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¿Cuáles son algunas de las características generales de la cepa DH5 alfa?


Desafortunadamente, no puedo encontrar algunas fuentes útiles.

Hábleme de algunas características importantes de DH5 alpha.

¿Qué hace que la DH5 alfa sea adecuada para la clonación de genes?


Hay dos fuentes posibles: una es el artículo de Bethesda Research Laboratories (referencia 1), que menciona algunas, la otra es el libro "Clonación de ADN: un enfoque práctico" (consulte la referencia 2)., Que se encuentra aquí en mi estante para libros.

Tomando ambos juntos, la cepa DH5 alfa se deriva de la cepa DH5 con la introducción de algunas características adicionales. El nombre DH son las iniciales de Douglas Hanahan, que desarrolló la cepa. La cepa es fácil de transformar con alta eficiencia.

Las nuevas características de DH5 alfa son las mutaciones recA y endA1:

  • La mutación endA1 inactiva una endonucleasa intracelular que degrada el ADN plasmídico.
  • La mutación recA elimina la recombinación homóloga. Esto reduce la posibilidad de deleciones y multimerización del plásmido.

La cepa DH5 también tiene las siguientes características:

  • La mutación hsdR17 elimina la endonucleasa de restricción del sistema de modificación de restricción EcoKI, por lo que el ADN que carece de metilación EcoKI no se degradará. El ADN preparado a partir de cepas de hsdR que son wt para hsdM se metilará y se puede usar para transformar cepas de E. coli K-12 wt.
  • Δ (lacZ) M15 es el alelo aceptor alfa necesario para el cribado azul-blanco con muchos vectores basados ​​en lacZ.

De especial interés son las referencias 3 y 4, que te brindan todos los detalles que deseas conocer.


Referencias:

  1. Laboratorios de investigación Bethesda. 1986. Huésped BRL pUC: células competentes DH5α de E. coli. Enfoque 8 (2): 9. El artículo está en la página 13 de este documento.
  2. Clonación de ADN: un enfoque práctico. Glover, D. M. (ed.), 1985, vol. 1, pág. 109, IRL Press, McLean, Virginia
  3. Elegir una cepa de E. coli competente
  4. Genotipos de E. coli

Mutaciones: significado, características y detección | Genética

En este artículo discutiremos sobre: ​​- 1. Significado de las mutaciones 2. Características de las mutaciones 3. Clasificación 4. Tipos 5. Agentes 6. Detecciones 7. Método de deficiencia nutricional 8. Mutaciones espontáneas 9. Aplicaciones de mutaciones en la mejora de cultivos.

  1. Significado de las mutaciones
  2. Características de las mutaciones
  3. Clasificación de mutaciones
  4. Tipos de mutaciones
  5. Agentes de mutaciones
  6. Detecciones de mutaciones
  7. Método de mutaciones por deficiencia nutricional
  8. Mutaciones espontáneas
  9. Aplicaciones de mutaciones en la mejora de cultivos

1. Significado de las mutaciones:

La mutación se refiere a un cambio hereditario repentino en el fenotipo de un individuo. En el término molecular, la mutación se define como el cambio permanente y relativamente raro en el número o secuencia de nucleótidos. La mutación fue descubierta por primera vez por Wright en 1791 en un cordero macho que tenía patas cortas.

Más tarde, Hugo de Vries informó de la mutación en 1900 en Oenothera, Morgan (1910) en Drosophila (mutante de ojo blanco) y varios otros en varios organismos. El término mutación fue acuñado por De Vries.

2. Características de las mutaciones:

Las mutaciones tienen varios rasgos característicos.

Algunas de las características importantes de las mutaciones se presentan brevemente a continuación:

I. Naturaleza del cambio:

Las mutaciones son cambios más o menos permanentes y heredables en el fenotipo de un individuo. Tales cambios ocurren debido a la alteración en el número, tipo o secuencia de nucleótidos del material genético, es decir, el ADN en la mayoría de los casos.

Las mutaciones espontáneas ocurren con una frecuencia muy baja. Sin embargo, la tasa de mutación se puede aumentar muchas veces mediante el uso de mutágenos físicos y químicos.

La frecuencia de mutación de un gen se calcula de la siguiente manera:

Frecuencia de mutación genética = M / M + N

donde, M = número de individuos que expresan la mutación de un gen, y

N = número de individuos normales en una población.

iii. Tasa de mutación:

La tasa de mutación varía de un gen a otro. Algunos genes exhiben una alta tasa de mutación que otros. Dichos genes se conocen como genes mutables, por ejemplo, ojo blanco en Drosophila. En algunos genomas, algunos genes aumentan la tasa de mutación natural de otros genes. Estos genes se denominan genes mutantes.

El ejemplo del gen mutador es el gen punteado en el maíz. En algunos casos, algunos genes disminuyen la frecuencia de mutaciones espontáneas de otros genes en el mismo genoma, que se conocen como genes anti-mutadores. Este gen se ha descrito en bacterias y bacteriófagos.

iv. Dirección del cambio:

Las mutaciones generalmente ocurren de alelo dominante a recesivo o de tipo salvaje a alelo mutante. Sin embargo, también se conocen mutaciones inversas, por ejemplo, ala de muesca y ojo de barra en Drosophila.

Las mutaciones son generalmente dañinas para el organismo. En otras palabras, la mayoría de las mutaciones tienen efectos deletéreos. Solo alrededor del 0,1% de las mutaciones inducidas son útiles en la mejora de cultivos. En la mayoría de los casos, los alelos mutantes tienen efectos pleiotrópicos. Las mutaciones dan lugar a múltiples alelos de un gen.

vi. Sitio de mutación:

Muton, que es una subdivisión del gen, es el sitio de la mutación. Un gen promedio contiene de 500 a 1000 sitios mutacionales. Dentro de un gen, algunos sitios son altamente mutables que otros. Estos se conocen generalmente como puntos calientes. Las mutaciones pueden ocurrir en cualquier tejido de un organismo, es decir, somático o gamético.

vii. Tipo de evento:

Las mutaciones son eventos aleatorios. Pueden ocurrir en cualquier gen (nuclear o citoplasmático), en cualquier célula (somática o reproductiva) y en cualquier etapa del desarrollo de un individuo.

viii. Reaparición:

El mismo tipo de mutación puede ocurrir repetidamente o una y otra vez en diferentes individuos de la misma población. Por tanto, las mutaciones son de naturaleza recurrente.

3. Clasificación de mutaciones:

Las mutaciones se pueden clasificar de varias formas. Una breve clasificación de mutaciones sobre la base de:

(7) La visibilidad se presenta en la Tabla 14.1.

4. Tipos de mutantes:

El producto de una mutación se conoce como mutante. Puede ser un genotipo o un individuo o una célula o un polipéptido.

Hay cuatro clases principales de mutantes identificables, a saber:

Estos se describen brevemente a continuación:

I. Morfológico:

Los mutantes morfológicos se refieren al cambio de forma, es decir, forma, tamaño y color. Las esporas albinas en Neurospora, las alas rizadas en Drosophila, los guisantes enanos, las ovejas de patas cortas son algunos ejemplos de mutantes morfológicos.

En esta clase, el nuevo alelo se reconoce por su efecto mortal o letal en el organismo. Cuando el alelo mutante es letal, todos los individuos que portan dicho alelo morirán, pero cuando es semiletal o subvital, algunos de los individuos sobrevivirán.

iii. Letal condicional:

Algunos alelos producen un fenotipo mutante en condiciones ambientales específicas. Estos mutantes se denominan mutantes restrictivos. En otras condiciones, producen un fenotipo normal y se denominan permisivos. Dichos mutantes pueden cultivarse en condiciones permisivas y luego cambiarse a condiciones restrictivas para su evaluación.

iv. Mutante bioquímico:

Algunos mutantes se identifican por la pérdida de una función bioquímica de la célula. La célula puede asumir una función normal si el medio se complementa con los nutrientes adecuados. Por ejemplo, los auxótrofos de adenina se pueden cultivar solo si se suministra adenina, mientras que el tipo salvaje no requiere suplemento de adenina.

Los mutágenos se refieren a agentes físicos o químicos que aumentan en gran medida la frecuencia de mutaciones. Varias radiaciones y productos químicos se utilizan como mutágenos. Las radiaciones están sometidas a mutágenos físicos. A continuación se presenta una breve descripción de varios mutágenos físicos y químicos:

Mutágenos físicos:

Los mutágenos físicos incluyen varios tipos de radiaciones, a saber. Rayos X, rayos gamma, partículas alfa, partículas beta, neutrones rápidos y térmicos (lentos) y rayos ultravioleta (Tabla 14.2).

A continuación se presenta una breve descripción de estos mutágenos:

Los rayos X fueron descubiertos por primera vez por Roentgen en 1895. Las longitudes de onda de los rayos X varían de 10 -11 a 10 -7. Son escasamente ionizantes y muy penetrantes. Se generan en máquinas de rayos X. Los rayos X pueden romper cromosomas y producir todo tipo de mutaciones en nucleótidos, es decir, adición, deleción, inversión, transposición, transiciones y transversiones.

Estos cambios se manifiestan agregando oxígeno a la desoxirribosa, eliminando el grupo amino o hidroxilo y formando peróxidos. Muller utilizó por primera vez los rayos X en 1927 para la inducción de mutaciones en Drosophila.

En las plantas, Stadler en 1928 utilizó por primera vez rayos X para la inducción de mutaciones en la cebada. Ahora, los rayos X se utilizan comúnmente para la inducción de mutaciones en varias plantas de cultivo. Los rayos X inducen mutaciones al formar radicales libres e iones.

Los rayos gamma son idénticos a los rayos X en la mayoría de las propiedades físicas y efectos biológicos. Pero los rayos gamma tienen una longitud de onda más corta que los rayos X y son más penetrantes que los rayos X. Se generan a partir de la desintegración radiactiva de algunos elementos como 14C, 60C, radio, etc.

De estos, el cobalto 60 se usa comúnmente para la producción de rayos gamma. Los rayos gamma causan mutaciones cromosómicas y genéticas como los rayos X al expulsar electrones de los átomos de los tejidos a través de los cuales pasan. Hoy en día, los rayos gamma también se utilizan ampliamente para la inducción de mutaciones en varias plantas de cultivo.

iii. Partículas Alfa:

Los rayos alfa están compuestos de partículas alfa. Están formados por dos protones y dos neutrones y, por tanto, tienen doble carga positiva. Son densamente ionizantes, pero menos penetrantes que los rayos beta y los neutrones. Las partículas alfa son emitidas por los isótopos de elementos más pesados.

Tienen carga positiva y, por lo tanto, se ralentizan por la carga negativa de los tejidos, lo que da como resultado un bajo poder de penetración. Las partículas alfa conducen tanto a la ionización como a la excitación, lo que resulta en mutaciones cromosómicas.

iv. Partículas Beta:

Los rayos beta están compuestos de partículas beta. Son escasamente ionizantes pero más penetrantes que los rayos alfa. Las partículas beta se generan a partir de la desintegración radiactiva de elementos más pesados ​​como 3H, 32P, 35S, etc. Están cargadas negativamente, por lo que su acción se reduce por la carga positiva de los tejidos. Las partículas beta también actúan por ionización y excitación como partículas alfa y dan como resultado mutaciones cromosómicas y genéticas.

v. Neutrones rápidos y térmicos:

Se trata de partículas densamente ionizantes y altamente penetrantes. Dado que son partículas eléctricamente neutras, su acción no se ralentiza por las partículas cargadas (negativas o positivas) de los tejidos. Se generan a partir de la desintegración radiactiva de elementos más pesados ​​en reactores atómicos o ciclotrones. Debido a su alta velocidad, estas partículas se denominan neutrones rápidos.

Su velocidad puede reducirse mediante el uso de grafito o agua pesada para producir neutrones lentos o neutrones térmicos. Los neutrones rápidos y térmicos dan como resultado tanto la rotura cromosómica como la mutación genética. Dado que son partículas pesadas, se mueven en línea recta. Los neutrones rápidos y térmicos se utilizan eficazmente para la inducción de mutaciones, especialmente en especies de cultivos que se reproducen asexualmente.

vi. Rayos ultravioleta:

Los rayos ultravioleta son radiaciones no ionizantes, que se producen a partir de tubos o lámparas de vapor de mercurio. También están presentes en la radiación solar. Los rayos ultravioleta pueden penetrar una o dos capas de células. Debido a su baja capacidad de penetración, se utilizan comúnmente para la radiación de microorganismos como bacterias y virus.

En organismos superiores, su uso generalmente se limita a la irradiación de polen en plantas y huevos en Drosophila. Los rayos UV también pueden romper los cromosomas. Tienen dos efectos químicos principales sobre las pirimidinas.

El primer efecto es la adición de una molécula de agua que debilita la unión de H con su complemento de purina y permite la separación localizada de las cadenas de ADN. El segundo efecto es unir pirimidinas para producir un dímero de pirimidina.

Esta dimerización puede producir TT, CC, UU y dímeros de pirimidina mixtos como CT. La dimerización interfiere con la síntesis de ADN y ARN. Los dímeros entre cadenas reticulan las cadenas de ácidos nucleicos, lo que inhibe la separación y distribución de las cadenas.

Mutágenos químicos:

Existe una larga lista de sustancias químicas que se utilizan como mutágenos. El tratamiento detallado de dichos productos químicos está más allá del alcance de esta discusión.

Los mutágenos químicos se pueden dividir en cuatro grupos, a saber:

A continuación se presenta una breve descripción de algunas sustancias químicas de estos grupos de uso común.

una. Agentes alquilantes:

Este es el grupo de mutágenos más poderoso. Inducen mutaciones, especialmente transiciones y transversiones, al agregar un grupo alquilo (etilo o metilo) en varias posiciones del ADN. La alquilación produce mutaciones al cambiar los enlaces de hidrógeno de varias formas.

Los agentes alquilantes incluyen metanosulfonato de etilo (EMS), metanosulfonato de metilo (MMS), etileniminas (EI), mostaza azufrada, mostaza nitrogenada, etc.

De estos, los tres primeros son de uso común. Dado que el efecto de los agentes alquilantes se asemeja al de las radiaciones ionizantes, también se conocen como productos químicos radiomiméticos. Los agentes alquilantes pueden causar diversas deformaciones grandes y pequeñas de la estructura de la base que dan como resultado transiciones y transversiones de pares de bases.

Las transversiones pueden ocurrir porque una purina se ha reducido tanto de tamaño que puede aceptar otra purina como complemento, o porque una pirimidina ha aumentado tanto de tamaño que puede aceptar otra pirimidina como complemento. En ambos casos, el diámetro del par de bases mutante es cercano al de un par de bases normal.

B. Análogos de base:

Los análogos de bases se refieren a compuestos químicos que son muy similares a las bases de ADN. A veces, estos productos químicos se incorporan al ADN en lugar de la base normal durante la replicación. Por lo tanto, pueden causar mutaciones por un emparejamiento de bases incorrecto. Un emparejamiento de bases incorrecto da como resultado transiciones o transversiones después de la replicación del ADN. Los análogos de bases más comúnmente utilizados son 5 bromo uracilo (5BU) y 2 amino purina (2AP).

5 el bromo uracilo es similar a la timina, pero tiene bromo en la posición C5, mientras que la timina tiene CH3 grupo en la posición C5. La presencia de bromo en 5BU mejora su cambio tautomérico de la forma cetogénica a la forma enólica. La forma ceto es una forma habitual y más estable, mientras que la forma enol es una forma rara y menos estable o de corta duración. El cambio tautomérico tiene lugar en las cuatro bases de ADN, pero con una frecuencia muy baja.

El cambio o desplazamiento de átomos de hidrógeno de una posición a otra en una base purina o pirimidina se conoce como desplazamiento tautomérico y dicho proceso se conoce como tautomerización.

La base que se produce como resultado de la tautomerización se conoce como forma tautomérica o tautómero. Como resultado de la tautomerización, el grupo amino (-NH2) de citosina y adenina se convierte en grupo imino (-NH). De manera similar, el grupo ceto (C = 0) de timina y guanina se cambia a grupo enol (-OH).

5BU es similar a la timina, por lo tanto, se empareja con la adenina (en lugar de la timina). Un tautómero de 5BU se emparejará con guanina en lugar de con adenina. Dado que la forma tautomérica es de corta duración, cambiará a la forma ceto en el momento de la replicación del ADN, que se emparejará con la adenina en lugar de la guanina.

De esta manera, da como resultado transiciones AT GC y GC - & gt AT. El mutágeno 2AP actúa de forma similar y provoca transiciones AT & lt- & gt GC. Este es un análogo de la adenina.

C. Tintes de acridina:

Los tintes de acridina son mutágenos muy eficaces. Los tintes de acridina incluyen, pro-flavina, naranja de acridina, amarillo de acridina, acriflavina y bromuro de etidio. De estos, la pro-flavina y la acriflavina son de uso común para la inducción de mutaciones. Los tintes de acridina se insertan entre dos pares de bases de ADN y dan lugar a la adición o eliminación de uno o pocos pares de bases cuando el ADN se replica (Fig. 14.1).

Por lo tanto, causan mutaciones de cambio de marco y, por esta razón, los tintes de acridina también se conocen como mutágenos de cambio de marco. La proflavina se usa generalmente para la inducción de mutaciones en bacteriófagos y acriflavina en bacterias y organismos superiores.

D. Otros mutágenos:

Otros mutágenos químicos importantes son el ácido nitroso y la hidroxiamina. Su papel en la inducción de mutaciones se describe brevemente aquí. El ácido nitroso es un poderoso mutágeno que reacciona con los grupos amino C6 de la citosina y la adenina. Reemplaza el grupo amino con oxígeno (+ a & # 8211 enlace H). Como resultado, la citosina actúa como timina y la adenina como guanina.

Por tanto, se inducen las transversiones de GC - & gt AT y AT - & gt GC. La hidroxilamina es un mutágeno muy útil porque parece ser muy específico y produce solo un tipo de cambio, a saber, la transición GC - & gt AT. Todos los mutágenos químicos, excepto los análogos de bases, se conocen como modificadores del ADN.

6. Detección de mutaciones:

La detección de mutaciones depende de sus tipos. Las mutaciones morfológicas se detectan por cambio en el fenotipo de un individuo o por cambio en la proporción de segregación en un cruce entre individuos normales (con marcador) e irradiados. Las mutaciones moleculares se detectan mediante un cambio en el nucleótido, y una mutación bioquímica puede detectarse mediante la alteración de una reacción bioquímica.

Los métodos de detección de mutantes morfológicos se han desarrollado principalmente con Drosophila. Cuatro métodos, a saber, (1) método CIB, (2) método Muller & # 8217s 5, (3) método del cromosoma X adjunto y (4) método de ciruela del lóbulo rizado son de uso común para la detección de mutaciones en Drosophila.

A continuación se presenta una breve descripción de cada método:

Este método fue desarrollado por Muller para la detección de mutaciones letales recesivas ligadas al sexo inducidas en machos de Drosophila. En esta técnica, C representa una inversión paracéntrica en gran parte del cromosoma X que suprime el cruce en la porción invertida. El yo es un letal recesivo. Las hembras con gen letal pueden sobrevivir solo en condición heterocigótica.

La B significa ojo de barra que actúa como marcador y ayuda en la identificación de moscas. I y B se heredan juntos porque C no permite que ocurra un cruce entre ellos. Los machos con cromosoma CIB no sobreviven debido al efecto letal.

Los pasos importantes de este método son los siguientes:

(a) Se realiza un cruce entre la hembra CIB y el macho tratado con mutágeno. En F1 la mitad de los machos que tienen un cromosoma X normal sobrevivirán y los que porten el cromosoma CIB morirán. Entre las mujeres, la mitad tiene el cromosoma CIB y la mitad el cromosoma normal (fig. 14.2). De F1, las hembras con el cromosoma CIB y los machos con el cromosoma normal se seleccionan para seguir cruzando.

(b) Ahora se hace un cruce entre la hembra CIB y el macho normal. Esta vez, la hembra CIB tiene un cromosoma CIB y un cromosoma tratado con mutágeno recibido del macho en el cruce anterior.

Esto producirá dos tipos de hembras, a saber, la mitad con el cromosoma CIB y la mitad con el cromosoma tratado con mutágeno (con fenotipo normal). Ambos descendientes sobrevivirán. En el caso de los hombres, la mitad con CIB morirá y la otra mitad tendrá un cromosoma tratado con mutágeno.

Si se indujo una mutación letal en el cromosoma X tratado con mutágeno, la mitad restante de los machos también morirá, lo que dará como resultado la ausencia de progenie masculina en el cruce anterior. Ausencia de progenie masculina en F2 confirma la inducción de una mutación letal recesiva ligada al sexo en el macho de Drosophila tratado con mutágeno.

ii. Método Muller 5:

Este método también fue desarrollado por Muller para detectar mutaciones ligadas al sexo en Drosophila. Este método es una versión mejorada del método CIB. Este método se diferencia del método CIB en dos aspectos importantes. Primero, este método utiliza el gen recesivo del albaricoque en lugar del letal recesivo en el método CIB. En segundo lugar, la hembra es homocigótica para los genes de bar albaricoque, mientras que es heterocigótica para los genes IB en el método CIB.

En este método, la mutación se detecta por la ausencia de machos salvajes en F2 progenie. Este método consiste en seguir pasos importantes (Fig. 14.3).

una. Una hembra de albaricoque en barra homocigótica se cruza con un macho tratado con mutágeno. En F1 obtenemos dos tipos de progenie, a saber, hembras barra heterocigóticas y machos barra albaricoque (Muller).

B. Estos F1 están inter-apareados. Esto produce cuatro tipos de individuos. La mitad de las hembras son albaricoque de barra homocigotas y la otra mitad son heterocigotas de barra. Entre los machos, la mitad son albaricoque en barra (Muller 5) y la mitad debería ser normal. Si se induce una mutación letal, el macho normal estará ausente en la progenie.

iii. Método X adjunto:

Este método se utiliza para detectar mutaciones visibles ligadas al sexo en Drosophila. En este método, se utiliza una hembra en la que dos cromosomas X se unen o se unen para estudiar la mutación (fig. 14.4). Por lo tanto, este método se conoce como método X adjunto. Las hembras X unidas (XXY) se cruzan con machos tratados con mutágeno. Este cruce da lugar a super hembras (XX-X), hembra adjunta (XXY), macho mutante (XY) e YY.

Los individuos YY mueren y la súper hembra también suele morir. El macho superviviente ha recibido el cromosoma X del macho tratado con mutágeno y el cromosoma Y de la hembra X adjunta. Dado que el cromosoma Y no tiene el alelo correspondiente del cromosoma X, incluso la mutación recesiva se expresará en dicho macho, lo que puede detectarse fácilmente.

iv. Método de lóbulo rizado-ciruela:

Este método se utiliza para la detección de mutaciones en autosomas. En este método, rizado se refiere a alas rizadas, lóbulo a ojo lobulado y ciruela a ciruela u ojo marrón. Todos estos tres genes son letales recesivos. Los genes rizado (CY) y lobulado (L) se encuentran en un cromosoma y ciruela (Pm) en otro cromosoma homólogo.

El cruce entre estos cromosomas no puede ocurrir debido a la presencia de inversión. Además, los individuos homocigotos para CYL o Pm no pueden sobrevivir debido al efecto letal. Solo los heterocigotos sobreviven. Por lo tanto, este sistema también se conoce como sistema letal equilibrado. Este método consta de los siguientes pasos (Fig. 14.5).

una. Se realiza un cruce entre la hembra de ciruela de lóbulo rizado (CYL / Pm) y el macho tratado con mutágeno. Esto produce un 50% de progenie como lóbulo rizado y un 50% como ciruela.

B. En la segunda generación se realiza un cruce entre el lóbulo rizado femenino y el lóbulo rizado macho ciruela. Esto dará lugar a individuos de ciruela de lóbulo rizado, lóbulo rizado y ciruela en una proporción de 1: 1: 1 y los rizos homocigotos morirán debido al efecto letal. A partir de esta progenie, se seleccionan hembras y machos de lóbulos rizados para un posterior apareamiento.

C. En la tercera generación, se realiza un cruce entre la hembra del lóbulo rizado que porta un autosoma tratado con mutágeno y el macho del lóbulo rizado que también porta un autosoma tratado. Esto da como resultado la producción de un 50% de progenie como lóbulo rizado, un 25% de lóbulo rizado homocigótico que muere y un 25% de progenie homocigótica para los autosomas tratados.

Esto se expresará como una mutación autosómica recesiva y constituirá un tercio de la progenie superviviente. En la Tabla 14.4 se muestra una comparación de diferentes métodos de detección de mutaciones en Drosophila.

Detección de mutaciones en plantas:

Como se indicó anteriormente, las técnicas de detección de mutaciones inducidas se han desarrollado principalmente en Drosophila. En las plantas, estas técnicas no se han desarrollado adecuadamente. En las plantas, se utilizan dos métodos para la detección de mutaciones dependiendo de la visibilidad de las mutaciones.

Estos métodos se describen brevemente a continuación:

I. Detección de mutaciones visibles:

Las mutaciones visibles generalmente ocurren en caracteres cualitativos u oligogénicos. Estas mutaciones se detectan sobre la base de un fenotipo alterado.

Esta técnica consta de los siguientes pasos:

una. Las semillas se tratan con un mutágeno. Para ello se utiliza una variedad o cepa mejorada.

B. Las semillas tratadas se cultivan en el campo experimental. Estas plantas se conocen como M1 plantas o M1 Generacion. Estos M1 las plantas se autofecundan para evitar el cruzamiento. Las semillas obtenidas de M1 las plantas representan M2 generación de semilla.

C. Las semillas obtenidas de M1 las plantas se cultivan para obtener M2 plantas. Debería criarse una población suficientemente grande en M2 generación para obtener fenotipos mutantes que generalmente ocurren con una frecuencia baja.

D. Se realiza una búsqueda para identificar o detectar plantas que difieran de la variedad parental. Estas plantas están aisladas y se estima su frecuencia. Estas mutaciones se denominan macromutaciones.

En el maíz, se utiliza un procedimiento diferente para la detección de mutaciones visibles. En el maíz, algunas cepas son homocigotas para varios genes recesivos y otras cepas son homocigotas para varios genes dominantes. Las semillas de líneas dominantes homocigotas se tratan con un mutágeno y M1 se crían plantas. Estos M1 las plantas se cruzan con cepas homocigóticas recesivas.

Las plantas tratadas con mutágeno se utilizan como hembras debido a la presencia de cierto grado de esterilidad masculina en estas plantas como consecuencia del efecto mutagénico. La F1 se hace crecer la progenie de dicho cruce y se realiza una búsqueda para detectar plantas con fenotipo recesivo para un gen específico. La presencia de plantas con fenotipo recesivo para un gen confirma la inducción de la mutación.

ii. Detección de mutación invisible:

Las mutaciones invisibles generalmente ocurren en caracteres cuantitativos o poligénicos como el rendimiento y el contenido de proteínas. La detección de tales mutaciones requiere una medición cuantitativa de tales caracteres. Para los rendimientos, la variedad tratada y no tratada con mutágeno se cultiva en ensayos repetidos.

Si el rendimiento de los tratamientos tratados y no tratados difiere significativamente, está indicada la presencia de mutación. De manera similar, si el contenido de proteína del material tratado difiere significativamente de la variedad parental, indica que se ha producido una mutación. Estas mutaciones se denominan micro-mutaciones.

7. Método de mutaciones por deficiencia nutricional:

Este método de detección de mutaciones inducidas se utiliza en microorganismos como Neurospora. La cepa normal se trata con un mutágeno y luego se cultiva en medio mínimo. Un medio mínimo contiene azúcar, sal, ácidos inorgánicos, nitrógeno y vitamina biotina. La cepa normal de Neurospora crece bien en el medio mínimo, pero un mutante bioquímico no crece en dicho medio.

Esto confirma la inducción de mutación. Luego se complementa el medio mínimo con ciertas vitaminas o aminoácidos, uno por uno y se observa el crecimiento. El medio que da como resultado el crecimiento normal del moho tratado con mutágeno indica que el mutante carece de síntesis de esa vitamina o aminoácido particular, cuya adición al medio de cultivo mínimo ha dado como resultado un crecimiento normal de la cepa tratada.

8. Mutaciones espontáneas:

Las mutaciones que ocurren naturalmente se conocen como mutaciones espontáneas. Tales mutaciones son inducidas por mutágenos químicos o radiaciones que están presentes en el ambiente externo al que está expuesto un organismo. La temperatura también afecta la frecuencia de mutaciones espontáneas. Un aumento de 10 ° C en la temperatura conduce a un aumento de cinco veces en la tasa de mutación en un organismo expuesto a tal variación de temperatura.

El cambio drástico de temperatura en cualquier dirección produce un efecto aún mayor en la frecuencia de mutación. Las condiciones ambientales externas de cualquier tipo, es decir, extremadamente altas o bajas, conducen a un aumento en la frecuencia de mutación.

El entorno interno de un organismo también juega un papel importante en la inducción de mutaciones espontáneas. Por ejemplo, los reordenamientos espontáneos de las bases de ADN dan como resultado transiciones de pares de bases. De manera similar, los errores en la reparación o replicación del ADN pueden causar mutaciones espontáneas.

9. Aplicaciones de mutaciones en el mejoramiento de cultivos:

Las mutaciones inducidas son útiles en la mejora de cultivos de cinco formas principales, a saber:

(1) Desarrollo de variedades mejoradas,

(2) Inducción de la esterilidad masculina,

(4) Creación de variabilidad genética y

(5) Superar la autoincompatibilidad.

Estos se analizan brevemente a continuación:

I. Desarrollo de variedades mejoradas:

Se han desarrollado más de 2000 variedades mejoradas (algunas directamente y otras mediante el uso de mutantes en la hibridación) mediante mutaciones inducidas en varios cultivos de todo el mundo.

En la India, las mutaciones inducidas han sido fundamentales en el desarrollo de variedades mejoradas de trigo (NP 836, Sarbati Sonor & # 8217a, Pusa Lerma), cebada (RDB 1), arroz (Jagannath, IIT 48, NT 60), tomate, ricino (Aruna). , Sobhagya), algodón (MCU 7, MCU 10, Indore 2), maní (TGI), caña de azúcar (Co 8152, 8153) y varios otros cultivos.

Además de alto rendimiento, se han desarrollado variedades con mejor calidad, precocidad, enanismo, resistencia a enfermedades y bajo contenido de toxinas en varios cultivos.

Se ha logrado una mejora en la calidad del contenido de proteínas en el trigo y el arroz, el contenido de aceite en la mostaza y el contenido de azúcar en la caña de azúcar. La precocidad se ha conseguido en ricino (de 270 días a 140 días), arroz y soja. Las variedades enanas se han desarrollado mediante el uso de padres mutantes en el trigo, el arroz, el sorgo y el mijo perla.

Se ha inducido resistencia a enfermedades en la avena al tizón Victoria y la roya de la corona en el trigo para la roya en la cebada para el mildiú en el maní para la mancha foliar y la roya del tallo en la caña de azúcar para la pudrición roja en la manzana para el mildiú, etc. Se han desarrollado variedades con bajo contenido de toxinas en colza y mostaza para ácido erúsico y en Lathyrus sativa para contenido de neurotoxinas.

ii. Inducción de la esterilidad masculina:

Las mutaciones inducidas han sido útiles en la inducción de esterilidad masculina en algunas plantas de cultivo. La esterilidad masculina genética se ha inducido en el trigo duro mediante radiaciones. Se han inducido mutantes de CMS en cebada, remolacha, mijo perla y algodón. El uso de líneas GMS y CMS ayuda a reducir el costo de producción de semillas híbridas.

iii. Producción de haploides:

El uso de pólenes irradiados con rayos X ha contribuido a la producción de haploides en muchos cultivos. La duplicación cromosómica de estos haploides da como resultado el desarrollo de líneas endogámicas que pueden utilizarse en el desarrollo de híbridos comerciales.

iv. Creación de variabilidad genética:

Las mutaciones inducidas son muy efectivas para crear variabilidad genética para varios caracteres económicos en plantas de cultivo. Se han utilizado mutaciones inducidas para aumentar el rango de variabilidad genética en cebada, avena, trigo y muchos otros cultivos. En cultivos de propagación asexual como la caña de azúcar y la papa, las mutaciones somáticas pueden ser útiles, porque la planta mutante puede multiplicarse como un clon.

v. Superar Autoincompatibilidad:

La mutación del gen S por irradiación ofrece una solución a la producción de plantas autofértiles en especies autoincompatibles. Esto ha tenido éxito en el caso de Prunusovium. Además de esta aplicación práctica en la mejora de cultivos, las mutaciones inducidas son de fundamental interés en los estudios genéticos.

Las mutaciones inducidas también tienen algunas limitaciones. La mayoría de las mutaciones son perjudiciales e indeseables. La identificación de micro-mutaciones, que son más útiles para un fitomejorador, suele ser muy difícil. Dado que las mutaciones se producen con una frecuencia muy baja, se debe cribar una población de plantas muy grande para identificar y aislar mutantes deseables.


Instalación básica de expresión y purificación de proteínas

La transformación es el proceso de obtener el vector recombinante de una mezcla de reacción o solución de vector en E. coli células. Para permitir que las células absorban el ADN del vector circular, deben ser competentes. El método para la preparación de células competentes depende del método de transformación utilizado y la eficiencia de transformación requerida.

  • Para una alta eficiencia de transformación, utilizamos celdas competentes para electroporación y electroporación. Aquí hay un protocolo para preparar electrocompetentes. E. coli.
  • Si una eficiencia más baja es suficiente, usamos transformación por choque térmico y células químicamente competentes. Aquí hay un protocolo para preparar el choque térmico competente. E. coli
  • .

La elección del E. coli La cepa del huésped depende del objetivo de la transformación.

  • La transformación de una mezcla de ligación debe realizarse en una cepa de recA-clonación, como DH5a, NovaBlue o XL1-Blue. Utilice siempre un control negativo con solo ADN vector.
  • Dependiendo del origen de los no recombinantes (de una mezcla de ligación que contiene solo vector digerido), se deben seleccionar varios transformantes (3-12) y verificar la presencia del inserto correcto mediante análisis de restricción o PCR de colonias.

Nota: Recomendamos la prueba de PCR de colonias antes de las minipreparaciones de ADN, ya que puede obtener el resultado de clones positivos mientras se incuban los cultivos inoculados con las mismas colonias. Preparas ADN solo de
1-2 de los clones positivos para PCR en lugar de prepararlos a partir de todas las colonias inoculadas y utilizar la digestión de restricción para la prueba. Le ahorrará tiempo y dinero para las columnas de enzimas de restricción y Miniprep, además, puede cribar más colonias en paralelo.
(Si su PCR no funciona por alguna razón, al menos todavía tiene sus colonias creciendo, por lo tanto, no pierde nada mientras espera que crezcan).


Sistema de liberación de TEV Ag43

El sistema de liberación PRISMO funciona utilizando el autotransportador Ag43 y la proteasa TEV. Los péptidos de SCI traducidos se dirigen hacia la membrana periplásmica a través de la secuencia señal pelB. Los péptidos SCI se fusionan con un sitio de corte de proteasa TEV y se muestran en la superficie de la célula a través de autotransportadores Ag43 de forma continua (con un promotor constitutivo). Junto con los análogos de SCI, las proteasas TEV también se muestran en la superficie de la célula cuando se inducen con arabinosa, nuevamente a través del autotransportador Ag43. Debido al modelo de mosaico fluido de la membrana celular, estos autotransportadores se mueven y chocan entre sí en la membrana celular. Si estas colisiones están en la posición y el ángulo correctos, las proteasas de TEV escinden los análogos de SCI del autotransportador en el sitio de la proteasa de TEV fusionada y los liberan en el medio. Para probar el sistema de liberación, creamos una construcción que tiene sfGFP en lugar del SCI. A continuación, pudimos cuantificar la liberación de proteínas mediante un espectrofotómetro M5 [6]. [6].


Discusión

El alto impacto de un evento de enfermedad animal asociado con la liberación accidental de virus de enfermedad animal de alta consecuencia requiere la precaución de tener procedimientos para asegurar la inactivación completa de los virus y genomas virales + ssRNA. En los estudios presentados aquí, se demostró que hervir solo durante cinco minutos inactiva el virus de la peste equina africana, el virus de la peste porcina africana, el virus de la fiebre aftosa, el virus de la enfermedad de la piel grumosa, el parvovirus porcino, el virus de la enfermedad vesicular porcina, el exantema vesicular del cerdo virus, virus de la peste porcina clásica y virus de la estomatitis vesicular (Tablas 4 y 5), y las muestras alcalinas y tratadas con calor enriquecidas con el virus de la fiebre aftosa y el virus de la peste porcina clásica también demostraron pérdida de la infectividad del virus in vitro (Tabla 4). El procedimiento presentado se basa no solo en condiciones alcalinas calientes (NaOH 0,25 N y 65 ° C durante 1 h) para la degradación de todo el ARN, presumiblemente para liberar ribonucleótidos con 5'-hidroxilos y 3'-fosfatos, sino también en el paso adicional de ebullición a 100 ° C durante 10 min después de que el pH se ha neutralizado entre pH 7 y 8. Dado que es probable que incluso unas pocas rupturas en el ARN genómico viral eviten la reconstitución del virus infeccioso, el estándar de pérdida completa de SCR detectable por rRT-PCR puede parecer una evaluación demasiado estricta para la verificación del procedimiento de tratamiento de seguridad del ADN. Es cierto que el riesgo de infección animal o reconstitución accidental y liberación de un virus a partir de contaminantes de ARN de ADN purificado es extremadamente bajo. Los ejemplos publicados de virus + ssRNA reconstituidos en animales son pocos y normalmente implican la inyección directa de ARN viral transcrito in vitro muy purificado y abundante dentro de un medio de transfección celular como la lipofectamina [19, 20]. In vitro, también utilizando métodos de transfección celular, la recuperación de virus a partir de ARN es más común, aunque el ARN debe ser de alta calidad, presumiblemente con pocas o ninguna ruptura dentro de los elementos reguladores o codificadores de proteínas [19, 21, 22]. Se espera que la estricta medida de degradación del ARN empleada en este documento añada confianza en la seguridad del ADN exportado de laboratorios que trabajan con virus de enfermedades animales altamente infecciosas de impacto económico nacional e internacional, como el virus de la fiebre aftosa.

También se espera que el procedimiento de tratamiento alcalino y térmico mejore la calidad del ADN en comparación con otros métodos de tratamiento de seguridad del ADN, como el tratamiento con ARNasa A [23]. En este sentido, se espera que el NaOH y el tratamiento térmico proporcionen una degradación más eficaz de ARN encapsulado en proteínas y / o lípidos, así como ARN dentro de un dúplex ARN: ARN o ARN: ADN. De hecho, se ha descubierto que tratamientos similares con NaOH y calor son eficaces para eliminar el ARN de las preparaciones de ADNc utilizadas en los análisis de transcriptomas mediante RT-PCR cuantitativa o micromatrices [10, 11].


Mario Alberto Flores-Valdez & middot 30 de junio de 2017 & editor académico middot

Solo le animo a que lea los comentarios del revisor 2 y edite más su manuscrito para abordar esos comentarios (lo que se puede hacer mientras está en producción).

Revisor 1 y middot 29 de junio de 2017

Informes básicos

Se realizaron mejoras sustanciales al nuevo manuscrito.

Diseño experimental

Los autores implementaron mejoras sustanciales en las secciones de métodos.

Validez de los hallazgos

Con las modificaciones sustanciales, el manuscrito ya está listo para ser aceptado.

Comentarios para el autor

Con los cambios sugeridos e implementados se mejoró el manuscrito.

Revisor 2 y middot 22 de junio de 2017

Informes básicos

El manuscrito de Zhaohui Wei et al informa sobre una nueva cepa de Streptomyces flavogriseus. El hecho de que esta cepa sea capaz de producir tanto actinomicina D como holomicina la hace única entre las cepas de S. flavogriseus conocidas hasta ahora. Además, la cantidad de actinomicina D producida por esta cepa la convierte en un buen candidato para una futura producción del fármaco.
Los datos que se muestran en el documento son consistentes y respaldan las conclusiones. La estructura del artículo es correcta.
Con las modificaciones agregadas, creo que el artículo es adecuado para su publicación.
Solo tengo comentarios menores:
- Abstracto:
* Movería la oración en la línea 10 "El antimicrobiano ... método de difusión" antes de "Holomicina exhibida ..." en la línea 14
* Movería "La viabilidad celular ... ensayo MTT" de la línea 12 a la línea 16 antes de "Holomicina exhibió ... células de carcinoma"

- Materiales y métodos:
* línea 66: "... fue suspendido" debe decir "fue suspendido"
* Tengo algunas inquietudes acerca de la bibliografía introducida. Por ejemplo: la referencia de las células HepG2 debería ser Knowles et al., 1980 en lugar de un artículo publicado el año pasado. Este es solo un ejemplo, pero me temo que hay algunas referencias más recientemente introducidas. Lo mismo para DH5alpha, etc ...

-Resultados:
* Línea 189: “… en tres extractos crudos…”. Por favor, mencione el nombre de los 3 medios.
* Ensayo de actividad antimicrobiana: Los autores deben afirmar que la actinomicina D purificada se comporta como la comercial en términos de actividad antimicrobiana. Esto fortalecería sus resultados.
* Se debe agregar el material y métodos de las nuevas figuras complementarias.

Diseño experimental

Validez de los hallazgos

Los autores han abordado correctamente todas las preguntas que tenía el revisor.

Comentarios para el autor

El estudio es interesante y proporciona información útil. Creo que el manuscrito ha mejorado considerablemente.


General

Caracteristicas

Manejo de la información

  1. Revise todos los contenedores en busca de fugas o roturas.
  2. Retire las células congeladas del empaque de hielo seco y colóquelas inmediatamente a una temperatura por debajo de -130 ° C, preferiblemente en vapor de nitrógeno líquido, hasta que estén listas para su uso.
  • Suero bovino fetal al 10% (FBS ATCC 30-2020)
  • 10 y microg / ml de insulina
  • 5,5 y microg / ml de transferrina
  • 5 ng / ml de selenio
  • 40 ng / ml dexametasona

Este medio está formulado para usarse con un 5% de CO2 en atmósfera de aire. Temperatura

Procedimiento de manipulación Para asegurar el nivel más alto de viabilidad, descongele el vial e inicie el cultivo tan pronto como sea posible al recibirlo. Si a su llegada, es necesario el almacenamiento continuo del cultivo congelado, debe almacenarse en fase de vapor de nitrógeno líquido y no a -70 ° C. El almacenamiento a -70 ° C resultará en una pérdida de viabilidad.

  1. Descongele el vial agitando suavemente en un baño de agua a 37 ° C. Para reducir la posibilidad de contaminación, mantenga la junta tórica y la tapa fuera del agua. La descongelación debe ser rápida (aproximadamente 2 minutos).
  2. Retire el vial del baño de agua tan pronto como se descongele el contenido y descontamine sumergiéndolo o rociándolo con etanol al 70%. Todas las operaciones a partir de este momento deben realizarse en estrictas condiciones de asepsia.
  3. Transfiera el contenido del vial a un tubo de centrífuga que contenga 9,0 ml de medio de cultivo completo y centrifugue a aproximadamente 125 x g durante 5 a 7 minutos.
  4. Resuspenda el sedimento celular con el medio completo recomendado (consulte la información específica del lote para conocer la proporción de dilución recomendada para el cultivo) y dispense en un matraz de cultivo de 25 cm 2 o 75 cm 2. Es importante evitar una alcalinidad excesiva del medio durante la recuperación de las células. Se sugiere que, antes de agregar el contenido del vial, el recipiente de cultivo que contiene el medio de crecimiento completo se coloque en la incubadora durante al menos 15 minutos para permitir que el medio alcance su pH normal (7,0 a 7,6).
  5. Incubar el cultivo a 37 ° C en una incubadora adecuada. Un 5% de CO2 en atmósfera de aire se recomienda si se utiliza el medio descrito en esta hoja de producto.
  1. Retire y deseche el medio de cultivo.
  2. Enjuague brevemente la capa celular con solución de tripsina al 0,25% (p / v) con EDTA 0,53 mM para eliminar todos los rastros de suero que contiene inhibidor de tripsina.
  3. Agregue de 2.0 a 3.0 ml de solución de tripsina-EDTA al matraz y observe las células bajo un microscopio invertido hasta que la capa de células se disperse (generalmente dentro de 5 a 15 minutos).
    Nota: Para evitar la formación de grumos, no agite las células golpeando o agitando el matraz mientras espera que las células se desprendan. Las células que son difíciles de separar se pueden colocar a 37 ° C para facilitar la dispersión.
  4. Agregue de 6.0 a 8.0 ml de medio de crecimiento completo y aspire las células pipeteando suavemente.
  5. Agregue alícuotas apropiadas de la suspensión celular a los nuevos recipientes de cultivo.
  6. Incubar cultivos a 37 ° C.

Especificaciones de control de calidad

Historia

Descargo de responsabilidad legal

El producto se proporciona 'TAL CUAL' y la viabilidad de los productos ATCC & reg está garantizada durante 30 días a partir de la fecha de envío, siempre que el cliente haya almacenado y manipulado el producto de acuerdo con la información incluida en la hoja de información del producto, el sitio web y Certificado de análisis. Para los cultivos vivos, la ATCC enumera la formulación de los medios y los reactivos que se ha encontrado que son efectivos para el producto. Si bien otros medios y reactivos no especificados también pueden producir resultados satisfactorios, un cambio en la ATCC y / o los protocolos recomendados por el depositante pueden afectar la recuperación, el crecimiento y / o la función del producto. Si se utiliza una formulación o un reactivo de medio alternativo, la garantía de viabilidad de la ATCC ya no es válida. Excepto como se establece expresamente en este documento, no se proporcionan otras garantías de ningún tipo, expresas o implícitas, incluidas, entre otras, las garantías implícitas de comerciabilidad, idoneidad para un propósito particular, fabricación de acuerdo con los estándares cGMP, tipicidad, seguridad, precisión. y / o no infracción.

Este producto está diseñado para uso exclusivo en investigación de laboratorio. No está destinado a ningún uso terapéutico animal o humano, ni al consumo humano o animal, ni a ningún uso diagnóstico. Cualquier uso comercial propuesto está prohibido sin una licencia de ATCC.

Si bien ATCC realiza esfuerzos razonables para incluir información precisa y actualizada en esta hoja de producto, ATCC no ofrece garantías ni representaciones en cuanto a su precisión. Las citas de la literatura científica y las patentes se proporcionan solo con fines informativos. ATCC no garantiza que se haya confirmado que dicha información es precisa o completa y el cliente es el único responsable de confirmar la exactitud e integridad de dicha información.

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Preguntas de revisión

¿Qué función realizan la mayoría de las hormonas producidas por la pituitaria anterior?

A. regular el crecimiento
B. regular el ciclo del sueño
C. regular la producción de otras hormonas
D. regular el volumen sanguíneo y la presión arterial

¿Cuál es la función de la hormona eritropoyetina?

A. estimula la producción de glóbulos rojos
B. estimula el crecimiento muscular
C. provoca la respuesta de lucha o huida
D. causa la producción de testosterona

¿Qué glándulas endocrinas están asociadas con los riñones?

A. glándulas tiroides
B. glándulas pituitarias
C. glándulas suprarrenales
D. gónadas


Celda de combustible microbiana miniaturizada (mMFC)

Las pilas de combustible microbianas tradicionales son voluminosas e ineficientes. Son costosos y es menos probable que se utilicen a escala industrial. Somos plenamente conscientes de este problema, por lo que se nos ocurrió la idea de una celda de combustible microbiana miniaturizada (mMFC).

Según nuestra revisión de la literatura, el interés por los diseños de mMFC ha ido en aumento durante las últimas décadas. Se han construido varios modelos y han demostrado ser muy exitosos [1, 2, 3]. Por ejemplo, Shogo Inoue y sus colegas han demostrado que el MFC puede ser tan pequeño como el tamaño de una moneda de un centavo estadounidense (Figura 2) [1]. A pesar de que el volumen de sus MFC es menor que 50 uL, la corriente producida aumenta considerablemente y se registraron hasta 12 mW / 100 〖mm〗 ^ 3 independientemente de las modificaciones tanto en los MFC como en las bacterias. En la Figura 2, se compararon cuatro diseños de MFC que son diferentes por materiales de construcción y volúmenes de cámara [2]. No hay duda de que los mMFC pueden funcionar mejor. Produjeron densidades de energía aproximadamente 300 veces más altas que las de los modelos más grandes.

Recientemente nos encontramos con el equipo de Bielefeld que comparte el mismo interés y pasión por MFC como una fuente potencial de energía verde. Nos ponemos en contacto y sabemos que ellos también trabajan en el complejo mtrCAB, por lo que inmediatamente vemos esto como una oportunidad de colaboración. Les pedimos que nos ayuden a construir el MFC miniaturizado (Figura 3) ya que tienen instalaciones y materiales para la construcción. Les agradecemos su generosidad y les deseamos éxito en su proyecto iGEM.

El MFC que nos han enviado tiene 2 cámaras, que a su vez están divididas por el cátodo y el ánodo. Cada cámara tiene 2,3 cm de largo, 2,3 cm de ancho y 1,5 cm de alto. El volumen de cada cámara es de 7,9 cm3. El volumen de todo el MFC es de 15,8 cm3.

Instrucciones completas de ensamblaje de celdas de combustible microbianas por Bielefeld aquí


La seguridad

Afortunadamente, nuestra universidad nos permitió ingresar al laboratorio este año de junio a octubre a pesar de la pandemia de COVID-19. TU Delft mantuvo un seguimiento activo de las noticias y siguió las instrucciones de las autoridades sanitarias, el Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente (RIVM). Seguimos estas instrucciones cuidadosamente.

  • El equipo siguió estrictas medidas de seguridad para evitar la propagación del virus COVID-19. Estuvimos atentos a mantener la higiene personal lavándonos las manos con frecuencia y de manera adecuada, tosiendo y estornudando en el codo y usando pañuelos de papel.
  • De acuerdo con las pautas del RIVM (Instituto Nacional Holandés de Salud Pública y Medio Ambiente), no íbamos a la universidad si teníamos síntomas relacionados con COVID-19 o si habíamos estado en contacto con alguien que dio positivo en la prueba.
  • La TU Delft ha tomado varias medidas de limpieza adicionales, que incluyen, entre otras, la limpieza frecuente de lugares de trabajo, baños, salas de reuniones y máquinas de café. También nos proporcionaron productos de limpieza como etanol al 70% y gel de manos para que nuestro trabajo sea lo más seguro posible.
  • Para mantener la ocupación de nuestros edificios y laboratorios lo más baja posible, todos los proyectos de los estudiantes se han llevado a cabo fuera del campus. Se nos permitió trabajar en el laboratorio con un máximo de 4 personas, manteniendo una distancia de 1,5 m en todo momento.
  • Durante los meses de verano, se nos permitió usar una gran sala de conferencias como "oficina", aunque trabajar desde casa seguía siendo la norma. A lo largo del proyecto, siempre hicimos un gran esfuerzo por mantener una distancia segura, mientras que al mismo tiempo intentamos hacer nuestro trabajo de la mejor manera posible.

La parte de laboratorio húmedo de nuestro proyecto se realizó en el área ML-1, que se encuentra en el departamento de Bionanociencia de nuestra Facultad de Ciencias Aplicadas en el campus de la Universidad Tecnológica de Delft. Se considera que ML-1 es el nivel de bioseguridad más bajo, correspondiente a BSL-1. Después de pasar las pruebas obligatorias ML1, se nos permitió ingresar y trabajar en dos laboratorios. Trabajamos en un laboratorio ML-1 regular y un laboratorio ML-1 destinado únicamente al trabajo de bacteriófagos (Figura 1).

Antes de comenzar nuestros experimentos, todos los miembros del equipo (laboratorio húmedo) pasaron las pruebas de seguridad obligatorias sobre:

  • Seguridad general de la Facultad de Ciencias Aplicadas
  • Seguridad general del laboratorio
  • Seguridad biológica ML-1
  • Seguridad láser para usuarios de láser

A continuación, puede encontrar un resumen de las reglas que los empleados y estudiantes de la TU Delft deben seguir para garantizar un entorno de trabajo seguro:

  • En caso de emergencia o accidente menor debemos llamar al número de alarma interna. Debemos explicar quiénes somos, dónde estamos y cuál es la emergencia. El centro de emergencia de TU Delft enviará el equipo de respuesta de emergencia interno (Bedrijfshulpverlening, BHV). Si es necesario, el centro de emergencias de TU Delft se pondrá en contacto con los servicios de emergencia externos.
  • En caso de que suene la alarma, primero debemos pensar en nuestra propia seguridad. Debemos asegurar nuestra estación de trabajo y salir del edificio lo antes posible, tomando la salida (de emergencia) más cercana. Si es posible, debemos advertir a los colegas y ayudar a las personas con discapacidad. Tenemos que ir al punto de reunión / control más cercano. En el punto de reunión / control, tenemos que esperar las instrucciones del equipo interno de respuesta a emergencias (Bedrijfshulpverlening, BHV).
  • Cuando vemos gas, humo o fuego, primero debemos pensar en nuestra propia seguridad. Tenemos que presionar el botón rojo de alarma de incendio. Si nos sentimos seguros, podemos apagar pequeños incendios. Si es posible, debemos advertir a los colegas y ayudar a las personas con discapacidad. Tenemos que ir al punto de reunión / control más cercano. En el punto de reunión / control, espere las instrucciones del equipo interno de respuesta a emergencias (Bedrijfshulpverlening, BHV).
  • Siempre debemos reportar incidentes, accidentes, cuasi accidentes y situaciones inseguras al asesor de Salud, Seguridad y Medio Ambiente de la facultad.

Además de completar las pruebas de seguridad, también recibimos capacitación de laboratorio sobre cómo operar de manera segura la mayoría de las técnicas utilizadas en los experimentos básicos. Acordamos reglas sobre cómo trabajar de forma segura en nuestro laboratorio para minimizar los riesgos potenciales para el personal del laboratorio y el medio ambiente. También aprendimos cómo desechar diferentes tipos de desechos y cómo minimizar el riesgo de contaminación. Para trabajar en el laboratorio especial de bacteriófagos, recibimos una capacitación por separado, ya que se requieren medidas de seguridad adicionales para contener los fagos y prevenir la contaminación. Aprendimos cómo limpiar adecuadamente las superficies contaminadas con fagos y cómo realizar correctamente experimentos con fagos.
Además de trabajar de forma segura, también nos aseguramos de diseñar experimentos que pudiéramos realizar de forma segura. Escribimos un informe de seguridad para evaluar los riesgos de nuestros experimentos, que incluyen: detalles experimentales, diseños, seguridad con respecto a COVID-19 e información de seguridad biológica. Este informe de seguridad fue aprobado por Susanne Hage, coordinadora de laboratorio húmedo del departamento de Bionanociencia de la TU Delft, y Marinka Almering, Oficial de Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Aplicadas de la TU Delft. Cuando hicimos ajustes a nuestro proyecto, actualizamos la propuesta y la aprobamos antes de comenzar los nuevos experimentos.

Diseño experimental seguro

Nivel ML-1

Diseñamos todos nuestros experimentos para cumplir con el nivel de seguridad ML-1. La clasificación de microorganismos o toxinas puede diferir entre países o regiones, seguimos la legislación de la TU Delft. Antes de trabajar en el laboratorio, verificamos que todos los organismos, vectores y partes cumplen con el nivel ML-1 y la ley holandesa.

Microorganismos

Para cumplir con nuestro laboratorio ML-1, nos aseguramos de que todos nuestros microorganismos fueran ML-1. Nosotros usamos E. coli BL21 (DE3) y E. coli DH5 alpha como nuestros organismos de chasis. Además usamos E. coli BL21 (DE3) como anfitrión para nuestros experimentos de ingeniería de fagos. Decidimos trabajar con el bacteriófago T7, ya que también está clasificado como ML-1. Realizamos experimentos de fagos exclusivamente en un laboratorio de bacteriófagos separado para evitar E. coli infección (Figura 1).

Inserta

Nos aseguramos de expresar inserciones seguras. La toxina Cry7Ca1 es específica para insectos y se puede utilizar en un laboratorio ML-1 sin la aceptación por separado de la oficina de OMG.
También expresamos YmdB (inhibidor de la ARNasa II), Mini-III (escinde el ARNhc), 4-hidroxibenzoato descarboxilasa (degrada el fenol) (para obtener más información, consulte Diseño). Todas estas moléculas no eran tóxicas y se clasificaron como ML-1. No se ha informado que todas estas moléculas sean dañinas para los seres humanos.

Vectores

Para nuestra investigación utilizamos diferentes vectores de backbones: pKD46, G322 - pUC57 - OriLR - deGFP, pTWIST_bsdBCCD_CO, pSB1C3_BPUL_GA, pTWIST_Cry, pBbB7a - GFP, pBbA2k - RFP, pBbE8c-pBbA2k - RFP, pBbE8c - pBbA2k - RFP, pBbE8c-pbA2k - RFP, pBbE8c-pbA2k - RFP, pBbE8c-pR4-RFs Algunos de estos plásmidos fueron amablemente proporcionados por otros laboratorios del departamento de BN y algunos se solicitaron a través de Addgene. Se siguieron las regulaciones del acuerdo de transferencia de material (MTA) de acuerdo con las reglas.

Productos quimicos

Usamos varios productos químicos que son peligrosos, estos incluyen bromuro de etidio, 2X Laemmli Sample Buffer y SYBR ™ Safe. Solo hemos trabajado con estos productos químicos en concentraciones bajas y solo hemos trabajado con estas toxinas en el área designada. Esta área estaba marcada con cinta especial, y acordamos que todos los trabajos con guantes en esa área eran de colores diferentes en comparación con el stock general. Además, ningún equipo contaminado salió de esta área.

Seguro por diseño

La seguridad es uno de nuestros requisitos de diseño importantes. PHOCUS es un biopesticida específico a base de bacteriófagos que se utiliza para controlar la crisis de la langosta del desierto. Nuestro objetivo es matar las langostas produciendo moléculas tóxicas en su intestino. Estas moléculas serán producidas por las bacterias intestinales después de la infección con nuestro bacteriófago diseñado. Las toxinas que queremos producir son la toxina Cry7Ca1 específica de la langosta y los ARN de horquilla corta (shRNA) que se dirigen a los genes esenciales de la langosta (para obtener más información, consulte Diseño).
Mientras trabajaba en nuestro proyecto, aprendimos que en biología nada es 100% seguro. Por lo tanto, Decidimos centrarnos en identificar los riesgos potenciales y tener implementadas las medidas de gestión de riesgos adecuadas para reducirlos a un grado aceptable. (Figura 1).

Figura 1. Resumen de las medidas Safe-By-Design para el diseño de PHOCUS.

Hacemos uso de fagos para la liberación de toxinas. Estos son virus que solo pueden infectar bacterias [1]. Un problema de seguridad identificado es que nuestros bacteriófagos modificados pueden ser peligrosos para los humanos. Sin embargo, aprendimos que este riesgo es insignificante porque:

  • Los fagos no pueden infectar células humanas. Aunque pueden ingresar al cuerpo humano, las reacciones alérgicas no son comunes en los humanos [2, 3, S. Hagens, entrevista personal].
  • La estabilidad de los fagos en ciertas condiciones varía para diferentes fagos [4]. Para nuestro proyecto, es importante elegir un fago que sea estable al pH del intestino de la langosta del desierto, que es pH 7-8 [J. Vanden Broeck, entrevista personal]. No es probable que un fago que sea estable a este pH sobreviva al pH del estómago humano (pH 1-2) [5].
  • Si los fagos sobreviven al pH del estómago humano, no es probable que afecten a la microbiota intestinal humana [S. Hagens, entrevista personal]. No obstante, es necesario realizar más investigaciones sobre el efecto exacto de los fagos líticos en la microbiota intestinal [6,7].

Un problema de seguridad adicional es que nuestros fagos podrían ser peligrosos para los animales y / o insectos. La investigación ha analizado la influencia de los fagos en la microbiota animal, pero este impacto aún no se comprende bien [8]. En cuanto a los insectos, se ha investigado el efecto de la administración oral de fagos por moscas y abejas [9, 10]. Esto pareció tener poco efecto. En general, se deben realizar más investigaciones sobre el efecto que tienen los fagos en la microbiota de animales e insectos (ver Ensayos de campo).

Otro problema de seguridad es la persistencia de nuestros fagos modificados en la naturaleza después de ser liberados. Sin embargo, la probabilidad de que nuestros fagos persistan durante mucho tiempo es baja ya que:

  • Los fagos son inestables cuando se exponen a niveles persistentes de UV [J.B. Jones, entrevista personal, 11]. Por lo tanto, fuera del intestino de la langosta, los fagos no persistirán por mucho tiempo.
  • La estabilidad de los fagos varía con la temperatura [4]. El riesgo de persistencia en la naturaleza puede reducirse eligiendo un fago que sea predominantemente estable a temperaturas corporales de la langosta de 25 a 31 grados Celsius [12].

Para probar la estabilidad de PHOCUS dentro de la langosta y la inestabilidad fuera de ella, hemos determinado qué datos deben recopilarse para que sean admisibles para las pruebas de campo (ver Pruebas de campo).

Los fagos dependen de los procesos metabólicos de la célula huésped para permitir la replicación viral. Se sabe que siguen dos posibles ciclos de vida, el ciclo lítico y el ciclo lisogénico [13]. Un fago lítico (virulento) no integra su material genético en el de su huésped [13]. Mientras que el ciclo de vida de un fago lisogénico (templado) consiste en el genoma viral, denominado profago, que se inserta en el genoma del huésped [14]. PHOCUS utilizará un fago lítico por varias razones:

  • Minimizará los riesgos de transferencia horizontal de genes y / o transducción mediada por fagos [15]. De lo contrario, esto podría dar una ventaja a ciertas bacterias, p. Ej. resistencia a los antibióticos y, por lo tanto, alterar el ecosistema [16]. Dado que nuestro proyecto se centra en los fagos líticos, la transducción generalizada es relevante. La transducción generalizada implica la integración de información genética aleatoria del cromosoma del huésped en el fago. Este raro evento ocurre durante la replicación del fago con una tasa de prevalencia de 1 en 11.000 fagos, justo antes de que el viroide esté encerrado dentro de la cápside del fago [18].
  • El ciclo lítico termina con la lisis celular y, por lo tanto, la muerte celular, lo que reduce la posibilidad de crear un nuevo OGM.
  • Debido a las propiedades del ciclo lítico, los fagos que alcanzan sus bacterias objetivo se propagarán rápidamente. Esto conducirá a grandes aumentos en la cantidad de toxina y shRNA producidos. Cuando la bacteria del hospedador explota, la toxina Cry7Ca1, las proteínas asociadas a ARNhc y ARNi se secretan de manera efectiva, lo que anula el problema de exportar los compuestos producidos fuera del hospedador. Como los compuestos se liberan muy cerca de la pared intestinal, pueden alcanzar fácilmente su objetivo. Las concentraciones más altas de toxina Cry7Ca1 y ARNhc en la pared intestinal se correlacionan con una tasa de muerte más rápida, lo que hace que PHOCUS sea más eficaz.

Diseñamos fagos para reemplazar genes no esenciales con un gen que codifica la toxina Cry7Ca1 o shRNA. Los riesgos relacionados con la propagación de fagos modificados dependen del tipo de fago y del tipo de modificación genética. Existen diferentes preocupaciones, además de la transferencia horizontal de genes mencionada anteriormente:

  • Diseminación de fagos en el medio ambiente: Los fagos diseñados con un rango de hospedadores ampliado tienen un cambio significativamente mayor para diseminarse en el medio ambiente [18]. Decidimos utilizar un cóctel de fagos, ya que no había una sola especie de bacteria siempre presente en el intestino de la langosta. Con el uso de este cóctel, esparcimos múltiples fagos diferentes, mientras que todos estos por separado tienen la oportunidad de propagarse. Incrementando la probabilidad total de propagación. Por lo tanto, elegimos diseñar fagos con un rango de hospedadores naturalmente estrecho, por lo que se reduce la posibilidad de propagación de nuestro cóctel de fagos modificado fuera de la langosta.
  • Producción de proteínas nocivas: dado que los fagos pueden modificarse para expresar todos los tipos de proteínas, los riesgos implicados en el uso de fagos modificados dependen en gran medida del tipo de modificación. Elegimos explícitamente no insertar secuencias dañinas para el medio ambiente, los seres humanos u otros animales.
  • Persistencia de la mutación aplicada en la naturaleza: Para examinar la estabilidad de la mutación en fagos manipulados, se puede determinar la presencia de la mutación en varias generaciones de fagos, como describen Nobrega et al. [19]. En resumen, el fago manipulado puede propagarse en su huésped durante varias generaciones y la presencia de la mutación puede confirmarse mediante PCR después de cada generación. Si nuestro inserto es extremadamente estable, nuestra mutación podría extenderse a través de poblaciones genéticas.

Toxinas de cristales insecticidas (Cry) de bacilo turingiensico (Bt) se están utilizando para el control biológico de plagas en todo el mundo, ya sea mediante formulaciones en aerosol basadas en preparaciones de cristales de esporas o introduciendo sus genes (proteína Cry o un fragmento activo de la misma) en cultivos transgénicos. [20, 21]. En nuestro proyecto, nos centramos en la toxina Cry Cry7Ca1 identificada en el B. thuringiensis cepa BTH-13 que se ha descrito como eficaz contra la langosta de la especie Locusta migratoria manilensis, perforando el revestimiento intestinal [22, 23].
En cuanto a la seguridad, optamos por utilizar Cry7Ca1 por diferentes motivos:

  • Las toxinas Cry son muy específicas de sus insectos objetivo y, por tanto, matan a un número limitado de especies [24]. Se ha informado que Cry7Ca1 tiene una toxicidad baja o nula frente a lepidópteros, coleópteros y dípteros [22].
  • La especificidad de las toxinas Cry es proporcionada por el entorno del intestino medio del insecto, que promueve la activación de la toxina de la protoxina y por la unión de la toxina Cry sólo a las membranas intestinales que muestran los receptores correspondientes [25].
  • Los seres humanos no tienen las mismas condiciones intestinales ni los mismos receptores que los insectos. La toxina Cry debería atravesarnos sin ningún efecto, siendo ingerida como cualquier otra proteína al ingerir alimentos [26].
  • Se ha demostrado que estas proteínas se descomponen en sistemas digestivos simulados de humanos [25]. Para las pruebas de alérgenos, también probamos la secuencia de la toxina Cry, utilizando el protocolo del equipo de Baltimore iGEM de 2017, que resultó no alergénico [28].

Nuestro enfoque de ARN de interferencia (ARNi) se basa en la pequeña maquinaria de procesamiento de ARN de interferencia (ARNip). Elegimos utilizar el enfoque de RNAi porque:

  • Los ARNip necesitan una complementariedad de secuencia del 100% con el ARN mensajero dirigido (ARNm) para escindirlos [29], lo que garantiza una especificidad adicional. La especificidad es muy importante ya que cualquier célula eucariota que posea maquinaria de ARNi activa es susceptible de silenciarse con nuestros ARNhc.
  • Podemos garantizar la especificidad eligiendo el objetivo correcto de ARN en horquilla corto (ARNhc). Como los fagos se rociarán en el medio ambiente, otras especies podrían estar expuestas a nuestros ARNhc. El ARNhc producido debe analizarse en busca de posibles objetivos externos para prevenir el silenciamiento genético fortuito en especies coexistentes en o en enjambres de langostas cercanas, así como en humanos y animales, mediante el uso de bases de datos transcriptómicas. Al elegir nuestro objetivo, debemos asegurarnos de elegir objetivos específicos, con el fin de evitar la aparición de fenotipos no deseados, es decir, la desagregarización [30] o el aumento de la ingesta de alimentos [31, 32].

Para que nuestro bioplaguicida funcione, los bacteriófagos que se dirigen específicamente a las bacterias presentes en el intestino de la langosta deben elegirse como vector de administración. Aunque el intestino de la langosta no está dominado por una sola especie bacteriana, la langosta del desierto mantiene una población constante de la Enterobacter género [33]. Para garantizar una producción suficiente de toxinas, el bioplaguicida consiste en un cóctel de fagos que se dirigen a una variedad de bacterias del Enterobacter género. Desafortunadamente, las bacterias del Enterobacter los géneros no son necesariamente específicos del intestino de la langosta únicamente. Aunque el Enterobacter El género no es un miembro central geográficamente conservado del microbioma humano, hay ciertas poblaciones humanas que muestran la presencia de Enterobacter en su microbioma [34]. Por lo tanto, existe la posibilidad de que nuestro bioplaguicida pueda infectar y matar al Enterobacter bacterias de ciertos seres humanos u otros organismos, mientras que simultáneamente producen la toxina específica de la langosta.

Sin embargo, estos riesgos son pequeños porque:

  • En los seres humanos, es poco probable que la muerte involuntaria de especies bacterianas por fagos tenga consecuencias negativas para la salud humana, debido a la fuerte presión de selección de bacterias no patógenas [S. Hagens, entrevista personal].
  • Para los humanos, la primera línea de defensa contra los fagos es el pH bajo en el estómago, ya que la mayoría de los fagos son sensibles a las condiciones ácidas. [35].
  • Los riesgos para otros organismos también son limitados. No solo los humanos, sino también otros organismos que contienen Enterobacter en sus entrañas [O. Lavy, entrevista personal] podría potencialmente estar en riesgo. Sin embargo, las toxinas que se producen son muy específicas de las langostas y no deberían dañar a esos organismos. No obstante, para garantizar que nuestro bioplaguicida sea seguro para otros animales, se deben realizar más estudios de datos metagenómicos en diferentes microbiomas intestinales.

La encapsulación es un medio por el cual se puede controlar rigurosamente el entorno de una sola molécula [36]. Existen varios tipos de encapsulación, por ejemplo, liposomas y microcápsulas poliméricas como los alginatos [37].

  • La encapsulación puede actuar como una barrera física para prevenir infecciones fuera del objetivo. los Enterobacter Se sabe que este género estimula el crecimiento de las plantas, ya que participan en la fijación de nitrógeno, la solubilización del fósforo en el suelo y la producción de antibióticos [38]. Se necesita una barrera física para nuestros fagos, independientemente de la naturaleza de la ingeniería que estemos realizando, para evitar desequilibrios ecológicos en la vegetación sobre la que se rocía el fago.

Un método de encapsulación claro que cumpla con nuestros requisitos de diseño es difícil de encontrar a primera vista. Se deben realizar más investigaciones sobre la encapsulación de nuestros bacteriófagos.

Cuando se exponen a pesticidas, las langostas con diferentes rasgos fenotípicos tienen diferentes posibilidades de supervivencia. Es más probable que los genes que tienen como resultado una mayor probabilidad de supervivencia se transmitan a la descendencia. Si esto ocurre durante períodos más prolongados, las langostas resistentes a los pesticidas pueden convertirse en dominantes en una población. Tenemos que prevenir la resistencia para que nuestro pesticida siga siendo efectivo. Los rasgos antes mencionados incluyen:

Resistencia Cry7Ca1

La toxina Cry7Ca1 se adhiere a los receptores en el intestino de la langosta y hace agujeros en el revestimiento del intestino. Algunas langostas pueden tener ligeras alteraciones genéticas que provocan cambios en el receptor Cry7Ca1, lo que da como resultado una unión ineficaz o ninguna. Es muy probable que las langostas con este rasgo lo transmitan a sus crías. La probabilidad de que esto suceda es difícil de estimar. Sin embargo, el riesgo de que la langosta del desierto se vuelva resistente a Cry7Ca1 se ve reforzado por:

  • Alta exposición de langostas a Cry7Ca1 [39].
  • Reproducción rápida, resultando en muchas generaciones [39, 40].

El riesgo de que esto ocurra se reduce mediante:

  • El riesgo de que esto ocurra se reduce mediante:
  • Baja frecuencia inicial de rasgos fenotípicos que favorecen la supervivencia [41].
Resistencia al ARNi

Existen tres escenarios diferentes en los que la langosta del desierto evoluciona para convertirse en resistencia al ARNi [42]:

  • La maquinaria de ARNi de la langosta del desierto se ve afectada debido a mutaciones [42]. Sin embargo, un sistema de ARNi impuesto disminuye las posibilidades de supervivencia en un enjambre debido a la susceptibilidad del virus y, por lo tanto, no es probable que esta mutación se propague a través de la población.
  • La secuencia diana en la langosta del desierto está mutada en la medida en que su ARNm ya no es suficientemente homólogo a los ARNip del ARNhc [42]. En caso de que esto sucediera, sería fácil cambiar a otra secuencia diana de un gen esencial.
  • La langosta del desierto puede obtener mutaciones que disminuyan la estabilidad del shRNA en el intestino o la captación del shRNA en la hemolinfa [42]. No se puede proporcionar una estimación sobre la magnitud de este riesgo.
Previniendo la resistencia

Se están aplicando dos métodos para mitigar el riesgo de que la langosta del desierto se vuelva resistente a PHOCUS:

  • Dos modos de acción diferentes: Existe la posibilidad de que una langosta del desierto sea resistente a uno de los dos métodos. Sin embargo, la posibilidad de que una langosta del desierto sea menos susceptible a Cry7Ca1 y RNAi al mismo tiempo es insignificante.
  • Vigilancia: Cuando se aplica PHOCUS, los genomas de la langosta del desierto deben ser monitoreados para evaluar si una variación genética particular se vuelve más prevalente en la población [41]. Si es así, se debe diseñar una estrategia, como la pulverización táctica de PHOCUS en áreas particulares o el desarrollo de una nueva toxina con un modo de acción diferente.

Las bacterias desarrollan resistencia a los fagos utilizando muchos mecanismos [43]. Si las bacterias diana son resistentes a PHOCUS, las toxinas no se producen para acabar con las langostas. Hemos utilizado específicamente fagos líticos para lisar todas las bacterias diana para limitar el desarrollo de resistencia. Aún así, estudiamos las posibilidades de desarrollo de resistencia y se nos ocurrieron dos escenarios en los que podría ocurrir resistencia a los fagos:

  • El primer escenario consiste en bacterias que desarrollan resistencia a PHOCUS, comenzando con una población bacteriana no resistente. Basado en nuestro modelo matemático, que estudia el desarrollo de bacterias resistentes, está claro que nuestro bacteriófago infectaría y mataría a todo el Enterobacter población en un par de horas, lo que evita que las bacterias desarrollen resistencia a PHOCUS.
  • El segundo escenario consiste en la existencia de una cepa resistente en el intestino de la langosta. Basándonos en el consejo del Dr. Steven Hagens, hemos optado por utilizar un cóctel de fagos que se dirigen a diferentes receptores de la misma bacteria para abordar los problemas relacionados con las bacterias resistentes. Esto asegura la susceptibilidad a nuestras bacterias objetivo.

Para reducir los riesgos relacionados con la propagación de OMG en la naturaleza debido a la liberación del bacteriófago manipulado, una estrategia consiste en limitar su propagación en el medio ambiente [44]. La cantidad de fagos modificados en el medio ambiente disminuirá de forma natural con el tiempo, lo que hará que no sean necesarias medidas adicionales de biocontención como:

  • PHOCUS pierde la competencia con el fago de tipo salvaje para el huésped debido a la reducción de su aptitud. La supervivencia de PHOCUS depende de una ventaja selectiva sobre el tipo salvaje. Sin embargo, los insertos no confieren una ventaja selectiva a PHOCUS.
  • Las inserciones genéticas se perderán con el tiempo y el fago volverá a su secuencia de tipo salvaje. Esto se debe al hecho de que los transgenes a menudo tienen un efecto deletéreo, una consecuencia general de la alteración del tipo salvaje [45]. Esperamos que la aptitud relativa disminuya y planteamos la hipótesis de que esto dará lugar a la eliminación de nuestro inserto, como suele ser el caso de los insertos en los genomas del virus [46].
  • Los bacteriófagos son generalmente inestables cuando se exponen a altas temperaturas y altas dosis de radiación ultravioleta. Diferentes factores ambientales pueden influir en la estabilidad de los bacteriófagos [4]. Los bacteriófagos tienen dificultades para persistir en la superficie de las hojas debido a la inactivación por radiación UV [47, J.B. Jones, entrevista personal].
  • La naturaleza lítica del bacteriófago modificado. Un bacteriófago depende del crecimiento de sus respectivos huéspedes para proliferar, son autolimitantes [48, 49]. Esto significa que si se libera una gran cantidad de fagos, sus respectivos hospedadores serán erradicados localmente. Limitar la capacidad de propagación y proliferación.

Pruebas de campo

Durante las entrevistas con expertos en el campo de, entre otros, la biología y la toxicología de los fagos, se trazaron y discutieron los posibles problemas de seguridad. Para abordar estas preocupaciones, Se desarrollaron estrategias de mitigación de riesgos y se diseñaron experimentos de laboratorio para probar la seguridad de PHOCUS.. Nos dimos cuenta de que, para que PHOCUS se utilice en el mundo real, primero tiene que pasar por pruebas de campo. Para ser admisible para estas pruebas a gran escala, se deben realizar más pruebas de seguridad. Por lo tanto, investigamos qué datos había que recopilar y diseñamos los experimentos en consecuencia, además de estudiar la legislación correspondiente.

De nuestra entrevista con la Dra. Cecile van der Vlugt, asesora senior de riesgos en el Instituto Nacional Holandés de Salud Pública y Medio Ambiente, aprendimos que, aunque la legislación puede estar ausente o no ser permisiva, el mejor enfoque para superar la legislación que no cumple es mediante la realización de una evaluación de riesgos de PHOCUS. Lo más probable es que tengamos que cumplir con tres tipos de regulaciones:

  • Regulaciones de OGM: Antes de llevar un OMG al medio ambiente, es necesario realizar una evaluación de riesgos para otros organismos en el medio ambiente, p. Ej. necesitamos demostrar que el fago no se propagará indefinidamente en la naturaleza.
  • Regulaciones de insecticidas: Todos los insecticidas deben aprobar regulaciones antes de que puedan aplicarse. Respondiendo preguntas como ¿qué tan específico es? ¿Persiste en el medio ambiente?
  • Regulaciones alimentarias: Esto también se aplicará a PHOCUS, ya que es un insecticida "vivo". Los reguladores observarán los efectos de las toxinas / patógenos de la modificación realizada en el fago y cómo podría transmitirse a otros organismos.

Existen muchos riesgos diferentes asociados con la implementación de PHOCUS para los cuales se deben recopilar datos a escala de laboratorio. De esta manera podemos probar las afirmaciones teóricas que hemos hecho anteriormente, es decir, que PHOCUS es seguro para los humanos. Para llevar PHOCUS más allá del laboratorio, se deben realizar muchos experimentos para probar su:

  • Toxicidad para organismos no objetivo (fago GM, Cry7Ca1, RNAi)
  • Patogenicidad para organismos no objetivo (fago GM, Cry7Ca1, RNAi)
  • Estabilidad y potencial de acumulación (fago GM, Cry7Ca1, RNAi)
  • Unicidad de la secuencia dirigida (ARNi)
  • Potencial flujo de genes del inserto (fago GM)
  • Especificidad para las langostas (CryCa1, RNAi)

Cabe señalar que nuestra percepción de lo que es aceptable sigue cambiando. Por lo tanto, la lista debe repetirse y modificarse después de discusiones continuas con los evaluadores y gerentes de riesgos. Esto es muy relevante en relación con nuestro proyecto, ya que tenemos una aplicación novedosa y, por lo tanto, puede haber riesgos potencialmente no identificados que podrían surgir con el tiempo..

Después de completar la evaluación de riesgos a escala de laboratorio y la aceptación por parte de las autoridades responsables, PHOCUS puede pasar a las pruebas de campo. Aquí, PHOCUS estará sujeto a diferentes pruebas en un entorno exterior, es decir, una evaluación de riesgo ambiental (ERA) [50]. Los experimentos realizados podrían ser la variante externa de los realizados en el laboratorio. Estos datos deben generarse nuevamente ya que el entorno real es mucho más complejo y podría dar lugar a diferentes interacciones. Los detalles específicos de qué datos deben recopilarse exactamente siguen siendo imprecisos. Principalmente porque nuestro enfoque es novedoso y las autoridades responsables aún no han elaborado la legislación relacionada. Es probable que lo hagan utilizando un enfoque caso por caso, como aconsejan los estudiosos [52, 53]. Todavía, Probablemente seguirá siendo comparable a las ERA existentes para las regulaciones de OGM, pesticidas y alimentos., p.ej. el ERA para plantas transgénicas en Australia, que analiza "toxicidad, alergenicidad, perfil nutricional, características agronómicas, aumento de la carga de enfermedades, propagación y persistencia del OGM, flujo de genes, etc." [53]. Se encuentran disponibles más directivas para el uso de agentes de control biológico [54]. Si bien también se presenta una crítica de la ERA contemporánea sobre los OMG, que utilizan toxinas Cry en plantas transgénicas [55], queda claro que los expertos en evaluación de riesgos no están de acuerdo sobre el mejor enfoque. Además, los diferentes países también tienen diferentes procedimientos. Por lo tanto, Es esencial comprender que no existe una forma determinada en la que PHOCUS obtenga la aprobación en todos los países., y sus reglamentos deben evaluarse en estrecha colaboración con las autoridades responsables de los países afectados.

Una vez realizadas las evaluaciones de riesgos, es importante enviar estos resultados al Grupo de árbitros de plaguicidas (PRG). Este es un grupo independiente de expertos científicos en plaguicidas. Evalúan los datos presentados y crean una lista corta de plaguicidas que consideran aceptables. Esta lista se especifica para su uso previsto. La FAO aconseja a los países qué plaguicidas utilizar. Solo compran y asesoran plaguicidas preseleccionados por el PRG. Por último, todos los países tienen su propia libertad legislativa, por lo que PHOCUS aún debería ser admitido en cada país individualmente.


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