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Detección de quórum en Vibrio cholerae


Esta es una figura que resume el mecanismo de detección de quórum en Vibrio cholerae.

En este video de Bonnie Bassler, ella explica cómo la detección de quórum puede enfocarse para controlar infecciones.

A las 15:09 ella explica por qué cqsA- los mutantes muestran un efecto más dramático cuando se agrega CAI1 externo - porque no estamos luchando contra el autoinductor producido endógenamente1.

Mi pregunta: ¿Pero no ayudará el autoinductor producido de forma endógena a controlar la virulencia, ya que cuanto más autoinductor, menor es la virulencia? ¿Por qué deberíamos luchar contra el autoinductor 1 producido de forma endógena?


En primer lugar, encuentro que la detección de quórum es en general fascinante, por lo que me alegra ver que el tema se plantea aquí.

El Dr. Bassler tiene muchos artículos sobre el tema, pero creo que uno de los más relevantes para esta pregunta está aquí.

Con respecto a tu pregunta, tienes la idea correcta, pero no entiendes el sentido de su comentario. El Western muestra una diferencia más dramática en las bacterias cqsA- porque no las inhiben (como sugirió). Por tanto, las concentraciones más bajas tienen niveles mucho más altos de la toxina producida porque el único CAI-1 que se proporciona es el sintético. Esto hace que el aumento en el CAI-1 administrado parezca más drástico porque comienza en un nivel superior.

Espero que eso sea así, ya que, si puedo encontrar una versión de escritura abierta del Western, regresaré y daré un análisis más detallado al respecto.

En cuanto a los comentarios de @AlanBoyd, V. cholerae es diferente porque busca crear una infección aguda, no persistente. La toxina del cólera es la que causa la mayor parte de la diarrea y la virulencia del cólera. V. cholera produce la toxina hasta que es inhibida por el autoinductor de éter (que debería ser después de que el paciente ya tiene diarrea masiva), luego cambia para producir enzimas que la separan del intestino. El paciente todavía tiene diarrea en este punto, el cólera simplemente no necesita producir más toxinas para que continúe. Hacerlo probablemente desperdiciaría energía y no ayudaría a las bacterias a regresar al suministro de agua.


Detección de quórum en Vibrio cholerae

Las bacterias pueden comunicarse con miembros de su propia especie y otros para coordinar su comportamiento en respuesta a la densidad celular. Este fenómeno, conocido como detección de quórum, se basa en la producción y detección de una o más moléculas de señal secretadas. Un estudio reciente identifica una red compleja de detección de quórum en el patógeno humano Vibrio cholerae.

Para que las bacterias patógenas sobrevivan en el entorno del huésped, la evasión de las defensas inmunitarias del huésped es una prioridad. La detección de quórum asegura que haya una cantidad suficiente de bacterias para coordinar una respuesta de virulencia que abrumará las defensas del huésped 1. Muchas bacterias Gram-negativas utilizan sistemas de detección de quórum similares a los de LuxI-LuxR de la bacteria marina. Vibrio fischeri. LuxI sintetiza una molécula de señal difusible, una norte-acilhomoserina lactona (AHL), que aumenta en concentración a medida que aumenta la densidad celular. A una concentración crítica, LuxR se une a la molécula de señal y luego puede regular la expresión génica. Por el contrario, las bacterias Gram-positivas utilizan péptidos procesados ​​cortos como sus moléculas señal, que son secretadas por un transportador de casete de unión a ATP. De manera similar, la acumulación de péptido señal a una concentración umbral da como resultado la regulación de la expresión génica por un sistema regulador de respuesta de quinasa sensor de dos componentes, que funciona a través de una cascada de fosforilación-desfosforilación.


El factor de transcripción sensible al quórum AphA regula directamente la competencia natural en Vibrio cholerae

Muchas bacterias utilizan la densidad de población para controlar la expresión génica mediante la detección de quórum. En Vibrio cholerae, la detección de quórum coordina la virulencia, la formación de biopelículas y la absorción de ADN por competencia natural. Los factores de transcripción AphA y HapR, expresados ​​a baja y alta densidad celular respectivamente, juegan un papel clave. En particular, AphA desencadena toda la cascada de virulencia tras la colonización del huésped. En este trabajo hemos mapeado la unión de ADN de todo el genoma por AphA. Mostramos que AphA es versátil, exhibiendo distintos modos de unión al ADN y regulación del promotor. Inesperadamente, aunque se sabe que HapR induce la competencia natural, demostramos que AphA también interviene. En particular, AphA es un represor directo de tfoX, el activador maestro de la competencia. Por tanto, la producción de AphA suprimió notablemente la captación de ADN, un efecto que se evita en gran medida mediante la expresión ectópica de tfoX. Nuestras observaciones sugieren una doble regulación de la competencia. A baja densidad celular, AphA es un represor maestro, mientras que HapR activa el proceso a alta densidad celular. Por lo tanto, proporcionamos una visión mecanicista profunda del papel de AphA y destacamos cómo V. cholerae utiliza este regulador para diversos fines.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Cifras

Fig 1. Unión de AphA en todo el genoma en…

Fig 1. Unión de AphA en todo el genoma en Vibrio cholerae .

(a) Unión de AphA en ambos ...

Fig 2. Represión de la expresión VC0857 por…

Fig 2. Represión de la expresión de VC0857 por AphA.

(a) Enlace de AphA entre VC0857 y V0858.…

Fig 3. Represión de tfoX expresión de ...

Fig 3. Represión de tfoX expresión de AphA.

(a) AphA se une en el tfoX lugar…

Fig 4. Interacciones entre AphA, CRP y…

Fig 4. Interacciones entre AphA, CRP y el cqsS región reguladora.

Fig 5. AphA reprime la captación de ADN en…

Fig 5. AphA reprime la captación de ADN en vivo reprimiendo la expresión de TfoX y ComEA.


Discusión

Los brotes masivos de cólera estacionales son una consecuencia directa del éxito de V. cholerae en adaptarse a dos hábitats distintos: el medio marino y el intestino humano. El apego a superficies abióticas y bióticas en el océano y dentro del huésped humano es fundamental para el perfil epidémico de este patógeno. Vibrio cholerae El Tor posee al menos tres circuitos de detección de quórum, que convergen para controlar la expresión de virulencia, la producción de proteasas y la formación de biopelículas en respuesta a la densidad de población celular. En un trabajo anterior, mostramos que a baja densidad celular, el fosfo-LuxO activo reprime HapR y, en ausencia de HapR, se expresan genes de virulencia (Fig.1 y Miller et al., 2002 Zhu et al., 2002). Mostramos aquí que la detección de quórum regula de manera similar la producción de biopelículas a través de la regulación de genes necesarios para la producción de EPS, que ya se ha demostrado que son necesarios para V. cholerae formación de biopelículas (Yildiz y Schoolnik, 1999). De manera análoga a la expresión del gen de virulencia, nuestros estudios actuales muestran que a baja densidad celular, fosfo-LuxO y HapR funcionan para activar vps genes necesarios para la formación de biopelículas (Figuras 1 y 6). A alta densidad celular, LuxO está inactivo y no reprime HapR, y HapR a su vez reprime la expresión de virulencia mediante la unión a la aphA promotor y reprimiendo su transcripción (Kovacikova y Skorupski, 2002). Bajo esta condición, el vps los genes también se reprimen y no se produce la formación de biopelículas. Queda por determinar si el efecto de HapR sobre vps la transcripción de genes es directa o indirecta. En contraste con los genes de virulencia y biopelícula, el tener suerte El gen que codifica la proteasa Hap no se expresa a baja densidad celular, y HapR activa su expresión a alta densidad celular (Figuras 1 y 6, y Jobling y Holmes, 1997).

El aspecto más sorprendente de este trabajo es que, en V. cholerae, la expresión de genes de virulencia y la formación de biopelículas ocurren a baja densidad celular, en ausencia de autoinductores y estos fenotipos se reprimen a alta densidad celular cuando las moléculas señal se han acumulado. Hasta donde sabemos, en todos los demás casos estudiados, la detección de quórum promueve la producción de factores de patogenicidad y la formación de biopelículas a alta densidad celular. Sugerimos que la naturaleza autolimitante de la infección por cólera, a diferencia de las infecciones crónicas causadas por otros patógenos (más notablemente, Pseudomonas aeruginosa), puede explicar el uso contrastante de la detección de quórum para controlar la formación de biopelículas y la expresión de factores de virulencia. Vibrio cholerae entra el anfitrión vía agua contaminada, las bacterias se adhieren al epitelio intestinal y secretan toxinas y otros factores de virulencia que provocan una diarrea grave. Como consecuencia de la diarrea, las bacterias se eliminan del huésped y se devuelven al medio ambiente. Nuestros resultados sugieren que podría ser beneficioso para V. cholerae ser competente en biofilm / adhesión y expresar productos génicos de virulencia en condiciones de baja densidad celular, es decir, al inicio de la infección. Sin embargo, después de que las bacterias han crecido hasta una alta densidad celular, para salir del huésped, afirmamos que V. cholerae se vuelve incapaz de producir biopelículas y presumiblemente se adhieren al intestino, las bacterias dejan de producir factores de patogenicidad y esto ayuda en la transición de regreso a un estilo de vida adaptado al ambiente externo. Curiosamente, a alta densidad celular, V. cholerae utiliza la detección de quórum para activar la expresión de la proteasa Hap, que se ha sugerido que es un "desprendimiento" que promueve la liberación del epitelio y el escape al medio ambiente (Finkelstein et al., 1992 ).

En contraste directo con nuestros resultados, la acumulación de autoinductores por Pseudomonas aeruginosa a una alta densidad celular promueve la maduración de la biopelícula, y los mutantes que no logran sintetizar el autoinductor se adhieren pero no se diferencian en biopelículas con una arquitectura madura (Davies et al., 1998). Además, en P. aeruginosa, la expresión del factor de virulencia a alta densidad celular requiere un circuito de detección de quórum intacto. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno humano oportunista, sobre todo de los que padecen fibrosis quística (FQ). Por lo general, los pacientes con FQ quedan colonizados permanentemente por P. aeruginosa, y eventualmente sucumbir a una infección bacteriana. Por lo tanto, a diferencia de V. cholerae, que solo ocupa temporalmente el nicho humano, P. aeruginosa permanece en este nicho especializado indefinidamente. Sugerimos que el control de detección de quórum de la formación de biopelículas y la expresión del factor de virulencia se sincroniza de manera opuesta en V. cholerae y P. aeruginosa porque los circuitos se han adaptado específicamente para promover el tipo de enfermedad particular de cada microbio.

Vibrio cholerae El Tor C6706 es capaz de formar una biopelícula y es totalmente virulento (Figs.2 y 3, y Zhu et al., 2002), sin embargo, varias biopelículas competentes, virulentas V. cholerae cepas que incluyen la cepa secuenciada El Tor N16961 poseen un cambio de marco natural en el HapR gen que elimina la entrada de detección de quórum (Zhu et al., 2002). Por lo tanto, un sistema funcional de detección de quórum no es un requisito absoluto para la virulencia o la formación de biopelículas. Sin embargo, la preservación de un funcional HapR El gen virulento de El Tor C6706 sugiere que se ha mantenido un sistema de detección de quórum intacto porque es necesario en algunos nichos. En nuestros experimentos de ciclo de tiempo de biopelícula extendida, observamos que el tipo salvaje, ΔluxOy ΔluxU las cepas acumulan mutaciones que aumentan la formación de biopelículas, sobreproducción de EPS y dan a las colonias un aspecto rugoso. Analizamos varias variantes rugosas de este tipo y descubrimos que habían adquirido mutaciones en HapR (Figura 5). Se han caracterizado varios otros mutantes que confieren un fenotipo similar en V. cholerae. Por ejemplo, CytR, un represor de la absorción y el metabolismo de nucleósidos, también reprime la transcripción de vpsL. Por lo tanto, la mutación de cytR promueve la producción de EPS y confiere una morfología de colonia rugosa a V. cholerae (Haugo y Watnick, 2002). Numerosos estudios han documentado la acumulación de mutaciones indefinidas que confieren la morfología rugosa a V. cholerae cultivado bajo estrés nutricional prolongado (Morris et al., 1996 Wai et al., 1998 Yildiz y Schoolnik, 1999 Ali et al., 2002). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que parece haber una presión selectiva para V. cholerae para aumentar la producción de EPS y formar biopelículas y esto puede manifestarse por varios mecanismos que incluyen: (i) detección de quórum, vía represión de HapR (ii) mutación espontánea de HapR o cytR, o (iii) por mecanismos que puedan ser HapR/cytR independiente. Por lo tanto, la formación de biopelículas en V. cholerae está controlado por una variedad de entradas sensoriales, solo algunas de las cuales se han caracterizado hasta la fecha. Presumiblemente, la capacidad de transición entre una fase asociada al anfitrión y una fase de vida libre es fundamental para V. cholerae. Sugerimos que V. cholerae ha desarrollado múltiples mecanismos para esta conversión, y esta redundancia probablemente reduce su vulnerabilidad a mutaciones o influencias ambientales que impactan en cualquier vía.

Las biopelículas bacterianas son espacialmente heterogéneas, lo que produce gradientes químicos y de nutrientes que dan como resultado micronichos dentro de las comunidades microbianas (Costerton et al., 1994 Stoodley et al., 2002). Incluso dentro de las biopelículas de una sola especie, se produce una expresión genética espacial y temporal diferencial (Whiteley et al., 2001). En las biopelículas de especies mixtas, la heterogeneidad estructural apoya la coexistencia de múltiples organismos dentro de una comunidad que aparentemente beneficia a todos los habitantes (Shapiro, 1998). Nuestros datos apoyan la hipótesis de que el entorno de la biopelícula puede promover mutaciones, que producen una biopelícula diferenciada genotípicamente (Shapiro, 1998). Por ejemplo, en respuesta al estrés, un subconjunto de individuos en una población inicialmente homogénea puede acumular una (s) mutación (es) (es decir, en HapR) que permite que ese subconjunto produzca abundantes EPS, crezca más rápido y forme biopelículas más robustas. El grupo de mutantes de Biofilm ++ en la población puede proporcionar una mayor adherencia al sustrato, estructuras que promueven el flujo de nutrientes y la eliminación de desechos, y una función de barrera que protege y mejora la supervivencia de todos los miembros de la comunidad. Los miembros restantes de la biopelícula podrían aportar diferentes beneficios a la comunidad, como la comunicación célula-célula. Por lo tanto, la capacidad de las bacterias para variar en la biopelícula, ya sea alterando los patrones espaciales y temporales de expresión génica o fijando nuevos patrones de expresión génica a través de la mutación, puede promover la especialización de funciones y podría simular el desarrollo multicelular.


Introducción

La detección de quórum (QS) es utilizada por una amplia variedad de bacterias para coordinar cambios de comportamiento en toda la población en respuesta a la densidad celular [1]. La bacteria Gram-negativa Vibrio cholerae, que causa la enfermedad diarreica cólera en el huésped humano, utiliza QS para regular la producción de factores de virulencia, la formación de biopelículas, la secreción de tipo VI, la regulación metabólica y la competencia natural para mantener la aptitud competitiva en varios nichos ambientales [2-11]. Se han identificado cuatro sistemas de señalización QS en paralelo en V. cholerae que se basan en una histidina quinasa phosphorelay para regular la expresión de genes aguas abajo [12] (Fig. 1). A baja densidad celular (LCD), CqsS y LuxPQ funcionan en paralelo con otras dos histidina quinasas, llamadas CqsR y VpsS, para fosforilar LuxO a través de una proteína de fosfotransferencia intermedia LuxU [10, 12]. LuxO fosforilado promueve la transcripción de ARN pequeños Qrr 1-4 que promueven la traducción del regulador maestro AphA [13, 14]. Por el contrario, Qrr 1-4 reprime la traducción del regulador transcripcional HapR en LCD [15, 16] (Fig. 1). A alta densidad celular (HCD), cada receptor quinasa detecta la presencia de mensajeros químicos únicos llamados autoinductores (AI) que inhiben la actividad quinasa de estos receptores al unirse a la señal [1]. Autoinducer sintasa CqsA cataliza la producción de CAI-1 (S-3-hidroxitridecan-4-ona) que es detectado por el receptor CqsS [17-21] y el autoinductor sintasa LuxS produce AI-2 (S-TMHF-borato) que es detectado por LuxP / Q [22-26]. Por tanto, en la HCD, cuando los receptores se unen a sus señales afines, la actividad de la quinasa se inhibe y conduce a la desfosforilación de LuxO. Esto evita la transcripción de Qrr 1–4 inhibiendo así la producción de AphA y promoviendo la traducción de HapR.

Detección de quórum en V. cholerae está controlado por cuatro receptores de histidina quinasas CqsS, LuxPQ, CqsR y VpsS. A baja densidad celular, estos receptores actúan predominantemente como quinasas y fosforilan LuxO a través de LuxU. LuxO fosforilado activa la transcripción de ARN pequeños Qrr1-4 que inhiben la traducción de HapR y promueven la traducción de AphA, lo que da como resultado un perfil de expresión de baja densidad celular. A alta densidad celular, cuando se unen las señales afines, se inhibe la actividad quinasa de estos receptores. Esto conduce a la desfosforilación de LuxO, evitando la transcripción de Qrr1-4. Por lo tanto, se induce la traducción de HapR y se reprime la traducción de AphA, lo que conduce a un patrón de expresión génica de alta densidad celular. Los autoinductores CAI-1 (producidos por CqsA) y AI-2 (producidos por LuxS) se han caracterizado previamente por regular la actividad quinasa de CqsS y LuxPQ respectivamente.

La actividad quinasa tanto de CqsR como de VpsS depende de la densidad celular, pero no está controlada por CAI-1 y AI-2, lo que sugiere que V. cholerae produce señales químicas únicas que se unen a CqsR y VpsS respectivamente [12]. Sin embargo, las señales de IA que controlan la actividad de CqsR y VpsS no han sido identificadas [12]. VpsS ​​no tiene dominios transmembrana previstos y, por lo tanto, se cree que es citoplasmático. Se ha demostrado que el óxido nítrico (NO) regula la actividad quinasa de VpsS in vitro a través de un socio de señalización VpsV (VcNosP) [27]. Sin embargo, V. cholerae no produce NO y ΔvpsV mutantes no tiene ningún cambio detectable en la respuesta QS [10, 12], por lo que el papel exacto de la detección de NO por VpsV en V. cholerae La respuesta de QS sigue siendo desconocida. Otro circuito QS fue identificado recientemente en V. cholerae, que consta de un receptor citoplasmático VqmA y su señal análoga DPO (3,5-dimetilpirazin-2-ol), pero este sistema no participa en la regulación de LuxO [28]. Por el contrario, se predice que CqsR tiene un dominio de unión a ligando periplásmico que presumiblemente está implicado en la detección de señales e influye en la actividad del dominio de histidina quinasa citoplásmica.

Dado que cualquiera de los receptores QS es suficiente para activar LuxO para apoyar V. cholerae colonización en el intestino delgado del huésped, es desconcertante que cuatro circuitos paralelos converjan para controlar un solo regulador para regular su respuesta QS [12]. Se ha propuesto que dicha arquitectura de red podría evitar la interferencia de la señal en cualquiera de los receptores QS, por lo que se puede mantener una respuesta QS robusta incluso en presencia de otro ruido de señal dirigido a una de las cuatro entradas [12]. Sin embargo, no está claro qué sustancias químicas naturales, además de las IA producidas de forma nativa, pueden cambiar la actividad de estos receptores QS e interferir con la V. cholerae Respuesta QS. Además, los entornos en los que la interferencia de QS sería perjudicial para la aptitud de este patógeno no han sido bien estudiados. En este estudio, investigamos estas dos preguntas más a fondo y mostramos que los mutantes que expresan solo CqsR sin los otros tres receptores QS son defectuosos en la colonización del intestino grueso del huésped, un nicho donde el tipo salvaje V. cholerae coloniza eficazmente y es relevante para el transporte asintomático del patógeno [29, 30]. Desarrollamos un ensayo de unión química e identificamos etanolamina, un metabolito intestinal común, como ligando para CqsR. Usando ensayos de reportero QS de células enteras y el modelo de ratón infantil, mostramos que la etanolamina puede funcionar como una fuente química de interferencia QS en CqsR. Sin embargo, V. cholerae ha evolucionado para evitar la interferencia de señal de la etanolamina al incorporar cuatro vías paralelas en su sistema QS, y esta arquitectura de circuito específica permite una colonización robusta del anfitrión.


Materiales y métodos

Cepas bacterianas y reactivos

Todos V. cholerae Las cepas utilizadas aquí se derivaron de una variante resistente a la estreptomicina del biotipo C6706str2 de WT O1 El Tor (Thelin y Taylor, 1996). Escherichia coli cepa S17-1λpir se utilizó para la clonación. Los antibióticos, cuando fue apropiado, se utilizaron en las siguientes concentraciones: ampicilina, 100 mg / L de kanamicina 100 mg / L de polimixina B, 50 u / L de estreptomicina, 500 mg / L. Se usó tetraciclina a 10 mg / L para la construcción de la cepa y a 1 mg / L para el mantenimiento del plásmido. Se utilizó X-Gal a 50 mg / L. Las síntesis químicas de CAI-1 y AI-2 se han descrito previamente (Higgins et al., 2007 Semmelhack et al., 2005). Las cepas se enumeran en el archivo complementario 1.

Manipulación de ADN y construcción de cepas.

Se utilizaron técnicas estándar de clonación molecular para la construcción de plásmidos (Sambrook et al., 1989). Los cebadores se enumeran en el archivo complementario 2. Alteraciones cromosómicas en V. cholerae se realizaron mediante intercambio alélico con pKAS32 (Skorupski y Taylor, 1996) o MuGENT (edición de genoma multiplex por transformación natural) (Dalia et al., 2014a). Cuando se usa pKAS32, los fragmentos de ADN & gt 1 kB aguas arriba y aguas abajo de la región genómica que se va a eliminar se amplificaron mediante PCR, se fusionaron mediante PCR de extensión por solapamiento (OE-PCR) (Ho et al., 1989), y posteriormente se insertaron en pKAS32 mediante ligación. o ensamblaje de Gibson (Gibson et al., 2009). Para MuGENT, se amplificaron mediante PCR aproximadamente 3 kB regiones cadena arriba y cadena abajo de la región genómica a eliminar. Posteriormente se usó OE-PCR para fusionar estos fragmentos cadena arriba y corriente abajo de un fragmento de ADN que codifica un casete KanR. El producto resultante se proporcionó a naturalmente competentes V. cholerae células cultivadas en caparazones de camarón, como se describió anteriormente (Dalia et al., 2014b Dalia et al., 2014a). Tras la selección y el aislamiento de colonias en placas LB que contenían tanto kanamicina como polimixina B, la deleción se verificó mediante PCR. Para los experimentos de la Figura 4, el suplemento 2 de la figura, usamos MuGENT para mutagénesis y células cotransformadas con un marcador seleccionable en un locus neutro, vc1807: Kan R , y un fragmento de ADN que contiene lacZ: Pdns-dns. Los transformantes se seleccionaron en placas LB que contenían kanamicina, polimixina B y X-Gal. mKate2 (Shcherbo et al., 2007), mTFP1 (Ai et al., 2006), o mKO (Karasawa et al., 2004) genes, cada uno impulsado por pTac, fueron insertados en el V. cholerae cromosoma en el lacZ sitio, como se describió anteriormente (Nadell et al., 2015).

Formación de agregados

Todos los medios de cultivo se esterilizaron por filtración (tamaño de poro: 0,22 µm). V. cholerae las cepas se cultivaron durante la noche en LB (Fisher BioReagents, Pittsburgh, PA Triptona 10 g / L, extracto de levadura 5 g / L y NaCl 10 g / L) a 37 ° C con agitación (250 rpm). Los cultivos se volvieron a diluir 1: 100 en LB suplementado con CaCl 10 mM2 (Kierek y Watnick, 2003b), y se incubaron a 37 ° C con agitación (250 rpm). Después de 1 h (OD aproximado600: 0,04), los cultivos se diluyeron 1:20 en 2 ml de LB + Ca 2+ 10 mM en tubos de ensayo Pyrex de 20 ml. Las muestras se incubaron en el anillo exterior de un tambor rodante (New Brunswick, Edison, NJ modelo # M1053-4004 1 Hz) a 30 ° C. En los puntos de tiempo designados, se extrajeron muestras de 150 μL de una altura fija dentro del cultivo y se depositaron en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos con cubreobjetos n. ° 1.5 (MatTek, Ashland, MA, n. ° de pieza P96G-1.5–5 F). Las muestras se dispensaron en los pocillos de microtitulación utilizando una pipeta electrónica de un solo canal (Eppendorf, Hamburg, Germany Xplorer) ajustada a la menor velocidad de aspiración y dispensación posible (172 μL / s). Para la formación de agregados en placas de microvaloración de 24 pocillos con fondo de plástico, se montaron microplacas en un agitador orbital (IKA, Staufen im Breisgau, Alemania KS 260 Basic 250 rpm) y las muestras se cultivaron durante 48 ha 30 ° C. Los ensayos de baja adherencia a la superficie utilizaron placas de microtitulación Corning Costar de 24 pocillos con fondo de plástico (Corning, Corning, NY). Las réplicas biológicas se definen como agregados derivados de una colonia individual aislada. Las réplicas técnicas se refieren a muestras tomadas de cultivos bacterianos independientes.

Un cribado genético de factores que promueven la agregación.

ΔvpsL HCD bloqueado y ΔvpsL lacZ: PHapR-hapR HCD bloqueado V. cholerae las cepas fueron mutagenizadas con Tn5 como se describió anteriormente (Miller et al., 2002). Los mutantes se aislaron en placas LB que contenían kanamicina y polimixina B (& lt200 colonias por placa). Las colonias se cultivaron a 37 ° C durante

16 h para asegurar que se pudieran observar diferencias en la opacidad de las colonias. Se evaluaron aproximadamente 25 000 colonias en cada uno de los dos exámenes de mutagénesis. Los cambios en la opacidad de las colonias se determinaron comparando la opacidad de las colonias individuales con las colonias adyacentes en la misma placa. Todos los mutantes que presentaban alteraciones en la opacidad de la colonia se purificaron y aislaron volviendo a secar en placas que contenían kanamicina y polimixina B. Posteriormente se ensayó la formación de agregados a las 22 h, usando el protocolo descrito anteriormente. No hubo antibióticos presentes en el medio de crecimiento para los ensayos de agregación. Los sitios de inserción de transposones se determinaron mediante PCR arbitraria (Saavedra et al., 2017). Se obtuvieron imágenes de la opacidad de las colonias después de 24 h de crecimiento de las colonias en placas LB a 37 ° C utilizando un microscopio estereoscópico (Leica, Wetzlar, Alemania M125 zoom 20X) equipado con una cámara Leica MC170 HD y utilizando una fuente de luz de cuello de cisne para proporcionar una muestra oblicua. iluminación.

Ensayo de bioluminiscencia

V. cholerae los cultivos se hicieron crecer usando el protocolo de formación de agregados anterior y se tomaron muestras en los puntos de tiempo indicados. Bioluminiscencia y OD600 se midieron respectivamente usando un contador de centelleo Tri-Carb 2810 TR (PerkinElmer, Waltham, MA) y un espectrofotómetro DU800 (Beckman Coulter, Brea, CA). Antes de medir el OD600, 1 ml de cada cultivo se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml que contenía pequeñas perlas de vidrio lavadas con ácido (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO modelo # G8772 425-600 μm) y las muestras se agitaron vigorosamente durante 10 minutos en un vórtice mezclador para romper los agregados.

Microscopía y análisis de imágenes

Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal de barrido puntual Leica SP-8 equipado con un láser de luz blanca sintonizable (ventana de excitación Leica modelo # WLL2 = 470-670 nm). La mTFP1 se excitó con un láser de onda continua de 442 nm (Leica) y todos los demás fluoróforos se excitaron utilizando el láser de luz blanca sintonizable. La luz emitida se detectó utilizando detectores espectrales GaAsP híbridos (Leica, HyD SP) y se empleó la detección de puerta temporizada para minimizar la señal de fondo. Se tomaron imágenes de los agregados utilizando un objetivo de aire 10X (Leica, HC PL FLUOTAR NA: 0,30) o un objetivo de inmersión en agua 63X (Leica, HC PL APO CS2 NA: 1,20). Todas las muestras, a menos que se especifique lo contrario, se obtuvieron en el centro aproximado del pocillo de microtitulación.

El número total y el tamaño se cuantificaron utilizando el objetivo aéreo 10X con un campo de visión de 1163 × 1163 μm 2 (2048 × 2048 píxeles 2). Se obtuvo una imagen de un volumen total de muestra de 100 μm con un tamaño de paso de 2 μm, comenzando justo por encima de la superficie del cubreobjetos. Las imágenes resultantes se analizaron utilizando software personalizado escrito en MATLAB, que se proporciona en un repositorio de código (https://github.com/jemielita/aggregation.git copia archivada en https://github.com/elifesciences-publications/aggregation). En resumen, para obtener imágenes segmentadas utilizando el objetivo aéreo 10X, se aplicó un algoritmo de segmentación basado en la intensidad a la pila de imágenes 3D seguido de un límite de tamaño mínimo del objeto. Para superar la subsegmentación esporádica de los agregados adyacentes, se aprovechó la convexidad de los agregados. Para todos los objetos identificados en un solo plano, se calculó la desviación cuadrática media (RMSD) entre el área y el área convexa de los objetos. Posteriormente, para todos los objetos cuyo RMSD excedió un límite, se calculó la línea más corta a través de los cuadrantes opuestos del objeto y se usó para bisecar el objeto inicialmente sobre-segmentado en dos objetos discretos. Siguiendo este procedimiento, se ensamblaron reconstrucciones 3D de cada agregado conectando regiones 2D superpuestas. Según fue necesario, los resultados de este protocolo de segmentación se corrigieron manualmente. Dentro de un experimento dado, todos los parámetros del protocolo de segmentación se mantuvieron fijos. Se hizo una excepción para el análisis de la ΔvpsL Δxds Δdns Deformación bloqueada por HCD para la que se redujo el umbral de intensidad empleado para segmentar adecuadamente el lado distal de baja intensidad (con respecto al objetivo) de los agregados grandes. Todos los datos de imágenes cuantitativos informados en este manuscrito se recopilaron con el objetivo de aire 10X, con la excepción de dos conjuntos de datos en la Figura 3, el suplemento de figura 2, que se recopilaron con el objetivo de agua 63X. El objetivo de agua 63X se utilizó para cuantificar la formación de conglomerados en un campo de visión de 1984 × 1984 μm 2 (1984 × 1984 píxeles 2). Se obtuvo una imagen de un volumen total de muestra de 50 μm con un tamaño de paso de 1 μm, comenzando justo por encima de la superficie del cubreobjetos. Para segmentar las imágenes obtenidas con el objetivo de inmersión en agua 63X, análogo a lo que describimos anteriormente, se utilizó un algoritmo de segmentación basado en la intensidad, seguido de la aplicación de un límite de tamaño de grupo superior.

Para los experimentos en los que se midió el área agregada de la sección transversal, se obtuvieron imágenes de las subregiones de la placa de microtitulación usando el módulo Leica Tile Scan y se ensambló computacionalmente una imagen del pocillo de microtitulación completo. Como se indicó anteriormente, se aplicó un algoritmo de segmentación basado en la intensidad a la imagen resultante, seguido de un límite de tamaño mínimo del objeto.

Definimos la fracción de volumen agregado como la suma del volumen de agregados identificados en el volumen de la imagen normalizado por el volumen total de la imagen. Definimos el volumen agregado promedio como el volumen agregado promedio efectivo en el que se encuentra una bacteria:

donde v es el volumen de un agregado individual y N es el número total de agregados identificados dentro de una muestra. Se utilizó un enfoque idéntico para definir el tamaño promedio de los conglomerados obtenido utilizando el objetivo de agua 63X y para calcular el área de sección transversal promedio. Para comparar la distribución de volúmenes agregados o áreas transversales generadas por diferentes cepas, utilizamos una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras sobre la distribución de datos agrupados de todas las réplicas biológicas. La fracción de volumen agregado y el tamaño agregado promedio se informan como la media ± desviación estándar (DE) para un mínimo de tres réplicas biológicas.

Cuantificación y tinción de eDNA

Para cuantificar los niveles de eDNA a granel, se transfirió 1 ml de cultivos a tubos Eppendorf de 1,5 ml que contenían pequeñas perlas de vidrio lavadas con ácido (Sigma-Aldrich, nº de catálogo G8772 425–600 μm). Las muestras se agitaron vigorosamente durante 10 min en un mezclador de vórtice seguido de centrifugación durante 1 min a 15 000 rpm. Los sobrenadantes clarificados se esterilizaron por filtración (tamaño de poro: 0,22 μm) y el ADN se extrajo utilizando la técnica estándar de precipitación con etanol (Ausubel et al., 2002 Seper et al., 2011). Se utilizó gel de bloqueo de fase (Sigma-Aldrich, grasa de alto vacío Dow Corning, nº de catálogo Z273554) durante la extracción con fenol. El contenido de eDNA se cuantificó posteriormente utilizando un NanoDrop One C (ThermoFisher, Waltham, MA, catálogo n.º ND-ONE-W).

En los experimentos de suplementación con DNasa I, los cultivos se prepararon como se describió anteriormente y se dividieron en alícuotas en una placa de microtitulación de 96 pocillos con fondo de vidrio (MatTek) hasta un volumen final de 100 μl. Los cultivos se hicieron crecer en la placa de microvaloración a 30 ° C en un agitador orbital (IKA, KS260 350 rpm). Se añadió DNasa I (Sigma-Aldrich, catálogo # D5025) a las muestras a T = 0 ha una concentración de 100 unidades Kunitz / mL (Turnbull et al., 2016). La tinción de eDNA se logró utilizando la tinción de ácido nucleico yoduro TOTO-1 (ThermoFisher, catálogo # T3600 concentración final: 1 μM). La tinción de las muestras en la Figura 5D y la Figura 3 — el suplemento 4 de la figura se logró usando SYTO-9 (ThermoFisher, catálogo # S34854 concentración final: 2,2 µM). Cuando se usó cualquiera de los tintes, las muestras se depositaron, como anteriormente, en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos con cubreobjetos nº 1.5 a la que se añadió posteriormente el colorante apropiado y se mezcló suavemente.


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En: Microbiología molecular, vol. 50, núm. 1, 10.2003, pág. 101-104.

Resultado de la investigación: Contribución a la revista ›Artículo› revisión por pares

T1 - La detección de quórum controla la formación de biopelículas en Vibrio cholerae

N2: varios circuitos de detección de quórum funcionan en paralelo para controlar la virulencia y la formación de biopelículas en Vibrio cholerae. A diferencia de otros patógenos bacterianos que inducen la producción de factores de virulencia y / o la formación de biopelículas a alta densidad celular en presencia de autoinductores sensibles al quórum, V. cholerae reprime estos comportamientos a alta densidad celular. Consistent with this, we show here that V. cholerae strains 'locked' in the regulatory state mimicking low cell density are enhanced for biofilm production whereas mutants 'locked' in the regulatory state mimicking high cell density are incapable of producing biofilms. The quorum-sensing cascade we have identified in V. cholerae regulates the transcription of genes involved in exopolysaccharide production (EPS), and variants that produce EPS and form biofilms arise at high frequency from non-EPS, non-biofilm producing strains. Our data show that spontaneous mutation of the transcriptional regulator hapR is responsible for this effect. Several toxigenic strains of V. cholerae possess a naturally occurring frameshift mutation in hapR. Thus, the distinct environments occupied by this aquatic pathogen presumably include niches where cell-cell communication is crucial, as well as ones where loss of quorum sensing via hapR mutation confers a selective advantage. Bacterial biofilms could represent a complex habitat where such differentiation occurs.

AB - Multiple quorum-sensing circuits function in parallel to control virulence and biofilm formation in Vibrio cholerae. In contrast to other bacterial pathogens that induce virulence factor production and/or biofilm formation at high cell density in the presence of quorum-sensing autoinducers, V. cholerae represses these behaviours at high cell density. Consistent with this, we show here that V. cholerae strains 'locked' in the regulatory state mimicking low cell density are enhanced for biofilm production whereas mutants 'locked' in the regulatory state mimicking high cell density are incapable of producing biofilms. The quorum-sensing cascade we have identified in V. cholerae regulates the transcription of genes involved in exopolysaccharide production (EPS), and variants that produce EPS and form biofilms arise at high frequency from non-EPS, non-biofilm producing strains. Our data show that spontaneous mutation of the transcriptional regulator hapR is responsible for this effect. Several toxigenic strains of V. cholerae possess a naturally occurring frameshift mutation in hapR. Thus, the distinct environments occupied by this aquatic pathogen presumably include niches where cell-cell communication is crucial, as well as ones where loss of quorum sensing via hapR mutation confers a selective advantage. Bacterial biofilms could represent a complex habitat where such differentiation occurs.


Ethanolamine regulates CqsR quorum-sensing signaling in Vibrio cholerae

The pathogen that causes cholera, Vibrio cholerae, uses the cell-cell communication process known as quorum sensing (QS) to regulate virulence factor production and biofilm formation in response to changes in population density and complexity. QS is mediated through the detection of extracellular chemical signals called autoinducers. Four histidine kinases, LuxPQ, CqsS, CqsR and VpsS, have been identified as receptors to activate the key QS regulator LuxO at low cell density. At high cell density, detection of autoinducers by these receptors leads to deactivation of LuxO, resulting in population-wide gene expression changes. While the cognate autoinducers that regulate the activity of CqsS and LuxQ are known, the signals that regulate CqsR have not been determined. Here we show that the common metabolite ethanolamine specifically interacts with the ligand-binding CACHE domain of CqsR in vitro and induces the high cell-density QS response through CqsR kinase inhibition in V. cholerae células. We also identified residues in the CqsR CACHE domain important for ethanolamine detection and signal transduction. Moreover, mutations disrupting endogenous ethanolamine production in V. cholerae delay the onset of, but do not abolish, the high cell-density QS gene expression. Finally, we demonstrate that modulation of CqsR QS response by ethanolamine occurs inside animal hosts. Our findings suggest that V. cholerae uses CqsR as a dual-function receptor to integrate information from the self-made signals as well as exogenous ethanolamine as an environmental cue to modulate QS response.

IMPORTANCIA Many bacteria use quorum sensing to regulate cellular processes that are important for their survival and adaptation to different environments. Quorum sensing usually depends on the detection on chemical signals called autoinducers made endogenously by the bacteria. We show here ethanolamine, a common metabolite made by various bacteria and eukaryotes, can modulate the activity of one of the quorum-sensing receptors in Vibrio cholerae, the etiological agent of the disease cholera. Our results raise the possibility that V. cholerae or other quorum-sensing bacteria can combine environmental sensing and quorum sensing to control group behaviors.


Resultados

LuxO Is Required for V. cholerae to Colonize Mice.

los V. harveyi luxCDABE operon was used as a heterologous target in V. cholerae to test for quorum-sensing regulation. This study revealed that wild-type V. cholerae expresses luminescence in a cell density-dependent manner, a luxO mutant displays maximal constitutive luminescence, and a HapR mutant produces no light (M.B.M. and B.L.B., unpublished work). Estas lux expression patterns correspond exactly to those of the analogous V. harveyi strains, confirming that the V. harveyi-like quorum-sensing circuit is operational in V. cholerae, and also that the V. cholerae LuxO and HapR proteins are functional homologues of the V. harveyi LuxO and LuxR proteins, at least with respect to regulation of luciferase. Sin embargo, V. cholerae does not possess a luciferase operon, so it is not clear what the endogenous quorum-sensing controlled targets are in this bacterium. The only previously characterized role for HapR is in regulation of expression of the HA protease (19).

In an effort to determine the targets of quorum sensing in V. cholerae, we tested whether mutations in luxO y / o HapR afectar V. cholerae pathogenesis. To do this we performed an en vivo colonization assay using the infant mouse model. Six-day-old suckling CD-1 mice were infected with 1:1 mixtures of overnight-cultured wild-type and luxO mutants and wild-type and HapR mutantes. Mice were killed after 20 h, and the small intestine was analyzed to determine the ratio of wild-type to mutant bacteria. Wild-type bacteria could be distinguished from the mutant strains by virtue of a lacZ deletion that does not affect virulence. Table 1 shows our results. los HapR mutant colonizes infant mice to the same extent as wild-type V. cholerae (competitive index ≈ 1). In contrast, the luxO mutant is profoundly defective in colonization, as not a single luxO mutant bacterium was recovered from the small intestines of any of the 12 mice used in the experiment. Therefore the competitive index for the luxO mutant is <10 −4 .

Infant mouse colonization assays

LuxO Regulates Virulence Gene Expression.

To investigate the mechanism by which LuxO regulates V. cholerae pathogenicity, we performed whole-genome DNA microarray experiments and compared the transcription profiles of the wild-type and luxO mutantes. In this experiment we used in vitro conditions (AKI medium) that are known to induce the expression of virulence factors. Our results are presented in Fig. 1 and Table 2. Fig. 1 shows that, relative to the wild-type strain, many genes are activated and many are repressed in the luxO mutante. However, higher expression of all of the genes in the ToxR-virulence regulon occurs in the wild-type strain compared with the luxO mutante. The differences in expression level for all of the LuxO-regulated genes are given in Table 2. Again, these data clearly show that the entire ToxR regulon is repressed in the luxO mutante. For example, genes in the TCP island are repressed 2.7- to 41.7-fold in the luxO mutante. Similarly, the ctxA y ctxB genes, which are transcribed in an operon and encode the two subunits of CT, are also strongly inhibited (40-fold) in the luxO mutante.

Gene expression profiles for wild-type C6706 and the luxO V. cholerae mutante. Genes with higher expression in the wild-type strain compared with the luxO mutant are shown in red. Genes expressed at higher levels in the luxO mutant compared with the wild-type strain are shown in green. Black dots represent genes that displayed less than 3-fold variation between the two strains. * indicate genes known to be essential for virulence.

Differential gene expression in the luxO mutant in AKI medium

To verify the microarray data, we examined the production of two major virulence determinants, CT and TcpA, after growth in AKI medium under exactly the same conditions we used in the microarray experiment. Our results show that the luxO mutant does not produce any detectable TcpA (Fig. 2 Upper) or CT (Fig. 2 Más bajo). These data are consistent with the microarray experiment and explain why the luxO mutant fails to colonize mice.

CT and TcpA production in wild-type C6706 and mutant V. cholerae son. Samples were prepared after 5 h incubation in AKI medium with aeration at 37°C. (Upper) Cell pellets from the specified strains were subjected to Western blot and probed with anti-TcpA antibody. (Más bajo) The corresponding cell-free culture fluids were assayed in GM1 ganglioside enzyme-linked immunosorbent CT assays.

LuxO Acts at the Level of tcpP Expression.

Two parallel signal transduction cascades coordinately regulate virulence in V. cholerae (33). The ToxR–ToxS and the TcpP–TcpH signaling circuits detect and respond to environmental stimuli, and both circuits exert their regulatory control over virulence by influencing the expression of toxT. ToxT, in turn, activates the transcription of a variety of genes required for virulence (34). To study the mechanism of repression of the virulence regulon in the luxO mutant, we constitutively expressed ToxR, TcpP, and ToxT (33) in the luxO mutant and tested whether overexpression of any of these genes could bypass the luxO defect and restore the mutant to CT production. Fig. 3A shows that constitutive expression of toxR does not affect CT production in the luxO mutante. However, CT is produced when either tcpP o toxT is constitutively expressed in the luxO mutante. This result indicates that the LuxO effect on the virulence regulon is mediated through down-regulation of TcpP. Consistent with this hypothesis, the microarray data in Table 2 show that 16.6-fold lower expression of tcpP occurs in the luxO mutant than in the wild-type strain.

LuxO represses tcpP expresión. (A) toxR, tcpP, y toxT were cloned into the expression vector pBAD24 (33), and the plasmids were introduced into the V. cholerae luxO mutante. Subsequently, the strains were grown under AKI-inducing conditions in the presence of 0.01% arabinose. CT production was quantitated after 5 h incubation at 37°C with aeration. The data are presented as the percentage of CT production of the wild-type bearing the same plasmids. (B) tcpP-lacZ expression was assayed in the wild type, the luxO mutant, and the wild-type strain constitutively expressing a cloned HapR gene (denoted pHapR). β-galactosidase activity assays (39) were conducted after growth with aeration for 5 h at 37°C in AKI medium.

In an independent test to verify that LuxO activates tcpP expression, we introduced tcpP-lacZ transcriptional reporter fusions onto the chromosomes of the wild-type and luxO null mutant. The β-galactosidase activity of the tcpP-lacZ fusion was measured in each strain, and we found that 40-fold less expression of the reporter occurs in the luxO mutant than in the wild type (Fig. 3B). This result shows that transcription of tcpP requires the presence of a functional LuxO protein.

LuxO Acts Through HapR to Control tcpP Expression.

The microarray experiment reveals that one of the genes regulated by LuxO is the V. harveyi luxR homologue HapR. Específicamente, HapR expression increases 6.9-fold in the luxO mutant, suggesting that LuxO is a repressor of HapR expression (Table 2). We therefore wondered whether LuxO might affect tcpP expression indirectly, by acting through HapR. We hypothesized that LuxO negatively regulates HapR expression, and HapR in turn represses tcpP expresión. To test this idea, a plasmid containing a constitutively expressed HapR gene was introduced into wild-type V. cholerae. The resulting recombinant strain fails to produce TCP and CT under our standard inducing conditions (Fig. 2), indicating that HapR is involved in repression of the ToxR regulon. Consistent with this result, Fig. 3B shows that in a wild-type strain, constitutive expression of HapR results in nearly complete repression of the tcpP-lacZ reporter fusion. Microarray analysis also demonstrates that constitutive expression of HapR results in a transcriptional profile of V. cholerae virulence genes very similar to that of the luxO mutant (data not shown). Taken together, these data suggest that HapR acts downstream of LuxO to repress tcpP expression, and this action ultimately results in repression of the ToxR virulence regulon.

To confirm our predictions regarding the roles of LuxO and HapR in virulence gene regulation, we performed an epistasis test to show that HapR indeed acts downstream of LuxO. We constructed a luxO, HapR double null mutant and tested CT and TCP production as well as the ability of the double mutant to colonize mice. The double mutant produces wild-type levels of both CT and TCP (Fig. 2), and this mutant has, at most, only a minor colonization defect (Table 1). These data show that HapR is epistatic to luxO and that LuxO is therefore not required to directly activate the tcpP promoter. Rather, LuxO controls tcpP expression indirectly by repressing expression of hapR, which in turn represses tcpP expresión. We do not know whether HapR acts directly or indirectly to repress tcpP transcripción. In general, HapR and its homologues in other Vibrio species (LuxR, SmcR, and OpaR) act as transcriptional activators (17, 18, 36, 37). As mentioned previously, HapR activates the expression of luxCDABE en V. cholerae. Many activators are also repressors, however, and HapR could possess both activities. Alternatively, HapR could activate a downstream repressor of tcpP expresión.

LuxO Regulation of HapR Expression.

Our data suggest that HapR plays an important role in the quorum-sensing regulation of V. cholerae virulence factors. To further investigate how HapR functions in regulation of the virulence process, we monitored the expression of a hapR-lacZ transcriptional fusion in the wild-type and the luxO mutante V. cholerae strains as a function of cell density. Figura 4A shows that HapR is expressed at low cell densities in the luxO null mutant, but not at low cell densities in wild-type V. cholerae. However, by the time the strains reach late log-phase, expression of HapR is identical in the wild-type and the luxO mutante. We interpret this result to imply that initial but not late expression of HapR en el luxO mutant is critical for the inhibition of virulence factor production.

LuxO regulation of HapR expression and HapR regulation of CT production. (A) Wild-type and luxO mutants carrying a chromosomal hapR-lacZ reporter fusion were grown in AKI medium at 37°C. Samples were withdrawn at the specified ODs, and β-galactosidase activity was assayed. ●, wild type (wt) ▴, luxO mutante. (B) Wild-type V. cholerae containing the vector pMal-c2x or carrying pJZ146 (pMal-c2X containing HapR under IPTG control) were grown as described in AKI medium, and IPTG (50 μM final concentration) was added at the indicated time points. All of the samples were assayed for CT production after a total of 10 h at 37°C. The data are presented as the percentage of CT production in the V. cholerae strain carrying pJZ146 compared with the strain carrying only the vector pMal-c2x.

A model in which early but not late expression of HapR represses virulence gene expression predicts that induction of HapR at late times should not influence the production of virulence factors. To test this idea, we introduced a plasmid containing an IPTG-inducible HapR gene construction into wild-type V. cholerae C6706. IPTG was added at different time points during growth, and CT production was assayed after 10 h of incubation. Figura 4B shows the level of CT production in HapR-expressing cells compared with that produced by a strain containing a vector control. Figura 4B shows that the HapR inhibitory effect on CT production is observed only when HapR is induced at early time points, even though SDS/PAGE analysis showed that the total HapR protein made by 10 h was similar regardless of whether IPTG was added at 0 h or 8 h (data not shown). These data indicate that, at least in vitro, HapR acts at an early stage of growth to repress virulence factor production. It remains unclear how HapR regulates virulence gene expression en vivo.

LuxO and HapR Proteins Control Multiple Processes in V. cholerae.

We investigated whether LuxO and HapR might control multiple cellular processes in addition to pathogenesis. As mentioned, HapR is required for production of the HA protease (19). The HA protease is encoded by the hapA gene, and it is a major extracellular protease that may serve as a “detachase” during colonization (38). Zymogram analysis (Fig. 5A) of 17 h cell-free spent culture fluids from the V. cholerae hapR y hapA mutants shows that, as expected, these mutants produce no HA protease. Quantitative analysis of the protease activities of the HapR mutant shows that it is very similar to that of the hapA mutant (Fig. 5). In contrast, identical preparations made from the luxO mutant resulted in a zymogram and protease activity profile similar to that of the wild type (Fig. 5). Interestingly, our analyses demonstrate that higher levels of protease are present in cell-free spent culture fluids prepared from a luxO-hapA double mutant than from the hapA single mutant (Fig. 5B). This result indicates that LuxO negatively regulates secreted proteases other than the HA protease. Additionally, the time course of protease production (Fig. 5B) shows that protease activity is produced earlier in the luxO mutant than in the wild type. We suggest that this LuxO regulation is exerted through HapR, which is consistent with our finding that LuxO represses HapR expression only at low cell density.

HA protease production in V. cholerae wild-type and mutant strains. (A) Zymogram analyses of cell-free culture fluids prepared from the designated V. cholerae parent and isogenic mutant strains after 17 h incubation at 37°C are shown. In lanes prepared from samples containing high HA protease activity [wild type (wt) and luxO], the HA protease results in complete clearing of the gelatin because the HA protease is active during the electrophoresis run. (B) A time course of HA protease production is shown for the same strains analyzed in A. Overnight cultures were diluted 1:100 in LB and incubated at 37°C. Samples were taken at 2-h intervals for determination of azocasein activity. One azocasein unit is defined as the amount of enzyme producing an increase of 0.01 OD units per h.

The microarray data presented in Table 2 show that the expression of several genes involved in chemotaxis and motility are altered in the luxO mutante. We examined the motility of the luxO mutant on a swarm plate and found that this mutant is less motile than the wild-type and HapR mutant strains (Fig. 6A). We also tested whether LuxO and HapR are involved in biofilm formation. Photographs and crystal violet quantifications of biofilms produced by the wild-type, luxO, y HapR mutants are shown in Fig. 6B. Compared with wild-type V. cholerae, los luxO mutant is deficient in its ability to form a biofilm, whereas the HapR mutant is increased in its ability to form a biofilm.

LuxO and HapR control multiple processes in V. cholerae. (A) Different V. cholerae strains were inoculated into motility agar (LB containing 0.3% agar) and incubated at 37°C for 4 h, after which the photograph was taken. (B) A comparison of biofilms produced by wild-type V. cholerae and the luxO y HapR mutantes. (Upper) The photograph shows the crystal violet staining in the borosilicate tubes containing the different strains. The normalized data are presented for these assays (Más bajo). El OD570 values are a measure of crystal-violet staining, which is proportional to the level of biofilm formation. The designation wt refers to the wild-type strain.


Parallel quorum sensing signaling pathways in Vibrio cholerae

Quorum sensing (QS) is a microbial signaling process for monitoring population density and complexity. Communication among bacterial cells via QS relies on the production, secretion, and detection of small molecules called autoinducers. Many bacteria have evolved their QS systems with different network architectures to incorporate information from multiple signals. In the human pathogen Vibrio cholerae, at least four parallel signaling pathways converge to control the activity of a single regulator to modulate its QS response. By integrating multiple signal inputs, it is believed that Vibrio species can survey intra-species, intra-genus, and inter-species populations and program their gene expression accordingly. Our recent studies suggest that this “many-to-one” circuitry is also important for maintaining the integrity of the input–output relationship of the system and minimizes premature commitment to QS due to signal perturbation. Here we discuss the implications of this specific parallel network setup for V. cholerae intercellular communication and how this system arrangement affects our approach to manipulate the QS response of this clinically important pathogen.

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Ver el vídeo: Bonnie Bassler Princeton Part 2: Vibrio Cholerae Quorum Sensing and Novel Antibiotics (Enero 2022).