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Creando modelos animales


Me preguntaba cómo un científico en un laboratorio puede saber qué tipo de modelo animal usar. He estado analizando el efecto de una proteína en una enfermedad. Y he pensado en las formas en que sé que esto se ha hecho en otras investigaciones - - deleción del gen que codifica para la proteína - insertar GFP por gen para la proteína dejando el gen intacto - o insertar gfp por gen para la proteína eliminando el gen Sin embargo, no puedo parecer para entender cómo un científico decide elegir un determinado modelo?


Si observa la definición de organismo modelo, ya que se puede encontrar en la página de inicio de Nature, esto aclara bastante:

Un organismo adecuado para estudiar un rasgo, enfermedad o fenómeno específico, debido a su corto tiempo de generación, genoma caracterizado o similitud con los humanos; ejemplos son una mosca, un pez, un roedor o un cerdo, cuya biología es bien conocida y accesible para estudios de laboratorio.

Entonces quieres un organismo que:

  • se puede criar en grandes cantidades
  • tiene un tiempo de generación suficientemente corto, por lo que puede analizar varias generaciones de él
  • está bien caracterizado
  • lo suficientemente cerca del organismo sobre el que desea aprender más (principalmente: humanos), por lo que los hallazgos se pueden transferir
  • puede estar mutado y tiene su gen / proteína / etc. de interés
  • ha sido secuenciado completamente

Además de estas consideraciones generales, también influyen las prácticas. Si no tiene una instalación de pesca a mano, lo más probable es que no comience a usar el pez cebra como modelo animal.

Ciertamente hay más requisitos, consulte una de las referencias.

Referencias:

  1. Requisitos y selección de un modelo animal.
  2. Seleccionar cepas y modelos animales apropiados: hacer el mejor uso posible de la investigación, la información y la divulgación
  3. Principios básicos en la selección de especies animales para proyectos de investigación

Modelos animales

Masayuki Mizui, George C. Tsokos, en Las enfermedades autoinmunes (quinta edición), 2014

Introducción

Los modelos animales han facilitado enormemente el estudio de enfermedades autoinmunes sistémicas, en particular el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR), y han ayudado a desarrollar nuevos tratamientos racionales. Además, los ratones propensos a la autoinmunidad han servido como herramientas importantes en el estudio de genes implicados en la expresión de la autoinmunidad y enfermedades relacionadas. Se han identificado genes que facilitan o inhiben la enfermedad y estos, a su vez, han facilitado el estudio de la inmunogenética y la inmunopatogénesis de las enfermedades autoinmunes sistémicas humanas. La etiología tanto del LES (Tsokos, 2011) como de la AR (McInnes y Schett, 2011) es heterogénea y complicada, pero los modelos animales aportan una comprensión coherente de la patogénesis de la enfermedad. Los modelos de ratón de enfermedad autoinmune sistémica se pueden agrupar en tres tipos: espontáneos, derivados de la manipulación genética e inducidos.


Primer paso para probar terapias

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A un paciente se le diagnostica melanoma uveal. Gracias a los avances terapéuticos, la enucleación es ahora un último recurso. Un equipo multidisciplinario de oftalmólogos y oncólogos radioterapeutas desarrolla un plan para tratar al paciente con radioterapia dirigida. Eligen usar una placa radiactiva, un tratamiento conocido como braquiterapia, para administrar dosis altas de radiación al tumor.

El tumor se encoge significativamente. Sin embargo, el paciente desarrolla la complicación grave de la retinopatía por radiación que afecta la visión.

Comprensión de la enfermedad: por qué necesitamos un modelo animal

La retinopatía por radiación es un término amplio que describe un espectro de cambios retinianos después de la exposición a la radiación.

Clásicamente definida por su vasculopatía, la retinopatía por radiación generalmente se desarrolla de seis meses a tres años después de la irradiación. Comienza con la pérdida preferencial de células endoteliales, lo que lleva a la oclusión de los vasos, fugas y falta de perfusión retiniana. A medida que avanza la enfermedad, las capas de la retina se ven comprometidas, lo que afecta aún más la visión. La retinopatía por radiación en etapa tardía se caracteriza por neovascularización ocular inducida por isquemia.

A pesar de una progresión de la enfermedad establecida, los mecanismos fisiopatológicos subyacentes de la retinopatía por radiación siguen sin estar claros.

Los tratamientos incluyen la modificación de los factores de riesgo, como:

  • Limitar la dosis total de radiación administrada al tejido.
  • Inyección intravítrea de anti-VEGF y / o corticosteroides.
  • Fotocoagulación con láser para limitar la neovascularización.

Se ha logrado un éxito modesto con estas terapias. Sin embargo, no abordan los eventos celulares y moleculares que conducen a la retinopatía por radiación, y las estrategias de prevención siguen siendo limitadas.

La falta de mecanismos aclarados y opciones de tratamiento dedicadas demuestra una clara necesidad de una investigación más sólida. Al igual que en otras vasculopatías retinianas como la retinopatía diabética, la investigación sobre la retinopatía por radiación puede beneficiarse del uso consciente de un modelo animal apropiado, una herramienta útil en la búsqueda de comprender las patologías de las enfermedades.

Haciendo el modelo

A pesar de su eficacia cercana al 95% y su uso como tratamiento de primera línea en muchos cánceres, la braquiterapia con placa epiescleral se asocia comúnmente con la retinopatía por radiación.

Debido a que no existe ningún modelo animal de retinopatía por radiación inducida por braquiterapia, buscamos establecer uno. Nuestro objetivo es sentar las bases para estudios más mecanicistas y, finalmente, probar terapias prometedoras en un modelo más cercano a la experiencia clínica.

Es necesario considerar varios factores al establecer un modelo de retinopatía por radiación:

  1. Modo de administración de radiación. Aunque técnicamente desafiante, nos decidimos por una placa epiescleral radiactiva, ya que aún no se había descrito. La mayoría de los modelos anteriores utilizaban radiación de haz externo en forma de rayos X.
  2. Tipo de radiación ionizante. El emisor utilizado determina el poder de penetración y la energía entregada al tumor y al tejido circundante.
  3. Dosis de radiación. Las dosis más altas, medidas en gray (Gy), dan como resultado un mayor daño retiniano poco después del tratamiento.
  4. Diferencias en la anatomía ocular entre especies. (Figura 1). Factores como el tamaño del cristalino y la arquitectura vascular pueden afectar el desarrollo de retinopatía en diferentes modelos.

Figura 1. Deben tenerse en cuenta las diferencias en la anatomía ocular entre varias especies al crear un modelo de retinopatía por radiación.
Imagen de Ramos MS, Echegaray JJ, Kuhn-Asif S, et al. Modelos animales de retinopatía por radiación & # 8211 De la teleterapia a la braquiterapia. Exp Eye Res. 2019 Abr 181: 240-251. Copyright 2019, con permiso de Elsevir.

Para crear nuestro modelo, se implantó quirúrgicamente una semilla de yodo-125 radiactivo de 1 mm por 4 mm posterior al limbo del ojo izquierdo de ratas Lewis (Figura 2). La dosis inicial de tratamiento con radiación duró seis horas, después de las cuales se extrajo la semilla. Se administró una dosis total de 45 Gy a una distancia de 1 mm de la semilla. Se administrarán dosis crecientes de radiación para encontrar el rango óptimo.

Figura 2. Colocación de una semilla de yodo-125 radiactivo de 1 mm x 4 mm implantada quirúrgicamente por detrás del limbo del ojo izquierdo de una rata Lewis.

Durante 12 meses, se hará un seguimiento de las ratas mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) y angiografía con fluoresceína de campo amplio (FA) para controlar la aparición de retinopatía (Figura 3). Según informes anteriores que utilizan radiación de haz externo, la mayoría de los animales muestran signos de retinopatía (es decir, hemorragias puntuales, manchas algodonosas o adelgazamiento de la retina) aproximadamente seis meses después del tratamiento.

Figura 3. Un ejemplo de imágenes de angiografía con fluoresceína de campo amplio utilizadas para controlar el desarrollo de retinopatía inducida por radiación en una rata Lewis.

Avanzando

Este estudio piloto es el primer intento de retinopatía por radiación inducida por braquiterapia con placa epiescleral en un modelo animal. Junto con el modelo apropiado, las modalidades de imágenes clínicamente relevantes, como OCT y AF de campo amplio, permitirán una evaluación y clasificación anatómica comparativa in vivo más fácil de los cambios retinopáticos inducidos por radiación.

Las investigaciones futuras pueden profundizar en los posibles mecanismos fisiopatológicos, como los que involucran vías inflamatorias, leucocitos, microglia y apoptosis. Estos estudios permitirán una mejor comprensión de la retinopatía por radiación y el desarrollo de terapias más efectivas para esta enfermedad.

El Sr. Ramos es técnico de investigación en Cole Eye Institute. El Dr. Yuan es un especialista en retina. El Dr. Singh es Director del Departamento de Oncología Oftalmológica.

Imagen destacada: Una fotografía en color de fondo de ojo de la presentación clínica de un ojo izquierdo afectado por retinopatía por radiación muestra múltiples exudados retinianos (material amarillo) que rodean el tumor irradiado.

Imagen de Ramos MS, Echegaray JJ, Kuhn-Asif S, et al. Modelos animales de retinopatía por radiación & # 8211 De la teleterapia a la braquiterapia. Exp Eye Res. 2019 Abr181: 240-251. Copyright 2019, con permiso de Elsevir.


Misión: democratización de datos

Como muchos niños de todo el mundo, Willian da Silveira soñaba con convertirse en astronauta. A medida que crecía, se dedicó a la farmacia, lo que lo llevó a la biofísica y la bioquímica y finalmente a la bioinformática. Sin embargo, mientras estaba en la Universidad Médica de Carolina del Sur, ese viejo sueño de su juventud en Brasil llamó a la puerta. La NASA no buscaba astronautas, sino analistas. La agencia espacial estaba acumulando datos de organismos modelo que habían volado al espacio, e invitaba a expertos en ómica y bioinformáticos a echar un vistazo.

Da Silveira obtuvo una pequeña subvención y algunos transcriptomas de hígado de ratón. Las cosas le parecieron un poco extrañas de inmediato; para él, era como si los ratones fueran diabéticos. Da Silveira, ahora en la Queen's University de Belfast, y un grupo cada vez mayor de colaboradores con diversas áreas de experiencia de instituciones de todo EE. UU. Buscaron más datos ómicos de más ratones. Fue casi abrumador, recuerda da Silveira, pero un detalle seguía apareciendo una y otra vez. “Muchas de las cosas que veíamos estaban relacionadas con el metabolismo mitocondrial”, dice.

Las mitocondrias, las centrales eléctricas de las células, como dice el refrán, nos brindan a nosotros y a todos los demás eucariotas espacio de energía, al parecer, lo elimina a través de la desregulación mitocondrial, signos de los cuales fueron evidentes cuando los equipos analizaron y ejecutaron simulaciones basadas en la datos de expresión génica murina. De los ratones, miraron a los astronautas. Efectivamente, cuando comenzaron a buscar, encontraron señales de que la función mitocondrial había fallado en muestras de orina y sangre de 59 astronautas y en el conjunto de datos del Estudio de Gemelos de la NASA, que comparó al astronauta Scott Kelly con su gemelo terrestre Scott.

Los resultados fueron publicados el pasado mes de noviembre en Celda 3 (junto con otros 28 artículos y comentarios relacionados con la biología espacial en las publicaciones de Cell Press) y sugieren que el estrés mitocondrial, que puede contribuir a la resistencia a la insulina, el envejecimiento prematuro y los problemas inmunológicos, es un fenotipo espacial persistente que podría ser un objetivo valioso para mitigar muchos diferentes dolencias que provienen de vivir en microgravedad y con una mayor exposición a la radiación.

Para da Silveira, era un sueño imposible ahora hecho realidad, gracias a un proyecto de ciencia abierta gestionado a través del Centro de Investigación Ames de la NASA en California llamado GeneLab. “No podría estar en el campo si no fuera por GeneLab”, dice da Silveira. "Están haciendo que los datos sean accesibles para cualquier persona en el mundo".

Desde abril de 2015, la NASA ha alojado conjuntos de datos ómicos y datos relacionados de misiones de organismos modelo en su base de datos GeneLab (mientras tanto, los datos no ómicos se han archivado en Ames Life Sciences Data Archive (ALSDA), que actualmente está trabajando para mejorar su integración con GeneLab 4). Estos incluyen transcriptomas, proteomas, epigenomas, metagenomas y metabolomas para sistemas modelo que incluyen plantas, microbios y animales. Los datos han sido generados y compartidos por los investigadores principales, así como también producidos a partir de análisis internos de tejidos archivados del Programa de intercambio de muestras biológicas de biología espacial de la NASA y la Colección científica institucional biológica de la NASA. En abril de 2021, GeneLab contenía 316 conjuntos de datos ómicos que son completamente gratuitos para que cualquier persona del mundo los descargue. Es la democratización de los datos en acción, dice el gerente de proyectos Sylvain Costes.

Tanto GeneLab como ALSDA son bases de datos compatibles con FAIR (localizables, accesibles, interoperables y reutilizables) diseñadas para estar disponibles abiertamente. Tales esfuerzos generalmente implican un cambio de cultura, pero los IP involucrados en misiones espaciales entienden el valor “GeneLab ha descubierto que sus IP están ansiosos por compartir sus datos, porque entienden que después de que se realizó su experimento original, esos conjuntos de datos, porque son relevantes para los vuelos espaciales, son absolutamente valiosos ”, dice Ryan Scott, un científico de Ames que trabaja para KBR.

En sus primeros años, esos datos ómicos eran un poco crudos y requerían cierta experiencia en bioinformática para procesarlos y analizarlos, lo que se puede hacer de maneras ligeramente diferentes. Sin embargo, los estándares están tomando forma para ayudar a cualquier persona, independientemente de su origen, a reutilizar los datos ómicos capturados de modelos espaciales.


Cómo hacer una célula animal para un proyecto científico

Bess Ruff, MA es coautor (a) de este artículo. Bess Ruff es estudiante de doctorado en Geografía en la Universidad Estatal de Florida. Recibió su Maestría en Ciencias Ambientales y Gestión de la Universidad de California, Santa Bárbara en 2016. Ha realizado trabajos de encuesta para proyectos de planificación espacial marina en el Caribe y ha brindado apoyo de investigación como becaria de posgrado para el Grupo de Pesca Sostenible.

Hay 7 referencias citadas en este artículo, que se pueden encontrar al final de la página.

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Las células son uno de los componentes fundamentales de los organismos vivos. Si estás aprendiendo biología en la escuela, es posible que tu maestro te pida que crees tu propio modelo de una célula animal para ayudarte a comprender cómo funcionan las células. También es posible que desee construir un modelo de una celda como parte de una feria de ciencias. Con algunos materiales simples, puede construir su propia célula animal para ayudar a reforzar su conocimiento y enseñar a otros.


Editor invitado principal Dr. Nelson S. Yee

El Dr. Nelson S. Yee es profesor asistente de medicina en hematología y oncología en la Universidad Estatal de Pensilvania.. Completó su doctorado y doctorado en la Universidad de Cornell y en el Centro Oncológico Memorial Sloan-Kettering, y anteriormente trabajó en la Universidad de Pennsylvania y la Universidad de Iowa. Ahora trabaja principalmente en canales iónicos en el cáncer utilizando modelos de pez cebra y ratón, así como en el desarrollo de terapias y biomarcadores en pacientes con enfermedades malignas. El Dr. Yee es autor o coautor de 40 artículos publicados y ha presentado en 30 conferencias, y tiene citas editoriales en Clinical Cancer Drugs, Molecular & # x00026 Cellular Oncology, Annals of Hematology & # x00026 Oncology, Biomarkers & # x00026 Diagnosis , Avisos de investigación académica internacional, Clonación & # x00026 Transgénesis, Avances en biología y trastornos genéticos & # x00026 Terapia génica.


Materiales y métodos

Estadísticas de OMIM

Las estadísticas para la consulta de texto libre de los registros OMIM se obtuvieron el 2/6/2009 (Tabla 1). Las estadísticas para el número de registros de genes OMIM con fenotipos asociados se obtuvieron haciendo una consulta en OMIM para cualquier registro de genes (* o +) con un filtro que seleccionaba registros con descripciones de variantes alélicas y / o sinopsis clínicas. Las estadísticas para el porcentaje de registros de fenotipo / enfermedad OMIM con base genética molecular conocida se obtuvieron de la tabla de estadísticas OMIM en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/mimstats.html, dividiendo el recuento de registros con una “Descripción del fenotipo, base molecular conocida” por el número total de registros de fenotipo (las estadísticas son al 8/10/2009).

Selección de genes / registros para anotación

Los genes humanos de OMIM se seleccionaron primero clasificándolos por aquellos con homólogos mutantes conocidos y descritos en Danio rerio y Drosophila melanogaster, luego por tener el mayor número de descripciones detalladas de alelos en OMIM. Seleccionamos los siguientes 11 genes para anotarlos de su registro OMIM: ATP2A1 (108730), EPB41 (130500), EXT2 (608210), EYA1 (601653), FECH (177000), PAX2 (167409), SHH (600725), SOX9 (608160), SOX10 (602229), TNNT2 (191045) y TTN (188840). EYA1, PAX2, SOX9, SOX10, y TTN fueron seleccionados para su grabación por tres curadores independientes para probar la consistencia de las anotaciones (que se publicará en otro lugar). Cuando un registro de genes OMIM se refería a un registro de enfermedad, los anotadores capturarían tanta información general del fenotipo sobre esa enfermedad como fuera posible.

Software de anotación y almacenamiento

Escribimos términos de ontología con el prefijo del nombre de las abreviaturas de ontología que se proporcionan al principio de este artículo. Usamos ZFA: gut en lugar de ZFA: 0000112 por motivos de legibilidad. La forma analizable computacionalmente real usaría los ID numéricos.

Todas las anotaciones OMIM se crearon con el software Phenote [24], utilizando la configuración "humana". Esto incluyó las siguientes ontologías: CL, CHEBI, FMA, GO y EDHAA para la selección de entidades y PATO para la selección de calidad. Todas las anotaciones se registraron con la procedencia asignada al identificador PubMed (PMID) para la publicación original como se indica en el registro OMIM. Las ontologías se actualizaron diariamente durante la anotación y las anotaciones a términos obsoletos se reconciliaron antes del análisis. Las anotaciones, junto con las ontologías de referencia, que se analizaron para este documento se pueden encontrar en la URL estable: http://obo.svn.sourceforge.net/viewvc/obo/phenotype-commons/annotations/OMIM/archive/2009/.

Fuentes de anotaciones adicionales

Se recuperaron anotaciones fenotípicas adicionales para la comparación entre especies de MGI [33], ZFIN [13], GAD [63], gen NCBI [64] y homologen [65] en septiembre de 2008. Las ontologías utilizadas en el análisis se descargaron del Repositorio de OBO Foundry [66] en agosto de 2008: BP-XP-UBERON (diciembre de 2008), ChEBI, CL, DO, DO-XP-FMA, EDHAA, FMA, GO-BP, GO-CC, GO-MF, MA, MP-XP, PATO, SO, UBERON, ZFA y ZFS. Para vincular las anotaciones de especies cruzadas realizadas con ontologías de anatomía específicas de especies (ssAO), creamos una “Uber-ontología”, UBERON, para llenar el vacío entre la Ontología de referencia de anatomía común (CARO) general [67] y las ssAO. La primera versión de UBERON se generó automáticamente alineando las ssAO existentes y las ontologías de referencia anatómicas, y luego se seleccionó parcialmente de forma manual. Las ontologías a las que se hace referencia incluyen: FMA, MA, EHDAA, ZFA, TAO, NIF, GAID, CL, XAO, MAT, FBbt, AAO, BILA, WBbt y CARO. Se pueden encontrar detalles adicionales en [17] y [16]. Todas las ontologías se cargaron en OBD, junto con las anotaciones de las fuentes enumeradas en la Tabla 4.

Razonamiento

El razonamiento se realizó sobre el conjunto combinado de anotaciones, ontologías y asignaciones de ontologías. Usamos el OBD RuleBasedReasoner para calcular el cierre de las relaciones transitivas y para calcular las relaciones de subsunción inferidas entre descripciones de EQ [28].

Análisis

El análisis del fenotipo se realizó utilizando el sistema OBD [28] que implementa una serie de métricas de similitud, que se describen a continuación. Todas las métricas de similitud se basan en el gráfico razonado y las anotaciones se propagan hacia arriba en la jerarquía de subsunción.

La mayoría de estas métricas usan el IC (Ecuación 1) de un término o fenotipo EQ (colectivamente llamado descripción), que es el logaritmo negativo de la probabilidad de que esa descripción se use para anotar un gen, alelo o genotipo (colectivamente llamado un característica). donde la probabilidad de una descripción es el número de características anotadas con esa descripción sobre el número total de características en la base de datos (Ecuación 2):

Aquí anotardescripción indica el número de características a las que se aplica la descripción, una vez realizado el razonamiento. Esto significa que descripciones muy generales, como la “morfología de la estructura anatómica”, que subsumen muchas descripciones más específicas, son aplicables a un mayor número de características y, por lo tanto, tienen un CI bajo.

MaxIC

El maxIC se obtiene tomando todas las descripciones compartidas por un par de características y encontrando las descripciones con el IC más alto. Esto puede ser una coincidencia exacta o puede ser una descripción subsumida inferida por el razonador. Una característica de la puntuación maxIC es que puede ocultar las contribuciones de anotaciones que no están en el conjunto maxIC. Esta puntuación es equivalente a la variante "máxima" de la similitud de Resnick, como se describe en [18].

Esta métrica intenta hacer coincidir cada descripción anotada directamente en una característica con una descripción anotada directamente en la otra característica. Cada descripción anotada directamente DI se compara con todas las descripciones D'1, D'2,… En la otra característica que se está comparando. Se encuentra la descripción subsumidora común más específica (puntuación más alta), y el conjunto único de estos se denomina subsumidores comunes. El ICCS es el IC promedio de todos los subsumidores comunes en este conjunto único.

Esta medida se muestra en la Figura 4 donde el tríptico central muestra los subsumidores comunes. La métrica ICCS se describe en [28] y no se ha descrito previamente que sepamos. Puede considerarse una composición de las medidas de Resnick media y máxima descritas en [18].

SimIC

Dados dos perfiles fenotípicos, por ejemplo los perfiles fenotípicos de dos genes, o dos genotipos, o los dos perfiles generados por dos curadores que anotan el mismo genotipo, podemos calcular la suma de las puntuaciones de IC para (a) aquellas descripciones de EQ fenotípicas que son sostenido en común (la intersección) y (b) el conjunto total combinado de descripciones de EQ de fenotipo (la unión). Al observar la relación de estas dos sumas (las que se comparten frente a la totalidad), podemos obtener una medida de cuán similares son los dos perfiles fenotípicos, con fenotipos perfectamente idénticos que tienen una puntuación de 1. La medida simIC se ilustra en (Ecuación 3).

Aquí una p denota el conjunto total de descripciones que se pueden aplicar a pag, incluidas las descripciones subsumidas. Como ejemplo, dados dos genotipos, pag y q, el simIC se obtiene dividiendo la suma de los IC para todas las descripciones en común por la suma de todas las descripciones en la unión. Aquí, las descripciones incluyen las descripciones reales utilizadas en el perfil y todas las descripciones subsumidas según lo determine el razonador. Esta métrica penaliza a los nodos que tienen anotaciones diferentes.

Usamos una métrica de similitud adicional, la simJ, que no utiliza las medidas de CI. La similitud entre dos perfiles es la relación entre el número de descripciones en común y el número de descripciones en ambos perfiles. Esto también se denomina "índice de Jaccard" o "coeficiente de similitud de Jaccard". El número de descripciones en común se denomina simTO en [18]. El simJ (Ecuación 4) es una variante del simTO normalizado:

Comparaciones de genes

Tenga en cuenta que para las comparaciones entre dos genes, todas las anotaciones hechas a genotipos heterocigotos y homocigotos se propagaron primero a los alelos únicos (o ambos, si se conocen), y luego se propagaron a su gen progenitor. Las anotaciones de genotipo utilizadas en cada consulta se excluyeron del conjunto de antecedentes al calcular la puntuación general (Figura 5).

Para las comparaciones alelo a alelo, calculamos cada métrica para todas las combinaciones de alelos por pares. Las puntuaciones de similitud entre un par de alelos se clasificaron en conjuntos intragenéticos (mismo gen) e intergenéticos (genes diferentes), y se compararon las puntuaciones medias de cada gen. La significancia de la diferencia entre las puntuaciones medias de cada gen se calculó utilizando una escala de Student de dos colas. t-prueba.

Para el pez cebra shha consulta, también comparamos este gen con todos los demás genes del pez cebra (2.908 genes en el conjunto total). Para las consultas entre especies, comparamos exhaustivamente cada gen con todos los demás genes utilizando simJ y luego calculamos todas las métricas en los 250 principales.


¿Por qué fallaron los ensayos en humanos?

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El 26 de octubre de 2006, en el día inaugural del Congreso Mundial Conjunto sobre Accidentes Cerebrovasculares en Ciudad del Cabo, Sudáfrica, se difundieron rápidamente entre los asistentes noticias decepcionantes: el segundo ensayo clínico de fase III para NXY-059 había fracasado. El fármaco, un agente atrapador de espín de radicales libres para el accidente cerebrovascular isquémico, se había anticipado con entusiasmo como un agente neuroprotector eficaz para los pacientes con accidente cerebrovascular. Como el desarrollador de fármacos, AstraZeneca, emitió un comunicado de prensa informando la noticia, los correos electrónicos circularon rápidamente dentro de la comunidad de investigación de accidentes cerebrovasculares, muchos con el asunto "¿Ha escuchado las malas noticias?"

"Estábamos optimistas de que este sería el nuevo fármaco para los accidentes cerebrovasculares", dice Marc Fisher, director del programa de accidentes cerebrovasculares del Centro Médico de la Universidad de Massachusetts, que asistió a la conferencia en Ciudad del Cabo. "Éramos.

Para consternación de los médicos y los investigadores del accidente cerebrovascular agudo, el compuesto mostró una eficacia limitada en la neuroprotección frente al placebo. En cambio, NXY-059 se unió a la familia de más de una docena de agentes neuroprotectores fallidos, incluidos antagonistas del glutamato, bloqueadores de los canales de calcio, agentes antiinflamatorios, agonistas de GABA, antagonistas de opioides, factores de crecimiento y fármacos de otros mecanismos. Todos habían alcanzado los ensayos clínicos de Fase III y fracasaron estrepitosamente en hacer lo que sus pruebas con modelos animales habían sugerido que harían: detener la cascada de necrosis en caso de accidente cerebrovascular y proteger las células cerebrales viables restantes.

El hecho de que NXY-059 hubiera sido víctima del mismo destino fue particularmente descorazonador para un grupo de mesa redonda sobre accidentes cerebrovasculares que, en 1999, abordó directamente la desconexión entre los modelos animales para el accidente cerebrovascular y sus ensayos en humanos contrapartes. El grupo había ideado un conjunto de pautas cuyo objetivo era estandarizar el camino hacia la terapéutica del accidente cerebrovascular. Durante su desarrollo, NXY-059 había sido su modelo principal. "Este fármaco fue aclamado como el primero en seguir los estándares", dice Sean Savitz, profesor asistente de neurología en la Facultad de Medicina de Harvard. "Pero no hizo eso".

"Fue muy decepcionante para todos nosotros que fallara, y fracasó totalmente", dice Sid Gilman, director del Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer de Michigan en el Departamento de Neurología de la Universidad de Michigan y uno de los consultores de AstraZeneca. en el diseño clínico de la Fase III.

Si el resultado de los ensayos del tratamiento NXY isquémico agudo para accidentes cerebrovasculares (SAINT) fuera una anomalía, los investigadores podrían haberlo ignorado. Pero no lo es: casi la mitad de todas las entidades moleculares que entran en desarrollo fallan, según Janet Woodcock, subcomisionada de la Administración de Drogas y Alimentos. "No hay duda sobre la ausencia de un efecto [de NYX-059], y eso puso en duda los muchos otros estudios sobre accidente cerebrovascular, y ¿qué tan buenos son los modelos animales?" dice Gilman. "Muchos agentes parecieron ser efectivos en el modelo animal y fallaron en los ensayos en humanos".

Debido a estos fracasos, cientos de millones de dólares y un enfoque potencial para el tratamiento del accidente cerebrovascular han desaparecido por el desagüe. El fracaso de NXY-059 puede haber estancado la búsqueda de un agente neuroprotector, al menos durante algún tiempo. "Este ensayo ha envenenado los estudios de accidentes cerebrovasculares", dice Gilman. "Dudo que los inversores quieran invertir en ensayos clínicos sobre accidentes cerebrovasculares durante un tiempo". La culpa, al parecer, puede residir en el uso descuidado de modelos animales.

En 1998, Fisher voló de Boston a Alemania para ayudar a una compañía farmacéutica, junto con académicos especializados en modelado animal, a examinar dos conjuntos de resultados de ensayos clínicos para un nuevo tratamiento de accidente cerebrovascular que había fallado. Querían descubrir dónde se habían equivocado. (Fisher se niega a revelar la compañía y los juicios involucrados).

En su vuelo de regreso, a Fisher se le ocurrió que el caos al que se había enfrentado el campo de la investigación sobre accidentes cerebrovasculares durante años podría beneficiarse del tipo de reunión a la que acababa de asistir: la industria y la academia colaborando para desarrollar prácticas estandarizadas. Al año siguiente, Fisher convocó al primer grupo de la Mesa Redonda de la Industria Académica de la Terapia de Accidentes Cerebrovasculares (STAIR) que diseñó un conjunto de recomendaciones para el desarrollo de fármacos clínicos y preclínicos para los accidentes cerebrovasculares. Desde el punto de vista preclínico, algunas de las recomendaciones parecían obvias: el fármaco candidato debería evaluarse en roedores y también deberían realizarse pruebas ciegas de especies animales superiores. Las pruebas deberían realizarse en ambos sexos y en diferentes edades de los animales y todos los datos, tanto positivos como positivos. negativo, debe publicarse.

Aproximadamente 26 millones de animales se utilizan para investigación cada año en los Estados Unidos y la Unión Europea, según estimaciones de la Research Defense Society en el Reino Unido. Sin embargo, el número de procedimientos con animales se ha reducido a la mitad en los últimos 30 años, probablemente debido a controles más estrictos, mejoras en el bienestar animal y avances científicos.

Aún así, a diferencia de los ensayos clínicos en humanos, no existen estándares de mejores prácticas para las pruebas con animales. STAIR es el intento de estandarización de la comunidad de investigación de accidentes cerebrovasculares. NXY-059 fue el primer agente neuroprotector que se desarrolló bajo los auspicios de las pautas de STAIR, aunque la implementación de las pautas puede haber sido sólo de labios para afuera. En particular, como escribió Savitz en un artículo publicado en línea en Neurología experimental en mayo, las pruebas preclínicas tuvieron varios agujeros, incluida la solidez estadística y la forma en que los resultados se tradujeron en diseño clínico. 1

Los principales problemas, escribe Savitz, fueron la aleatorización y el sesgo. En la evaluación inicial de NXY-059 en modelos de rata de isquemia focal, los informes no dijeron si los investigadores habían sido cegados con respecto a la administración de fármacos, las pruebas de comportamiento y el análisis histológico. Los resultados del estudio con roedores fueron mixtos, mostrando un rango de reducción del tamaño del infarto cerebral en una variedad de intervalos. Por muy positivos que hayan sido los resultados, señala Savitz, la clara falta de solidez estadística pone en duda cualquier resultado. Un informe posterior sobre los efectos de NXY-059 en un modelo embólico de conejo mostró una reducción del 35% en el infarto después de 48 horas, pero no indicó si se habían realizado análisis estadísticos, pruebas ciegas, mediciones fisiológicas, monitoreo del flujo sanguíneo o evaluaciones de comportamiento. hecho.

AstraZeneca sostiene que las pruebas preclínicas con animales y la fase clínica de SAINT se adhirieron a las pautas de STAIR: "El diseño de las pruebas de SAINT fue sólido y bien considerado a la luz de la fuerte evidencia de neuroprotección que existía en los modelos y especies probados en ese momento. , "según un comunicado enviado a El Científico en respuesta al artículo de Savitz. Gilman, también editor en jefe de Neurología experimental, dice que no tiene conocimiento de que AstraZeneca haya redactado o presentado ninguna respuesta oficial.

"Muchos agentes parecieron ser efectivos en el modelo animal y fallaron en los ensayos en humanos".
- Sid Gilman

Los problemas estadísticos que empantanaron algunos de los ensayos preclínicos del NXY-059 son comunes en modelos animales. Las encuestas de artículos basados ​​en modelos animales encuentran errores en aproximadamente la mitad, según Michael Festing, un científico de animales de laboratorio recientemente retirado del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido y miembro de la junta del Centro Nacional de las Tres R (reemplazo, refinamiento y reducción de NC3R) , una organización que aboga por utilizar menos animales en la investigación y racionalizar las pruebas con animales actuales. "Es discutible si esos son lo suficientemente serios como para que las conclusiones sean inválidas", dice Festing.

Incluso los innumerables casos exitosos de experimentación animal que llevaron a tratamientos efectivos para la presión arterial alta, el asma, el rechazo de trasplantes y las vacunas contra la poliomielitis, la difteria y la tos ferina se llevaron a cabo sin métodos de prueba estandarizados.

"People don't report if studies are randomized," says Ian Roberts, professor of epidemiology at the London School of Hygiene and Tropical Medicine. How animals are selected, or whether assessments were blind, are rarely included in the methods and thus create a potential for bias. "Imagine a cage of 20 rats, and you've got a treatment for some," explains Roberts. "So you stick your hand in a cage, and pull out a rat. The rats that are the most vigorous are hardest to catch, so when you pull out 10 rats, they're the sluggish ones, the tired ones, they're not the same as the ones still in the cage, and they're the control. Immediately there's a difference between the two groups."

The NC3Rs, in cooperation with the National Institutes of Health, is surveying a group of 300 papers, half from the United Kingdom, half from the United States, for their statistical quality in mouse, rat, and primate model studies. Researchers hope that by fall they will have a report describing how well (or not) the studies were randomized and whether they used the correct statistical methods. In an initial pilot study of 12 papers conducted in 2001 for the Medical Research Council, Festing reported: In six of the papers the number of animals used wasn't clear only two of the papers reported randomization and only six of the papers specified the sex of the animals tested. (For more on how gender can influence results, see "Why Sex Matters".)

Statistics aren't the only problem. Methodology is arbitrary, replication is lacking, and negative results are often omitted. A report in Academic Emergency Medicine by Vik Bebarta et al. in 2003 showed that animal experiments where randomization and blind testing are not reported are five times more likely to report positive results. 2 In a December 2006 paper in the Revista médica británica, Pablo Perel et al. showed that in six clinical trials for conditions including neonatal respiratory distress syndrome, hemorrhage, and osteoporosis, only three of the trials had corresponding animal studies that agreed with clinical results. 3 The authors attribute this discrepancy to poor methodology (i.e., bias in the animal models) and the failure of the models to mimic the human disease condition.

The difficulties associated with using animal models for human disease result from the metabolic, anatomic, and cellular differences between humans and other creatures, but the problems go even deeper than that.

When experimenting in animals researchers often use incorrect statistical methods, adopt an arbitrary methodology, and fail to publish negative results.

One of the major criticisms of the NXY-059 testing was the lack of correlation between how the effects of the drug were monitored in animals versus in humans. In the rodent model, researchers induced an ischemic event, administered the drug at various time intervals, and measured the size of the infarction. During the clinical trials, however, the drug's effect was evaluated in stroke patients using behavioral indicators such as the modified Rankin scale and NIH stroke severity (NIHSS) scale. In the primate tests the behavior assessments were based on a food-reward system, showing that NXY-059 did not improve left arm weakness in the aftermath of a stroke. "Even if we accept that NXY-059 does improve arm weakness," writes Savitz, "how would such a finding translate to human acute stroke studies that use the modified Rankin scale and NIHSS scores as primary outcome measures?" Indeed, some consider the two phases of testing, from animal to human, completely out of whack, and that only by statistical fluke was SAINT I, the first clinical trial, deemed a success.

Some say that animal research is best when targeted at specific mechanisms of action. "Animals are better used for understanding disease mechanism and potential new treatments, rather than predicting what will happen in humans," says Simon Festing, executive director of RDS (and son of Michael Festing). RDS is a UK organization that advocates the understanding of animal research in medicine. "The 2001 Nobel Prize in medicine involved sea urchins and yeast, organisms that evolved apart from humans by millions of years," says the younger Festing. "And yet, they are ideal models for studying cell divisions ? research that is being used in cancer therapeutics in humans now."

For specific models of human disease, Simon Festing adds, the farther away from the human species the animal studies get, the less predictive the model will be. For example, researchers studying some conditions, including Parkinson disease, have established a clear animal model. The primate model displays symptoms similar to human symptoms, whereas a mouse model may not be able to show the distinct tremor in the limbs. While this difference in essence relates back to fundamental anatomic variation among the various species, finding the best model is inherently difficult.

"The choice of animals is rather narrow," says Michael Festing. "There are 4,000 species of rodents, but we use only three or four of them. Then there's a shortage of anything that's not rodents, and in some cases we're restricted to dogs and cats ? which are a problem from the ethical point of view ? and primates, also a problem from the ethical point of view. So [choosing the right animal model is] sort of done by default: Eliminate the ones that are not suitable and choose from what's left."

Perhaps because of its abundance and short gestation, the mouse has become the flagship of animal testing, especially useful with genetic modifications, gene knockouts, and knockins. In 2003, NIH launched the Knockout Mouse Project (KOMP) and has awarded more than $50 million with the goal of creating a library of mouse embryonic stem cells lines, each with one gene knocked out.

Nonetheless, even genetically manipulated mice have their problems. The current knockout mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) may be completely wrong, according to John Trojanowski at the University of Pennsylvania School of Medicine. He and colleagues recently showed that two versions of the disease, sporadic and hereditary, are biochemically distinct, and that a different mechanism controls the disease in each case. 4 In hereditary ALS the disease is associated with a mutation (SOD-1), whereas the sporadic cases are associated with the TDP-43 protein. Until now, research has focused primarily on SOD-1 knockout mice, with virtually no success in human trials. The new findings relating to the TDP-43 protein suggest that the SOD-1 knockout model for ALS could be wrong. "There was this nagging doubt" about the validity of the current models, Trojanowski says. "And there may be a whole new pathology characteristic, so we need models based on TDP-43."

A recent study at the Massachusetts Institute of Technology shows distinct differences between gene regulation in humans and mouse liver ? particularly how the master regulatory proteins function. 5 In a comparison of 4,000 genes in humans and mice, the researchers expected to see identical behavior ? that is, the binding of transcription factors to the same sites in most pairs of homologous genes. However, they found that transcription factor binding sites differed between the species in 41% to 89% of the cases.

Many of the underlying limitations associated with mice models involve the inherent nature of animal testing. The laboratory environment can have a significant effect on test results, as stress is a common factor in caged life. Jeffrey Mogil, a psychology researcher at McGill University in Quebec, demonstrated last year that laboratory mice feel "sympathy pains" for their fellow labmates. In other words, seeing another mouse in distress elevates the amount of distress the onlooker displays. The average researcher, when testing for toxicity effects in mice for example, likely assumes that they are starting at a pain baseline, when in truth the surrounding environment is not benign and can significantly affect results, Mogil says.

Choosing the right animal model is "sort of done by default: Eliminate the ones that are not suitable and choose from what's left." -Michael Festing

In new research, Mogil's group is demonstrating that the very presence of a lab researcher can alter behavior in mice. "The surprising thing is that these effects are visual, not auditory or olfactory," he says. "It's a huge surprise. Most people think [mice] are mostly blind anyway. I'm being convinced that the visual world of the mouse is a lot richer than expected."

Although the failure of NXY-059 may be one insult too many for clinicians and patients eagerly awaiting a neuroprotective agent, some experts feel that this hurdle is far from being the final chapter. Whether they blame weak animal test standardization, poor clinical design, or inadequate statistical analysis, questions often return to the NXY-059 itself as an indicator for the future of neuroprotection. "This drug is known to have antioxidant effects, but it was never shown what its mechanism was on the brain. Early studies were only hinting at possibilities," Savitz says.

In a field where much work is concentrating on nitrone-based spin trap agents, NXY-059 became the parent compound. But it's clear that it wasn't the answer. "The drug probably isn't a good drug to begin with," says Myron Ginsberg, professor of neurology and clinician at the University of Miami School of Medicine. Despite NYX-059's disappointing failure, other neuroprotective options are still in the pipeline. Ginsberg is in the early stages of working on albumin as a neuroprotective therapeutic, and researchers are also considering hypothermia as a way of preserving brain cells after ischemic stroke. "The fact that this drug failed, Ginsberg says, "doesn't say anything about the potential for neuroprotection [in the future.]."


For further information, please contact

Kasper Kjær-Sørensen, PhD
Department of Molecular Biology and Genetics
Aarhus University
kks@mbg.au.dk - +45 5144 6497

Claus Oxvig, Professor
Department of Molecular Biology and Genetics
Aarhus University
co@mbg.au.dk - +45 3036 2460

Aage Kristian Olsen Alstrup, PhD, Veterinarian
Department of Clinical Medicine, the PET Centre
Aarhus University
aage.olsen@clin.au.dk - +45 78464396

This article was published in Dyrlægen (The Veterinarian) on 27 February 2017, pp. 26-30, and is reproduced here by permission of the editor of Dyrlægen Dyrlægen.


Contenido

Knocking out the activity of a gene provides information about what that gene normally does. Humans share many genes with mice. Consequently, observing the characteristics of knockout mice gives researchers information that can be used to better understand how a similar gene may cause or contribute to disease in humans.

Examples of research in which knockout mice have been useful include studying and modeling different kinds of cancer, obesity, heart disease, diabetes, arthritis, substance abuse, anxiety, aging and Parkinson's disease. Knockout mice also offer a biological and scientific context in which drugs and other therapies can be developed and tested.

Millions of knockout mice are used in experiments each year. [3]

There are several thousand different strains of knockout mice. [3] Many mouse models are named after the gene that has been inactivated. For example, the p53 knockout mouse is named after the p53 gene which codes for a protein that normally suppresses the growth of tumours by arresting cell division and/or inducing apoptosis. Humans born with mutations that deactivate the p53 gene suffer from Li-Fraumeni syndrome, a condition that dramatically increases the risk of developing bone cancers, breast cancer and blood cancers at an early age. Other mouse models are named according to their physical characteristics or behaviours.

There are several variations to the procedure of producing knockout mice the following is a typical example.

  1. The gene to be knocked out is isolated from a mouse gene library. Then a new DNA sequence is engineered which is very similar to the original gene and its immediate neighbour sequence, except that it is changed sufficiently to make the gene inoperable. Usually, the new sequence is also given a marker gene, a gene that normal mice don't have and that confers resistance to a certain toxic agent (e.g., neomycin) or that produces an observable change (e.g. colour or fluorescence). In addition, a second gene, such as herpes tk+, is also included in the construct in order to accomplish a complete selection. are isolated from a mouse blastocyst (a very young embryo) and grown in vitro. For this example, we will take stem cells from a white mouse.
  2. The new sequence from step 1 is introduced into the stem cells from step 2 by electroporation. By the natural process of homologous recombination some of the electroporated stem cells will incorporate the new sequence with the knocked-out gene into their chromosomes in place of the original gene. The chances of a successful recombination event are relatively low, so the majority of altered cells will have the new sequence in only one of the two relevant chromosomes – they are said to be heterozygous. Cells that were transformed with a vector containing the neomycin resistance gene and the herpes tk+ gene are grown in a solution containing neomycin and Ganciclovir in order to select for the transformations that occurred via homologous recombination. Any insertion of DNA that occurred via random insertion will die because they test positive for both the neomycin resistance gene and the herpes tk+ gene, whose gene product reacts with Ganciclovir to produce a deadly toxin. Moreover, cells that do not integrate any of the genetic material test negative for both genes and therefore die as a result of poisoning with neomycin.
  3. The embryonic stem cells that incorporated the knocked-out gene are isolated from the unaltered cells using the marker gene from step 1. For example, the unaltered cells can be killed using a toxic agent to which the altered cells are resistant.
  4. The knocked-out embryonic stem cells from step 4 are inserted into a mouse blastocyst. For this example, we use blastocysts from a grey mouse. The blastocysts now contain two types of stem cells: the original ones (from the grey mouse), and the knocked-out cells (from the white mouse). These blastocysts are then implanted into the uterus of female mice, where they develop. The newborn mice will therefore be chimeras: some parts of their bodies result from the original stem cells, other parts from the knocked-out stem cells. Their fur will show patches of white and grey, with white patches derived from the knocked-out stem cells and grey patches from the recipient blastocyst.
  5. Some of the newborn chimera mice will have gonads derived from knocked-out stem cells, and will therefore produce eggs or sperm containing the knocked-out gene. When these chimera mice are crossbred with others of the wild type, some of their offspring will have one copy of the knocked-out gene in all their cells. These mice do not retain any grey mouse DNA and are not chimeras, however they are still heterozygous.
  6. When these heterozygous offspring are interbred, some of their offspring will inherit the knocked-out gene from both parents they carry no functional copy of the original unaltered gene (i.e. they are homozygous for that allele).

A detailed explanation of how knockout (KO) mice are created is located at the website of the Nobel Prize in Physiology or Medicine 2007. [4]

The National Institutes of Health discusses some important limitations of this technique. [5]

While knockout mouse technology represents a valuable research tool, some important limitations exist. About 15 percent of gene knockouts are developmentally lethal, which means that the genetically altered embryos cannot grow into adult mice. This problem is often overcome through the use of conditional mutations. The lack of adult mice limits studies to embryonic development and often makes it more difficult to determine a gene's function in relation to human health. In some instances, the gene may serve a different function in adults than in developing embryos.

Knocking out a gene also may fail to produce an observable change in a mouse or may even produce different characteristics from those observed in humans in which the same gene is inactivated. For example, mutations in the p53 gene are associated with more than half of human cancers and often lead to tumours in a particular set of tissues. However, when the p53 gene is knocked out in mice, the animals develop tumours in a different array of tissues.

There is variability in the whole procedure depending largely on the strain from which the stem cells have been derived. Generally cells derived from strain 129 are used. This specific strain is not suitable for many experiments (e.g., behavioural), so it is very common to backcross the offspring to other strains. Some genomic loci have been proven very difficult to knock out. Reasons might be the presence of repetitive sequences, extensive DNA methylation, or heterochromatin. The confounding presence of neighbouring 129 genes on the knockout segment of genetic material has been dubbed the "flanking-gene effect". [6] Methods and guidelines to deal with this problem have been proposed. [7] [8]

Another limitation is that conventional (i.e. non-conditional) knockout mice develop in the absence of the gene being investigated. At times, loss of activity during development may mask the role of the gene in the adult state, especially if the gene is involved in numerous processes spanning development. Conditional/inducible mutation approaches are then required that first allow the mouse to develop and mature normally prior to ablation of the gene of interest.

Another serious limitation is a lack of evolutive adaptations in knockout model that might occur in wild type animals after they naturally mutate. For instance, erythrocyte-specific coexpression of GLUT1 with stomatin constitutes a compensatory mechanism in mammals that are unable to synthesize vitamin C. [9]