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Genes donde tanto una mutación incapacitante como la amplificación del número de copias causan diferentes enfermedades genéticas


Estoy tratando de hacer una lista de esos genes, porque deben estar estrictamente regulados. MeCP2 es uno: causa el síndrome de Rett con una mutación incapacitante, pero causa el síndrome de duplicación de MeCP2 si se ha aumentado su número de copias. ¿Alguien sabe de otros?


Genes donde tanto una mutación incapacitante como la amplificación del número de copias causan diferentes enfermedades genéticas - Biología

Conflictos de interés Estos autores revelan lo siguiente: Josep M. Llovet es consultor de Bayer, BMS, Lilly, Blueprint, Celsion, GSK y Boehringer-Ingelheim, y ha recibido becas de investigación de Bayer, BMS, Blueprint y Boehringer-Ingelheim. Jessica Zucman-Rossi es consultora de IntraGen. Los autores restantes no declaran conflictos.

Fondos Jessica Zucman-Rossi cuenta con una beca de la Ligue Contre le Cancer y del INCa con el proyecto ICGC. Josep M. Llovet ha recibido ayudas del Programa Marco 7 de la Comisión Europea (Heptromic, propuesta número 259744), la Fundación para la Investigación del Cáncer Samuel Waxman, el Programa Grant I + D (SAF2013-41027) y la Asociación Española Contra el Cáncer (AECC).

Los nombres de los autores en negrita designan la co-primera autoría compartida.


Fondo

La aneuploidía, el fenómeno por el que los genomas adquieren o pierden fragmentos cromosómicos, se ha relacionado causalmente en una amplia variedad de enfermedades humanas como los trastornos neuropsiquiátricos y el cáncer [1, 2, 3]. La plasticidad genética y fenotípica resultante de la evolución de la aneuploidía provoca resistencias al tratamiento y recurrencias de la enfermedad [4, 5, 6], lo que constituye un desafío fundamental para la medicina actual. Estudios recientes han demostrado que no solo los tejidos patológicos, sino también los tejidos patológicamente normales pueden contener un alto grado de mosaicismos somáticos (p. Ej., Sangre periférica [7] y esófago [8]). Por lo tanto, definir qué alteraciones del número de copias (CNA) causan patogénesis y cuáles son parte de las variaciones normales se vuelve cada vez más importante en la medicina del genoma, especialmente para el cáncer [9, 10].

Se han realizado varios esfuerzos para obtener un conocimiento completo de las CNA responsables del diagnóstico, el pronóstico y la terapéutica dirigida del cáncer. El análisis sistemático de CNA en más de 10.000 muestras de tumores primarios en el atlas del genoma del cáncer (TCGA) y 2.500 muestras en el Consorcio Internacional del Genoma del Cáncer (ICGC) reveló distintos paisajes de CNA en diferentes tipos de cáncer [11, 12, 13]. La comparación de CNA entre tumores autólogos obtenidos en diferentes etapas de diferentes histologías reveló que los CNA son fundamentales para la evolución del tumor a lo largo del tiempo y el espacio. Sin embargo, los estudios basados ​​en muestras de tejido a granel no pueden describir completamente la historia de la evolución del tumor, que ocurre en la resolución de una sola célula [14], y por lo tanto tienen un poder limitado para descubrir los impulsores genéticos asociados.

Los avances recientes en la secuenciación de ADN unicelular (p. Ej., El enfoque basado en el etiquetado [15] y la solución de CNV unicelular de 10x Genomics) han permitido la adquisición a gran escala de perfiles de número de copias unicelulares (SCCN) en decenas de miles de celdas con una resolución de alrededor de 100 kb (

Cobertura de secuenciación 0,1X por celda) [16,17,18,19]. Otras plataformas, como la secuenciación de ARN unicelular [20, 21] y la secuenciación ATAC unicelular [22] también se han utilizado para la elaboración de perfiles de SCCN. Se ha desarrollado un conjunto de herramientas bioinformáticas para llamar perfiles SCCN, teniendo en cuenta varios factores de confusión [23, 24, 25].

Estos perfiles de SCCN no solo presentan un rico conjunto de perturbaciones genéticas que son invisibles a nivel de tejido, sino que también potencian la reconstrucción del linaje celular, sobre la base de la cual se puede medir el impacto de un alelo en la aptitud celular. Por lo tanto, los enfoques estadísticos que integran el rastreo del linaje celular con el análisis genético de poblaciones [26] pueden permitir el descubrimiento de nuevos genes y mecanismos de progresión de la enfermedad.

Hasta ahora, los estudios que realizan un rastreo de linaje retrospectivo a partir de datos unicelulares han estado utilizando en gran medida enfoques filogenéticos diseñados para modelar la evolución de las especies, que es bastante diferente de la evolución celular en términos de duración, escala, genética y dinámica [27, 28]. Muchos enfoques filogenéticos existentes asumen que los sitios genómicos evolucionan de forma independiente y siguen el llamado supuesto de sitio infinito (ISA) [29]. Pero en el contexto de la aneuploidía, un sitio del genoma a menudo puede ser alterado repetidamente por diferentes CNA, debido en parte a limitaciones en las estructuras del genoma y cromatina, las propiedades de la replicación / reparación del ADN [30] y la selección funcional. Para aplicar enfoques convencionales de máxima parsimonia en los datos de SCCN, uno tiene que segmentar en exceso las regiones genómicas y representar los números de copia como caracteres en intervalos disjuntos, lo que representa mal las propiedades de los ADN y distorsiona la propensión a la evolución en los estados de número de copias. Otros métodos convencionales que utilizan distancias euclidianas, de Hamming o correlacionales también representan mal la naturaleza segmentaria y no lineal de la evolución de la CNA [31], lo que conduce a una inferencia inexacta de la topología de los árboles y las longitudes de las ramas.

Se han desarrollado algunos enfoques filogenéticos nuevos para abordar estas limitaciones mediante la introducción de una nueva métrica de distancia llamada Distancia mínima de eventos (MED), que postula el número mínimo y la serie de ganancias o pérdidas de una sola copia que se requieren para evolucionar un genoma a otro. . En particular, el algoritmo MEDICC [32] infiere un árbol filogenético de número de copias a partir de los perfiles de números de copias alélicas de un conjunto de muestras. Sin embargo, el problema es NP-hard [33]. Incluso las soluciones simplificadas podrían aplicarse a solo decenas de genomas y no son escalables a los conjuntos de datos actuales de una sola célula que constan de miles de células. Zeira y col. [34] propuso una solución de tiempo lineal al problema basada en una formulación de programación lineal entera (ILP), pero no se lanzó ninguna herramienta.

Tener los nuevos algoritmos de inferencia de árboles eficientes y de distancia fue un buen paso adelante, pero no está claro cómo identificar variantes funcionales, dado un árbol filogenético celular. Intuitivamente, las variantes funcionales que afectan la aptitud celular deberían conducir a frecuencias de alelos variantes alteradas en las poblaciones descendientes, como implican estudios filogenéticos de tumores multirregionales previos [10, 35]. Sin embargo, no se han desarrollado procedimientos matemáticos [28, 31] para cuantificar el impacto de una alteración genómica sobre un árbol filogenético, teniendo en cuenta la escasez en el muestreo de la población celular, la multiplicidad en la partición de subconjuntos y la propensión de la alteración en una ubicación genómica particular. , etc. [36]


Resultados

Descripción general del enfoque DriverNet

Desarrollamos un nuevo enfoque algorítmico integrado (DriverNet) para analizar interrogaciones genómicas y transcriptómicas basadas en la población de (sub) tipos de tumores para la identificación de mutaciones conductoras patógenas. Nuestro enfoque relaciona las aberraciones genómicas con patrones transcripcionales alterados, informados por asociaciones o interacciones conocidas entre genes. Los detalles completos del algoritmo se describen en los Métodos en línea, pero se resumirán aquí brevemente. Como se muestra esquemáticamente en la Figura 1C, DriverNet formula asociaciones entre mutaciones y niveles de expresión utilizando un gráfico bipartito donde los nodos son: i) el conjunto de genes que representan el estado de la mutación (la partición izquierda del gráfico) y ii) el conjunto de genes que representan la expresión periférica estado en cada uno de los pacientes (la partición derecha del gráfico). Para cada paciente, se dibuja un borde entre los nodos en las particiones izquierda y derecha del gráfico si se cumplen las siguientes tres condiciones: i) gen gramo I está mutado en el paciente pag de la población (nodos verdes en la partición izquierda del gráfico) ii) gen gramo j muestra una expresión periférica en el paciente pag (nodos rojos en la partición derecha del gráfico) y iii) gramo I y gramo j se sabe que interactúan de acuerdo con bases de datos de rutas o conjuntos de genes (un "gráfico de influencia" después de [18]). Luego, nuestro método utiliza un enfoque de optimización codicioso para explicar tantos nodos en la partición derecha del gráfico bipartito como sea posible utilizando el menor número de nodos en la partición izquierda del gráfico de manera que los genes expliquen el mayor número de eventos de expresión periféricos (por ejemplo, gramo2 en la Figura 1C) se denominan genes impulsores putativos. Finalmente, aplicamos pruebas de significancia estadística a estos candidatos basados ​​en distribuciones nulas informadas por remuestreo estocástico.

Conjuntos de datos

Para nuestro análisis, utilizamos cuatro conjuntos de datos disponibles públicamente que contienen datos del genoma y del transcriptoma de varios tipos de tumores (Tabla 1). Las descripciones detalladas del análisis de los conjuntos de datos y los flujos de trabajo de preprocesamiento se pueden encontrar en el archivo adicional 1. El conjunto de datos GBM representa el número de copias, mutaciones y datos de expresión para 120 pacientes con glioblastoma multiforme [6] tomados del portal TCGA [19]. Tenga en cuenta que los casos que tenían datos de mutaciones y números de copias se incluyeron en este conjunto de datos. El conjunto de datos METABRIC [20] representa las alteraciones en el número de copias y los datos de expresión génica adjuntos para 997 pacientes con cáncer de mama. TN representa las mutaciones validadas, el número de copias y los datos de expresión de 66 pacientes con cáncer de mama triple negativo [11]. El conjunto de datos TCGA HGS contiene mutaciones, número de copias y datos de expresión para 304 pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado [7] que se tomaron del portal TCGA. Al igual que el conjunto de datos de GBM, solo incluimos los casos que tenían datos de mutaciones y números de copias. El flujo de trabajo de análisis de datos se muestra esquemáticamente en el archivo adicional 2. Los conjuntos de datos GBM2, TN2 y HGS2 representan solo mutaciones y datos de expresión génica para pacientes con glioblastoma 140, 66 y 307, triple negativo y cáncer de ovario seroso de alto grado, respectivamente.

El análisis de evaluación comparativa del rendimiento establece a DriverNet como un algoritmo sensible y específico

En la práctica, las mediciones cuantitativas con técnicas estándar de evaluación comparativa de sensibilidad / especificidad no son prácticas en ausencia de una verdad fundamental. Sin embargo, debido a la disponibilidad de bases de datos de genes del cáncer bien estudiadas, incluido el censo de genes del cáncer (CGC) [21] y el catálogo de mutaciones somáticas en conjuntos de datos de cáncer (COSMIC) [22], nos propusimos aproximar las métricas de rendimiento y comparar DriverNet con los siguientes dos métodos en competencia: i) un método descrito por Masica y Karchin [14], que utiliza estadísticas basadas en correlación seguidas de una prueba exacta de Fisher para asociar mutaciones con patrones de expresión génica (denominado 'Fisher', ver Adicional archivo 1), ii) un método descrito en Youn y Simon [5], que identifica genes impulsores basándose en la tasa de mutación de fondo, el impacto funcional en las proteínas y la redundancia en el código genético (denominado "Frecuencia"). De acuerdo con los dos enfoques mencionados anteriormente, eliminamos los datos del número de copias del análisis y restringimos las comparaciones solo a los datos de mutación (GBM2, TN2 y HGS2, Tabla 1), lo que resultó en la exclusión del conjunto de datos METABRIC ya que contenía la aberración del número de copias. solo datos. Usamos dos medidas sistemáticas de evaluación comparativa de la siguiente manera: i) examinar la proporción de predicciones encontradas en la base de datos del Censo de genes del cáncer (CGC) [21] ii) examinar la prevalencia de mutaciones somáticas de genes candidatos de acuerdo con la base de datos COSMIC, asumiendo genes con una mayor prevalencia de mutaciones en la correspondiente población de pacientes de interés en COSMIC (glioblastoma, cáncer de mama y de ovario) es más probable que sean genes impulsores. Teóricamente, esta medida debería favorecer el enfoque de Frecuencia.

Para evaluar sistemáticamente la especificidad, comparamos la proporción de predicciones que estaban presentes en CGC en función de la disminución de los umbrales de sensibilidad (Figura 2A, B, C) para los tres métodos. También analizamos la distribución acumulativa de la prevalencia de mutaciones en la base de datos COSMIC para los tres conjuntos de datos (Figura 2D, E, F). En todo el rango de las predicciones principales generadas por DriverNet, la concordancia con CGC siempre fue mayor que para Fisher y Frequency en los conjuntos de datos GBM2 y TN2. Para HGS2, DriverNet y el enfoque de frecuencia superaron al método de Fisher. La prevalencia acumulada en el conjunto de datos COSMIC fue mayor para DriverNet en comparación con los otros dos enfoques en todo el rango de las predicciones principales, con la frecuencia en segundo lugar. Por lo tanto, DriverNet requiere muchas menos predicciones para capturar la mayoría de los impulsores en el conjunto de datos, lo que indica una mayor especificidad relativa.

Evaluación comparativa de rendimiento de DriverNet con los conjuntos de datos GBM2, HGS2 y HGS2. (C.A) Concordancia con el censo de genes del cáncer para los enfoques DriverNet, basado en frecuencia y basado en Fisher en función de la norte genes clasificados (de 200) para los conjuntos de datos GBM2, TN2 y HGS2, respectivamente. (D-F) Concordancia con la base de datos COSMIC (distribución acumulada de la prevalencia de mutaciones en la base de datos COSMIC) para los enfoques DriverNet, basados ​​en frecuencia y basados ​​en Fisher en función de la norte genes clasificados (de 200) para los conjuntos de datos GBM2, TN2 y HGS2, respectivamente. Tenga en cuenta que para el conjunto de datos GBM2, DriverNet nomina 113 genes como impulsores candidatos, por lo tanto, la concordancia de los genes DriverNet con el Censo de genes del cáncer se traza para los 113 candidatos.

Para GBM2 (solo mutaciones), el método de frecuencia identificó ocho genes: EGFR, IDH1, NF1, PIK3R1, PTEN, RB1, TP53, y FKBP9 como significativamente alterado con siete de estos encontrados en CGC (archivo adicional 3). En total, DriverNet identificó 34 genes (pag & lt 0.05), incluidos siete de los genes designados por el enfoque basado en frecuencias (archivo adicional 4). Varios genes encontrados en CGC (PIK3C2G, MDM2, BCR, ERBB2, DDIT3, FGFR1, BRCA2, MET, y PDGFRA) también se encontraban entre los 34 genes principales nominados por DriverNet. Nosotros detectamos REUNIÓ como el gen 29 clasificado (pag = 0,002, mutado en tres casos), que se informó en [1], lo que sugiere que ha sido pasado por alto por el método de frecuencia, que clasificó a este gen como el 93º.

Para TN2 (solo mutación, sin número de copia), el método de frecuencia identificó cinco genes: PIK3CA, RB1, TP53, PTEN, y MYO3A como genes significativamente alterados por mutación, de los cuales cuatro se encontraron en CGC (archivo adicional 5). En total, DriverNet identificó 59 genes con pag & lt 0.05, cuatro de los cuales fueron designados por el enfoque basado en frecuencias (archivo adicional 6). Se incluye una predicción de DriverNet no identificada por el enfoque de frecuencia JAK1 (pag = 0, clasificado 13, mutado en un caso), que juega un papel clave en la señalización de la prolactina, que está implicada en el cáncer de mama [23, 24].

Para HGS2 (solo mutación, sin número de copia), el método de frecuencia identificado CSMD3, BRCA1, BRCA2, y TP53 como genes significativamente alterados, tres de los cuales se encontraron en CGC (archivo adicional 7). DriverNet identificado BRCA1, BRCA2, y TP53 además de los genes CGC, KRAS, PTEN, KIT, NRAS, RPN1, RB1, PIK3CA, CLTCL1, ATIC, CREBBP, MET, PPP2R1A, CLTC, CTNNB1, BRAF, y TSHR (Archivo adicional 8). BRAF, PIK3CA, KRAS, y NRAS son impulsores oncogénicos conocidos y enfatizan el poder de la integración de los datos de expresión para designar genes importantes pero con poca frecuencia mutados. Además, el conocido gen supresor de tumores, PTEN, estaba entre los genes principales en DriverNet (puesto 11), pero fue pasado por alto por el método de frecuencia, que clasificó a este gen en el puesto 525.

Las mutaciones poco frecuentes que modulan las redes transcripcionales ocupan un lugar destacado en los conjuntos de datos a nivel de población

Luego, buscamos determinar la prevalencia de controladores raros en los cuatro conjuntos de datos ignorados por el enfoque basado en la frecuencia para la predicción de controladores. Identificamos impulsores significativos 'infrecuentes' (pag & lt 0.05) donde el gen de interés fue abrogado por mutación o alteración del número de copias (CNA) en & lt 2% de los casos. Debido a la verdad de terreno desconocida con respecto a los controladores reales, restringimos la presentación a aquellos genes que también se encuentran en el CGC. Esto resultó en 22 genes en METABRIC, 13 genes en HGS, 1 gen en TN y 2 genes en GBM (Tabla 2). Los controladores poco frecuentes en METABRIC fueron PTEN, RB1, MDM2, MYC, CDKN2A, CLTC, CREBBP, GNAS, EGFR, CCNE1, EP300, CBL, PIK3R1, JAK2, TP53, NUP98, PIK3CA, IDH2, KRAS, y TRA@. Ambos PIK3CA (dos casos con amplificaciones de alto nivel) y PIK3R1 (dos casos con deleciones homocigotas) se alteraron en el 0,19% de los casos y, sin embargo, mostraron evidencia de conducir los niveles de expresión de los genes conectados a las colas de la distribución de expresión. Curiosamente, identificamos siete casos (0,67%) con deleciones homocigotas en TP53 (locus 17p13.1) coincidente con la expresión periférica en las vías de señalización MAPK y Wnt (archivos adicionales 9 y 10). Pérdida de función de TP53 se asocia típicamente con la mutación, sin embargo, estos resultados sugieren que en casos raros, las deleciones homocigóticas pueden ser el mecanismo por el cual TP53 se pierde en el cáncer de mama.

En HGS, encontramos 13 genes que eran controladores poco frecuentes que también se encuentran en CGC (AKT2, KIT, NRAS, RPN, PIK3CA, CREBBP, PPP2R1A, ATIC, CLTCL1, MET, MAP2K4, ETV1, y EP300) (Tabla 2). Curiosamente, EQUIPO (1,97% de los casos) y NRAS (0,66% de los casos) se detectaron como conductores (pag = 2E-4 y 9E-4, respectivamente Archivos adicionales 11 y 12) donde EQUIPO está mutado en melanomas, tumores del estroma gastrointestinal, pacientes adultos con leucemia mieloide aguda y muchos otros tipos de tumores con alta frecuencia y es el objetivo del inhibidor de la quinasa Imatinib. Las mutaciones en NRAS (típicamente asociados con melanomas, mielomas múltiples, leucemia mielógena aguda y cáncer de tiroides) fueron, en ambos casos, la mutación del hotspot Q61R en el dominio Ras. Ambos EQUIPO y NRAS las mutaciones se pasaron por alto como mutaciones impulsoras por el enfoque basado en la frecuencia (archivo adicional 7). Esto ilustra la mayor sensibilidad de DriverNet para identificar conductores poco frecuentes en la población. Curiosamente, las mutaciones típicamente asociadas con cánceres de ovario de grado inferior (Tipo I), como PIK3CA (0,66% de casos mutados) y CTNNB1 (0.6% de casos mutados) también fueron nominados como conductores a pesar de tener una frecuencia extremadamente baja. Los dos PIK3CA las mutaciones estaban ambas en puntos calientes activadores bien conocidos, E545K y H1047R. Sugerimos que estos (cuatro casos separados) en realidad podrían ser cánceres de ovario mal diagnosticados histológicamente. Estos casos representan una anécdota importante ya que muchas poblaciones de tumores contienen mutaciones raras que crean perfiles de expresión aberrantes. Los cánceres de ovario de tipo I exhiben perfiles de expresión considerablemente diferentes en comparación con los cánceres serosos de alto grado de tipo II [25]. Si de hecho estos casos no son serios, no sería sorprendente, dada la formulación de DriverNet de integración de perfiles genómicos y transcriptómicos, que estas mutaciones raras cubrirían muchos eventos atípicos. Además, observamos que lo mencionado anteriormente MAP2K4 como un conductor poco frecuente con una mutación en un caso y deleciones homocigotas en dos casos, y la presencia de ETV1, típicamente conocidos por las fusiones de genes, se enumeran entre los impulsores poco frecuentes en los datos ováricos de HGS. Finalmente, hicimos una referencia cruzada a la lista de genes pag & lt 0.05 con Cheung et al. [26] (una lista de genes con vulnerabilidades genéticas en líneas celulares cancerosas) y señaló que ALG8 y CCNE1 superpuestos.

En los conjuntos de datos TN y GBM, los resultados fueron más escasos. En el conjunto de datos TN, solo un gen era un controlador poco frecuente que también estaba en CGC: JAK1 con una mutación que ocurre en un solo caso (Tabla 2). JAK1 los valores atípicos asociados se enriquecieron para la señalización de EGFR1 (archivos adicionales 13 y 14), lo que sugiere que la mutación tiene efectos posteriores en una importante red de señalización oncogénica. En el conjunto de datos de GBM, dos genes, a saber KRAS y AKT1, eran conductores poco frecuentes y también se encontraron en CGC. KRAS los valores atípicos asociados se enriquecieron para la señalización de MAPK y PDGFR y AKT1 los valores atípicos se enriquecieron para la señalización de la familia FoxO (archivos adicionales 15 y 16). La activación de AKT está asociada con muchas neoplasias, donde AKT actúa, en parte, inhibiendo los supresores de tumores FoxO [27]. En conjunto, las investigaciones de controladores raros en METABRIC, HGS, TN y GBM señalan De buena fe, pero raras mutaciones impulsoras, que probablemente se omitirían mediante métodos que examinan las aberraciones genómicas mediante selección o análisis de frecuencia. Estos resultados indican que las raras mutaciones impulsoras que modulan las redes de expresión comprenden un componente significativo del panorama de la variación transcripcional atribuida al genoma somático y, por lo tanto, no deben pasarse por alto en la enumeración completa de mutaciones impulsoras en estudios a nivel de población.

Los cambios en el número de copias genómicas que albergan oncogenes conocidos modulan simultáneamente las vías metabólicas

A continuación, examinamos los patrones de expresión modulada asociados con los controladores que ocurren dentro de la misma amplificación de alto nivel o deleción homocigótica. Sorprendentemente, observamos cuatro ejemplos en los conjuntos de datos METABRIC y GBM en los que genes proximales a controladores conocidos y dentro del mismo cambio de número de copias genómicas mostraron evidencia de alteración de la expresión de vías metabólicas exclusivas de la modulación de vías oncogénicas o supresoras de tumores conocidas (Figura 3). PNMT codifica la enzima feniletanolamina N-metiltransferasa y reside aproximadamente 20 Kb centromérica para ERBB2 con un gen interviniente. ERBB2, amplificado en aproximadamente el 15-20% de los cánceres de mama, es un receptor de factor de crecimiento unido a la membrana bien conocido que se puede dirigir y que es inhibido eficazmente por trastuzumab en la práctica clínica. La proximidad de PNMT para ERBB2 da como resultado la coamplificación de ambos genes en casi todos los casos (82/83 casos con amplificación de alto nivel de ERBB2 (Archivo adicional 10)). PNMT fue el controlador mejor clasificado en nuestro análisis (ERBB2 era el rango 3). Cuando examinamos los genes atípicos asociados con ERBB2 y PNMT, ERBB2Los genes atípicos asociados se enriquecieron, como se esperaba, para las vías de señalización de Erbb y EGF. PNMTLos valores atípicos asociados se enriquecieron para las vías de biosíntesis de macromoléculas no oncogénicas, incluidas las vías metabólicas y el metabolismo de la tirosina (Figura 3A). La modulación concurrente de vías oncogénicas y metabólicas también se encontró en otras amplificaciones de alto nivel en METABRIC, incluida la amplificación 11q14 de PAK1 y NDUFC2 (Archivo adicional 10). PAK1 (27 casos con amplificaciones de alto nivel) muestra evidencia de conducción EGFR señalización (Figura 3B) y segrega de manera importante con un resultado pobre subtipo ER positivo como se informa en [20]. NDUFC2 (30 casos con amplificaciones de alto nivel), aguas abajo de PAK1 por aproximadamente 660 Kb, codifica una enzima NADH deshidrogenasa. Valores atípicos asociados con NDUFC2 se asociaron con vías metabólicas y una vía de fosforilación oxidativa: una vía metabólica que utiliza la energía liberada por la oxidación de nutrientes para producir trifosfato de adenosina (Figura 3B).

Modulación simultánea de vías metabólicas en alteraciones del número de copias que albergan oncogenes conocidos. EnrichmentMap [32] diagramas que representan las vías del Reactome enriquecidas en el conjunto de valores atípicos asociados con pares de genes que se coamplifican o co-suprimen. En cada par, un gen es un oncogén o supresor de tumores conocido, mientras que el otro es un gen del metabolismo. Las rutas se muestran como nodos conectados en un gráfico donde el tamaño del nodo indica el número de genes en la ruta. Los bordes entre los nodos indican genes comunes a ambas vías donde el grosor del borde representa el grado de superposición. En general, se observó poca superposición entre los impulsores metabólicos y los impulsores oncogénicos / supresores de tumores. (A) PNMT y ERBB2 genes coamplificados en el locus chr17q12 en el cáncer de mama. (B) PAK1 y NDUFC2 genes coamplificados en el locus 11q14 en el cáncer de mama. (C) CDKN2A y MTAP genes co-delecionados en chr9p21.3 en GBM.

En los datos de GBM se observó un patrón similar de modulación simultánea de las vías metabólicas por los cambios en el número de copias que albergan oncogenes conocidos. La quinasa dependiente de ciclina CDKN2A y la metiltioadenosina fosforilasa MTAP están separados por aproximadamente 100 Kb y son genes adyacentes. MTAP (DriverNet rango 3) y supresor de tumores conocido CDKN2A (DriverNet rango 4) son conocidos por ser co-eliminados y fueron observados como tales en nuestro análisis. Observamos 53 casos con deleciones homocigotas en CDK2NA con la co-deleción de acompañamiento de MTAP en todos los casos (Expediente adicional 16). En dos casos adicionales con CDKN2A mutaciones puntuales, MTAP no se encontró que estuviera mutado o eliminado. Los caminos enriquecidos de la CDK2NA-Los valores atípicos asociados incluyeron el ciclo celular, la señalización de p53 y la red de factores de transcripción FOXM1, entre otros. La única vía enriquecida significativa de valores atípicos asociados a la deleción de MTAP fue la vía metabólica (Figura 3C).

Examinamos PNMT-, NDUFC2-, y MTAP- genes periféricos asociados que formaban parte de las vías metabólicas y también ERBB2-, PAK1-, y CDKN2A- genes periféricos asociados que estaban relacionados con las vías oncogénicas / supresoras de tumores. Los genes periféricos relacionados con las vías metabólicas y las vías oncogénicas / supresoras de tumores se distribuyeron a través de loci dispares en el genoma eliminando la co-amplificación como la causa de las señales observadas (archivo adicional 17).

Los resultados de los genes metabólicos que se co-aberran con genes oncogénicos y supresores de tumores sugieren fuertemente que al menos una parte de la alteración de la vía metabólica en el cáncer puede atribuirse mecánicamente a aberraciones somáticas en el genoma. Además, nuestros resultados indican la posibilidad intrigante de que se estén seleccionando aberraciones genómicas que albergan controladores supresores oncogénicos / tumorales conocidos debido a la modulación de la vía oncogénica junto con la modulación de la vía metabólica no superpuesta.


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RESULTADOS

Genes amplificados identificados mediante análisis de número de copias en todo el genoma

Un total de 58 SCLC, que consistían en 33 tumores frescos y 25 líneas celulares (Tabla de información de apoyo S1A, B), se sometieron a análisis de matriz de 250K SNP, y todas las regiones genómicas con ≥ 5 copias en ≥ 5 loci SNP consecutivos se recogieron primero como las regiones amplificadas en los genomas de SCLC. Sin embargo, según estos criterios, los cromosomas completos o los brazos cromosómicos completos se recogieron con más frecuencia que las regiones cromosómicas focales en varios cromosomas entre varios tumores y líneas celulares. Por lo tanto, las regiones cromosómicas amplificadas definidas como segmentos de ≥5 loci SNP consecutivos con números de copias estimados de ≥6 se recogieron a continuación de cada SCLC. Se identificaron diez regiones amplificadas en los cromosomas 1p, 8q, 9p, 12p y 19p en 7 de los 33 tumores recientes (Tabla de información de apoyo S2). Los tamaños de las regiones amplificadas variaron de 0,05 a 3,61 Mb (media ± DE = 1,06 ± 1,25 Mb), y se mapearon 110 genes en estas regiones. Se identificaron 47 regiones amplificadas en los cromosomas 1p, 2p, 8q, 9p, 12p, 14q, 17q y 20q en 13 de las 25 líneas celulares (Tabla de información de apoyo S2). Los tamaños de las regiones amplificadas variaron de 0,08 a 4,22 Mb (media ± DE = 0,67 ± 0,81 Mb), y se mapearon 211 genes en estas regiones. Por lo tanto, se identificaron varias regiones cromosómicas con amplificación focal según el criterio de número de copias ≥6, los tamaños de las regiones amplificadas fueron similares en los tumores recientes y las líneas celulares, y las diversas regiones amplificadas en los tumores recientes se superpusieron con las de las líneas celulares (Información de apoyo Tablas S2). Por consiguiente, las regiones comúnmente amplificadas se determinaron mediante la comparación de las regiones amplificadas entre los 58 SCLC, incluidos tanto los tumores recientes como las líneas celulares. Ocho regiones de los cromosomas 1p, 2p, 8q y 9p se amplificaron comúnmente (≥2 SCLC) en estos SCLC (Tabla 1). Los tamaños de las regiones variaron de 0,03 a 0,77 Mb (media ± DE = 0,25 ± 0,23 Mb), y se cartografiaron 34 genes en estas regiones. Tres de las 8 regiones contenidas MI C oncogenes familiares, MYCL1, MYCN, y MI C, respectivamente, se sabe que se amplifica con frecuencia en SCLC (Wistuba et al., 2001 Kim et al., 2006 Voortman et al., 2010 Larsen y Minna, 2011).

No Citobanda Comienzo Fin Tamaño Gene Nombre de la muestra No. de SCLC amplificados
(Megabyte) (Megabyte) (Megabyte) Tumor fresco Línea celular
1 1p34.3 37.37 38.19 0.77 LOC728431, ZC3H12A, MEAF6, SNIP1, DNALI1, GNL2, RSPO1, C1orf109, CDCA8, EPHA10, MANEAL, YRDC, C1orf122, MTF1, INPP5B, SF3A3, FHL3, UTP11L, POU3F1 SM09-008T H1184 3
H510
2 1p34.2 39.96 40.05 0.09 TRIT1, MYCL1 SM09-012T H1184 6
H1963
H510
HCC33
H2141
3 2p24.3 15.98 16.16 0.18 MYCNOS, MYCN - H526 2
H69
4 8q12.2 62.01 62.18 0.17 LOC100130298 - H2171 3
Lu135
N417
5 8q12.2 62.36 62.39 0.03 CLVS1 - H2171 3
Lu135
N417
6 8q24.21 128.75 128.88 0.13 MYC, MIR1204, PVT1 H2171 6
SM09-011T1 H446
SM09-019T H82
N417
7 9p24.1 5.35 5.78 0.43 PLGRKT, CD274, PDCD1LG2, KIAA1432, ERMP1 R-513T H1607 3
SM09-010T
8 9p23 13.27 13.45 0.18 FLJ41200 - H1607 2
H446

MYCL1 y MYCN fueron co-amplificados con TRIT1 en 1p34.2 y MYCNOS en 2p24.3, respectivamente, en 6 y 2 SCLC. En la región 8q24.21, MI C, MIR1204, y PVT1 se coamplificaron en 6 SCLC. Los puntos de corte del número de copias de las regiones amplificadas en 8q24.21 se mapearon en el PVT1 gen en cinco de los seis SCLC (Tablas de información de apoyo S2 Información de apoyo Fig. S1). La región 1p34.3 se co-amplificó con MYCL1 en 1p34.2, y las regiones 8q12.2 se coamplificaron con MI C en 8q24.21, respectivamente, en varios SCLC (Información de apoyo, Fig. S2). Por lo tanto, se sugirió la aparición de reordenamientos intracromosómicos complicados en el proceso de MYCL1 y MI C amplificación, lo que resulta en la coamplificación de varios otros genes en los cromosomas 1 y 8, respectivamente.

Además de las regiones de los cromosomas 1, 2 y 8, se identificaron dos regiones nuevas comúnmente amplificadas en los cromosomas 9p, 9p23 y 9p24.1 (Tabla 1, Fig. 1). La región 9p23 que incluye FLJ41200 se amplificó en 2 SCLC, mientras que la región 9p24.1, incluida PLGRKT, CD274, PDCD1LG2, KIAA1432, y ERMP1, se amplificó en tres SCLC. Ambas regiones se coamplificaron en la línea celular H1607, mientras que solo la región 9p23 se amplificó en la línea celular H446 y solo la región 9p24.1 se amplificó en dos tumores recientes (Información de apoyo, Fig. S2). En el cromosoma 9p, NFIB a las 9p23 y JAK2 en 9p24.1 se informó que se amplificaron en SCLC (Voortman et al., 2010 Dooley et al., 2011). Sin embargo, NFIB y JAK2 se amplificaron sólo en un SCLC, respectivamente. Por lo tanto, estos dos genes no se mapearon en las regiones comúnmente amplificadas en el cromosoma 9p (Tabla de información de apoyo S2 Tabla 1 Fig. 1).

Expresión de genes amplificados en el cromosoma 9p

Cinco genes PLGRKT, CD274, PDCD1LG2, KIAA1432, y ERMP1, se mapearon en la región comúnmente amplificada en 9p24.1 (Tabla 1). Para determinar qué genes se sobreexpresaron mediante amplificación génica, se trazó el perfil de su expresión de ARNm en 19 tumores recientes (Información de apoyo, Fig. S3A). Estos cinco genes se amplificaron en uno de los 19 tumores, SM09-010T. Expresión de PLGRKT, CD274 y KIAA1432, pero no de PDCD1LG2 y ERMP1, fue claramente alto en SM09-010T (Información de apoyo, Fig. S3B). Por lo tanto, PLGRKT, CD274, y KIAA1432 podría sobreexpresarse mediante amplificación de genes en SCLC.

Para determinar aún más los genes cuya expresión está asociada con el número de copias en el cromosoma 9p, a continuación realizamos el estudio de asociación de la expresión génica con el número de copias del gen en 55 SCLC, incluidos 30 tumores frescos y 25 líneas celulares (Tabla de información de apoyo S1A, B). Además de PLGRKT, CD274 y KIAA1432 a las 9p24.1 y FLJ41200 en 9p23 como genes comúnmente amplificados en SCLC, NFIB a las 9p23 y JAK2 a 9p24.1 también se sometieron al análisis. Expresión de CD274 y KIAA1432 en células amplificadas fue significativamente mayor que en células no amplificadas (PAG & lt 0.05) (Fig. 2A), y cinco genes excepto FLJ41200 mostró asociaciones significativas entre los niveles de expresión de ARNm y el número de copias (PAG & lt 0.05) (Figura 2B). Notablemente, KIAA1432 mostró la asociación más fuerte entre ellos (PAG = 1,04E-06). Por lo tanto, KIAA1432 es el objetivo más fuerte activado por amplificación de genes en el cromosoma 9p en SCLC. Si hay otro objetivo en la región 9p23, NF1B es más probable que sea el indicado FLJ41200.

Copiar números de genes amplificados definidos por PCR genómica en tiempo real

Para investigar más a fondo la prevalencia y la especificidad de la amplificación de genes en las regiones de los cromosomas 1, 2, 8 y 9 en SCLC, 87 SCLC compuestos por 62 tumores y 25 líneas celulares se sometieron a análisis de PCR genómica en tiempo real. Entre ellos, 33 tumores y 25 líneas celulares también se sometieron a análisis de matriz de SNP de 250K (Tabla de información de apoyo S1A, B). Tres MI C Se analizaron genes de la familia y seis genes en el cromosoma 9p, y los criterios de amplificación de genes por PCR genómica en tiempo real se definieron como proporciones de número de copias de ADN ≥3 que eran equivalentes al número de copias ≥6. Cinco de los 33 tumores y 12 de las 25 líneas celulares mostraron amplificación de 1 a 5 de los 9 genes mediante análisis de matriz de 250 K SNP (tablas de información de apoyo S2). Excepto por dos SCLC, la línea celular H1184 con MYCL1 amplificación y el tumor SM09-011T1 con MI C La amplificación, la amplificación de genes definidos por matrices de 250K SNP se detectó consistentemente mediante PCR genómica en tiempo real (Tabla de información de apoyo S3). Por otro lado, en siete SCLC sin amplificación mediante análisis de matriz de 250K SNP, se consideró que 1 a 6 genes estaban amplificados mediante análisis de PCR genómica en tiempo real. Las inconsistencias de los resultados se debieron a las siguientes razones. En primer lugar, solo una pequeña región que incluye MI C cubierta por dos marcadores SNP se amplificó en la línea celular Lu135, por lo tanto, esta región no se definió como amplificada por análisis de matriz de SNP, sino como amplificada por análisis de PCR genómico en tiempo real. En segundo lugar, en R-511T y SM09-006T, pérdida de número de copia del lugar de referencia, RPPH1, en el cromosoma 14 mejoró el grado de amplificación en varios genes mediante análisis genómico-PCR en tiempo real. En tercer lugar, en H2195 y R-506M1, fue difícil definir el número de copias posiblemente debido a la heterogeneidad de las células aneuploides y la presencia de células no cancerosas contaminadas, respectivamente. Por lo tanto, en estos SCLC, los genes con proporciones de número de copias ≥3 por PCR genómica en tiempo real se definieron como cinco copias por análisis de matriz de SNP.

Incluso con algunas inconsistencias entre los resultados de los análisis de matrices de SNP y los de los análisis de PCR genómica en tiempo real, la asociación entre ellos fue muy significativa (PAG = 5,58E-07 según la prueba exacta de Fisher). Por lo tanto, investigamos la prevalencia y la especificidad de la amplificación de genes en función de los datos obtenidos mediante análisis de PCR genómica en tiempo real. La amplificación de estos genes se detectó en 12 de los 62 tumores frescos (19,4%) y 13 de las 25 líneas celulares (52,0%) (Tabla 2). Tres MI C los genes familiares se amplificaron de manera mutuamente excluyente en 16 SCLC (18,4%). Los genes del cromosoma 9p se amplificaron en 10 SCLC (11,5%). Notablemente, NF1B / FLJ41200 a las 9p23 y JAK2 / CD274 / PLGRKT / KIAA1432 en 9p24.21 no se co-amplificaron en 8 de los 10 SCLC, lo que indica que la amplificación de estas dos regiones se produjo de forma independiente en la mayoría de los SCLC. Por lo tanto, se sugirió ampliamente la presencia de genes diana para la amplificación en cada región. Por esta razón, las especificidades de la amplificación de 9p23 y la amplificación de 9p24.21 se analizaron de forma independiente entre los 87 SCLC. Es importante destacar que cuatro genes en la región 9p24.1 se amplificaron de manera mutuamente excluyente con MI C genes familiares, mientras que MI C gen fue co-amplificado en uno de los tres SCLC con NF1B amplificación, en consonancia con los resultados de los análisis de matriz de 250K SNP (información de apoyo, figura S2).

1p34.2 2p24.3 8q24.21 9p23 9p24.1
Nombre de la muestra MYCL1 MYCN MI C NFIB FLJ41200 JAK2 PLGRKT CD274 KIAA1432
H1963 +
HCC33 +
H510 +
H2141 +
SM09-012T +
S391T +
H69 +
H526 +
1591T +
R-511T +
H82 +
N417 +
Lu135 +
H2171 +
SM09-019T +
H446 + + +
H2195 + +
SM09-008T +
SM09-006T + + + + + +
H1607 + + + + +
R-506M1 + + + +
SM09-010T + + +
R-513T + + +
SM09-004T + +
1491M +
Tasa de amplificación en 87 SCLC (%) 6.9 4.6 6.9 3.4 5.7 3.4 6.9 6.9 6.9

Identificación de transcripciones de fusión mediante secuenciación del transcriptoma completo

Cuarenta y dos SCLC, que consistían en 19 tumores recientes y 23 líneas celulares, se sometieron a secuenciación del transcriptoma completo para identificar genes de fusión expresados ​​en SCLC (tablas de información de apoyo S1A, B y S4). Los recuentos totales de lectura variaron de 74,378,482 a 93,612,490, y su promedio fue de 86,529,758. Se identificaron un total de 60 transcripciones de fusión, transcritas de una porción de 95 genes, como expresadas según los criterios de ≥10 lecturas de extremos emparejados (PE) para cada transcripción (Tabla 3). Veintidós de ellos (36,7%) estaban en marco, por lo que se predijo que producirían proteínas de fusión. No se detectó un conjunto de transcripciones de fusión 5′-3 ′ de forma recurrente en ≥2 SCLC. Sin embargo, dos de los genes asociados de 5 ′, PVT1 y RLF, se detectaron de forma recurrente en ≥2 SCLC (14 pares en 7 SCLC). PVT1 se detectó como el gen socio 5 'de siete pares de fusión con diferentes genes socios 3' en cinco SCLC. Previamente, PVT1 se demostró que estaba fusionado con CHD7 en H2171 y Lu135 (Campbell et al., 2008 Pleasance et al., 2010). En este estudio, PVT1-CHD7 se detectó en H2171 con ≥10 lecturas de PE pero no en Lu135. RLF se detectó como el gen socio 5 'de 7 pares de fusión con diferentes genes socios 3' en 2 SCLC. RLF fue reportado como un gen de fusión con MYCL1 expresado en células SCLC (Makela et al., 1991a, 1991b, 1995), y el RLF-MYCL1 También se detectó fusión en H1963 con ≥10 lecturas de PE en este estudio. Tres de los cinco pares de fusión que tienen RLF como el gen socio 5 ′, RLF-MYCL1, RLF-SMAP2 y RLF-FAM132A, se predijo que producirían proteínas de fusión. Las 46 transcripciones de fusión restantes se detectaron en un solo SCLC, respectivamente, y se predijo que 19 de ellas producirían proteínas de fusión. Por lo tanto, ninguna de las 22 transcripciones de fusión que se predice que producirán proteínas de fusión se expresó de forma recurrente en múltiples casos de CPCP.

5 'gen socio 3 'gen socio Distancia en el genoma (pb) Cuadro
No Muestra #PE lee #junction lee Gene ARNm No Chr Amperio. Gene ARNm No Chr Amperio. En el marco de
I. transcripciones 5 'detectadas en ≥ 2 casos
1 H82 408 239 PVT1 NR_003367.1 8 + MYH7 NM_000257.2 14 +
2 H2171 345 177 PVT1 NR_003367.1 8 + CHD7 NM_017780.3 8 + 67027313
3 H2171 219 20 PVT1 NR_003367.1 8 + SLC7A7 NM_001126105.2 14 105507749
4 H2171 114 17 PVT1 NR_003367.1 8 + CCNB1IP1 NM_021178.3 14 N / A
5 H2107 37 13 PVT1 NR_003367.1 8 NOL4 NM_001198546.1 18 N / A
6 N417 34 82 PVT1 NR_003367.1 8 + CLVS1 NM_173519.2 8 + 66392576
7 H446 12 26 PVT1 NR_003367.1 8 + LY6H NM_001130478.1 8 15125833
8 HCC33 525 128 RLF NM_012421.3 1 + UBE2J2 NM_058167.2 1 39417806
9 H1963 391 562 RLF NM_012421.3 1 + MYCL1 NM_001033081.2 1 + 259353 +
10 H1963 194 68 RLF NM_012421.3 1 + COL9A2 NM_001852.3 1 + 59570
11 H1963 118 68 RLF NM_012421.3 1 + BCL2L1 NM_001191.2 20 + N / A
12 H1963 112 124 RLF NM_012421.3 1 + HM13 NM_030789.2 20 + N / A
13 H1963 43 163 RLF NM_012421.3 1 + SMAP2 NM_001198978.1 1 + 133135 +
14 HCC33 33 132 RLF NM_012421.3 1 + FAM132A NM_001014980.2 1 39444938 +
II. Transcripciones de fusión detectadas en un solo caso
15 H1963 2168 1627 TPX2 NM_012112.4 20 + HM13 NM_030789.2 20 + 169703 +
16 SM09-012T 290 335 CAP1 NM_001105530.1 1 + MACF1 NM_012090.4 1 + 991332
17 H1963 226 52 BCL2L1 NM_138578.1 20 + HM13 NM_030789.2 20 + 94884
18 HCC33 193 83 TRIT1 NM_017646.4 1 + EP400 NM_015409.4 12 + N / A
19 H1963 125 45 BCL2L1 NM_138578.1 20 + DEM1 NM_022774.1 1 + N / A +
20 H2171 122 56 ENO2 NM_001975.2 12 ACRBP NM_032489.2 12 +
21 H1963 99 99 BCL2L1 NM_138578.1 20 + LLANTAS3 NM_014747.2 1 + N / A
22 SM09-004T 82 101 WAC NM_016628.4 10 GPR158 NM_020752.2 10 2931268
23 Lu139 79 45 CSMD3 NM_052900.2 8 MI C NM_002467.4 8 14299072
24 H1184 54 88 RERE NM_001042681.1 1 SLC2A5 NM_001135585.1 1 223728 +
25 H69 50 44 FOXK2 NM_004514.3 17 HEXDC NM_173620.2 17 77073
26 H1963 50 17 BCL2L1 NM_138578.1 20 + ZNF684 NM_152373.3 1 + N / A +
27 N417 42 30 NCOR2 NM_001077261.3 12 SCARB1 NM_005505.4 12 210164
28 HCC33 41 71 UBE4B NM_001105562.2 1 TBCB NM_001281.2 19 N / A +
29 SM09-010T 41 43 KIAA1432 NM_001135920.2 9 + JAK2 NM_004972.3 9 501144 +
30 H1963 41 31 ZMPSTE24 NM_005857.4 1 + MFSD2A NM_001136493.1 1 + 288105
31 H510 38 37 SMEK1 NM_032560.4 14 HEATR3 NM_182922.2 16 N / A +
32 SM09-016T 36 48 NAV2 NM_001111018.1 11 LOC494141 NR_026563.1 11 1137161
33 Lu135 32 23 LRRC45 NM_144999.2 17 GCGR NM_000160.3 17 209390
34 H510 30 67 TWSG1 NM_020648.5 18 PIK3C3 NM_002647.2 18 30132781
35 H69 30 34 PAWR NM_002583.2 12 GNS NM_002076.3 12 14832520
36 H1184 25 20 SF3A3 NM_006802.2 1 + GNL2 NM_013285.2 1 + 361067 +
37 H209 24 19 CREBBP NM_001079846.1 16 SLX4 NM_032444.2 16 113472
38 SM09-016T 24 14 RASA2 NM_006506.2 3 NICN1 NM_032316.3 3 91739168 +
39 H1963 22 48 SMAP2 NM_022733.2 1 + MYCL1 NM_001033081.2 1 + 472040
40 SM09-016T 22 13 SFMBT1 NM_001005158.2 3 AP2A2 NM_001242837.1 11 N / A
41 H510 21 12 PTK2 NM_001199649.1 8 PKHD1L1 NM_177531.4 8 31125439
42 H526 19 31 SLC25A36 NM_001104647.1 3 PLSCR1 NM_021105.2 3 5534191
43 H526 19 20 XPR1 NM_001135669.1 1 TRMT1L NM_001202423.1 1 4227805 +
44 H2195 18 22 HMBOX1 NM_001135726.1 8 ZFAND3 NM_021943.2 6 N / A +
45 SM09-014T 18 10 CRLS1 NM_001127458.1 20 KCNK17 NM_001135111.1 6 N / A
46 H510 17 14 PHF15 NM_015288.4 5 UBE2B NM_003337.2 5 133999
47 H1963 17 10 BCL2L1 NM_138578.1 20 + ZNF643 NM_023070.2 1 + N / A +
48 SM09-016T 15 40 ATP5L NM_006476.4 11 TEAD1 NM_021961.5 11 105305820
49 SM09-014T 14 23 NUDCD1 NM_001128211.1 8 SYBU NM_001099743.1 8 244247 +
50 Lu134 14 17 SPG11 NM_001160227.1 15 SORD NM_003104.5 15 359425 +
51 SM09-016T 14 17 NGLY1 NM_001145293.1 3 CCKBR NM_176875.3 11 N / A +
52 SM09-016T 13 21 DLEC1 NM_007335.2 3 ODZ4 NM_001098816.2 11 N / A
53 H1963 13 19 PPT1 NM_000310.3 1 + BCL2L1 NM_001191.2 20 + N / A
54 H128 13 12 NAIP NM_004536.2 5 OCLN NM_001205254.1 5 1414179
55 H1963 12 10 BCL2L1 NM_138578.1 20 + BMP8B NM_001720.3 1 + N / A
56 H526 12 10 CIT NM_001206999.1 12 RFC5 NM_001130112.2 12 1653559 +
57 H1963 11 22 BCL2L1 NM_138578.1 20 + RLF NM_012421.3 1 + N / A
58 SM09-018T 10 22 NFIX NM_002501.2 19 GATAD2A NM_017660.3 19 6287032 +
59 SM09-016T 11 19 STAG1 NM_005862.2 3 STXBP5L NM_014980.2 3 14912391
60 H2171 10 12 PICALM NM_001008660.2 11 CCDC81 NM_001156474.1 11 304853 +

Amplificación de genes con fusiones

A continuación, investigamos el número de copias de 95 genes en los 60 pares de fusión identificados por secuenciación del transcriptoma completo (Tabla 3). Veintiocho de los genes asociados en 5 'detectados en 9 SCLC y 22 de los genes asociados en 3' detectados en siete SCLC se cartografiaron en las regiones amplificadas.

En cuatro de los cinco SCLC que expresan transcripciones de fusión con PVT1 como el gen socio 5 ′, las porciones 5 ′ del PVT1 gen en 8q24.21 fueron amplificados, lo que indica que se habían producido roturas cromosómicas en el PVT1 locus (Información de apoyo, Fig. S1). Tres de los siete genes fusionados con PVT1 también fueron amplificados. Por lo tanto, se indicó que las roturas cromosómicas a menudo ocurren en el PVT1 locus durante el proceso de MI C amplificación. Por esta razón, buscamos más PVT1 transcripciones de fusión expresadas en las líneas celulares H2171, Lu135 y N417, que mostraron coamplificación de tres regiones en el cromosoma 8q (Tabla 1). Además de PVT1-CHD7 (PE lee = 345), PVT1-SLC7A7 (Lectura PE = 219), y PVT1-CCNB1IP1 (Lecturas de PE = 114) se detectaron en H2171. Como se describió anteriormente, no PVT1 se detectó fusión en Lu135. PVT1-CLVS1 (Lectura PE = 34) y PVT1-ASPH (Lecturas de PE = 27, lecturas de unión = 9) se detectaron en N417.

RLF, detectado como el gen socio 5 'de siete pares de fusión en dos líneas celulares, H1963 y HCC33, se amplificó en ambas líneas celulares (Tabla 3). Tres genes asociados en 3 ′, MYCL1, COL9A2, y SMAP2, fusionado con RLF en H1963 también se mapearon en 1p34.2 y se amplificaron. Otros dos genes asociados en 3 ′, BCL2L1 y HM13, fusionado con RLF en H1963 y mapeados en 20q11.21, también se amplificaron. Los dos genes socios 3 ′ restantes, UBE2J2 y FAM132A en 1p36.33, también se amplificaron en HCC33 con 2 SNP consecutivos. Por lo tanto, la producción de transcripciones de fusión con RLF siempre estuvo acompañada por la amplificación de los genes 5 ′ y 3 ′, lo que indica que esos genes se habían fusionado en el proceso de MYCL1 amplificación.

Estos resultados indican claramente que la amplificación de varias regiones de los cromosomas 1 y 8 de forma simultánea, pero no secuencial, se produce en las células de SCLC, y respaldan aún más que se producen reordenamientos intracromosómicos complicados en el proceso de MYCL1 o MI C amplificación, lo que resulta en la coamplificación y fusión de varios genes en los cromosomas 1 y 8. Por lo tanto, la PVT1 y RLF los loci serían puntos críticos de roturas cromosómicas en el proceso de amplificación de genes en células de SCLC.

SCLC con expresión de múltiples transcripciones de fusión

Se detectaron sesenta transcripciones de fusión en 23 de los 42 SCLC (Tabla 3, Tabla de información complementaria S4), lo que indica la presencia de SCLC que expresan múltiples transcripciones de fusión. De hecho, se identificaron dieciséis pares de fusión que constaban de 15 genes en H1963 (Información de apoyo, Fig. S4A). Doce de los 15 genes, incluidos MYCL1, se asignaron al amplicón 1p34.2 y los 3 genes restantes se asignaron al amplicón 20q11.21. Siete fusiones fueron intracromosómicas entre genes en 1p34.2 o 20q11.21, mientras que las otras nueve fusiones fueron intercromosómicas entre genes en 1p34.2 y genes en 20q11.21. Por lo tanto, en H1963, era probable que ocurrieran reordenamientos cromosómicos complicados en el proceso de MYCL1 amplificación.

Se identificaron siete pares de fusión que constaban de 14 genes en SM09-016T (Información de apoyo, Fig. S4B). Siete y 7 de los 14 genes se mapearon en los cromosomas 3 y 11, respectivamente. Los genes asociados 5 'y 3' de cuatro de las siete fusiones se mapearon en los mismos cromosomas, mientras que los de las tres fusiones restantes se mapearon en cromosomas diferentes. Por lo tanto, estos genes se fusionaron mediante reordenamientos intracromosómicos o intercromosómicos. Curiosamente, no se amplificaron genes fusionados en SM09-016T, lo que indica que se habían producido reordenamientos cromosómicos complicados sin amplificación génica. Se detectaron de dos a cinco transcripciones de fusión en otros ocho SCLC. Entre las 24 fusiones detectadas en estos SCLC, 18 de ellas fueron intracromosómicas y las seis restantes fueron intercromosómicas. Se mapearon ocho de los genes asociados en 5 'y cuatro de los genes asociados en 3' en las regiones amplificadas. Por lo tanto, los reordenamientos intracromosómicos parecían ocurrir preferentemente en las células de SCLC independientemente del proceso de amplificación del gen.

KIAA1432-JAK2 Fusión detectada en un SCLC con amplificación 9p24.1

Curiosamente, un KIAA1432 – JAK2 Se detectó transcripción de fusión en SM09-010T con amplificación de la KIAA1432 gen en 9p24.1 (Tabla 3 Fig. 3A). Además, se demostró que tres (4,6%) de 65 SCLC analizados por RT-PCR expresan KIAA1432 – JAK2 transcripciones de fusión. Sin embargo, se predijo que solo uno de ellos expresado en SM09-010T produciría una proteína de fusión, aunque el dominio de tirosina quinasa se rompió por fusión (Fig. 3B).


Condiciones de salud relacionadas con cambios genéticos

Acondroplasia

Dos mutaciones en el FGFR3 El gen causa más del 99 por ciento de los casos de acondroplasia, que es una forma de enanismo de extremidades cortas. Ambas mutaciones conducen al mismo cambio en la proteína FGFR3. Específicamente, el bloque de construcción de proteínas (aminoácido) glicina se reemplaza con el aminoácido arginina en la posición de la proteína 380 (escrito como Gly380Arg o G380R). Los investigadores creen que este cambio genético hace que el receptor sea demasiado activo, lo que conduce a las alteraciones en el crecimiento óseo que ocurren en este trastorno.

Síndrome de Crouzon con acantosis nigricans

Un solo FGFR3 Se ha identificado una mutación genética en personas con síndrome de Crouzon con acantosis nigricans. Esta rara condición causa la unión prematura de los huesos del cráneo (craneosinostosis), lo que lleva a una cabeza deforme y rasgos faciales distintivos, y una anomalía de la piel llamada acantosis nigricans que se caracteriza por una piel gruesa, oscura y aterciopelada en los pliegues y arrugas del cuerpo. El cambio genético que causa el síndrome de Crouzon con acantosis nigricans reemplaza el aminoácido alanina por el aminoácido ácido glutámico en la posición 391 de la proteína FGFR3 (escrito como Ala391Glu o A391E). El receptor alterado se activa más fácilmente de lo normal y puede desencadenar vías de señalización incluso sin la unión de factores de crecimiento. La hiperactividad resultante de la proteína FGFR3 interrumpe el crecimiento normal de los huesos del cráneo y la piel, lo que conduce a las características del síndrome de Crouzon con acantosis nigricans.

Nevo epidérmico

Mutaciones en el FGFR3 gen se ha encontrado en aproximadamente el 30 por ciento de las personas con cierto tipo de nevo epidérmico (plural: nevi). Específicamente, FGFR3 Las mutaciones genéticas están asociadas con algunos nevos epidérmicos queratinocíticos, que son crecimientos anormales de la piel compuestos por células de la piel llamadas queratinocitos. FGFR3 No se han encontrado mutaciones genéticas en otros tipos de nevos epidérmicos.

Los más comunes FGFR3 la mutación genética en los nevos epidérmicos cambia un solo aminoácido en la proteína FGFR3. El aminoácido arginina se reemplaza con el aminoácido cisteína en la posición 248 (escrito como Arg248Cys o R248C). Esta mutación crea una proteína que se enciende sin la unión de un factor de crecimiento, lo que significa que la proteína FGFR3 está constantemente activa. Los estudios sugieren que las células con este FGFR3 la mutación genética crece y se divide más que las células normales. El crecimiento excesivo resultante de las células de la piel conduce a nevos epidérmicos.

los FGFR3 Las mutaciones genéticas encontradas en los nevos epidérmicos también ocurren en personas con otra anomalía de la piel llamada queratosis seborreica y en personas con trastornos esqueléticos conocidos como displasia tanatofórica, síndrome de Crouzon con acantosis nigricans y SADDAN (cada uno descrito en otra sección de esta página). Sin embargo, a diferencia de las condiciones esqueléticas, las mutaciones asociadas con los nevos epidérmicos (y la queratosis seborreica) son mutaciones somáticas que surgen al azar. En los nevos epidérmicos, las mutaciones ocurren durante las primeras etapas del desarrollo antes del nacimiento y están presentes solo en las células del nevo, no en las células normales de la piel que lo rodean.

Hipocondroplasia

Más de 25 mutaciones en el FGFR3 Se han identificado genes en personas con hipocondroplasia, otra forma de enanismo de extremidades cortas que es más leve que la acondroplasia. Muchos casos son causados ​​por uno de dos FGFR3 mutaciones genéticas, las cuales conducen al mismo cambio en la proteína FGFR3. Específicamente, el aminoácido asparagina se reemplaza con el aminoácido lisina en la posición de la proteína 540 (escrito como Asn540Lys o N540K). Otro FGFR3 las mutaciones genéticas probablemente causan una pequeña cantidad de casos de hipocondroplasia. Aunque no se han explicado los efectos de estas mutaciones asociadas a la hipocondroplasia, probablemente causen que el receptor sea levemente hiperactivo, lo que conduce a las alteraciones en el crecimiento óseo que ocurren en este trastorno.

Síndrome lacrimo-auriculo-dento-digital

Al menos una mutación en el FGFR3 Se ha descubierto que el gen causa el síndrome lacrimo-auriculo-dento-digital (LADD). Las principales características del síndrome LADD son la producción anormal de lágrimas, malformaciones en los oídos con pérdida auditiva, disminución de la producción de saliva, dientes pequeños y deformidades en las manos. los FGFR3 La mutación genética que causa el síndrome LADD reemplaza el aminoácido ácido aspártico con el aminoácido asparagina en la posición 513 de la proteína receptora FGFR3 (escrita como Asp513Asn o D513N). Es muy probable que esta mutación reduzca la capacidad de la proteína receptora FGFR3 para activar la señalización química dentro de las células cuando está unida a su factor de crecimiento. Estos defectos en la señalización celular interrumpen la maduración y el desarrollo celular, lo que da como resultado la formación anormal de los oídos, el esqueleto y las glándulas en los ojos y la boca en personas con síndrome LADD.

Síndrome de Muenke

Una sola mutación en el FGFR3 Se ha demostrado que el gen causa el síndrome de Muenke, que es una condición que causa craneosinostosis, lo que lleva a una cabeza deformada y rasgos faciales distintivos. Los signos y síntomas adicionales pueden incluir pérdida de audición, anomalías sutiles en manos y pies y retraso en el desarrollo. La mutación que causa el síndrome de Muenke sustituye el aminoácido arginina por el aminoácido prolina en la posición 250 de la proteína FGFR3 (escrita como Pro250Arg o P250R). Esta mutación da como resultado la producción de un receptor que es demasiado activo, lo que permite que los huesos del cráneo se fusionen antes de lo normal.

La mutación Pro250Arg también se ha identificado en algunas personas con craneosinostosis coronal aparentemente aislada. Esta condición se caracteriza por una fusión prematura de la línea de crecimiento que atraviesa la parte superior de la cabeza de oreja a oreja (la sutura coronal). Las personas con craneosinostosis coronal aislada no tienen las otras características que a veces se asocian con el síndrome de Muenke (como anomalías en las manos y los pies).

Saddan

Una mutación en el FGFR3 Se ha identificado el gen en personas con SADDAN (acondroplasia grave con retraso en el desarrollo y acantosis nigricans). SADDAN se caracteriza por un enanismo de extremidades cortas (acondroplasia) un profundo retraso en el desarrollo y una piel gruesa, oscura y aterciopelada. El cambio genético que causa esta condición sustituye el aminoácido metionina por el aminoácido lisina en la posición 650 de la proteína FGFR3 (escrito como Lys650Met o K650M). Los investigadores creen que esta mutación sobreactiva fuertemente la proteína FGFR3, lo que conduce a problemas graves con el crecimiento óseo. Sigue siendo incierto cómo la mutación causa retraso en el desarrollo o acantosis nigricans.

Displasia tanatofórica

Mutaciones en el FGFR3 Se han identificado genes en personas con displasia tanatofórica, que es un trastorno esquelético grave caracterizado por extremidades extremadamente cortas y un tórax estrecho. Mas de 10 FGFR3 Se ha descubierto que las mutaciones genéticas causan displasia tanatofórica tipo I. La mayoría de estas mutaciones cambian un solo aminoácido en la proteína FGFR3. La mutación más común sustituye el aminoácido cisteína por el aminoácido arginina en la posición de la proteína 248 (escrito como Arg248Cys o R248C). Otras mutaciones hacen que la proteína sea más larga de lo normal.

Se ha demostrado que solo una mutación causa displasia tanatofórica tipo II. Esta mutación reemplaza el aminoácido lisina con el aminoácido ácido glutámico en la posición 650 de la proteína FGFR3 (escrito como Lys650Glu o K650E). Este cambio afecta a una parte diferente de la proteína FGFR3 que las mutaciones que causan la displasia tanatofórica tipo I.

Los cambios genéticos responsables de ambos tipos de displasia tanatofórica hacen que el receptor FGFR3 esté hiperactivo, lo que conduce a los graves problemas de crecimiento óseo que se producen en esta afección.

Cáncer de vejiga

Algunas mutaciones genéticas se adquieren durante la vida de una persona y solo están presentes en determinadas células. Estos cambios, que se denominan mutaciones somáticas, no se heredan. Mutaciones somáticas en el FGFR3 Se han encontrado genes en algunos casos de cáncer de vejiga. El cáncer de vejiga es una enfermedad en la que ciertas células de la vejiga se vuelven anormales y se multiplican sin control para formar un tumor. El cáncer de vejiga puede causar sangre en la orina, dolor al orinar, micción frecuente, sensación de necesidad de orinar sin poder hacerlo o dolor lumbar.

El cáncer de vejiga generalmente se divide en dos tipos, cáncer de vejiga no músculo invasivo (NMIBC) y cáncer de vejiga músculo invasivo (MIBC), según el lugar de la vejiga en el que se encuentra el tumor. Aproximadamente el 80 por ciento de los tumores NMIBC tienen FGFR3 mutaciones genéticas. FGFR3 las mutaciones genéticas cambian los aminoácidos individuales en la proteína FGFR3, que parece sobreactivar la señalización de la proteína. Como resultado, es probable que las células de la vejiga crezcan y se dividan de manera anormal. Esta división celular descontrolada conduce a la formación de cáncer de vejiga.

Mieloma múltiple

MedlinePlus Genetics proporciona información sobre el mieloma múltiple

Otros trastornos

Al menos dos FGFR3 Se ha descubierto que las mutaciones genéticas causan un trastorno poco común llamado camptodactilia, estatura alta, síndrome de pérdida auditiva (síndrome CATSHL). Las personas con esta afección son más altas que el promedio y, por lo general, tienen pérdida auditiva. También pueden tener los dedos de las manos o de los pies doblados permanentemente (camptodactilia) y otras anomalías esqueléticas. Los investigadores sugieren que el FGFR3 Las mutaciones genéticas implicadas en el síndrome CATSHL reducen la función de la proteína FGFR3, aunque no está claro cómo las mutaciones conducen a los signos y síntomas de la enfermedad.

Mutaciones en el FGFR3 Se han encontrado genes en 30 a 70 por ciento de las personas con queratosis seborreica, que son tumores pequeños, oscuros, no cancerosos (benignos) de la piel causados ​​por el crecimiento excesivo de células de la piel. Las queratosis seborreicas se desarrollan en la edad adulta y se observan en la mayoría de las personas mayores de 50 años. FGFR3 Las mutaciones genéticas asociadas con las queratosis seborreicas son mutaciones somáticas y no se heredan. Al menos nueve FGFR3 Se han identificado mutaciones genéticas en personas con queratosis seborreica. Estas mutaciones cambian los aminoácidos individuales en la proteína FGFR3. Las proteínas FGFR3 mutadas son anormalmente activas, lo que da como resultado un crecimiento excesivo de las células de la piel, lo que lleva a queratosis seborreica. Se ha sugerido que las mutaciones involucradas en la queratosis seborreica pueden ser causadas por la exposición a la luz ultravioleta (UV).

El Arg248Cys somático FGFR3 La mutación genética encontrada en el nevo epidérmico (descrita anteriormente) también puede causar el síndrome de García-Hafner-Happle (también conocido como síndrome del nevo epidérmico del receptor 3 del factor de crecimiento de fibroblastos). Esta afección se caracteriza por un nevo epidérmico queratinocítico suave y aterciopelado y problemas neurológicos, como convulsiones, discapacidad intelectual, subdesarrollo del tejido que conecta las dos mitades del cerebro (cuerpo calloso) y pérdida de células cerebrales (atrofia cortical). . Se cree que los problemas neurológicos ocurren porque la mutación somática afecta a las células del cerebro además de las de la piel.

Otros cánceres

Además del cáncer de vejiga, las mutaciones somáticas en el FGFR3 gen se han asociado con un cáncer de glóbulos blancos (mieloma múltiple) y cáncer de cuello uterino. Algunos casos de mieloma múltiple están relacionados con un reordenamiento del material genético (una translocación) que involucra el cromosoma 14 y la región del cromosoma 4 que contiene el FGFR3 gene. Las mutaciones que se han asociado con el cáncer de cuello uterino son cambios en nucleótidos individuales en el FGFR3 gene.

FGFR3 Se cree que las mutaciones genéticas que producen mieloma múltiple y cáncer de cuello uterino sobreactivan la proteína FGFR3 en ciertas células. El receptor mutado hace que las células crezcan y se dividan en ausencia de señales externas a la célula. Esta división incontrolada puede provocar el crecimiento excesivo de células cancerosas.


Abreviaturas

Área bajo la curva dosis-respuesta

Cromosoma artificial bacteriano

Enciclopedia de líneas de células cancerosas

Hibridación genómica comparativa

Portal de respuesta a la terapéutica del cáncer

Base de datos de variantes genómicas

Familia de tumores del sarcoma de Ewing

Hibridación in situ fluorescente

Comité de nomenclatura genética de HUGO

Organización del genoma humano

La pérdida de heterocigosidad

Red nacional integral de cáncer

CGH cromosómico basado en oligonucleótidos

Reacción en cadena de la polimerasa

Polimorfismo de nucleótido simple

Investigación de aplicación terapéutica para generar tratamientos efectivos


Copiar genes de enfermedades relacionadas con la variación del número

Uno de los temas más importantes y desafiantes en biomedicina y genómica es cómo identificar genes relacionados con enfermedades. Los conjuntos de datos de biotecnologías de alto rendimiento se han utilizado ampliamente para superar este problema desde varias perspectivas, p.ej., epigenómica, genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica. A nivel genómico, las variaciones en el número de copias (CNV) se han reconocido como variaciones genéticas críticas, que contribuyen significativamente a la diversidad genómica. Se han asociado con enfermedades tanto comunes como complejas y, por lo tanto, tienen una gran influencia en una variedad de trastornos genéticos mendelianos y somáticos.

Resultados

En esta revisión, basada en una variedad de enfermedades complejas, brindamos una descripción general sobre el papel fundamental del uso de CNV para identificar genes relacionados con enfermedades y discutimos en detalle los diferentes métodos de secuenciación y alto rendimiento aplicados para la detección de CNV. También se destacan algunas limitaciones y desafíos relacionados con la CNV.

Conclusiones

La detección confiable de CNV no solo permitirá discriminar mutaciones impulsoras para diversas enfermedades, sino que también ayudará a desarrollar una medicina personalizada al integrarla con otras características genómicas.


Genes donde tanto una mutación incapacitante como la amplificación del número de copias causan diferentes enfermedades genéticas - Biología

Las mutaciones genéticas están influenciadas por el contexto de la secuencia, la estructura y las características genómicas.

Se han identificado los mecanismos responsables de muchos puntos calientes mutacionales.

Los puntos calientes están relacionados en gran medida con loci propensos a la mutación durante la replicación o reparación del ADN.

La selección conduce a mutaciones recurrentes en los tejidos somáticos que pueden aprovecharse con fines terapéuticos.

La mutación del genoma humano da como resultado tres clases de variación genómica: variantes de un solo nucleótido, inserciones o deleciones cortas y grandes variantes estructurales (SV). Algunas mutaciones ocurren durante procesos normales, como la recombinación meiótica o el desarrollo de células B, y otras son el resultado de la replicación del ADN o la reparación aberrante de roturas en contextos específicos de secuencia. Independientemente del mecanismo, las mutaciones están sujetas a selección y algunos puntos calientes pueden manifestarse en forma de enfermedad. Aquí, discutimos las regiones genómicas propensas a la mutación, los mecanismos que contribuyen a la susceptibilidad a las mutaciones y los procesos que conducen a su acumulación en genomas normales y somáticos. Con una secuenciación del genoma humano más precisa y adicional, es probable que se descubran puntos críticos de mutación adicionales, detalles mecánicos de su formación y la relevancia de los puntos críticos para la evolución y la enfermedad.