondriales (p. Ej., GOT1 / 2 para aspartato , PSAT1 para serina, GPT1 / 2 para alanina). El glutamato también es necesario para la síntesis de glutatión (GSH) y se utiliza como columna vertebral para la biosíntesis de prolina y arginina. Por otro lado, se ha demostrado en varios contextos que el catabolismo de otros aminoácidos (p. Ej., Prolina) es una fuente importante de glutamato. Para proporcionar flexibilidad metabólica en condiciones de nutrientes limitados, las células de cáncer de páncreas eliminan los péptidos de colágeno de la matriz extracelular y utilizan la prolina como fuente anaplerótica cuando los niveles de glutamina son bajos [20]. Además, también se ha demostrado que el catabolismo de la prolina por la prolina deshidrogenasa (PRODH) es una fuente importante de glutamato en la metástasis de las células del cáncer de mama [21]. En otros contextos, la pirrolina 5-carboxilato reductasa 1 mitocondrial (PYCR1) redirige el exceso de NADH mitocondrial y / o glutamato hacia la síntesis de prolina en células de glioma mutante de isocitrato deshidrogenasa 1 (IDH1), lo que lleva a un ciclo de TCA parcialmente desacoplado que permite que las células regulen la NAD mitocondrial + / NADH [22].

Vías bioquímicas y transportadores que involucran glutamina (Gln) e intermedios relacionados. La glutamina es transportada por transportadores de membrana plasmática (p. Ej., SLC1A5 / ASCT2, SLC6A14 / ATB 0, +, SLC38A1 / SNAT1, SLC38A2 / SNAT2) y la síntesis de nucleótidos, aminoácidos y glicosilo de combustible a través de asparagina sintetasa (ASNS), carbamoil fosfato sintetasa I (CPS1), fosforribosil pirofosfato amidotransferasa (PPAT) y glutamina-fructosa 6-fosfato aminotransferasa (GFPT1). Los gradientes de sodio (Na +) y cloruro (Cl & # x02212) a través de la membrana plasmática determinan la concentración intracelular de glutamina. La glutamina aporta directamente nitrógeno para la biosíntesis de purinas y pirimidinas (marcada en rojo). La glutamina citosólica también puede transportarse a las mitocondrias a través de una variante SLC1A5 dirigida a mitocondrias (MTS) (MTS-SLC1A5 también conocida como SLC1A5_var) donde actúa como una fuente anaplerótica principal para el metabolismo del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) (& # x02018glutamin2019) & # . La glutaminólisis es inhibida por BPTES o CB-839, que se dirigen específicamente a la glutaminasa (GLS). El glutamato derivado de la glutamina es una fuente importante de carbono y nitrógeno para la síntesis de aminoácidos no esenciales. & # x003b1KG, & # x003b1-cetoglutarato Ala, alanina Asp, aspartato CP, carbamoil fosfato F6P, fructosa 6-fosfato GlcN6P, glucosamina 6-fosfato Gln, glutamina Glu, glutamato Oac, oxaloxiacetato P5C, 5-carboxilacetato pirrolina fosfo- & # x003b2- d-ribosilamina Pro, prolina Pyr, piruvato.

Si bien la capacidad para utilizar las vías de glutaminólisis es transcripcionalmente inherente al genoma de todas las células, la tendencia a desviar la glutamina hacia ellas es probablemente específica del tejido, del tipo celular y depende de las necesidades metabólicas condicionales [23]. Por ejemplo, los mamíferos recién nacidos utilizan prolina, no glutamina, como principal aporte anabólico para la síntesis de arginina [24]. Por otro lado, un cambio a la glutaminólisis como la principal fuente de glutamato es intrínseco en muchos contextos de cáncer. La regulación al alza de GLS por vías oncogénicas es un mecanismo común para este cambio metabólico. El factor de transcripción oncogénico c-Myc ha sido implicado como un impulsor de la regulación positiva de GLS1 al suprimir los efectos inhibidores sobre la traducción de GLS1 por miR-23a / b [25]. Esta regulación positiva de GLS1 a través de mecanismos postranscripcionales también se ha atribuido a otros factores pro-neoplásicos. El miembro p65 de NF - & # x003baB regula negativamente la transcripción de miR-23a en células leucémicas, mientras que HSF1, que se expresa de forma ubicua en varios tipos de cáncer, suprime la transcripción del inhibidor de GLS1 miR-137 [26,27]. Además, se demostró que el factor de transcripción c-Jun, un efector aguas abajo de oncogenic-Dbl y la vía de la quinasa JNK-MAP, se une directamente al promotor GLS1 y promueve su regulación positiva [28]. A diferencia de GLS1, GLS2 se ha identificado como un objetivo para el supresor de tumores p53 y, por tanto, puede apoyar propiedades anticancerígenas [29,30]. Esta aparente contradicción puede ser el resultado de diferencias en las propiedades entre las dos isoenzimas GLS y requiere más investigación.

Se ha demostrado además que otros oncogenes median los efectos pro-cancerígenos a través de la regulación positiva de la glutaminólisis. En células de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), se demostró que KRAS oncogénico cambia el metabolismo de la glutamina regulando al alza GOT1 citoplasmático y regulando a la baja GLUD1, estimulando una vía en la que el aspartato derivado de glutamina de las mitocondrias se utiliza como metabolito para generar OAA citosólico [11]. La actividad posterior de la malato deshidrogenasa (MDH) y la enzima málica citosólica (ME1) suministran a las células PDAC la reducción de nucleótidos de piridina necesarios para la homeostasis redox [11]. En un estudio separado, las células PDAC cultivadas en condiciones ácidas también mostraron una mayor dependencia de la glutamina para la homeostasis redox y la anaplerosis [31]. En el cáncer colorrectal (CCR), las mutaciones en el gen PIK3CA, que codifica la subunidad p100 & # x003b1 de PI3K, conducen a la regulación positiva de GPT2 y la dependencia de los intermedios de TCA derivados de glutamina para mantener el crecimiento [32]. Además, el homólogo 1 del receptor hepático (LRH1) se ha implicado como factor de transcripción, que impulsa la formación de tumores a través de los efectos sobre el metabolismo de la glutamina en el carcinoma hepatocelular (HCC) [33]. En general, la regulación positiva de la glutaminólisis en las células cancerosas es casi omnipresente y se logra a través de muchos efectores oncogénicos diferentes.

La inhibición de la glutaminólisis aberrante se ha centrado en gran medida en dirigirse a la actividad de la glutaminasa mitocondrial. El BPTES y el CB-839 más soluble y biodisponible inhiben selectivamente GLS1 y se han investigado como agentes antineoplásicos en varios contextos [34,35,36,37,38]. Sin embargo, ciertos tipos de cáncer (p. Ej., Páncreas, pulmón) demuestran una sensibilidad contradictoria a la inhibición del GLS in vitro e in vivo, lo que sugiere que los tumores pueden ser más independientes de la glutaminólisis in vivo que los modelados en cultivo [39,40]. Además, estos estudios destacan la plasticidad del metabolismo de la glutamina y el glutamato y sugieren que las células pueden redirigir de forma autónoma el flujo metabólico para suministrar glutamato a través de otros medios (Figura 1). El glutamato se produce durante la síntesis de nucleobases de purina y pirimidina y la subunidad de glicosilación N-acetil-glucosamina (GlcNAc). La síntesis de purina y pirimidina utiliza el & # x003b3-nitrógeno de la glutamina para generar 5-fosfo - & # x003b2-d-ribosilamina (PRA) y carbamoil fosfato (CP) mediante fosforribosil pirofosfato amidotransferasa (PPAT) y la carbamoil fosfato sintetasa (CPS) dominio del complejo CAD, respectivamente [41,42,43]. La glutamina citosólica también es un sustrato para la glutamina-fructosa 6-fosfato aminotransferasa (GFPT1), que se utiliza para producir glutamato y glucosamina 6-fosfato (GlcN6P), un precursor de la N-acetilglucosaminilación O-unida [44]. Además, la síntesis de asparagina citosólica por la asparagina sintetasa (ASNS) también produce glutamato. Dadas las numerosas rutas de suministro de glutamato, los esfuerzos para abordar las demandas de glutamina en el cáncer se han ampliado para identificar antagonistas que se dirigen a más de una enzima dependiente de glutamina simultáneamente. La 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON) se desarrolló hace décadas como un posible agente antineoplásico por su actividad inhibidora contra muchas enzimas dependientes de glutamina, incluidas la glutaminasa y la glutamina amidotransferasas [45]. Sin embargo, la toxicidad gastrointestinal (GI) en la mayoría de los pacientes que recibieron DON limitó su uso clínico [46]. Más recientemente, se han desarrollado formas de profármacos de DON con propiedades mejoradas de administración al cerebro o tumores y toxicidad gastrointestinal reducida, lo que ha revitalizado el interés en el uso de antagonistas de glutamina como agentes antitumorales [47,48,49,50,51]. Una estrategia alternativa es limitar el acceso de las células cancerosas a la glutamina inhibiendo la captación dependiente del transportador. Dos de los transportadores de glutamina mejor documentados son de las familias de portadores de solutos (SLC) SLC1A y SLC38A, y el transportador SLC6A14 / ATB 0, + más promiscuo dependiente de Na + / Cl & # x02212 también puede desempeñar un papel en la importación de glutamina [ 52,53,54]. Se han identificado inhibidores de SLC1A5 / ASCT2 y muestran propiedades antitumorales prometedoras en modelos preclínicos [55,56,57,58,59]. Además, dirigirse a los transportadores secundarios de glutamina (p. Ej., SLC38A2, SLC6A14) genética o farmacológicamente (p. Ej., & # X003b1-metiltriptófano) suprime significativamente la homeostasis de aminoácidos y el crecimiento tumoral en el cáncer de páncreas [60,61].

2.2. Aspartato

El aspartato es un aminoácido ácido no esencial que puede adquirirse mediante síntesis de novo y / o importar de fuentes externas. Sin embargo, los niveles circulantes de aspartato en condiciones fisiológicas son bajos (

10 & # x000b5M) y mantenida por las transaminasas de aspartato hepático, por lo tanto, la síntesis probablemente proporciona la mayor parte del aspartato celular en la mayoría de los contextos [4]. La biosíntesis de aspartato se lleva a cabo mediante aspartato aminotransferasas (transaminasas glutámico-oxaloacéticas) en el citosol (GOT1) y en la matriz mitocondrial (GOT2), que, como se mencionó anteriormente, utilizan glutamato como fuente de nitrógeno amino. El aspartato tiene muchos destinos biosintéticos dentro de la célula (p. Ej., Proteínas, nucleótidos y aminoácidos) y también sirve como factor de intercambio para el transportador de aspartato-glutamato (AGC1 / AGC2), un componente esencial de la lanzadera malato-aspartato (MAS ) ( Figura 2 ). MAS es responsable de transferir electrones del NADH citosólico al NADH mitocondrial, ya que los equivalentes reductores (p. Ej., NAD (P) H) no pueden cruzar directamente la membrana mitocondrial interna. Sin embargo, estudios recientes identificaron que SLC25A51 y SLC25A52 facilitan el transporte mitocondrial de NAD + [62,63,64]. Se requiere la actividad posterior de MAS y / o UCP2 para exportar aspartato al citosol, donde puede usarse como fuente proteinogénica y / o precursor de la síntesis de arginina y asparagina [65,66].

Vías bioquímicas y transportadores que involucran aspartato (Asp) e intermedios relacionados. El aspartato es transportado por el transportador de membrana plasmática SLC1A3, que también transporta glutamato. El aspartato es sintetizado por transaminasas glutámico-oxaloacéticas (GOT) presentes en el citosol (GOT1) o mitocondrias (GOT2). La salida mitocondrial de aspartato se produce principalmente a través de SLC25A12 o SLC25A13, que contraintercambian glutamato y son componentes críticos de la lanzadera malato-aspartato (MAS) y UCP2. El aspartato citosólico se utiliza como sustrato para la síntesis de asparagina y arginina a través de la asparagina sintetasa (ASNS) y la argininosuccinato sintasa (ASS1) y como sustrato para la biosíntesis de nucleótidos, aportando carbono y nitrógeno a las purinas y pirimidinas (marcadas en rojo). La asparagina citosólica se utiliza como factor de intercambio de varios aminoácidos a través de un transportador de membrana plasmática desconocido. AA, aminoácido AcCoA, acetil-coenzima A & # x003b1KG, & # x003b1-cetoglutarato Asn, asparagina Asp, aspartato FH, fumarato hidratasa Gln, glutamina Glu, glutamato GSH, glutatión reducido GSSG, glutatión oxidado mallato OX, malato , piruvato SDH, succinato deshidrogenasa UCP2, proteína de desacoplamiento 2.

En muchos contextos, el aspartato es sintetizado predominantemente por GOT2 mitocondrial y se sugiere que es una salida de la actividad de la cadena de transporte de electrones (ETC) mitocondrial en las células en proliferación [11,67,68,69,70,71,72]. Aunque el ATP es otro resultado importante de la actividad ETC, las células en proliferación con acceso suficiente a la glucosa pueden cambiar a la glucólisis aeróbica para satisfacer en gran medida estos requisitos [67]. El aspartato cumple una función biosintética, actuando como donante de nitrógeno para la síntesis de adenina y como esqueleto de carbono a través del orotato para la síntesis de pirimidina. Se ha sugerido que la disponibilidad de aspartato limita la proliferación de ciertos cánceres. Sullivan y col. utilizaron una asparaginasa de cobaya (gpASNase1) para suministrar a los tumores aspartato derivado de asparagina y observaron un mayor crecimiento tumoral en las líneas celulares PDAC colorrectales y murinas HCT116 y AL1376, respectivamente [73]. Curiosamente, gpASNas1 tuvo poco o ningún efecto sobre el crecimiento del tumor AsPC1 humano. De manera similar, algunas células cancerosas utilizan un transportador de glutamato y aspartato de membrana plasmática, SLC1A3, para proporcionar aspartato en condiciones en las que la síntesis de novo está restringida por la inhibición de ETC [74]. La adquisición ambiental de aspartato por SLC1A3 también se ha implicado en microambientes hipóxicos o en respuesta a la restricción de glutamina [72,74,75]. Según se informa, la hipoxia suprime la biosíntesis de aspartato mitocondrial a través de la regulación descendente dependiente de HIF1 y # x003b1 de GOT1 y GOT2 en células de carcinoma renal deficientes en Von Hippel-Lindau (VHL) [76]. Sin embargo, se ha demostrado que las células de cáncer de páncreas mantienen flujos biosintéticos de aspartato en tensiones de oxígeno tan bajas como 0,1% O2 a través de la actividad del Complejo III + IV que contiene supercomplejos respiratorios, que se sugiere que promueven una respiración eficiente en ambientes limitados de oxígeno [77]. En particular, la estabilización máxima de HIF ocurre en

1% O2, muy por encima de las tensiones en las que el oxígeno se convierte en un factor limitante para la respiración mitocondrial [78]. Aunque la glutaminólisis proporciona a las células la mayor parte del carbono necesario para sintetizar aspartato, en los subtipos de cáncer impulsados ​​por deficiencias del ciclo de TCA (p. Ej., Deficiencia de SDH o FH), la actividad de la piruvato carboxilasa puede desviar el piruvato derivado de la glucosa para suministrar el oxaloacetato necesario para esta función anabólica. [79,80,81,82,83,84]. Este cambio a la síntesis de aspartato dependiente de PC también se observó en tumores PDAC in vivo y en líneas celulares de cáncer de mama y pulmón expuestas a tensiones de oxígeno hipóxicas [77,85]. En conjunto, el aspartato es un metabolito anabólico crítico necesario para suministrar nucleótidos para la proliferación de células cancerosas; sin embargo, su síntesis a partir de vías derivadas de glutamina y / o glucosa es compleja y depende en gran medida del contexto ambiental y la disponibilidad de nutrientes.

El aspartato citosólico es utilizado por ASNS y ASS1 para la biosíntesis de asparagina y arginina, respectivamente (Figura 2). La producción de estos aminoácidos apoya la traducción de proteínas, pero también juega un papel indirecto en la proliferación. Por ejemplo, la asparagina actúa como un factor de intercambio de aminoácidos para facilitar la entrada de otros aminoácidos (p. Ej., Serina, treonina) necesarios para regular la actividad y la proliferación de la diana de mamíferos del complejo 1 de rapamicina (mTORC1) [86]. La arginina es una fuente importante de óxido nítrico celular (NO), a través de la actividad de iNOS, o es catabolizada por la arginasa como el paso final del ciclo de la urea. La arginina y otros aminoácidos básicos (p. Ej., Lisina, ornitina) también pueden transportarse a las mitocondrias mediante SLC25A29 [87].Se demostró que la expresión de SLC25A29 estaba elevada en varias líneas de células cancerosas y era importante para la producción de NO por una NOS mitocondrial [88]. La actividad de la arginasa 2 extrahepática (ARG2) también regula la producción de NO mitocondrial [87,89,90]. En particular, varios cánceres regulan negativamente la actividad de estas vías mediante el silenciamiento de la expresión de ASS1 y / o ASNS, creando una dependencia (auxotrofia) para la adquisición ambiental y / o estromal de estos aminoácidos [91,92,93,94]. El silenciamiento de ASS1 y / o ASNS puede proporcionar una ventaja selectiva para las células cancerosas, permitiendo la desviación del aspartato hacia otras vías anabólicas como la biosíntesis de nucleótidos. Es importante destacar que la actividad del MAS y / u otros transportadores de aspartato mitocondrial (por ejemplo, UCP2) representan un paso clave para regular la disponibilidad compartimental de este aminoácido crítico [65,66].

2.3. Serina, glicina y alanina

El metabolismo de los pequeños aminoácidos neutros serina, glicina y alanina se produce tanto en el citosol como en las mitocondrias y tiene implicaciones para la fisiología y las enfermedades humanas (Figura 3). La serina consta de una cadena lateral de hidroximetilo simple y es absorbida o sintetizada de novo a partir del intermedio glucolítico 3-fosfoglicerato por tres enzimas citosólicas, fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), fosfoserina aminotransferasa (PSAT1) y fosfoserina fosfatasa (PSPH). La actividad de la síntesis de serina es importante para el desarrollo normal, ya que la eliminación de Phgdh causa letalidad embrionaria en parte debido a defectos neurológicos [95]. Se cree que la serina, específicamente la D-serina, es un neurotransmisor excitador crítico que actúa como coagonista del receptor de N-metil D-aspartato (NMDA) en las neuronas, y el agotamiento debido a una síntesis deficiente o actividad racemasa probablemente conduce a una neurotoxicidad catastrófica [96]. Se cree que los niveles anormales de D-serina en el cerebro contribuyen a trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia [97,98,99,100]. La expresión de las enzimas de biosíntesis de serina está altamente regulada por varios factores, incluidos NRF2-ATF4 [101,102], c-Myc [103] y factores inducibles por hipoxia [104]. Muchos de estos reguladores transcripcionales están alterados en el cáncer y contribuyen a un aumento del flujo de síntesis de serina, pero también se encontró que la expresión de PHGDH se amplifica a través de la ganancia del número de copias de una región genómica en el cromosoma 1p12 en un subconjunto de mama y melanoma [105,106]. Se ha demostrado que la expresión de PHGDH apoya el crecimiento tumoral específicamente en entornos con niveles bajos de serina, como el líquido cefalorraquídeo donde las concentraciones son significativamente más bajas que en el plasma, y ​​la restricción dietética de serina y glicina reduce el crecimiento tumoral en modelos preclínicos de cáncer y mejora la actividad de los inhibidores mitocondriales [107,108,109,110,111] . Además, un subconjunto de células PDAC regulan negativamente las enzimas de síntesis de serina, y se ha demostrado que el suministro neuronal suministra serina a las células cancerosas específicamente en entornos nulos [112]. Como se cree que la PHGDH es el paso limitante de la síntesis de serina y es importante para la proliferación de líneas de células cancerosas amplificadas con PHGDH, se han desarrollado varios inhibidores [113,114,115]. En particular, la síntesis y captación de serina puede ocurrir en paralelo con el catabolismo, dependiendo del contexto y la demanda intrínseca de la célula de serina y / o sus muchas salidas catabólicas.

Metabolismo de pequeños aminoácidos neutros que incluyen serina (Ser), glicina (Gly) y alanina (Ala). La serina, la glicina y la alanina son transportadas principalmente por los transportadores de la membrana plasmática SLC38A1, SLC38A2, SLC1A4 y SLC1A5 o se sintetizan de novo por vías citosólicas y / o mitocondriales. Los gradientes de sodio (Na +) a través de la membrana plasmática impulsan la concentración intracelular de serina, glicina y alanina. La serina se sintetiza a partir de 3-fosfoglicerato (3pg) a través de un proceso de tres pasos que involucra 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (PHGDH), fosfoserina aminotransferasa (PSAT1) y fosfoserina fosfatasa (PSPH). La serina citosólica se utiliza para varias vías metabólicas, incluida la vía de transulfuración para la síntesis de cisteína de novo y el metabolismo de un carbono mediado por folato (FOCM) que implica serina hidroximetiltransferasa (SHMT) y metilentetrahidrofolato deshidrogenasas (MTHFD). La FOCM ocurre tanto en el citosol como en las mitocondrias y puede producir glicina. En el citosol, la glicina se utiliza para la síntesis de glutatión y purina (marcada en rojo) y actúa como sustrato para el ciclo de la metionina importante para las reacciones de metilación. En las mitocondrias, la glicina se puede escindir mediante el sistema de escisión de glicina (GCS) para proporcionar un carbono que se une para FOCM y es un sustrato para la síntesis del ácido & # x003b4-aminolevulínico (& # x003b4-ALA). Cuando la actividad de GCS es baja, la glicina mitocondrial puede conducir a la acumulación de metilglioxal. Los componentes de FOCM, incluido el 5,10-metilen-tetrahidrofolato (5,10-meTHF) y el 10-formil-tetrahidrofolato (10-formilTHF) pueden contribuir a la biosíntesis de nucleótidos (marcados en azul oscuro y rojo oscuro, respectivamente). La importación de serina mitocondrial se ve facilitada por la sideroflexina 1 y 3 (SFXN1 / 3), el formiato se transporta mediante un mecanismo de transporte (er) desconocido y la glicina es importada por SLC25A38 y otros transportadores pueden estar involucrados. La alanina se sintetiza a partir de piruvato mediante transaminasas glutámico-pirúvicas (GPT) citosólicas o mitocondriales localizadas en el citosol (GPT1) o en las mitocondrias (GPT2). El piruvato es importado a las mitocondrias por el portador de piruvato mitocondrial (MPC1 / 2), un heterodímero obligado. La alanina se intercambia entre el citosol y las mitocondrias por un transportador desconocido. 10-formilTHF, 10-formil-tetrahidrofolato 3pg, 3-fosfoglicerato 5,10-meeTHF, 5,10-metenil-tetrahidrofolato 5,10-meTHF, 5,10-metilen-tetrahidrofolato 5-mTHF, 5-metil-tetrahidrofolato accoa , acetil-coenzima A & # x003b1KG, & # x003b1-cetoglutarato Ala, alanina Cys, cisteína & # x003b4-ALA, & # x003b4-ácido aminolevulínico DMG, brecha de dimetilglicina, gliceraldehído 3-G-fosfato de glucosa reducida, glucina GS glutatión Homocys, homocisteína Lac, lactato Met, metionina Oac, oxalacetato p-Pyr, 3-fosfopiruvato p-Ser, fosfoserina Pyr, piruvato SAH, S-adenosilhomocisteína SAM, S-adenosilmetionina Ser, serina Succ-coa-coa, succinil-THF , tetrahidrofolato.

La serina se utiliza para la síntesis de glicina, así como para la síntesis de ceramidas y esfingolípidos, síntesis de nucleótidos, metabolismo de un carbono mediado por folato (FOCM), regeneración de S-adenosil metionina para reacciones de metilación y transsulfuración para la biosíntesis de cisteína (Figura 3). La síntesis de glicina requiere de las enzimas citosólica y mitocondrial serina hidroximetiltransferasa (SHMT1 / 2) que producen unidades de un carbono en forma de 5,10-metileno-tetrahidrofolato (5,10-meTHF). La actividad posterior de las metilentetrahidrofolato deshidrogenasas (MTHFD1 / 1L / 2) libera formiato, que puede transportarse a través de las membranas mitocondriales. El ciclo metabólico resultante actúa como una lanzadera para los equivalentes reductores de NAD (P) H y las unidades de un carbono necesarias para la síntesis de timidina y purina. La direccionalidad del ciclo metabólico FOCM opera predominantemente de forma oxidativa en las mitocondrias, pero puede revertirse para mantener el suministro de un carbono para la síntesis de nucleótidos en los casos en que se eliminan las isoformas mitocondriales [116,117,118]. Se ha demostrado una alta actividad y dependencia de SHMT1 / 2 para la proliferación en múltiples contextos de cáncer, y se han desarrollado inhibidores dirigidos a estas enzimas [105,106,119,120]. En entornos repletos, el catabolismo de serina por SHMT2 puede ocurrir en exceso y se ha informado la liberación de glicina y formiato, denominada & # x0201cformate overflow & # x0201d, para varias líneas de células cancerosas y no transformadas y en ratones [121]. A través de este mecanismo, el catabolismo de la serina actúa como una fuente significativa tanto de ATP como de NAD (P) H, y se demostró que el flujo a través de esta vía apoya el metabolismo mitocondrial oxidativo [122]. En respuesta a la inhibición farmacológica de la respiración que se espera aumente el NADH / NAD + mitocondrial, el catabolismo de la serina mitocondrial se mantiene, mientras que otras fuentes enzimáticas de NADH (p. Ej., Piruvato deshidrogenasa) fueron inhibidas por retroalimentación [123]. Por tanto, el metabolismo de la serina es muy complejo y puede proporcionar a las células glicina, unidades de un carbono, NAD (P) H y ATP, según el contexto y la demanda celular [124].

La glicina también puede contribuir con unidades de un carbono a través de la actividad mitocondrial del sistema de escisión de la glicina (GCS), que libera CO2, NH3y 5,10-meTHF (Figura 3). En particular, se encontró que la actividad de GCS en muchas líneas de células cancerosas era baja en relación con el catabolismo de la serina [125]. Sin embargo, en el contexto de líneas celulares cancerosas con alto flujo de SHMT2 mitocondrial, la actividad de GCS es necesaria para eliminar el exceso de glicina y prevenir la acumulación de los subproductos tóxicos aminoacetona y metilglioxal derivados de la interconversión de glicina y treonina [126]. Se encontró que el metilglioxal se acumula en los cánceres de pulmón de células no pequeñas en relación con el tejido normal, y el secuestro de metilglioxal tóxico requiere glutatión (GSH) y la actividad de la glioxalasa (GLO1) para prevenir el daño celular [127]. Se ha demostrado que la actividad de la GCS es importante para el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre a través de la regulación epigenética [128]. La glicina extracelular también se puede utilizar para la síntesis de serina dependiente de SHMT, pero requiere una fuente exógena de formiato [125]. Además de FOCM, la glicina también es un precursor necesario para la síntesis de GSH y ácido & # x003b4-aminolevulínico (& # x003b4-ALA mitocondrial) necesarios para la biosíntesis del hemo. La síntesis de glutatión se produce en el citosol, lo que requiere la exportación mitocondrial de glicina y la importación de GSH a orgánulos intracelulares, incluida la mitocondria, que contiene

10 & # x0201315% de GSH celular a una concentración similar a la del citosol [129]. El mantenimiento de las reservas de GSH es importante para regular la actividad de proteínas sensibles a la oxidación postraduccional de residuos de cisteína (p. Ej., PTP1B) [130,131,132]. Se puede comprender la actividad y el papel posterior del metabolismo de la serina y la glicina examinando la captación y secreción extracelular, sin embargo, el intercambio citosólico-mitocondrial es igualmente importante y requiere varios transportadores de membrana plasmática y mitocondriales [121,133].

La síntesis de alanina requiere transaminasas glutámico-pirúvicas citosólicas y / o mitocondriales (GPT1 / 2). La síntesis fisiológica se produce en el músculo esquelético a partir de piruvato y glutamato derivados de la glucólisis y el catabolismo de BCAA, respectivamente. La alanina secretada por los músculos proporciona el carbono necesario para la gluconeogénesis en el hígado, que a su vez devuelve la glucosa a los músculos y secuestra el nitrógeno producido por el catabolismo de la alanina en forma de urea [134,135,136,137]. El ciclo de glucosa / alanina resultante, denominado & # x0201cCahill cycle & # x0201d, es una interferencia importante entre órganos y relevante durante la fisiología normal, el ejercicio, el ayuno y la enfermedad [138]. Se ha propuesto que la desregulación de este ciclo ocurre en pacientes con cáncer, por lo que el aumento de la renovación de proteínas y / o la degradación muscular (& # x0201ccachexia & # x0201d) libera alanina, BCAA y otros aminoácidos para la gluconeogénesis hepática [139,140,141]. Se midió la conversión hepática elevada de alanina a glucosa en pacientes con cáncer de pulmón y otros pacientes con cáncer, pero los niveles plasmáticos de alanina se mantuvieron en su mayoría estables [142,143,144,145]. Los hepatocitos expresan isoformas citosólicas (GPT1) y mitocondriales (GPT2) necesarias para la síntesis y catabolismo de alanina de novo. Sin embargo, los parámetros bioquímicos y los estudios sugieren que GPT1 (Km, ala = 34 mM) y GPT2 (Km, ala = 2 mM) muestran preferencia por el anabolismo y el catabolismo de la alanina, respectivamente, aunque esto depende en gran medida del método utilizado para determinar la direccionalidad [ 146,147,148,149,150]. La evidencia reciente sugiere que las células de cáncer de páncreas tienen una gran demanda de alanina y eliminan la alanina de fuentes estromales (p. Ej., Células estrelladas activadas) [60,151]. La mayoría de las células de cáncer de páncreas humano expresan selectivamente GPT2, tanto a nivel de transcripción como de proteína, lo que sugiere que el metabolismo de la alanina se produce principalmente en las mitocondrias [60]. En particular, el catabolismo de alanina mitocondrial por GPT2 requiere la actividad de un transportador de alanina mitocondrial, que se identificó funcionalmente hace décadas pero sigue siendo desconocido [147]. Se sugirió que la baja expresión de GPT1 citosólico, que catalizaba la síntesis de alanina a partir de piruvato en los hepatocitos, y la captación de alanina proporcionaban a las células de cáncer de páncreas la capacidad de retener piruvato en el citosol y sustentar la glucólisis aeróbica [60,152]. Por el contrario, los linfocitos T na & # x000efve requieren alanina para su activación, ya que ni GPT1 ni GPT2 se expresan en niveles suficientes [153]. Se descubrió que la producción de alanina a partir de piruvato es importante para la metástasis de las células del cáncer de mama, ya que proporciona una fuente de cetoglutarato de & # x003b1 que se utiliza para la hidroxilación del colágeno y la remodelación de la matriz extracelular (MEC) [154]. Es importante destacar que se ha sugerido que el transporte a través de la membrana plasmática puede ser el principal paso limitante de la velocidad del metabolismo de la alanina a concentraciones extracelulares & # x0003c1 mM [147,155,156]. Los niveles plasmáticos normales de alanina son

0.2 & # x020130.4 mM, pero niveles elevados (

1 mM) se han medido intratumoralmente, lo que sugiere una alteración del metabolismo y la disponibilidad de la alanina en el cáncer y en las células estromales asociadas a tumores [157,158]. En particular, se identificó que SLC38A2 / SNAT2 es el principal transportador concentrado de alanina utilizado por las células de cáncer de páncreas y que la selección de SLC38A2 fue suficiente para suprimir la captación de alanina por las células de cáncer de páncreas y provocar un recableado significativo del metabolismo del piruvato compartimentado [60]. En conjunto, estos estudios sugieren que es posible alterar el metabolismo de la alanina en el cáncer al alterar el transporte de la membrana plasmática, y el transporte de alanina mitocondrial puede ser un factor clave en el metabolismo de la glucosa-piruvato-alanina por el músculo esquelético, los hepatocitos y las células cancerosas.

2.4. Aminoácidos de cadena ramificada

Los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) incluyen leucina, isoleucina y valina y se derivan de fuentes dietéticas. Debido a su esencialidad en los mamíferos, el transporte y la detección de BCAA, además de los mecanismos catabólicos de adquisición (p. Ej., Autofagia, macropinocitosis) ha atraído mucho interés. La captación celular de BCAA se ve facilitada principalmente por el transportador de aminoácidos de tipo L (SLC7A5 / LAT1), que requiere dimerización con SLC3A2 / CD98 para funcionar. También transporta aminoácidos aromáticos (p. Ej., Tirosina, fenilalanina) (Figura 4) [159,160]. En particular, LAT1 es independiente del sodio y depende de otros aminoácidos para servir como factores de intercambio para facilitar la importación neta de BCAA [159]. La leucina está bien caracterizada por influir en la señalización de mTORC1, que se activa de forma aberrante en muchos tipos de cáncer [161]. La leucina puede activar la señalización de mTORC1 a través de la detección directa por Sestrin2 y la interrupción de la interacción Sestrin2-Gator2, desencadenando una cascada de señalización a través de efectores descendentes (p. Ej., Proteína de unión al factor 4E de iniciación de la traducción eucariota 1, quinasa p70-S6, ULK1) [161,162,163,164]. Estas señales coordinan la proliferación mediante la actividad de la autofagia y la síntesis de proteínas, lípidos y nucleótidos.

Vías bioquímicas y mecanismos de detección que involucran a los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA) leucina (Leu), isoleucina (Ile) y valina (Val). Los BCAA son importados principalmente por el transportador de aminoácidos grande (LAT1), un dímero que consta de SLC7A5 y SLC3A2 / CD98, que funciona como un intercambiador de aminoácidos y el SLC16A9 / B0AT1 dependiente de Na +. Se cree que la glutamina, transportada principalmente por SLC38A1, SLC38A2 y SLC1A5, proporciona la fuerza impulsora química necesaria para influir en los BCAA a través de LAT1. La leucina citosólica es detectada directamente por Sestrin2 y regula las señales dependientes de mTORC1 que controlan la autofagia, la síntesis de proteínas y la proliferación. Los BCAA pueden ser metabolizados por la transaminasa BCAA (BCAT) presente en el citosol (BCAT1) o mitocondrial (BCAT2), que producen cetoácidos de cadena ramificada (BCKA). Los BCKA citosólicos pueden transportarse a través de transportadores de monocarboxilato SLC16A presentes en la membrana plasmática o mitocondrias. Los BCAA son importados a las mitocondrias por SLC25A44 y pueden contribuir a la producción de acil-CoA a través de la actividad de BCAT2 y BCKA deshidrogenasa (BCKDH), que está regulada por BCKDH quinasa (BCKDK) y proteína fosfatasa 1K dependiente de Mg 2+ / Mn 2+ ( PPM1K). La acil-CoA producida por el catabolismo de los BCAA puede impulsar el metabolismo del ciclo del TCA y la lipogénesis de novo. Los niveles de acetil-CoA se detectan a través de la acetilación de RAPTOR dependiente de EPS300, que a su vez regula la actividad de mTORC1. La propionil-CoA mitocondrial, producida a partir del catabolismo de valina o isoleucina, se metaboliza para producir succinil-CoA, pero puede producir el subproducto metilmalonato (MMA) cuando los niveles de vitamina B12 son bajos. AcCoA, acetil-coenzima A & # x003b1KG, & # x003b1-cetoglutarato Gln, glutamina Glu, glutamato Ile, isoleucina KIC, & # x003b1-ácido cetoisocaproico KIV, & # x003b1-cetoisovalerico xtob002b #1 y #3 -metilvalérico Leu, leucina Oac, oxaloacetato PropCoA, propionil-coenzima A SucCoA, succinil-coenzima A Val, valina.

Debido a la abundante expresión de SLC1A5 / ASCT2 y LAT1, se ha sugerido que la captación de glutamina dependiente de ASCT2 puede servir como factor de intercambio para la entrada de BCAA por LAT1. Sin embargo, ASCT2 es prescindible para la proliferación y la señalización de mTORC1 en muchas líneas de cáncer, y ASCT2 funciona principalmente como un intercambiador incapaz de concentrar la glutamina lo suficiente para impulsar la actividad de LAT1 [55,165,166]. Por tanto, es más probable que los transportadores de glutamina activos secundarios (p. Ej., SNAT1 / SLC38A1, SNAT2 / SLC38A2, SLC6A14 / ATB 0, +) contribuyan a la concentración de glutamina para el intercambio mediado por LAT1. Sin embargo, la deleción de SLC38A2 en el cáncer de páncreas no logró afectar el flujo de captación de BCAA ni de glutamina a pesar de la disminución significativa de los niveles intracelulares de glutamina [60]. Más bien, la cooperatividad del transportador entre los transportadores de glutamina y BCAA puede ser más importante para el mantenimiento del nivel. De hecho, el nocaut LAT1 da como resultado un

Disminución del 90% en el transporte de leucina en las células del carcinoma hepatocelular, pero no logra defectos proliferativos ilícitos, y la eliminación o inhibición de LAT1 no tuvo un impacto negativo en la reactivación de mTORC1 después de la estimulación de EAA [165,167]. Además, se abolió el nocaut de SLC3A2 / CD98

El 90% de la captación de leucina por LAT1 en células de adenocarcinoma de colon, pero no se observaron defectos proliferativos ni activación de la respuesta de estrés de aminoácidos ligados a GCN2 [168]. Por tanto, el transporte de BCAA y / o glutamina por la membrana plasmática puede no ser limitante o depende en gran medida del contexto celular, y la capacidad de transporte mínima puede ser suficiente para satisfacer las demandas biosintéticas y catabólicas de estos aminoácidos. En contraste, LAT1 fue regulado significativamente al alza en un Apc fl /Florida LSL-Kras G12D /+ Villin CreER modelo de ratón de cáncer colorrectal y deleción dirigida de Slc7a5 dio lugar a un retraso de la tumorigénesis y una mejora de la supervivencia [169]. Además, JPH203, un inhibidor de molécula pequeña de LAT1, ha demostrado una eficacia preclínica significativa en el cáncer colorrectal y el linfoma / leucemia linfoblástica de células T y fue bien tolerado en un estudio de fase I en pacientes con tumores sólidos avanzados [170,171,172]. Otros sistemas de transporte pueden facilitar la captación de BCAA, incluido el SLC6A19 / B0AT1 dependiente de Na +, que puede contribuir a una sensibilidad diferente en respuesta a la deleción de LAT1 [173,174]. Los inhibidores dirigidos a SLC6A19 / B0AT1 se han desarrollado utilizando enfoques de cribado in silico y de alto rendimiento [175,176].

Además de utilizarse para la síntesis de proteínas, los BCAA pueden contribuir a salidas anabólicas y bioenergéticas importantes para la fisiología humana y la actividad desregulada se atribuye a múltiples enfermedades (revisado en [161,177,178]) (Figura 4). A través de la actividad catalítica de las aminotransferasas de cadena ramificada altamente reversibles (BCAT1 / 2) localizadas dentro del citosol (BCAT1) o la matriz mitocondrial (BCAT2), el catabolismo de los BCAA proporciona a las células nitrógeno amino para la síntesis de glutamato, así como cetoácidos de cadena ramificada (BCKA) (p. Ej. , & # x003b1-cetoisocaproico, KIC & # x003b1-cetoisovalérico, KIV & # x003b1-ceto - & # x003b2-metilvalérico, KMV) que contribuyen a la síntesis de acil-CoA, la lipogénesis y el metabolismo del ciclo del TCA. Mientras que BCAT2 se expresa de forma ubicua, BCAT1 se expresa de forma selectiva en el cerebro, el ovario y la placenta [179]. BCAT1 suele estar regulado positivamente en muchas líneas de cáncer diferentes, como el glioblastoma humano, el cáncer de mama y el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), mientras que BCAT2 parece más importante para el cáncer de páncreas [180]. Además, los niveles elevados de BCAA en plasma se asocian con varias enfermedades, incluidas las enfermedades cardiovasculares, el cáncer de páncreas y el cáncer de mama [139,181,182]. En las mitocondrias, los BCKA pueden sufrir una descarboxilación irreversible por el complejo de cadena ramificada & # x003b1-cetoácido deshidrogenasa (BCKDH), que consta de tres subunidades (E1, E2 y E3). La actividad de BCKDH está regulada negativamente por el estado de fosforilación de la subunidad E1. La quinasa BCKDH (BCKDK) y la proteína fosfatasa 1 K dependiente de Mg 2+ / Mn 2+ (PPM1K) coordinan la actividad de oxidación de BCKA. Se demostró que la actividad de PPM1K regula positivamente el catabolismo de BCAA importante para la leucemogénesis [177,183]. Además, la oxidación defectuosa de BCKA conduce al error innato del metabolismo de la enfermedad de la orina del jarabe de arce (MSUD), y la actividad de BCKDH desregulada también se atribuye a varias enfermedades humanas (por ejemplo, diabetes, cáncer) [184].

Los productos acil-CoA de la oxidación de BCAA (p. Ej., Acetil-CoA, propionil-CoA, succinil-CoA) tienen el potencial de contribuir con carbono para la actividad oxidativa del ciclo del TCA y / o lipogénesis, lo que sugiere que los BCAA pueden servir como una importante fuente de combustible para la proliferación. células. Además, la acetil-CoA derivada de la leucina puede proporcionar señales proliferativas directas a través de la acetilación de Raptor a través de EP300, que a su vez regula negativamente la formación de autofagosomas y activa la señalización de mTORC1 [185,186]. Si esto representa una contribución metabólica importante, en particular al ciclo de TCA, depende en gran medida del contexto. La contribución metabólica de la acil-CoA derivada de BCAA se ha caracterizado ampliamente en tumores mutantes impulsados ​​por Kras (p. Ej., Páncreas, pulmón) dada la correlación entre los niveles plasmáticos elevados y la progresión de la enfermedad [139]. En la leucemia mieloide aguda (LMA), el cáncer de páncreas humano y las células de cáncer colorrectal, así como en LSL-Kras G12D /+ Trp53 flox /flox - tumores pulmonares y pancreáticos, los BCAA marcados con 13C contribuyeron mínimamente a los intermedios del ciclo del TCA mitocondrial independientemente de qué isoforma de BCAT1 / 2 se exprese en cada contexto [180,187,188,189,190]. Por el contrario, los fibroblastos asociados al cáncer derivados de tumores pancreáticos humanos mostraron un mayor flujo de oxidación de BCAA que las células de cáncer de páncreas, y los BCKA secretados de los CAF se incorporaron al ciclo de TCA en las células de cáncer de páncreas humano mediante oxidación posterior [191]. De manera similar, se demostró que 13 C-KIC, derivado del catabolismo de la leucina, se oxida por tumores en un modelo de glioma de rata utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear hiperpolarizada (RMN) [192]. El transporte de BCKA a través de la membrana plasmática es facilitado principalmente por transportadores de monocarboxilato, MCT1 / SLC16A1 y MCT4 / SLC16A4, lo que permite que las células compartan grupos de BCKA circulantes para convertirse en BCAA si es necesario [193,194,195,196]. En los adipocitos, los BCAA representan una importante fuente anaplerótica y lipogénica. La acetil-CoA o propionil-CoA se utiliza para la síntesis de ácidos grasos de cadena par o impar y, además de succinil-CoA, contribuye significativamente a los intermedios del ciclo del TCA (por ejemplo, citrato) [197,198,199]. El tejido adiposo también puede utilizar el catabolismo de los BCAA para generar ácidos grasos de cadena ramificada mono-metilados a través de la actividad promiscua de la carnitina acetiltransferasa (CRAT) y la ácido graso sintasa (FASN) [200]. En particular, la metilmalonil-CoA mutasa necesaria para convertir propionil-CoA en succinil-CoA es dependiente de B12, y los ácidos grasos de cadena impar y el ácido metilmalónico (MMA) se acumulan en los adipocitos solo cuando se cultivan en medios deficientes en cobalamina (p. Ej., DMEM) [199]. En un estudio reciente, el aumento de los niveles de MMA en circulación se correlaciona con el aumento de la edad, y se encontró que el MMA promueve un fenotipo similar a la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) y contribuye a un aumento de la tumorigénesis [201].


La biogénesis de la porina de la membrana mitocondrial externa implica una vía de importación a través de los receptores y el poro de importación general del complejo TOM.

La porina, también denominada canal aniónico dependiente del voltaje, es la proteína más abundante de la membrana externa mitocondrial. Se sabe que el proceso de importación y ensamblaje de la proteína depende del receptor de superficie Tom20, pero el requisito de otras proteínas mitocondriales sigue siendo controvertido. Hemos utilizado mitocondrias de Neurospora crassa y Saccharomyces cerevisiae para analizar la vía de importación de la porina. La importación de porina en mitocondrias aisladas en las que se ha abierto la membrana externa se inhibe a pesar de los niveles de Tom20 similares a los de las mitocondrias intactas. Un precursor destinado a la matriz y el precursor de la porina compiten por los mismos sitios de translocación tanto en las mitocondrias normales como en las mitocondrias cuyos receptores de superficie se han eliminado, lo que sugiere que ambos precursores utilizan el poro de importación general. Usando un ensayo establecido para monitorear el ensamblaje de porina importada in vitro en complejos de porina preexistentes, hemos demostrado que además de Tom20, la biogénesis de la porina depende del receptor central Tom22, así como de Tom5 y Tom7 del complejo de poros de importación general (translocase del complejo central de la membrana mitocondrial externa [TOM]). La caracterización de dos nuevos alelos mutantes de la proteína de poro esencial Tom40 demuestra que la importación de porina también requiere un Tom40 funcional. Además, el precursor de la porina se puede reticular con Tom20, Tom22 y Tom40 en su ruta de importación. Concluimos que la importación de porina no procede únicamente de la acción de Tom20, sino que requiere una membrana exterior intacta e involucra al menos cuatro subunidades más de la maquinaria de TOM, incluido el poro de importación general.

Cifras

Importación de F 1 β y porina en norte . crassa mitocondrias con ...

Ensamblaje de porina importada in vitro…

Ensamblaje de porina importada in vitro en complejos preexistentes. (A) Precursor de levadura radiomarcado ...

Se inhibe la inserción de porina ...

La inserción de la porina se inhibe al bloquear el poro de translocación con productos intermedios importados ...

La porina forma un alto peso molecular ...

La porina forma complejos de alto peso molecular en la levadura. (A) Purificado S . cerevisiae ...

La importación de porina requiere componentes ...

La importación de porina requiere componentes del GIP. (A) Niveles de proteínas de Tom ...

La importación de porina no se ve afectada en tom40-3 mitocondrias mutantes. (A) El experimento ...

Dos nuevos alelos mutantes de ...

Dos nuevos alelos mutantes de TOM40 . (A) Secuencias de aminoácidos previstas (único ...

Porin está cerca de Tom20, Tom22 y Tom40 en su inserción ...

Se inhibe la importación de porina ...

La importación de porina se inhibe en tom40 mitocondrias mutantes. (A) Precursor de porina radiomarcado ...


Contenido

La aspartato transaminasa cataliza la interconversión de aspartato y α-cetoglutarato en oxaloacetato y glutamato.

L-aspartato (Asp) + α-cetoglutarato ↔ oxaloacetato + L-glutamato (Glu)

Como transaminasa prototípica, AST se basa en PLP (vitamina B6) como cofactor para transferir el grupo amino del aspartato o glutamato al cetoácido correspondiente. En el proceso, el cofactor se desplaza entre el PLP y la forma de fosfato de piridoxamina (PMP). [6] La transferencia de grupos amino catalizada por esta enzima es crucial tanto en la degradación como en la biosíntesis de aminoácidos. En la degradación de aminoácidos, después de la conversión de α-cetoglutarato en glutamato, el glutamato se somete posteriormente a una desaminación oxidativa para formar iones de amonio, que se excretan como urea. En la reacción inversa, el aspartato puede sintetizarse a partir de oxaloacetato, que es un intermedio clave en el ciclo del ácido cítrico. [7]

Hay dos isoenzimas presentes en una amplia variedad de eucariotas. Inhumanos:

Se cree que estas isoenzimas han evolucionado a partir de un AST ancestral común a través de la duplicación de genes, y comparten una homología de secuencia de aproximadamente el 45%. [8]

AST también se ha encontrado en varios microorganismos, incluidos E. coli, H. mediterranei, [9] y T. thermophilus. [10] En E. coli, la enzima está codificada por el aspCgen y también se ha demostrado que exhibe la actividad de una transaminasa de aminoácidos aromáticos (EC 2.6.1.57). [11]

Se han realizado estudios de cristalografía de rayos X para determinar la estructura de la aspartato transaminasa de diversas fuentes, incluidas las mitocondrias de pollo, [12] el citosol del corazón de cerdo, [13] y E. coli. [14] [15] En general, la estructura polipeptídica tridimensional de todas las especies es bastante similar. AST es dimérico y consta de dos subunidades idénticas, cada una con aproximadamente 400 residuos de aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 45 kD. [8] Cada subunidad se compone de un dominio grande y uno pequeño, así como un tercer dominio que consta de los residuos N-terminales 3-14, estos pocos residuos forman una hebra, que une y estabiliza las dos subunidades del dímero. El dominio grande, que incluye los residuos 48-325, se une al cofactor PLP mediante un enlace aldimina al grupo ε-amino de Lys258. Otros residuos en este dominio, Asp 222 y Tyr 225, también interactúan con PLP a través de enlaces de hidrógeno. El dominio pequeño consta de los residuos 15-47 y 326-410 y representa una región flexible que desplaza la enzima de una conformación "abierta" a una "cerrada" tras la unión del sustrato. [12] [15] [16]

Los dos sitios activos independientes se colocan cerca de la interfaz entre los dos dominios. Dentro de cada sitio activo, un par de residuos de arginina son responsables de la especificidad de la enzima por los sustratos de ácido dicarboxílico: Arg386 interactúa con el grupo carboxilato (α-) proximal del sustrato, mientras que Arg292 forma complejos con el carboxilato distal (cadena lateral). [12] [15]

En términos de estructura secundaria, AST contiene elementos α y β. Cada dominio tiene una hoja central de cadenas β con hélices α empaquetadas a cada lado.

La aspartato transaminasa, al igual que todas las transaminasas, opera mediante el reconocimiento de sustrato dual, es decir, es capaz de reconocer y unir selectivamente dos aminoácidos (Asp y Glu) con diferentes cadenas laterales. [17] En cualquier caso, la reacción de las transaminasas consta de dos semirreacciones similares que constituyen lo que se conoce como un mecanismo de ping-pong. En la primera semirreacción, el aminoácido 1 (p. Ej., L-Asp) reacciona con el complejo enzima-PLP para generar el cetoácido 1 (oxaloacetato) y la enzima modificada-PMP. En la segunda media reacción, el cetoácido 2 (α-cetoglutarato) reacciona con la enzima-PMP para producir el aminoácido 2 (L-Glu), regenerando la enzima-PLP original en el proceso. La formación de un producto racémico (D-Glu) es muy rara. [18]

Los pasos específicos para la semirreacción de Enzima-PLP + aspartato ⇌ Enzima-PMP + oxaloacetato son los siguientes (ver figura); la otra semirreacción (no mostrada) procede de manera inversa, con α-cetoglutarato como sustrato. [6] [7]

  1. Formación de aldimina interna: en primer lugar, el grupo ε-amino de Lys258 forma un enlace de base de Schiff con el carbono del aldehído para generar una aldimina interna.
  2. Transaldiminación: la aldimina interna se convierte en una aldimina externa cuando el grupo ε-amino de Lys258 es desplazado por el grupo amino del aspartato. Esta reacción de transaldiminación se produce mediante un ataque nucleofílico por el grupo amino desprotonado de Asp y procede a través de un intermedio tetraédrico. En este punto, los grupos carboxilato de Asp son estabilizados por los grupos guanidinio de los residuos Arg386 y Arg 292 de la enzima. formación: El hidrógeno unido al carbono α de Asp se extrae (se cree que Lys258 es el aceptor de protones) para formar un intermedio quinonoide. formación: El quinonoide se vuelve a protonar, pero ahora en el carbono del aldehído, para formar el intermedio cetimina.
  3. Hidrólisis de cetimina: Finalmente, la cetimina se hidroliza para formar PMP y oxalacetato.

Se cree que este mecanismo tiene varios pasos que determinan parcialmente la velocidad. [19] Sin embargo, se ha demostrado que el paso de unión del sustrato (transaldiminación) impulsa la reacción catalítica hacia adelante. [20]

AST es similar a la alanina transaminasa (ALT) en que ambas enzimas están asociadas con las células del parénquima hepático. La diferencia es que la ALT se encuentra predominantemente en el hígado, con cantidades clínicamente insignificantes en los riñones, el corazón y el músculo esquelético, mientras que la AST se encuentra en el hígado, el corazón (músculo cardíaco), el músculo esquelético, los riñones, el cerebro y el tejido rojo. células de sangre. [ cita necesaria ] Como resultado, la ALT es un indicador más específico de inflamación del hígado que la AST, ya que la AST también puede estar elevada en enfermedades que afectan a otros órganos, como infarto de miocardio, pancreatitis aguda, anemia hemolítica aguda, quemaduras graves, enfermedad renal aguda, enfermedades musculoesqueléticas. y trauma. [21]

La AST se definió como un marcador bioquímico para el diagnóstico de infarto agudo de miocardio en 1954. Sin embargo, el uso de AST para tal diagnóstico es ahora redundante y ha sido reemplazado por las troponinas cardíacas. [22]

La AST se mide comúnmente clínicamente como parte de las pruebas de diagnóstico de la función hepática, para determinar la salud del hígado. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la fuente de AST (y, en menor medida, ALT) en los análisis de sangre puede reflejar patología en órganos distintos al hígado. De hecho, cuando la AST es más alta que la ALT, se debe considerar una fuente muscular de estas enzimas. Por ejemplo, la inflamación muscular debido a la dermatomiositis puede causar AST y gtALT. Este es un buen recordatorio de que AST y ALT no son buenas medidas de la función hepática porque no reflejan de manera confiable la capacidad sintética del hígado y pueden provenir de tejidos distintos del hígado (como el músculo).

Las pruebas de laboratorio siempre deben interpretarse utilizando el rango de referencia del laboratorio que realizó la prueba. A continuación se muestran ejemplos de rangos de referencia:


DISCUSIÓN

La translocación de proteínas precursoras mitocondriales hacia y a través de la OM es un proceso estudiado activamente (Pfanner et al., 2004 Neupert y Herrmann, 2007 Chacinska et al., 2009 Schmidt et al., 2010 Endo et al., 2011 Dimmer y Rapaport, 2012). Sin embargo, a diferencia de los precursores, portadores o proteínas de barril β que contienen presecuencia, se sabe muy poco acerca de la translocación OM de proteínas que se dirigen al IMS a través de la vía de plegamiento oxidativo dedicada, MIA. Nuestro ensayo de importación de competencia in organello entre precursores radiomarcados y precursores en cantidades saturadas planteó la posibilidad de que las proteínas precursoras dependientes de MIA utilicen una ruta de importación diferente de la clásica que toman las proteínas precursoras que contienen presecuencia. Sin embargo, esta vía de importación discreta involucra el canal Tom40, porque pudimos inhibir la entrada de proteínas dependientes de MIA con un agente alquilante que obstruía el canal Tom40.

De importancia, demostramos una interacción in vivo entre un sustrato modelo MIA, Mix17BANDERAy Tom40. La última observación es interesante porque no se ha informado de interacción física entre las proteínas precursoras dependientes de MIA y TOM o cualquier otro componente de OM. Pudimos observar una etapa intermedia en el proceso transitorio y dinámico de tránsito a través del OM, que puede tener dos explicaciones. Primero, aplicamos un enfoque in vivo para expresar una proteína precursora en la célula y seguir a sus socios en la biogénesis mediante purificaciones por afinidad. En segundo lugar, la elección de Mix17 como modelo de proteína dependiente de MIA puede tener ventajas en el seguimiento de interacciones rápidas durante la translocación a través de la OM. Mia40 sirve como receptor específico y eficiente para sus sustratos en un trans lado del OM (Milenkovic et al., 2009 Sideris et al., 2009 von der Malsburg et al., 2011). Es probable que esto esté precedido por una interacción rápida con la maquinaria responsable de la transferencia de estas proteínas precursoras al trans lado del OM. Nuestro sustrato modelo, Mix17, pertenece a las proteínas dependientes de MIA más grandes (Gabriel et al., 2007). De interés, el Twin CX9El motivo C está localizado en el extremo C-terminal de Mix17 (Böttinger et al., 2012). Estas características pueden afectar la velocidad de su translocación a través del OM. Apoyando esta posibilidad, la formación del intermedio Mia40-Mix17 que sigue a la translocación OM es menos eficaz en comparación con otros sustratos dependientes de MIA (Böttinger et al., 2012). Esto, a su vez, puede favorecer la acumulación de intermediarios de transporte de MO anteriores. Se forma un intermedio de translocación similar entre Tom40 y Pet191, aunque con menor eficiencia, lo que puede explicarse por su importación mitocondrial más rápida, seguida de un reconocimiento más eficiente por Mia40. Así identificamos un intermedio de transporte de Mix17BANDERA se formó con Tom40 y posteriormente mostró que otras proteínas precursoras dependientes de MIA, como Pet191, también formaban este intermedio.

De interés, no identificamos ningún otro componente de TOM u OM en el intermedio de translocación formado por Tom40 y las proteínas destinadas a IMS. Esto fue sorprendente porque las proteínas dependientes de TIM23 y que contienen presecuencia en tránsito interactúan con todo el complejo TOM, incluidas sus subunidades centrales, Tom22 y Tom5 (Dekker et al., 1997 Chacinska et al., 2003, 2010 Frazier et al., 2003 Tamura et al., 2009). Además, se purificaron varias proteínas precursoras importadas utilizando Tom22SU (Chacinska et al., 2003, 2010 Wrobel et al., 2013).De acuerdo con la ausencia de Tom22 en el intermedio de translocación de Tom40, la importación de proteínas precursoras dependientes de MIA marcadas radiactivamente en las mitocondrias que carecen de Tom22 pero también de Tom70 y Tom20 no se vio afectada. Los requisitos de transporte minimizados también se informaron anteriormente para el citocromo C (Wiedemann et al., 2003).

La situación con Tom5 es diferente. El requisito de Tim9 para Tom5 informado anteriormente (Kurz et al., 1999 Vögtle et al., 2012) se confirmó en los presentes experimentos. Sin embargo, la dependencia funcional de Tom5 parece no ser una característica universal de las proteínas destinadas a IMS. La importación de una subfracción de proteínas dependientes de MIA, incluida Mix17, no se vio afectada en ausencia de Tom5. De importancia, Tom5 no estaba presente en los intermedios de translocación de Tom40. Sobre la base de nuestros datos, proponemos un escenario en el que la función de Tom5 se necesita indirectamente en la etapa de translocación OM. La ausencia de Tom5 puede alterar otras proteínas aún desconocidas involucradas en el reconocimiento y transporte de proteínas IMS específicas a través de la OM. Alternativamente, las mitocondrias que carecen de Tom5 también pueden verse afectadas en las reacciones de plegamiento oxidativo. Este deterioro daría lugar a un atrapamiento improductivo de proteínas en el IMS. Nuestros resultados plantean la posibilidad de existencia del complejo TOM alterado que no contiene todas las subunidades TOM típicas. Además, no se puede excluir la dinámica de la maquinaria TOM, es decir, la disociación transitoria tras la unión del precursor. Finalmente, una forma putativa diferente o más dinámica de la translocasa de Tom40 puede formarse preferentemente in vivo. En resumen, las proteínas destinadas a IMS cruzan la OM a través de una translocasa de Tom40 que es arquitectónicamente distinta del complejo de TOM que contiene Tom22.


INTRODUCCIÓN

La adquisición de un endosimbionte bacteriano por una célula huésped primitiva y su posterior conversión en la mitocondria marca una de las transiciones más importantes en biología: el advenimiento de la célula eucariota (Embley y Martin, 2006). Un aspecto definitorio de las mitocondrias es su capacidad para importar proteínas del citosol, un proceso impulsado por un conjunto de translocasas de proteínas características (Neupert y Herrmann, 2007 Lithgow y Schneider, 2010 Schmidt et al., 2010 Endo et al., 2011).

En la membrana externa encontramos dos translocaciones de este tipo. La más importante, la puerta de entrada general para prácticamente todas las proteínas importadas, es la translocasa de la membrana mitocondrial externa (TOM). Consiste en la subunidad de núcleo formador de poros Tom40 (Hill et al., 1998 Ahting et al., 2001), una proteína con estructura de barril β, receptores de importación de proteínas (como Tom70, Tom20 y Tom22 en la levadura) y de varias subunidades más pequeñas. La otra translocasa en la membrana externa es la maquinaria de clasificación y ensamblaje (SAM), cuya función es la inserción de proteínas de barril β. Su subunidad central es Sam50, que en sí misma es una proteína de barril β (Chacinska et al., 2009).

Amplios estudios han revelado que la mayoría de los componentes y gran parte de la arquitectura del TOM y el SAM se conservan entre la levadura y los mamíferos (Hoogenraad et al., 2002 Dolezal et al., 2006 Schneider et al., 2008 Hewitt et al., 2011). Sin embargo, un análisis más global muestra que solo los componentes centrales de las translocasas de proteínas mitocondriales se conservan en todos los eucariotas. Entre estos, Sam50 es el más conservado: se encuentra en todos los grupos de eucariotas e incluso tiene un ortólogo bacteriano, la proteína BamA similar a Omp85, que funciona insertando proteínas de barril β en la membrana bacteriana externa (Bos et al., 2007). Tom40 también se conserva y se encuentra en prácticamente todos los eucariotas, sin embargo, aunque la estructura de barril β de Tom40 indicaría una ascendencia bacteriana, no se ha identificado ningún ortólogo bacteriano (Dolezal et al., 2006 Zeth, 2010).

Las subunidades receptoras del complejo TOM están mucho menos conservadas. Así, en las plantas, Tom22 está severamente truncado y no hay un Tom20 convencional (Mac´asev et al., 2004). En cambio, encontramos un análogo estructural de Tom20 que está codificado a la inversa, lo que sugiere que la similitud estructural entre el Tom20 de mamífero y fúngico por un lado y la planta Tom20 por el otro lado se debe a una evolución convergente y no a una descendencia común (Perry et al., 2006). Tom70 parece faltar en las plantas (Chan et al., 2006) pero recientemente se ha detectado en algunos representantes de la Chromalveolata, que no están relacionados con hongos, mamíferos y plantas, lo que indica que Tom70 podría estar más extendido de lo que se pensaba anteriormente (Tsaousis et al., 2011).

Estudios recientes en varios protozoos diferentes revelaron desviaciones interesantes, pero en su mayor parte menores, de los sistemas canónicos de importación de proteínas descritos en levaduras y mamíferos (Dolezal et al., 2005). Por lo tanto, fue una sorpresa que los tripanosomátidos tengan una maquinaria de translocación de la membrana externa mitocondrial fundamentalmente diferente. Los tripanosomátidos carecen de Tom40 (Pusnik et al., 2009) y, en su lugar, emplean un canal de translocación de proteínas de la membrana externa denominado ATOM, para la translocación arcaica de la membrana mitocondrial externa (Pusnik et al., 2011). A diferencia de Tom40, ATOM tiene un ortólogo bacteriano. Muestra similitudes con un subgrupo de la familia de proteínas bacterianas similares a Omp85 que es distinta del ortólogo Sam50 BamA. Esto sugiere que los tripanosomátidos han conservado un sistema arcaico de importación de proteínas de la membrana externa que podría haber precedido al canal de importación de proteínas basado en Tom40.

El descubrimiento de ATOM proporcionó nuevos conocimientos inesperados sobre la evolución del sistema de importación de proteínas de la membrana externa mitocondrial y la evolución de los eucariotas en general. Además, planteó la cuestión de qué otros factores podrían ser necesarios para la translocación de proteínas a través de la membrana externa de las mitocondrias tripanosomales. Utilizando Trypanosoma brucei como sistema de modelo experimental, descubrimos un factor tan novedoso. Esta proteína es una proteína esencial de la membrana externa mitocondrial que se requiere para la importación de un gran subconjunto, pero no todas las proteínas de la matriz y, por lo tanto, podría tener una función similar a la de un receptor.


¿En qué se diferencian los mecanismos de lanzadera entre sí?

Un sistema portador que se ha estudiado ampliamente en el músculo de vuelo de los insectos es el lanzadera de glicerol-fosfato. Este mecanismo utiliza la presencia en la cara externa de la membrana mitocondrial interna de una enzima dependiente de FAD que oxida el fosfato de glicerol.

El fosfato de glicerol se produce mediante la reducción de fosfato de dihidroxiacetona en el curso de la reacción, el NADH se oxida a NAD +. En esta reacción, el agente oxidante (que a su vez se reduce) es FAD y el producto es FADH.2 (Figura 20.23). El FADH2 luego pasa electrones a través de la cadena de transporte de electrones, lo que lleva a la producción de 1,5 moles de ATP por cada mol de NADH citosólico. Este mecanismo también se ha observado en el músculo y el cerebro de los mamíferos.


Un mecanismo de lanzadera más complejo y eficiente es el malate-aspartateshuttle, que se ha encontrado en riñones, hígado y corazón de mamíferos. Thisshuttle utiliza el hecho de que el malato puede atravesar la membrana mitocondrial, mientras que el oxaloacetato no. El punto digno de mención sobre este mecanismo de lanzadera es que la transferencia de electrones de NADH en el citosol produce NADH en la mitocondria. En el citosol, el oxalacetato se reduce a malato por la cito-solic malato deshidrogenasa, acompañado por la oxidación del NADH citosólico a NAD + (Figura 20.24). El malato luego cruza la membrana mitocondrial. En la mitocondria, la conversión de malato de nuevo a oxaloacetato es catalizada por la malato deshidrogenasa mitocondrial (una de las enzimas del ciclo del ácido cítrico). El oxaloacetato se convierte en aspartato, que también puede atravesar la membrana mitocondrial. El aspartato se convierte en oxalacetato en el citosol, completando el ciclo de reacciones.


El NADH que se produce en la mitocondria pasa electrones a la cadena de transporte de electrones. Con la lanzadera malato-aspartato, se producen 2,5 moles de ATP por cada mol de NADH citosólico en lugar de 1,5 moles de ATP en la lanzadera glicerol-fosfato, que utiliza FADH2 como transportista.


Discusión

Las proteínas de barril β de membrana integral se encuentran en las MO de bacterias Gram negativas y mitocondrias. Su ensamblaje requiere una proteína conservada evolutivamente de la familia Omp85, pero se han producido adaptaciones significativas de las maquinarias de ensamblaje durante la evolución. Las proteínas accesorias, es decir, cuatro lipoproteínas en el caso de bacterias y dos proteínas asociadas a la membrana expuestas al citosol en las mitocondrias, no muestran ninguna similitud de secuencia. Además, el componente similar a Omp85 adaptado durante la evolución, además de un dominio de barril β incluido en la membrana, las proteínas bacterianas contienen cinco dominios POTRA expuestos al periplasma, mientras que la variante mitocondrial contiene solo uno de esos dominios. Es de destacar que recientemente se demostró que un solo dominio POTRA es suficiente para la función de Omp85 en N. meningitidis (Bos et al.2007b), pero en E. coli BamA, tres de estos dominios eran esenciales, aunque también los otros dos eran importantes para un funcionamiento óptimo (Kim et al. 2007).

No solo las maquinarias de montaje, sino también las señales que reconocen sufrieron adaptaciones durante la evolución. Además, estas señales son reconocidas por diferentes componentes de la maquinaria, es decir, por Omp85 en el sistema bacteriano (Robert et al. 2006) y por Tob38 en el sistema mitocondrial (Kutik et al. 2008). Recientemente demostramos que, a pesar de estas variaciones, la secuencia de firma OMP bacteriana primordial todavía es reconocida y procesada adecuadamente por la maquinaria mitocondrial (Walther et al. 2009), lo que sugiere que el mecanismo básico del ensamblaje de proteínas de barril β podría conservarse evolutivamente. Para probar esta hipótesis, investigamos aquí si un OMP mitocondrial, VDAC, se puede ensamblar en el OM de las bacterias, lo que de hecho fue el caso, y se demostró que depende de un complejo Bam funcional. Es de destacar que la estructura de VDAC, es decir, un barril β de 19 hebras (Bayrhuber et al. 2008 Hiller et al. 2008 Ujwal et al. 2008), se desvía de las de las OMP bacterianas, que contienen todas un número par de cadenas β (Koebnik et al. 2000). Sin embargo, esta diferencia aparentemente no impide la incorporación de VDAC en la MO bacteriana. De acuerdo con esta observación, se informó previamente que una forma mutante de porina PhoE que carece de la cadena β transmembrana N-terminal se incorporó funcionalmente en la E. coli OM (Bosch et al. 1988), lo que demuestra que, de hecho, la maquinaria bacteriana de Bam puede trabajar con barriles β con un número impar de hebras.

El ensamblaje eficiente de VDAC en la OM bacteriana dependía de su señal β, que también es necesaria para su ensamblaje en la OM mitocondrial (Kutik et al. 2008). Así, el sistema bacteriano es capaz de decodificar las señales evolucionadas en las OMP mitocondriales aunque sean reconocidas en el sistema mitocondrial auténtico por un componente que no tiene equivalente en el sistema bacteriano. A niveles de expresión muy altos, una forma mutante de VDAC que carece de cinco residuos de aminoácidos C-terminales y, por lo tanto, se ve afectada en su señal β, era indetectable en la superficie de la célula bacteriana en experimentos de microscopía de inmunofluorescencia (figura 3B). Sin embargo, a niveles de expresión más bajos, al menos una parte de la cantidad total de la proteína mutante producida pareció incorporarse a la MO (figs. 4A y 5A), lo que demuestra que una señal β intacta no es absolutamente esencial para el ensamblaje de OM de VDAC. en E. coli. De manera similar, una secuencia de firma C-terminal intacta no es absolutamente esencial para el ensamblaje correcto de una OMP bacteriana en la OM. En condiciones de alta expresión, una forma mutante de porina PhoE que carece del residuo Phe C-terminal no se incorporó en absoluto en el E. coli MO, pero formó densos agregados periplásmicos que se sedimentan con la fracción de la membrana durante la centrifugación y podrían visualizarse en la célula por microscopía electrónica (Struyvé et al. 1991 de Cock et al. 1997). Sin embargo, en condiciones de expresión más bajas, esta proteína mutante se ensambló en la OM (de Cock et al. 1997). Presumiblemente, la cinética de agregación más baja en condiciones de baja expresión aumenta el lapso de tiempo para que la maquinaria Bam se ocupe de sustratos con una señal de reconocimiento imperfecta. De manera similar, cuando la OMP PhoE bacteriana se expresó altamente en la levadura, se acumuló como agregados desplegados en las mitocondrias, mientras que se ensambló de manera eficiente en la OM mitocondrial en condiciones de expresión más bajas (Walther et al. 2009).

Además, la composición de lípidos podría afectar potencialmente el ensamblaje de proteínas integrales de membrana. De hecho, el LPS, un componente lipídico abundante de la OM bacteriana, ha sido implicado en la biogénesis de las OMP en E. coli (Bos et al.2007a), aunque mutantes viables deficientes en LPS de N. meningitidis Se han descrito en los que el ensamblaje de OMP parece no verse afectado (Steeghs et al. 2001). La composición lipídica de la OM bacteriana es, por la presencia de LPS y la ausencia de esteroles, completamente diferente de la de la OM mitocondrial, pero esta diferencia aparentemente no es un impedimento insuperable para el ensamblaje de VDAC en la OM bacteriana.

En conclusión, parece que el reconocimiento de señales es lo suficientemente flexible como para permitir el ensamblaje de una OMP mitocondrial en la OM bacteriana. Junto con la observación anterior de que las OMP bacterianas expresadas en la levadura se ensamblan en la OM mitocondrial (Walther et al. 2009), estos datos permiten concluir que el mecanismo básico del ensamblaje de proteínas de barril β se conserva evolutivamente.