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¿Qué tan estéril es estéril cuando se trabaja con ácidos nucleicos para prevenir la contaminación?


Estoy leyendo sobre el trabajo preparatorio sobre el trabajo con ácidos nucleicos y muchas de las instrucciones hablan sobre procedimientos excesivos en la limpieza de entornos con un alto% de etanol y asegurarse de que el equipo esté libre de nucleasas y se esterilice en autoclave.

¿Son estos pasos de esterilización realmente necesarios al investigar / ejecutar geles? Comprar todo este equipo parece muy excesivo, y dado que una sola nucleasa podría comprometer mis resultados, ¿por qué molestarse?


Respuesta corta:

Respuesta larga: Depende con lo que estés trabajando.

ADN: Si está trabajando con ADN, es bastante estable y generalmente puede salirse con la suya con un lavado / autoclave de etanol al 70% (principalmente para evitar la contaminación y obtener resultados consistentes). EDITAR: Lea la respuesta de Chris también a continuación

ARN: Si está trabajando bien con ARN ... lo que haya hecho para el ADN ya no se aplica. Tienes que llevarlo al siguiente nivel. Necesitará reemplazar todo, necesitará agua libre de nucleasas, tubos, reactivos y demás. Deseche el etanol y traiga RNAZap, agua DEPC o algo así.

Un entorno libre de ARNasa es esencial cuando se trabaja con muestras de ARN. Hay dos razones principales para la degradación del ARN durante el análisis de ARN.

Primero, el ARN, por su propia estructura, es intrínsecamente más débil que el ADN. El ARN está formado por unidades de ribosa, que tienen un grupo hidroxilo altamente reactivo en C2 que participa en eventos enzimáticos mediados por ARN. Esto hace que el ARN sea más lábil químicamente que el ADN. El ARN también es más propenso a degradarse por calor que el ADN.

En segundo lugar, las enzimas que degradan el ARN, las ribonucleasas (RNasas) son tan ubicuas y resistentes; eliminarlos a menudo resulta casi imposible. Por ejemplo, esterilizar en autoclave una solución que contenga bacterias destruirá las células bacterianas, pero no las RNasas liberadas por las células. Además, incluso pequeñas cantidades de RNasas pueden degradar el ARN. Tenga en cuenta que las ARNas están presentes en todas partes (piel, reactivos, plástico normal, etc.).

Por lo tanto, es esencial evitar la introducción inadvertida de ARNasas en la muestra de ARN durante o después del procedimiento de aislamiento.

Recuerde que seguir técnicas microbiológicas asépticas suele ser una buena práctica (y un requisito) cuando se trabaja en un laboratorio de biología molecular.

Hay excelentes guías disponibles en línea para trabajar con ARN:

Tomé el párrafo anterior de aquí: http://www.bioline.com/us/rna-hints-and-tips

Life Tech tiene algunos consejos más para ti: https://www.lifetechnologies.com/uk/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html

Aquí hay un buen pdf para tener en su libro de laboratorio como hoja de referencia: http: //genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf

Si esto te asusta, es bueno porque cuando trabajas con ARN hay un millón de cosas que pueden salir mal las primeras veces que lo intentas. Tienes que tener mucho cuidado, y adaptar una actitud arrogante como no molestar va a volver y perseguirte por la noche ...


En primer lugar, la esterilidad no es necesaria. Se necesita mucho más esfuerzo para lograr esto que simplemente limpiar todo con etanol. Lo que necesita es un entorno de trabajo limpio y controlado (pero esto es algo que necesita de todos modos para obtener resultados reproducibles) y un equipo bueno y limpio. Necesitará más precauciones para el trabajo del ARN ya que el ARN es más sensible y las ARNas son ubicuas, pero las reglas generales son las mismas. Algunas observaciones mías al respecto:

  • No es necesario limpiar todo en su entorno antes de trabajar. ¿Tocará el ADN el escritorio o el exterior de su pipeta? Simplemente use guantes, use recipientes de plástico nuevos, no toque los recipientes de plástico con el dedo desnudo y estará bien.

  • No hay una necesidad general de esterilizar en autoclave todo lo que usa (a menos que lo necesite explícitamente esterilizado). No toque las cosas con los dedos desnudos. Los autoclaves también pueden ser una fuente de contaminación cuando están mal mantenidos o se utilizan también para esterilizar basura en el autoclave. Los artículos de plástico generalmente no contienen nucleasas, gracias al proceso de producción (el plástico derretido no es un buen lugar para vivir).

  • Si trabaja con ARN, intente configurar un espacio de trabajo separado para evitar contaminaciones por su trabajo normal. Si usa cristalería, lávela con agua tratada con DEPC y esterilícela en autoclave para que quede libre de ARNasa. ¡Usa guantes! También use un conjunto diferente de productos químicos para este trabajo para evitar la contaminación cruzada. Las puntas con filtro pueden ser una buena idea aquí. Además de ser cuidadoso, el trabajo con ARN no es magia sino artesanía sólida.

  • Si hace PCR, intente configurar un lugar de trabajo diferente, separado de su trabajo normal. La PCR es muy sensible a las contaminaciones que se acumulan en sus pipetas debido a su trabajo normal. He visto varios casos de amplificaciones de falsos positivos en el trabajo normal.


¿Qué tan estéril es estéril cuando se trabaja con ácidos nucleicos para prevenir la contaminación? - biología

Además de los métodos físicos de control microbiano, también se utilizan productos químicos para controlar el crecimiento microbiano. Se puede utilizar una amplia variedad de productos químicos como desinfectantes o antisépticos. Al elegir cuál usar, es importante considerar el tipo de microbio al que se dirige, qué tan limpio debe ser el artículo, el efecto del desinfectante en la integridad del artículo, su seguridad para los animales, los seres humanos y el medio ambiente, su costo y su facilidad de uso. Esta sección describe la variedad de productos químicos utilizados como desinfectantes y antisépticos, incluidos sus mecanismos de acción y usos comunes.


Artículo de Investigación Original

  • 1 División de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud, Universidad de Australia Occidental, Perth, WA, Australia
  • 2 Centro de Metabolómica Integrativa y Biología Computacional, Facultad de Ciencias, Universidad Edith Cowan, Perth, WA, Australia

El microbioma humano incluye billones de bacterias, muchas de las cuales juegan un papel vital en la fisiología del huésped. Numerosos estudios han detectado ADN bacteriano en muestras de meconio y líquido amniótico de primer paso, lo que sugiere que el microbioma humano puede comenzar en el útero. Sin embargo, estos datos siguen siendo polémicos debido a problemas de contaminación subyacentes. Aquí, hemos utilizado un método descrito anteriormente para reducir la contaminación en los flujos de trabajo del microbioma para determinar si hay un microbioma bacteriano fetal más allá del nivel de contaminación de fondo. Reclutamos a 50 mujeres que se sometieron a partos por cesárea que no eran de emergencia sin evidencia de infección intrauterina y recolectamos muestras de meconio y líquido amniótico de primer paso. La secuenciación del gen 16S rRNA de longitud completa se realizó utilizando la tecnología de células PacBio SMRT, para permitir el perfil de alta resolución del intestino fetal y los microbiomas bacterianos del líquido amniótico. Los niveles de citocinas inflamatorias se midieron en el líquido amniótico y los niveles de ácidos grasos de cadena corta inmunomoduladores (AGCC) se cuantificaron en el meconio. Todas las muestras de meconio y la mayoría de las muestras de líquido amniótico (36/43) contenían ADN bacteriano. El microbioma de meconio estuvo dominado por lecturas que se asignaron a Pelomonas puraquae. Aparte de esta especie, el microbioma de meconio era notablemente heterogéneo entre los pacientes. El microbioma del líquido amniótico era más diverso y contenía principalmente lecturas que se asignaban a los comensales típicos de la piel, incluidos Propionibacterium acnes y Estafilococo spp. Todas las muestras de meconio contenían acetato y propionato, en proporciones similares a las informadas anteriormente en bebés. P. puraquae las lecturas se correlacionaron inversamente con los niveles de propionato de meconio. Los niveles de citocinas en el líquido amniótico se asociaron con el microbioma del líquido amniótico. Nuestros resultados demuestran que el ADN bacteriano y los AGCC están presentes. en el úteroy tienen el potencial de influir en el desarrollo del sistema inmunológico fetal.


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MATERIALES Y MÉTODOS

Reemplazo alélico

Escherichia coli La DH5α, utilizada para la clonación, se cultivó en medio LB Lennox (BD, Difco) a 37 ° C. Mycobacterium abscessus ssp. massiliense Se cultivó CIP108297 en caldo Middlebrook 7H9-ADC (BD, Difco) suplementado con Tween 80 al 0,05% o agar 7H11-ADC (BD, Difco) a 37ºC. Se añadieron kanamicina (Kan), estreptomicina (Str) e higromicina (Hyg) hasta concentraciones finales de 200, 200 y 2000 μg / ml, respectivamente. Recombinación homóloga en el trmD locus de M. abscessus ssp. massiliense CIP108297 se realizó utilizando un sistema basado en recombinasa micobacteriana en el que los genes recombinantes del micobacteriófago Che9c (22) se expresan a partir del plásmido replicativo pNitET-xylE-kan (un derivado del pNitET-sacB-kan plásmido (23) generado internamente en el que el sacB gen fue reemplazado por el xylE marcador de color) bajo el control de un promotor inducible por isovaleronitrilo. Inducido por isovaleronitrilo M. abscessus ssp. massiliense CIP108297 células que albergan pNitET-xylE-kan se electro-transformaron con ~ 300 ng de sustrato de intercambio alélico lineal que consiste en el casete de resistencia a la estreptomicina de pHP45Ω flanqueado por 1000 pb de secuencia de ADN que flanquea inmediatamente los codones de inicio y parada de trmD, y los mutantes de doble cruzamiento se aislaron en agar que contenía Str. Reemplazo alélico que conduce a la eliminación completa del trmD El locus se comprobó mediante PCR utilizando un par de cebadores que se hibridaban fuera del sustrato de intercambio alélico lineal.

El plásmido pMV306H se construyó reemplazando el casete de resistencia a kanamicina de pMV306hsp (un vector de expresión micobacteriana integrador que permite la expresión de genes bajo el control del promotor hsp60, plásmido Addgene # 26155) (24) por un casete de resistencia a higromicina. pMV306H :: trmD se generó mediante la clonación de la PCR amplificada trmD gen de M. abscessus ssp. massiliense CIP108297 en el sitio HindIII de pMV306H. Todas las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla complementaria S1.

Expresión y purificación de larga duración. M. abscessus TrmD

Escherichia coli La cepa BL21 (DE3) que contiene el plásmido AVA0421 con un sitio de proteasa N-His-3C-inserto de longitud completa TrmD, amablemente proporcionado por el Seattle Structural Genomics Consortium, (25) se cultivó durante la noche a 37 ° C en medio LB que contenía ampicilina ( 100 μg / ml). Este cultivo en etapa de siembra se utilizó para inocular seis matraces de agitación que contenían 1 l de cada medio 2XYT con ampicilina (100 μg / ml) hasta que la densidad óptica (A600 nm) alcanzó 0,6. La expresión de la construcción recombinante se indujo mediante la adición de isopropil β-d -1-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,5 mM y se dejó crecer adicionalmente a 18ºC durante 16 h.

Aislamiento de células y lisis.

Las células se recolectaron por centrifugación a 4 ° C durante 20 min a 5000 gy el sedimento se resuspendió en tampón A (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, MgCl 10 mM2, TCEP 1 mM, imidazol 20 mM). Tritón al 0,1% (Sigma), 10 μg / ml de DNasaI, MgCl 5 mM2 y se añadieron a la suspensión celular tres comprimidos de cóctel inhibidor de proteasa (New England Biolabs). Las células se lisaron en un Emulsiflex (Glen Creston) y se clarificó el lisado mediante centrifugación a 4ºC durante 40 min a 25 568 g.

Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados

El lisado clarificado se filtró usando un filtro de jeringa de 0,45 µm y se pasó a través de una columna de níquel-sefarosa preequilibrada (con tampón A) de 10 ml preempaquetada (HiTrap IMAC FF, GE Healthcare). La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón A y la proteína unida se eluyó como eluciones de 4 x 10 ml usando tampón B (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%, TCEP 1 mM, imidazol 500 mM). La proteína se analizó en un gel de SDS-PAGE al 15%. Diálisis: Se combinaron los eluidos de la columna Hi-Trap IMAC, se añadió proteasa 3C en una proporción de 1:50 mg (proteasa: proteína) y se sometieron a diálisis frente a 2 l de tampón C (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, 5% glicerol, TCEP 1 mM) durante la noche a 4ºC.

La proteína, después de diálisis durante la noche y escisión de la etiqueta N-His, se pasó a través de una columna de níquel HiTrap IMAC FF de 5 ml preequilibrada (tampón A) (GE Healthcare).

Cromatografía de exclusión por tamaño

El flujo a través de la columna anterior se concentró a 3 ml usando un concentrador centrífugo de 10 kDa (Sartorius Stedim) y se cargó en un preequilibrado (con tampón D: HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%) 120 ml Columna Superdex200 16/600 (GE Healthcare). Se recogieron fracciones de 2 ml y se analizaron en un gel de SDS-PAGE al 15%. Las fracciones correspondientes a la proteína TrmD pura se combinaron y concentraron a 25 mg / ml, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a –80 ° C. La identidad de la proteína purificada se confirmó adicionalmente mediante huellas dactilares en masa MALDI.

Cristalización de la forma apo de longitud completa M. abscessus TrmD

M. abscessus Los cristales de TrmD apo se cultivaron en placas de caída de 48 pocillos (Swiss CDI) en las siguientes condiciones: cacodilato de sodio 0,08 mM, pH de 5,8 a 6,8, sulfato de amonio 1–2 M. Se prepararon 24 mg / ml de la proteína en tampón de almacenamiento (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%) en una proporción de gota de 1 μl: 1 μl (proteína: depósito respectivamente) y se equilibraron contra un depósito de 70 μl.

Remojo de cristales nativos de TrmD con fragmentos y ligandos

Los cristales para este experimento se cultivaron a 19 ° C en placas de caída de 48 pocillos (Swiss CDI) en las siguientes condiciones: cacodilato de sodio 0,08 mM pH 6,5 a 7,0, sulfato de amonio 1-2 M, 20 mg / ml de la proteína en tampón de almacenamiento (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%) en una proporción de gota de 1 µl: 1 µl se prepararon y equilibraron frente a un depósito de 250 µl. Además, los cristales se recogieron y se dejaron en remojo en una gota de 4 μl que contenía una solución de reservorio y fragmentos / compuesto 10 mM (en DMSO) que luego se equilibraron con 700 μl de la solución de reservorio correspondiente durante la noche a 19 ° C en un colgador de 24 pocillos. configuración de difusión de vapor de gotas.

Cocristalización de la proteína TrmD con SAM / SAH / AW6 / AW7

Se añadió una concentración final de 2-5 mM de compuesto en DMSO / agua a 20 mg / ml de proteína TrmD, se mezcló y se incubó durante 2 h en hielo. Los cristales se cultivaron en las siguientes condiciones: cacodilato de sodio 0,08 mM pH 6,5 a 7,0, sulfato de amonio 1-2 M o en pantallas de matriz dispersa: Wizard 1 & amp2 (Molecular Dimensions), Wizard 3 & amp4 (Molecular Dimensions), JCSG + Suite (Molecular Dimensions) . Las gotas de cristalización se establecieron en una proporción de gota de proteína a depósito de 0.3 μl: 0.3 μl, en una placa de gotas de asiento de 96 pocillos (MRC2), utilizando un robot de cristalización de mosquitos (TTP labtech) y las gotas se equilibraron contra 70 μl de depósito en 19 ° C.

Recopilación y procesamiento de datos de rayos X

Los cristales unidos a ligando / apo de TrmD se crioenfriaron en aguas madres que contenían etilenglicol al 27,5%. Se recopilaron conjuntos de datos de rayos X en líneas de luz I04, I02, I03, I04-1 o I24 en Diamond Light Source en el Reino Unido, utilizando el método de rotación a una longitud de onda de 0,979 Å, inicio Omega: 0 °, Oscilación Omega: 0,1– 0,2 °, oscilación total: 210–240 °, imágenes totales: 2100–2400, tiempo de exposición: 0,05–0,08 s. Las imágenes de difracción se procesaron usando AutoPROC (26), utilizando XDS (27) para indexación, integración, seguido de los programas POINTLESS (28), AIMLESS (29) y TRUNCATE (30) de CCP4 Suite (31) para reducción de datos, escalado y cálculo de amplitudes de factores de estructura y estadísticas de intensidad. Todos los cristales TrmD pertenecían al grupo espacial PAG212121 y constaba de dos protómeros en la unidad asimétrica.

Solución y refinamiento de estructuras

los M. abscessus La estructura de TrmD Apo se resolvió mediante reemplazo molecular usando PHASER (32) con las coordenadas atómicas de M. abscessus TrmD a 1,7 Å (entrada de PDB: Consorcio de Genómica Estructural de Seattle 3QUV para Enfermedades Infecciosas) como modelo de búsqueda y las estructuras unidas al ligando de TrmD se resolvieron mediante reemplazo molecular con las coordenadas atómicas de las M. abscessus Estructura de TrmD Apo (entrada PDB: 6NVR) como modelo de búsqueda. El refinamiento de la estructura se llevó a cabo utilizando REFMAC (33) y PHENIX (34).

Los modelos obtenidos se reconstruyeron manualmente utilizando el programa de gráficos interactivos COOT (35) y los mapas de densidad de electrones se calcularon con 2 |Fo| – |FC| y |Fo| – |FC| coeficientes. Las posiciones de los ligandos y las moléculas de agua se localizaron en mapas de densidad electrónica de diferencia y mapas de diferencia OMIT | mFo - DFC| (36) se calcularon y analizaron para verificar más las posiciones de los fragmentos y ligandos.

Fluorimetría diferencial de barrido (DSF)

Los DSF se llevaron a cabo en un formato de 96 pocillos con cada pocillo que contenía 25 μl de mezcla de reacción de proteína TrmD 10 μM en tampón (HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5%), compuesto 5 mM, DMSO al 5% y 5 × Tinte naranja Sypro. También se incluyeron controles apropiados positivos (proteína, DMSO y SAM) y negativos (proteína, solo DMSO). Las mediciones se realizaron en un termociclador Biorad-CFX connect utilizando el siguiente programa: 25 ° C durante 10 min seguido de un incremento lineal de 0,5 ° C cada 30 s para alcanzar una temperatura final de 95 ° C. Los resultados se analizaron con Microsoft Excel.

Calorimetría de titulación isotérmica (ITC)

Los experimentos de ITC para cuantificar la unión de ligandos a TrmD se realizaron como se describe en (37) usando sistemas Malvern MicroCal iTC200 o Auto-iTC200 a 25 ° C. Las titulaciones consistieron en una inyección inicial (0,2 µl), descartada durante el procesamiento de datos, seguida de 19 (2 µl) o 39 (1 µl) inyecciones separadas por intervalos de 60 a 150 s de duración. La proteína se dializó durante la noche a 4 ° C en tampón de almacenamiento (M. abscessus TrmD: HEPES 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 5% M. tuberculosis TrmD: HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 500 mM). Las soluciones de células de muestra y jeringas se prepararon utilizando el mismo tampón de almacenamiento, con una concentración final de DMSO del 2 al 10% según la solubilidad del ligando en el tampón. Se utilizaron concentraciones de TrmD de 33 o 100 µM, con relaciones de concentración de ligando a proteína que iban de 10 a 20: 1. También se realizaron titulaciones de control sin proteína y se restaron de las titulaciones de ligando a proteína. Las titulaciones se ajustaron con el software Origin (OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.), Utilizando un modelo de unión de un sitio con norte fijado a 1 sólo para ligandos de unión débil. Las titulaciones se realizaron típicamente una vez (norte = 1), con múltiples isotermas obtenidas (norte & gt 1) para compuestos clave de interés. KD los valores se informan con dos cifras significativas. El error proporcionado por el software Origin debido al ajuste del modelo se informa cuando norte = 1, mientras que la desviación estándar se informa cuando norte & gt 1.

Síntesis química de compuestos.

Los compuestos AW1-7 se sintetizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en la información de apoyo. En una publicación correspondiente de Whitehouse se describe una discusión más profunda sobre la estrategia de química médica para la fusión de fragmentos y el desarrollo de compuestos principales. et al. (37). Los compuestos AW1-7 se enumeran en esta publicación de la siguiente manera: AW1 (Compuesto 23), AW2 (Compuesto 24f), AW3 (Compuesto 26f), AW4 (Compuesto 28), AW5 (Compuesto 29a), AW6 (Compuesto 31a) y AW7 (Compuesto 29d).

Ensayos de actividad bioquímica

Los ensayos para cuantificar las reacciones de metilación de TrmD se llevaron a cabo en reacciones de 20 μl que consistían en 6,25 μM de SAM, 0,1 μM de TrmD y 6,25 μM de tRNA Pro. UGG en presencia de compuestos de 0 a 500 μM en diluciones seriadas con tampón de ensayo que contiene Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl 10 mM2, NH 24 mM4Cl, DMSO al 5% y DTT 1 mM en agua libre de nucleasas. Las secuencias de ARNt se identificaron a partir de M. abscessus secuencia del genoma usando el algoritmo tRNAscan-SE, (38, 39). El sustrato M. abscessus tRNA Pro UGG para el ensayo, que tiene la secuencia 5'-CGGGGUGUAGCGCAGCUUGGUAGCGCAUCCGCUUUGGGAGCGGAGGGUCGCAGGUUCAAAUCCUGUCACCCCGA-3 ', se adquirió comercialmente de Integrated DNA Technologies (EE. UU.). Las reacciones se llevaron a cabo durante 1 ha temperatura ambiente seguido de la adición de EDTA 20 mM para detener las reacciones. Cada una de las muestras de 20 μl se diluyó diez veces con el disolvente A de la fase móvil de UPLC (ácido fórmico al 0,1% en agua), se centrifugó durante 10 min a 13000 g para eliminar cualquier precipitado y el sobrenadante se dividió en alícuotas en 96 pocillos. platos. A continuación, se inyectaron muestras de 40 μl en una columna Acquity UPLC (Waters) T3 de 1,8 μM y se eluyeron utilizando una elución en gradiente que constaba de Fase móvil A: ácido fórmico al 0,1% en agua y fase móvil B: ácido fórmico al 0,1% en metanol al 100% durante 4 min. . La absorbancia se controló utilizando un detector de matriz de fotodiodos (PDA) (Waters) en un rango de longitud de onda de ƛ: 220-500 nm. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado. Los datos corregidos en blanco se analizaron utilizando Microsoft Excel y análisis de regresión no lineal para IC50 La determinación se realizó utilizando el prisma GraphPad versión 7.00, GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.

Cepas de micobacterias utilizadas y mediciones de MIC

Mycobacterium abscessus ssp. absceso (ATCC 19977) transformado con plásmido pmv310 que expresa el operón Lux ABDCE, cultivado en caldo Middlebrook 7H9 suplementado con ADC (Sigma, Reino Unido). Todas las demás cepas de NTM son aislados clínicos. Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) se determinaron para las micobacterias de acuerdo con el método M07-A9 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Brevemente, las micobacterias se cultivaron a densidad óptica (A600 nm) de 0,2-0,3 en cultivo líquido y se añadieron 1 x 105 bacterias a cada pocillo de placas de 96 pocillos que contenían diluciones seriadas del compuesto (400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, 0,8, 0.4, 0 μM), en pocillos triplicados por condición, y se incubaron a 37 ° C hasta que se observó crecimiento en los pocillos de control. Mediciones MIC usando M. tuberculosis Se realizaron H37Rv como se informa en (37). M. tuberculosis Se cultivó H37Rv en una base Middlebrook 7H9 que contenía 14 mg / l de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), 0,81 g / l de NaCl, 0,3 g / l de casitona y 0,05% de Tyloxapol. Se cultivó H37Rv y se diluyó hasta un tamaño de inóculo similar al mencionado anteriormente antes de la exposición a diluciones en serie de compuestos (comenzando a 100 µM), y las placas se incubaron a 37ºC durante 2 semanas. El valor de MIC se determinó como el último pocillo que no mostró crecimiento bacteriano.

Derribo de CRISPR – dCas9 en M. abscessus

El plásmido que codifica dCas9 (pTetInt-dcas9-Km) y el segundo vector que contiene el casete sgRNA (pGRNAz) se derivaron del sistema de interferencia CRISPr inducible por tetraciclina de Choudhary et al. (40) y optimizado para M. abscessus ATCC19977. Las guías de 20 nucleótidos dirigidas a yidC (MAB_4953c) y trmD (MAB_3226c) se hibridaron y clonaron entre sphI y aclI del pGRNAz. Como control, el pGRNAz se dejó vacío. Las cepas que contenían CRISPr-I se cultivaron en caldo Middlebrook 7H9 suplementado con ADC 1x, tween80 al 0,05% y glicerol al 0,5%, higromicina 1 mg / ml y zeocina 300 µg / ml. Los cultivos se inocularon a 10 ^ 6 UFC / ml a partir de precultivos desarrollados exponencialmente. El compuesto AW7 y la doxiciclina se añadieron o no a una concentración de 25 µM y 1,5625, 6,25, 25 o 100 ng / ml respectivamente. El OD600 se midió y se contaron las UFC a las 72 h.

Estudio de infección por macrófagos

Las muestras de sangre fueron donadas por voluntarios sanos que habían obtenido el consentimiento informado de acuerdo con la aprobación del Comité de Ética en Investigación local. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de muestras de sangre periférica con citrato mediante separación en gradiente de densidad usando Lympholyte (Cedarlane Labs) y posterior selección positiva de CD14 + usando el protocolo de microperlas MACS Miltenyi Biotec Human CD14 (Miltenyi Biotec). Las células CD14 + se diferenciaron en macrófagos utilizando factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humanos recombinantes (200 ng / ml de GM-CSF) e interferón gamma humano recombinante (50 ng / ml de IFNγ) (Peprotech) en medio DMEM de cultivo de tejidos estándar que contiene suero de ternero fetal, penicilina y estreptomicina. Después de la eliminación de los antibióticos, los macrófagos se infectaron con una multiplicidad de infección de 10: 1 con M. abscessus 19977 durante 2 h, se lavó en solución salina tamponada con fosfato estéril y luego se incubó en medio DMEM con FCS y 25 μM de compuesto durante 24 y 48 h.En los puntos de tiempo dados, el sobrenadante se guardó para estudios de citotoxicidad celular, y M. abscessus supervivencia dentro de los macrófagos calculada por lisis de macrófagos en agua estéril y cálculo de la unidad formadora de colonias en placas de Columbia Blood Agar (VWR BDH).

Citotoxicidad

La lactato deshidrogenasa (LDH) se midió como un biomarcador de citotoxicidad celular utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad Pierce LDH. El sobrenadante celular se midió a las 2, 24 y 48 h después de la infección de acuerdo con el protocolo del kit.

Derivado de ratón desnudo M. leprae

Mycobacterium leprae (aislado Thai-53) se mantuvo en pases seriados en las almohadillas de las patas de ratones desnudos atímicos (Envigo, EE. UU.). Los ratones se inocularon en la superficie plantar de ambas patas traseras con 5 x 107 ratones desnudos viables frescos derivados M. leprae. Cuando las almohadillas de las patas del ratón se agrandaron moderadamente (entre los 5 y los 6 meses aproximadamente), se recolectaron para fines intracelulares. M. leprae como se describió anteriormente (41), lavado por centrifugación, resuspendido en medio, enumerado por recuento directo de bacilos acidorresistentes según el método de Shepard (42), mantenido a 4 ° C en espera de pruebas de control de calidad para contaminación y viabilidad (41). Los bacilos recién recolectados siempre se emplearon en experimentos dentro de las 24 h posteriores a la recolección.

M. leprae cultura axénica

Almohadilla de pie de ratón desnuda recién cosechada derivada M. leprae se suspendieron en medio 7H12 modificado, AW7 se añadió a diferentes concentraciones (100–6,25 μM) y se incubaron durante 7 días a 33 ° C. Como controles negativos y positivos se utilizaron solo medios y rifampicina (Sigma, EE. UU.) A 2,4 μM. Después de las alícuotas de incubación de AW7 tratado y control M. leprae fueron procesados ​​para radiorrespirometría (RR) como se describió anteriormente (43).

M. leprae cultivo de macrófagos

Se obtuvieron asépticamente células de médula ósea de ambos fémures de ratones hembra BALB / c y se cultivaron en cubreobjetos de plástico en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Life Technologies, EE. UU.) Suplementado con suero de ternero fetal al 10% (v / v) (Life Technologies) , 25 mM / l de HEPES (Sigma, EE. UU.), 2 mM / l de glutamina (Sigma, EE. UU.), 50 μg / ml de ampicilina (Sigma, EE. UU.) Y 10 ng / ml de factor estimulante de colonias de macrófagos murinos recombinantes (R & ampD Systems, EE. UU. ) durante 6 a 7 días a 37 ° C y 5% de CO2. Las células se infectaron con almohadillas de patas de ratones desnudos recién recolectadas derivadas de M. leprae a una multiplicidad de infección (MOI) de 20: 1 durante la noche a 33 ° C y luego se lava para eliminar las bacterias extracelulares. AW7 se añadió a diferentes concentraciones (100–6,25 μM) y las células se incubaron durante 7 días a 33 ° C. Se utilizaron solo medios y rifampicina a 2,4 μM como controles negativos y positivos. AW7 Las células tratadas y de control se lisaron con dodecilsulfato de sodio (SDS, 0,1% p / v, Sigma, EE. UU.) y el intracelular M. leprae procesado para radiorrespirometría (44).

Radiorrespirometría

Metabolismo de una suspensión de M. leprae se midió evaluando la oxidación del ácido 14 C-palmítico a 14 CO2 por radiorrespirometría como se describió anteriormente (45). Niveles de 14 CO capturado2 es proporcional a la tasa de oxidación del ácido 14 C-palmítico y se utiliza como indicador de M. leprae viabilidad. En el presente estudio se registraron los recuentos acumulados por minuto (CPM) del séptimo día y se determinó el porcentaje de inhibición del metabolismo en comparación con ningún control de fármaco. La significancia estadística entre los grupos de tratamiento y sin control de drogas fue determinada por Student's t-prueba y PAG & lt 0,05 se considera significativo.


El ácido úrico promueve una respuesta inflamatoria aguda a la muerte celular estéril en ratones

1 Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Worcester, Massachusetts, EE. UU. 2 Departamento de Ciencia y Tecnología Bioquímica, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, Taiwán.

Envíe la correspondencia a: Kenneth L. Rock, Departamento de Patología, Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, 55 Lake Ave. North, Worcester, Massachusetts 01655, EE. UU. Teléfono: 508.856.2521 Fax: 508.856.1094 Correo electrónico: Kenneth.[email protected]

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Abstracto

La inflamación se produce en respuesta tanto a la agresión patógena como al daño tisular en condiciones estériles, y estas últimas contribuyen a la patogenia de muchas enfermedades. Aunque se han sugerido varias sustancias endógenas, incluido el ácido úrico, para alertar al cuerpo del peligro y estimular la inflamación, se sabe poco acerca de su contribución a tales respuestas in vivo. En este número de la JCI, Kono et al. utilizar ratones recién generados con niveles reducidos de ácido úrico para investigar su papel como una señal endógena de daño tisular en las respuestas inflamatorias a la lesión hepática. Encuentran que el ácido úrico se libera de los tejidos moribundos e induce la inflamación hasta la muerte celular, pero no participa en la respuesta a moléculas microbianas o partículas irritantes estériles. Creo que este es el primer informe de una señal de peligro endógena que actúa como regulador fisiológico de la inflamación.

Autores

La necrosis estimula la inflamación y esta respuesta es médicamente relevante porque contribuye a la patogenia de varias enfermedades. Se cree que la necrosis estimula la inflamación porque las células moribundas liberan moléculas proinflamatorias que son reconocidas por el sistema inmunológico. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre la identidad molecular de estas moléculas y su contribución a las respuestas in vivo. Aquí, investigamos el papel del ácido úrico en la respuesta inflamatoria a las células necróticas en ratones. Descubrimos que las células muertas no solo liberaban reservas intracelulares de ácido úrico, sino que también lo producían en grandes cantidades post mortem a medida que se degradaban los ácidos nucleicos. Usando ratones Tg recientemente desarrollados que tienen niveles reducidos de ácido úrico intracelular y / o extracelularmente, encontramos que el agotamiento del ácido úrico reduce sustancialmente la respuesta inflamatoria inducida por la muerte celular. Se obtuvieron resultados similares con tratamientos farmacológicos que redujeron los niveles de ácido úrico ya sea bloqueando su síntesis o hidrolizándolo en los fluidos extracelulares. Es importante destacar que el agotamiento del ácido úrico inhibió selectivamente la respuesta inflamatoria a las células moribundas, pero no a las moléculas microbianas o las partículas irritantes estériles. En conjunto, nuestros datos identifican al ácido úrico como una molécula proinflamatoria liberada por las células moribundas que contribuye significativamente a las respuestas inflamatorias inducidas por la muerte celular in vivo.

Cuando las células experimentan necrosis in vivo, desencadenan una respuesta inflamatoria aguda (1). El flujo sanguíneo local aumenta, las vénulas pierden líquido rico en proteínas y los leucocitos se extravasan de la sangre al tejido. Los neutrófilos son las primeras células reclutadas en el sitio de la muerte celular, y esto es seguido más tarde por una afluencia de monocitos. Estos eventos ocurren siempre que ocurre una necrosis significativa y son tan reproducibles que la progresión de la respuesta inflamatoria se usa de manera forense para fechar el momento de la lesión tisular (2).

¿Por qué la muerte celular debería estimular una respuesta inflamatoria? La necrosis no es típicamente un evento fisiológico normal, sino que ocurre como consecuencia de algún proceso patológico que daña las células como tal, la necrosis es un presagio de una amenaza potencial para el huésped (3). Presumiblemente debido a esto, el sistema inmunológico innato se moviliza rápidamente para entregar las defensas solubles y celulares al sitio de la lesión. Una vez desplegadas, las defensas se activarán e intentarán neutralizar o aislar a los agentes dañinos que estén presentes. También ayudan a eliminar las células muertas y los desechos y estimulan los mecanismos para reparar el daño tisular. Por otro lado, el reclutamiento de las defensas innatas tiene un precio (4 - 6). La entrega de los mecanismos efectores inmunes es imprecisa y, como resultado, las células sanas normales pueden quedar atrapadas en la línea de fuego y dañarse. Las enzimas hidrolíticas y los compuestos químicos altamente reactivos, como los radicales de oxígeno, se escapan de los leucocitos vivos y moribundos, y estas moléculas causan daños en las células del medio ambiente. En las infecciones, este proceso suele ser de corta duración y el daño colateral resultante es un pequeño precio a pagar para contener una afección potencialmente mortal. Sin embargo, en situaciones de muerte celular estéril, y cuando este proceso es crónico, la relación costo-beneficio es menos favorable y puede conducir a la enfermedad. Debido a estos efectos positivos y negativos, es importante comprender los mecanismos por los cuales la muerte celular conduce a la inflamación (7, 8).

¿Cómo provoca realmente la muerte celular una respuesta inflamatoria? Se cree que las células contienen moléculas inmunoestimuladoras (a menudo denominadas patrones moleculares asociados al daño [DAMP]) que no están expuestas en las células vivas, pero que se liberan tras la necrosis (9 - 11). El sistema inmunológico innato ha desarrollado la capacidad de reconocer y luego responder a la presencia de DAMP. Puede haber diferentes clases de DAMP que actúan sobre diferentes dianas celulares y tienen diferentes efectos biológicos. Por ejemplo, algunos DAMP pueden desencadenar inflamación (denominados aquí DAMP proinflamatorios) (12) y otros pueden funcionar como adyuvantes para promover respuestas inmunitarias adaptativas (13), mientras que otros pueden afectar otros procesos como el comportamiento tumoral (14).

La identidad molecular de los DAMP proinflamatorios es muy poco conocida. Recientemente se han descrito algunas moléculas candidatas potenciales, incluidas moléculas como HMGB1 (12), SAP130 (15), cadena pesada de miosina (16) y fragmentos de componentes de la matriz extracelular (generados a partir de hidrolasas liberadas de células muertas) (17, 18). ). Sin embargo, aunque estas moléculas tienen potencial proinflamatorio, su función real en la inflamación inducida por la muerte celular in vivo no está clara en su mayor parte. Por ejemplo, mientras que HMGB1 puede inducir inflamación (12), las células mutantes necróticas que carecen de HMGB1 son tan proinflamatorias como las células WT (19), ya sea porque HMGB1 no es realmente un DAMP proinflamatorio in vivo o porque la redundancia en DAMP proinflamatorios hace que su presencia no sea esencial. claro. La determinación de la identidad molecular de los DAMP y su contribución a la inflamación in vivo es importante porque estas moléculas podrían ser objetivos de intervención terapéutica para prevenir o tratar enfermedades causadas por la inflamación inducida por la muerte celular.

Anteriormente habíamos encontrado que el ácido úrico se libera de las células moribundas, donde luego funciona como un adyuvante que promueve la generación de una respuesta inmune adaptativa (13, 20). Se cree que la forma activa de esta molécula es el urato monosódico, que actúa para promover las respuestas inmunitarias estimulando las células dendríticas. Independientemente de esto y en otros entornos, los cristales de urato monosódico pueden desencadenar inflamación, y cuando esto ocurre espontáneamente en pacientes hiperuricémicos, causa la enfermedad inflamatoria de la gota (21). Estos hallazgos nos han llevado a plantear la hipótesis de que el ácido úrico liberado por las células moribundas podría funcionar como un DAMP proinflamatorio que contribuye a la inflamación inducida por la muerte celular. Los estudios de este informe se diseñaron para probar esta hipótesis.

Modelos de ratón Uricase Tg. Para analizar los roles del ácido úrico in vivo, sería útil tener animales deficientes en esta molécula. Es posible reducir los niveles de ácido úrico en animales mediante enfoques farmacológicos. Un enfoque ha sido bloquear su síntesis. El ácido úrico se genera a partir de la xantina por la xantina oxidasa, y esta reacción puede ser inhibida por el alopurinol, un análogo del ácido úrico (22). Una limitación de este enfoque es que solo reduce parcialmente pero no elimina el ácido úrico de las células y los fluidos corporales. Otro método consiste en reducir el ácido úrico mediante la administración de uricasa, una enzima que oxida el ácido úrico en alantoína y agua. Este tratamiento puede reducir notablemente los niveles de ácido úrico, pero tiene limitaciones en su farmacocinética, incluida la distribución lenta en los fluidos intersticiales y la rápida eliminación de la sangre. Las fuentes actualmente disponibles de esta enzima son inmunogénicas en ratones y provocan anticuerpos neutralizantes, lo que excluye el uso a largo plazo in vivo. (23). Debido a estos problemas, sería atractivo tener modelos genéticos que sean establemente deficientes en ácido úrico que pudieran usarse además de los tratamientos farmacológicos. Desafortunadamente, los ratones que son genéticamente deficientes en xantina oxidasa y, por lo tanto, no pueden producir ácido úrico, se corren al nacer y mueren después de varias semanas (24).

Decidimos seguir un enfoque diferente para desarrollar ratones con deficiencia de ácido úrico. Presumimos que la expresión de uricasa murina como un transgén podría reducir crónicamente los niveles de ácido úrico en los tejidos y superar algunas de las limitaciones de los otros enfoques disponibles. La uricasa solo se expresa en el hígado de los ratones. Clonamos este gen del hígado de ratón y lo usamos para producir 2 construcciones diferentes. En una construcción, el cDNA de uricasa se fusionó con una secuencia señal del adenovirus E3-gp19K gen de modo que cuando se expresa, la proteína uricasa sería secretada en los fluidos extracelulares (Figura 1A y ref. 25). La idea aquí era que la uricasa secretada agotaría el ácido úrico de los fluidos intersticiales de los tejidos. En otra construcción, el cDNA de uricasa se dirigió a peroxisomas usando su secuencia de dirección endógena (Figura 1A, a esto se hace referencia en el presente documento como la construcción de uricasa intracelular). La idea detrás de esta construcción era que el transgén debería reducir las reservas intracelulares de ácido úrico y, después de que las células mueren y liberan la enzima, también agotar el ácido úrico del entorno de las células muertas. Por lo tanto, estos animales de 2 Tg fueron diseñados para reducir los niveles de ácido úrico alrededor de las células moribundas, pero para hacerlo de diferentes maneras. Tanto la construcción de uricasa secretada como la intracelular se colocaron bajo el control del promotor de la actina β para que se expresaran y ejercieran sus efectos ampliamente en la mayoría de los tejidos (26). Estas construcciones de uricasa se inyectaron en los núcleos de huevos C57BL / 6 fertilizados y se generaron varios fundadores de Tg independientes. Los animales eran viables, fértiles y sin anomalías fenotípicas obvias. También se generó una tercera construcción en la que se eliminó la secuencia de dirección peroxisomal para que la uricasa se expresara en el citosol; sin embargo, las células no toleraron la expresión estable de este ADNc, por lo que no se usó en nuestros estudios (datos no mostrados).

Generación y caracterización de ratones Tg uricasa. (A) Construcción de transgenes uricasa. La uricasa secretada (ssUOX) se generó mediante la adición N-terminal de una secuencia señal para la secreción derivada del adenovirus gp19K (gp19K-ss). La uricasa intracelular no modificada (intUOX) tiene una secuencia de señal de dirección de peroxisoma C-terminal (PTS). (B) Western blot de uricasa y α-tubulina (control de carga) en órganos de ratones Tg o WT. (C) Actividad uricasa en órganos y suero. Se inyectaron ratones WT C57BL / 6 con 9 μg de i.p. y 9 μg de i.v. rasburicasa donde esté indicado. Se recogieron órganos de ratones WT, uricasa Tg o ratones WT no tratados 18 horas después de la inyección de rasburicasa, y se prepararon los lisados. Se agregaron 20 μl de lisado de varios órganos a 1 ml de solución de ácido úrico (DO292 = 1,0) y se incubó a 37 ° C durante los períodos de tiempo indicados. La actividad de la uricasa se midió mediante la disminución de la DO292. (D) Cantidad de ácido úrico en la cavidad peritoneal en ratones WT y uricasa Tg (norte = 6). (mi) Concentración plasmática de ácido úrico en ratones WT y uricasa Tg. Las muestras se extrajeron y se enfriaron inmediatamente en hielo para evitar que la uricasa oxidara el ácido úrico ex vivo (norte = 13–19). (F) Número total de neutrófilos en la cavidad peritoneal después de 15 horas después de la administración i.p. inyección de 2 mg de cristales de urato monosódico. norte = 6 (PBS) norte = 15 (PESO) norte = 8 (ssUOX). **PAG & lt 0.01 *PAG & lt 0.05 versus WT en (DF).

Analizamos la expresión de uricasa por Western blot en suero y lisados ​​tisulares de animales WT y Tg. La uricasa fue indetectable en el suero de los ratones WT y los Tg para la construcción intracelular, como se esperaba (Figura 1B). Por el contrario, la uricasa estaba presente en el suero de ratones Tg para la secuencia señal-uricasa constructo, lo que indica que el transgén fue secretado, como se esperaba (Figura 1B). Es de suponer que la mayor parte de la enzima en el suero se origina en los líquidos intersticiales (administrados después del drenaje a través de los vasos linfáticos) y posiblemente también de las células de la sangre y los tejidos con arquitectura sinusoidal (p. Ej., El bazo, el hígado y la médula ósea). En los animales WT, la uricasa fue indetectable en todos los tejidos excepto en el hígado, como se esperaba (Figura 1B). Por el contrario, la uricasa fue detectable en todos los tejidos de ambos animales Tg, incluido el hígado, donde estaba presente en cantidades elevadas en comparación con los ratones WT (Figura 1B). Por tanto, las construcciones de Tg uricasa se expresaron con la distribución esperada.

Para verificar que la Tg uricasa estaba activa, también realizamos ensayos enzimáticos en lisados ​​de suero y tejido. La actividad uricasa solo se detectó en el suero de las Tgs de uricasa secretadas y no en las intracelulares o animales WT. Los lisados ​​de todos los órganos examinados de ambas Tgs contenían uricasa activa (Figura 1C), mientras que todos los tejidos de los ratones WT, excepto el hígado, carecían de esta actividad. El contenido de uricasa secretada varió entre diferentes lisados ​​de tejido, presumiblemente debido a diferencias en la cantidad de esta enzima en el RE, la vía exocítica y posiblemente el líquido extracelular. Curiosamente, los lisados ​​de la mayoría de los tejidos de animales inyectados i.v. 18 horas antes con uricasa recombinante tenía poca o ninguna actividad uricasa, presumiblemente porque la enzima permaneció intravascular y / o se eliminó, la excepción fue el pulmón (Figura 1C).Estos resultados indican que las formas recombinantes intracelulares y secretadas de uricasa son enzimáticamente activas, tanto en las células como, cuando se secretan, en el entorno extracelular y el suero de ratones.

Niveles de ácido úrico en ratones Tg con uricasa. A continuación, examinamos los efectos de la uricasa expresada sobre los niveles de ácido úrico en los diversos ratones Tg. En los ratones que expresan uricasa secretada, predijimos que habría una reducción en los niveles de ácido úrico en los fluidos intersticiales. Evaluamos esta predicción en el líquido peritoneal residente muestreado por lavado. Como se predijo, los niveles de ácido úrico en el líquido peritoneal de los ratones Tg con uricasa secretada se redujeron significativamente en comparación con los animales WT, aunque la reducción no fue completa (

60% Figura 1D). También medimos los niveles de ácido úrico en suero recién aislado y encontramos que se redujeron en aproximadamente un 30% en los animales Tg de uricasa secretada, aunque esta reducción fue más modesta que en el peritoneo, fue significativa (PAG & lt 0.05 Figura 1E). Es probable que la mayor reducción del ácido úrico en los fluidos tisulares en comparación con el suero refleje la secreción directa de uricasa en los fluidos tisulares, donde, debido al pequeño volumen de líquido, la enzima se encuentra presumiblemente en una concentración más alta que después de ser reabsorbida y distribuido por todo el suero. Para determinar si la uricasa secretada era suficiente para inhibir las respuestas inflamatorias al ácido úrico, inyectamos cristal de urato monosódico i.p en ratones control o ssUOX Tg y encontramos que las respuestas inflamatorias resultantes fueron inhibidas significativamente por la uricasa secretada (Figura 1F).

Tras incubar el suero de animales WT, los niveles de ácido úrico ex vivo se mantuvieron estables (Figura 2A). Hubo una reducción lenta y modesta en los niveles de ácido úrico tras la incubación del suero de los ratones Tg intracelulares, lo que indica la presencia de una pequeña cantidad de uricasa (Figura 2A). En contraste, después de la incubación del suero de los ratones Tg de uricasa secretada, los niveles de ácido úrico cayeron rápidamente a niveles indetectables, lo que refleja la actividad de la uricasa presente en el suero (Figura 2A). El hecho de que el ácido úrico todavía estuviera presente en presencia de uricasa activa en el suero indica que in vivo, la producción de ácido úrico excede su eliminación. Dado que los niveles de ácido úrico están regulados in vivo por la producción celular, así como por la adsorción desde el intestino y la lectura en el riñón (27), es posible que en los ratones Tg, haya habido aumentos compensatorios en estos procesos en respuesta a la pérdida de ácido úrico sin embargo, este problema no ha sido investigado. No hubo aumento de ácido úrico en homogeneizados de ningún tejido en ratones ssUOX Tg, y más bien se encontró alguna disminución en varios órganos. En cualquier caso, estos datos indican que los ratones Tg de uricasa secretada tienen una reducción significativa de los niveles de ácido úrico en los fluidos extracelulares y el suero.

Generación de ácido úrico tras la muerte celular. (A) Cambio de la concentración de ácido úrico en suero de ratones WT y uricasa Tg incubados ex vivo. Se recogió suero de ratones uricasa Tg después de dejarlos coagular a temperatura ambiente y posteriormente se incubó a 37 ° C durante los tiempos indicados en que se midió la concentración de ácido úrico (norte = 32–36). (B) Generación de ácido úrico tras la muerte celular. Los lisados ​​de tejido obtenidos de los órganos indicados de ratones uricasa Tg o compañeros de camada WT se incubaron a 37ºC durante los tiempos indicados. El contenido de ácido úrico se normalizó con la concentración de proteínas. (C) El ácido úrico post mórtem es generado por la xantina oxidasa. Los lisados ​​de tejido se incubaron a 37 ° C durante los tiempos indicados en presencia de alopurinol (128 mg / l) o uricasa (0,5 mg / ml). Se muestran las concentraciones de ácido úrico en el lisado tisular.

En ratones Tg para la construcción de uricasa intracelular, examinamos los niveles intracelulares de ácido úrico. En la mayoría de los tejidos de Tg, encontramos una reducción parcial pero significativa (30% -70%) en los niveles intracelulares de ácido úrico en comparación con las células WT (Figura 2B y Figura 1 suplementaria material suplementario disponible en línea con este artículo doi: 10.1172 / JCI40124DS1 ). Curiosamente, cuando las células muertas se cultivaron a 37 ° C, como ocurriría cuando las células mueren in vivo, observamos un marcado aumento en los niveles de ácido úrico en las células WT. Este aumento en la síntesis fue bloqueado por inhibidores de la xantina oxidasa, lo que indica que las purinas se metabolizan en ácido úrico post mórtem (Figura 2C). Sorprendentemente, este aumento post mórtem de ácido úrico se suprimió en ratones Tg de uricasa tanto intracelulares como secretables. Estos datos indican que la uricasa recombinante intracelular y secretable se libera de las células muertas y elimina el ácido úrico endógeno y recién producido en el entorno local. Los niveles séricos de ácido úrico no se redujeron en la Tgs de uricasa intracelular (Figura 1E), y esto no fue sorprendente, dado que una cantidad sustancial de ácido úrico se origina en la dieta (absorbido desde el intestino) y que solo hubo una reducción parcial en las reservas intracelulares de ácido úrico en las Tgs. Además, hay poca uricasa intracelular liberada en el suero (Figura 1B y Figura 2A).

En resumen, los animales de 2 Tg tienen diferentes distribuciones de uricasa y reducciones correspondientes parciales pero significativas en ácido úrico en diferentes compartimentos corporales. La uricasa Tg secretada tiene uricasa y ácido úrico reducido en los líquidos extracelulares. Los animales Tg de uricasa intracelular tienen uricasa intracelularmente que reduce los depósitos intracelulares, pero no extracelulares, de ácido úrico. Además, la Tg uricasa se libera en forma activa de las células muertas y luego elimina el ácido úrico dentro y alrededor de las células muertas. Por lo tanto, estos 2 transgenes diferentes reducirán el ácido úrico alrededor de las células moribundas, pero lo harán de formas algo diferentes.

Efecto del agotamiento del ácido úrico sobre la inflamación hasta la muerte celular en el hígado. Para examinar el papel del ácido úrico en la inflamación inducida por la muerte celular, utilizamos un modelo de lesión hepática bien establecido en el que los ratones fueron tratados con una dosis tóxica de acetaminofén (19). Este fármaco se metaboliza en el hígado a N-acetil-p-benzoquinona imina, lo que provoca necrosis en las regiones centrolobulillares de este órgano. La muerte celular estéril resultante estimula una fuerte respuesta inflamatoria neutrofílica, que puede cuantificarse midiendo el contenido de una enzima mieloperoxidasa (MPO) específica de neutrófilos en el hígado (19). La extensión de la lesión hepática se puede cuantificar midiendo la cantidad de enzimas citosólicas hepáticas (alanina aminotransferasa [ALT]) liberadas y presentes en el suero.

Los 2 modelos de ratón Tg con uricasa y los ratones WT se trataron con una única dosis tóxica de acetaminofén. Se cuantificó la respuesta inflamatoria resultante a la muerte celular en el hígado y se encontró que era muy diferente en los ratones WT versus uricasa Tg. El hígado lesionado en los animales WT desarrolló una fuerte inflamación neutrofílica, mientras que la inflamación en los hígados lesionados de los ratones Tg se redujo notablemente (Figura 3A). La reducción en la respuesta inflamatoria se observó tanto en los ratones Tg de uricasa intracelular como secretada, con una inhibición algo mayor con la construcción intracelular (Figura 3A). El infiltrado de células inflamatorias en los hígados tratados se caracterizó además por disociar el hígado en una separación unicelular seguida de tinción inmunofluorescente y citometría de flujo (Figura complementaria 2). Dieciocho horas después de la lesión, las células inflamatorias predominantes fueron neutrófilos (como se esperaba) y su número se redujo significativamente en ambas Tgs de uricasa. Había muchos menos monocitos, macrófagos, células T o células B en este momento después de la lesión, y su número no se redujo significativamente en ninguna de las Tgs de uricasa (Figura 2 complementaria). La detección inmunohistoquímica de neutrófilos mediante tinción para la actividad de esterasa reveló de manera similar la infiltración de neutrófilos y una reducción en su número en ambos ratones Tg con uricasa (Figura 3, B y C). Además de medir la MPO en el hígado, analizamos los niveles de citocinas proinflamatorias en los animales de control y tratados. Pudimos detectar niveles elevados de IL-1βMIP2 y KC de los animales de control tratados, y los niveles de estos mediadores proinflamatorios se redujeron significativamente en el suero y / o hígado de los ratones UOX-Tg (Figura complementaria 3).

Reducción del reclutamiento de neutrófilos a la lesión hepática en ratones Tg con uricasa. Actividad MPO del tejido hepático (A), número de células esterasas positivas (neutrófilos) (B), histología de secciones teñidas para actividad esterasa (C), actividad de ALT en suero (D), cuantificación del área necrótica (mi) e histología de secciones de hígado teñidas con H & ampE (F) de ratones WT y uricasa Tg 18 horas después de la exposición con 300 mg / kg de acetaminofeno. Número total de ratones utilizados en A y D de 4 experimentos independientes fueron norte = 6 (control PBS) norte = 26 (PESO) norte = 24 (ssUOX) y norte = 23 (intUOX). Número total de ratones utilizados en B y mi fueron norte = 6 (control PBS) norte = 8 (PESO) norte = 5 (ssUOX) y norte = 5 (intUOX). Se muestran las medias y los valores SEM. **PAG & lt 0.01 *PAG & lt 0,05. NS, no significativo versus control WT C57BL / 6. (C) Imágenes representativas de tinción de esterasa utilizadas en el análisis de B. Las puntas de flecha indican las células positivas a esterasa. Barras de escala: 25 mm. (F) Imágenes representativas de tinción H & ampE utilizadas en el análisis de mi. Barras de escala: 250 mm.

Por el contrario, los niveles de la enzima ALT aumentaron en el suero de los ratones WT y Tg a niveles que no fueron significativamente diferentes, lo que indica que la cantidad de daño hepatocelular inducida por fármacos fue similar y no se vio afectada por la expresión de uricasa (Figura 3D). Esto se confirmó además mediante el examen histopatológico de las secciones de hígado, tanto los ratones WT como los ratones Tg uricasa mostraron niveles similares de necrosis centrolobulillar (Figura 3, E y F). En este punto de tiempo temprano, no hubo evidencia de fibrosis o daño vascular, como se esperaba. Por tanto, la expresión de uricasa inhibía la respuesta inflamatoria a la lesión de los hepatocitos y lo hacía tanto si el transgén se secretaba como si era intracelular. Cabe señalar que nosotros y otros hemos informado anteriormente que el daño de las células hepáticas se puede reducir bloqueando la inflamación (19, 28) y este efecto protector no se observó en estos experimentos, esto se debe presumiblemente a que la inflamación debe inhibirse casi por completo para ver este efecto. .

Estos resultados sugieren que el ácido úrico se libera de (y según los datos de la Figura 2B, potencialmente generado adicionalmente por) los hepatocitos moribundos y que el UOX reduce los niveles de esta molécula en el hígado lesionado. Para investigar más a fondo este problema, medimos el contenido de ácido úrico en los hígados de controles y ratones tratados con acetaminofén. Los niveles de ácido úrico se elevaron significativamente en el hígado lesionado de los ratones de control, y estos niveles se redujeron tanto en los ratones ssUOX como en los ratones UOX Tg intracelulares (Figura complementaria 4).

También examinamos el efecto en este modelo de reducir las concentraciones de ácido úrico de forma aguda mediante la inyección de uricasa recombinante. Este tratamiento tampoco redujo la cantidad de daño hepático causado por la inyección de acetaminofén, según lo evaluado por la liberación de ALT en el suero (Figura 4B). Sin embargo, la uricasa recombinante redujo los niveles de ácido úrico en el hígado (Figura 4 complementaria) y provocó una reducción parcial pero significativa de la inflamación del hígado después de una lesión (Figura 4A). El grado de inhibición de la inflamación fue menor que el observado en los animales Tg de uricasa, presumiblemente porque la uricasa inyectada es menos biodisponible en el sitio de la lesión. El hecho de que se obtuvieron resultados cualitativamente similares cuando los niveles de ácido úrico se redujeron por la expresión de los transgenes o la inyección aguda de uricasa argumenta en contra de la posibilidad de que la depleción crónica de ácido úrico en las Tgs pueda de alguna manera conducir a adaptaciones que indirectamente afectaron la respuesta inflamatoria.

Reducción del reclutamiento de neutrófilos a la lesión hepática en ratones tratados con rasburicasa. Actividad MPO del tejido hepático (A) y actividad de ALT en suero (B) de ratones de control y tratados con rasburicasa 18 horas después de la exposición con 300 mg / kg de acetaminofeno. norte = 6 (PBS) norte = 20 (APAP) norte = 18 (APAP + rasburicasa). Los valores medios y SEM son para datos combinados de 4 experimentos independientes. **PAG & lt 0,01, frente al grupo de control APAP solo. NS, no significativo versus APAP solo.

En otro conjunto de experimentos, investigamos el efecto sobre la inflamación de la lesión tisular de reducir los niveles de ácido úrico utilizando alopurinol para bloquear su síntesis. Confirmamos que el tratamiento con alopurinol redujo las concentraciones intracelulares de ácido úrico en el hígado (Figura 5A) y encontramos que no redujo significativamente sus niveles en suero en este período de tiempo (no mostrado). Aunque este tratamiento de manera similar no redujo significativamente la cantidad de daño hepático causado por la inyección de acetaminofeno, inhibió la respuesta inflamatoria resultante (Figura 5, B y C). Este resultado es importante porque confirma los resultados obtenidos con Tg y uricasa inyectada y lo hace disminuyendo el ácido úrico a través de un mecanismo completamente diferente. Esto sostiene firmemente que la reducción de la inflamación a la muerte celular se debe al agotamiento del ácido úrico y no a algún otro efecto pleiotrópico de los tratamientos.

Reducción del reclutamiento de neutrófilos a la lesión hepática mediante el tratamiento con alopurinol. (A) Concentración de ácido úrico en lisado de hígado tratado con 1 semana de tratamiento i.p. inyecciones de alopurinol (10 mg / kg / d). Actividad MPO del tejido hepático (B) y actividad de ALT en suero (C) de ratones de control y tratados con alopurinol 18 horas después de la exposición con 300 mg / kg de acetaminofeno. norte = 6 (PBS) norte = 17 (APAP) norte = 17 (APAP + alopurinol). Los valores medios y SEM son para datos combinados de 3 experimentos independientes. *PAG & lt 0,05, frente al grupo de control APAP solo. NS, no significativo versus APAP solo.

Efecto del agotamiento del ácido úrico sobre la inflamación de otras células necróticas de la cavidad peritoneal. Para determinar si el ácido úrico estaba desempeñando un papel en la inflamación inducida por la muerte en otros tipos de células y en otra ubicación anatómica, evaluamos el efecto del agotamiento del ácido úrico en las respuestas inflamatorias a las células muertas inyectadas en el peritoneo. La inyección de EL4 necrótico (un linfoma de células T singénicas) en el peritoneo provoca una fuerte inflamación neutrofílica (Figura 6A), como se informó anteriormente (19). El número de células (3 × 10 7) inyectadas se eligió para obtener respuestas robustas y son relevantes para situaciones in vivo en las que incluso un número mucho mayor de células mueren en condiciones patológicas (por ejemplo, infarto de miocardio o daño tóxico). Esta respuesta inflamatoria se reduce parcial pero significativamente cuando el ácido úrico se agota mediante la inyección de uricasa recombinante (Figura 6A). De manera similar, encontramos que la respuesta inflamatoria a las células muertas inyectadas i.p. se redujo en los ratones ssUOX Tg (Figura complementaria 5).

Reducción del reclutamiento de neutrófilos en la cavidad peritoneal en respuesta a células necróticas tratadas con rasburicasa o pulmón de ratones Tg con uricasa. Número total de neutrófilos o monocitos en la cavidad peritoneal 15 horas después de la administración i.p. desafío con células EL4 necróticas (A y B) o homogeneizado de pulmón de WT C57BL / 6 (C y D) con o sin 18 μg de rasburicasa. (mi y F) Se inyectó i.p. homogeneizado de pulmón de ratones WT o uricasa Tg intracelular. en WT C57BL / 6. Los números de neutrófilos o monocitos en PEC se determinaron contando las células Ly-6G + 7/4 + o Ly-6G - 7/4 + en 100 µl de lavado peritoneal, respectivamente. Control negativo: ratones C57BL / 6 estimulados con PBS. Las concentraciones de ácido úrico de la suspensión de células EL4 y del homogeneizado de pulmón WT inyectado fueron de 5,4 mg / dl y 7,5 mg / dl, respectivamente. Los valores medios y SEM son para datos combinados de 3 o más experimentos independientes. Número de ratones utilizados en (A y B): norte = 8 (PBS) norte = 15 (EL4) norte = 16 (EL4 + rasburicasa) (C y D): norte = 10 (PBS) norte = 24 (pulmón) norte = 23 (pulmón + rasburicasa) (mi y F): norte = 4 (PBS) norte = 10 (WT-pulmón) norte = 10 (intUOX Tg-pulmón). **PAG & lt 0.01 NS, no significativo versus control EL4 necrótico sin rasburicasa (A y B), homogeneizado de pulmón sin rasburicasa (C y D), o WT-pulmón (mi y F).

También se obtuvieron resultados similares cuando se utilizaron células muertas de tejidos primarios (no cultivados) en lugar de EL4. La inyección intraperitoneal de homogeneizados pulmonares necróticos provocó respuestas inflamatorias neutrofílicas y la inyección de uricasa redujo estas respuestas significativamente (Figura 6, C y D). De manera similar, cuando se inyectó i.p. el pulmón necrótico de los animales Tg de uricasa intracelular. sin uricasa exógena, observamos una reducción similar en la inflamación en relación con las respuestas al pulmón WT (Figura 6, E y F). Por tanto, la depleción de ácido úrico reduce la inflamación a varios tipos de células muertas y también en diferentes localizaciones anatómicas (hígado y peritoneo), aunque existen algunas diferencias cuantitativas en el grado de inhibición en estas diferentes situaciones.

Efecto del agotamiento del ácido úrico sobre la inflamación debida a estímulos microbianos o particulados estériles. Era importante evaluar si el agotamiento del ácido úrico afectaba selectivamente a la inflamación inducida por la muerte celular o si en general era inmunosupresora. Para abordar este problema, investigamos para determinar si el agotamiento del ácido úrico afectaría una respuesta inflamatoria en la que el ácido úrico no debería desempeñar un papel directo. Para ello, inyectamos cristales de sílice estériles, zimosán (pared celular de levadura) o LPS i.p. en los diversos modelos de ratón y cuantificó la respuesta inflamatoria resultante. En animales WT no tratados o tratados con tampón, el cristal de sílice, el zimosán y el LPS provocan una respuesta inflamatoria neutrofílica similar a la de las células muertas (Figura 7, A – C). No hubo reducción en estas respuestas inflamatorias en los ratones Tg de uricasa secretada o intracelular en comparación con los animales WT (Figura 7, A – C). De hecho, en los ratones Tg con uricasa intracelular, las respuestas inflamatorias al cristal de sílice, zimosán y LPS aumentaron significativamente por razones que no están claras, pero que presumiblemente están relacionadas de alguna manera con la hidrólisis del ácido úrico intracelular. En cualquier caso, esta mayor respuesta a los estímulos microbianos o particulados estériles hace que la inhibición de las respuestas a las células muertas sea aún más impresionante. La inflamación inducida por zimosán tampoco disminuyó en los ratones tratados con uricasa exógena o alopurinol en comparación con los animales de control (Figura 7, D y E). En conjunto, estos resultados son importantes porque indican que la depleción de ácido úrico no causa un defecto generalizado en la generación de una respuesta inflamatoria aguda, sino que afecta selectivamente a la inflamación inducida por muerte celular.

No hay disminución en el reclutamiento de neutrófilos a cristales de sílice, zimosán o LPS en ratones Tg con uricasa o ratones tratados con rasburicasa o alopurinol. Número total de neutrófilos en la cavidad peritoneal 15 horas después de la administración i.p. inyección en ratones WT o uricasa Tg de 0,5 mg de cristal de sílice (A), 0,2 mg de zimosán en ratones Tg con uricasa (B), 100 ng de LPS ultrapuro (C), o ratones tratados con rasburicasa (D), o inyección de zymosan en ratones de control o tratados con alopurinol (mi). Los valores medios y SEM son para datos combinados de 3 o más experimentos independientes. Número de ratones utilizados en (A): norte = 5 (PBS), norte = 11 (sílice WT), norte = 8 (sílice ssUOX Tg) 6 (sílice intUOX Tg) (B): norte = 4 (PBS) norte = 15 (PESO zimosán) norte = 15 (ssUOX Tg zymosan) norte = 17 (intUOX Tg zymosan) (C): norte = 9 (PBS) norte = 9 (PESO LPS) norte = 9 (ssUOX Tg LPS) norte = 9 (intUOX Tg LPS) (D): norte = 4 (PBS) norte = 15 (zimosán) norte = 14 (zimosán + rasburicasa) (mi) norte = 4 (PBS) norte = 9 (zimosán) norte = 9 (zimosán + alopurinol). *PAG & lt 0.05 NS, no significativo versus sílice WT (A), Zimosán WT (B) o WT LPS (C).

El principal hallazgo de este informe es que el agotamiento del ácido úrico in vivo inhibe la respuesta inflamatoria a la muerte celular. Este efecto inhibidor se observó en las respuestas a las células necróticas de hígado, pulmón y linfoma y si estas respuestas se producían en los tejidos (hígado) o en el peritoneo. Por lo tanto, el ácido úrico está desempeñando un papel en la inflamación hasta la muerte celular para múltiples tipos de células diferentes y en diferentes ubicaciones anatómicas. Con base en estos hallazgos, predecimos que el ácido úrico desempeñará este papel generalmente en múltiples tejidos.

¿Por qué el agotamiento del ácido úrico inhibe la inflamación? Esto se debe casi con certeza a la pérdida de ácido úrico más que a un efecto pleiotrópico del método de agotamiento porque se observó inhibición independientemente de si los niveles de ácido úrico se redujeron al bloquear su síntesis, disminuir las reservas intracelulares a través de un catabolismo mejorado y / o eliminar de los fluidos extracelulares, ya sea de forma aguda o crónica. En teoría, el ácido úrico podría influir en las respuestas inflamatorias de diferentes formas. Es un antioxidante, por lo que es posible que su eliminación afecte la inflamación a través de una alteración del potencial redox (29). Sin embargo, es poco probable que una alteración generalizada en redox sea un mecanismo de acción importante porque la inflamación se inhibió independientemente de que se redujeran los niveles de ácido úrico extracelular (tratamiento con uricasa) o no (tratamiento con alopurinol). Aún más importante, el agotamiento del ácido úrico inhibe selectivamente la inflamación hasta la muerte celular en lugar de otros estímulos, incluidos los estímulos microbianos o las partículas irritantes (sílice). Estos últimos hallazgos son importantes porque argumentan que el ácido úrico no funciona como un modulador general de la inflamación, como podría ocurrir si en general afectara el potencial redox. En cambio, el mecanismo de acción más probable del ácido úrico es como un DAMP proinflamatorio que se libera de las células moribundas. Esto sería consistente con las conocidas propiedades proinflamatorias del urato monosódico (MSU). También explicaría la inhibición selectiva de la inflamación inducida por la muerte celular por el agotamiento del ácido úrico. Además, explicaría por qué eliminarlo intracelularmente de las células moribundas o extracelularmente después de la muerte celular inhibiría la inflamación.

El modelo de ácido úrico actuando como un DAMP proinflamatorio es similar al que hemos propuesto anteriormente (7, 8). Todas las células contienen depósitos intracelulares de ácido úrico producidos por el catabolismo de las purinas, y estas concentraciones son bastante altas. Además, en el presente estudio encontramos que después de la muerte celular hay un estallido de producción de ácido úrico, ya que las purinas, presumiblemente liberadas por la acción de nucleasas sobre el ADN y el ARN, son convertidas por la xantina oxidasa en ácido úrico. Cuando este material se libera en los fluidos extracelulares, la concentración de ácido úrico excederá el punto de saturación en los fluidos corporales. Además, en presencia de altos niveles de sodio en los fluidos extracelulares, las condiciones deberían promover la nucleación de urato monosódico y, la hipótesis es que esta es la forma biológicamente activa del proinflamatorio DAMP. Si bien este modelo se ajusta a nuestros datos, sigue siendo posible que el ácido úrico esté desempeñando un papel de alguna otra manera, por ejemplo, controlando de alguna manera la liberación y / o actividad de otros DAMP.

Anteriormente habíamos encontrado que la MSU y las células muertas estimulan la inflamación estéril a través de la misma vía final (19, 30). Ambos inducen IL-1 y este mediador es esencial para la inflamación neutrofílica en estas respuestas. Por el contrario, la IL-1 no es necesaria para la inflamación estimulada por productos microbianos (19, 30). Los hallazgos actuales de que las células muertas funcionan a través del ácido úrico pueden explicar en parte la vía común.

La depleción de ácido úrico inhibe la inflamación inducida por la muerte celular sólo parcialmente. Debido a que el ácido úrico no se elimina por completo en nuestros estudios, es posible que se esté subestimando su contribución a esta respuesta. Para evaluar este punto, sería interesante examinar el efecto de reducir aún más el ácido úrico. Esperábamos lograr esto con los ratones uricase Tg, pero a pesar de analizar múltiples fundadores independientes, no logramos obtener animales con una eliminación más completa. Esto plantea la posibilidad de que niveles muy bajos de ácido úrico no sean permisivos de forma sostenida. A pesar de ser un "producto de desecho", existen varios mecanismos que mantienen altos niveles in vivo, incluida la absorción de la dieta y la reabsorción a través del riñón, por lo que el ácido úrico podría servir para alguna otra función útil. De hecho, descubrimos que, si bien los ratones Tg de uricasa secretada estaban sanos desde el nacimiento hasta la mediana edad, su supervivencia después de aproximadamente 8 meses se redujo, la base de este aumento de la mortalidad se estudiará y se informará en el futuro.

Dado el gran número de DAMP potenciales, quizás sea sorprendente que la eliminación de uno solo, como el ácido úrico, haya tenido algún efecto. Esto podría indicar que hay relativamente pocos DAMP proinflamatorios y / o que el ácido úrico es uno de los principales. También es posible que el ácido úrico desempeñe un papel diferente al de otros DAMP proinflamatorios. El ácido úrico es un pequeño compuesto heterocíclico orgánico, mientras que los otros candidatos a DAMP conocidos son proteínas y, por lo tanto, pueden funcionar de diferentes maneras. Si es así, el ácido úrico podría proporcionar efectos aditivos o sinérgicos con otros DAMP. Tampoco sería sorprendente que diferentes tejidos tuvieran diferentes contenidos de DAMP, en cuyo caso un DAMP específico, como el ácido úrico, podría desempeñar un papel mayor o menor en diferentes tejidos. Esta podría ser una de las razones de nuestros experimentos por las que el agotamiento del ácido úrico inhibe la inflamación de diferentes tipos de células en diferentes grados. Será de interés explorar estas posibilidades en estudios futuros.

La identificación de DAMP proinflamatorios, como el ácido úrico, que desempeñan un papel in vivo es de interés porque estas moléculas son posibles dianas terapéuticas. Se sabe que la inflamación estimulada por la muerte celular complica la lesión isquémica y / o tóxica aguda de varios órganos, incluidos el corazón, el hígado y los pulmones, y se cree que también contribuye a la patogénesis de enfermedades crónicas asociadas con la muerte celular (5 , 31, 32). Por lo tanto, potencialmente podría ser de beneficio terapéutico bloquear esta respuesta inflamatoria estéril. Con este fin, inhibir la acción de los DAMP proinflamatorios sería atractivo porque debería inhibir selectivamente la inflamación hasta la muerte celular sin afectar la capacidad del huésped para generar respuestas inflamatorias en otros entornos, como la infección. Con base en los resultados actuales, será de interés probar este concepto con ácido úrico, especialmente porque ya existen medicamentos reductores de ácido úrico disponibles que son bien tolerados y aprobados para su uso en humanos.

Productos químicos y biológicos. Se adquirieron ácido úrico, alopurinol, acetaminofén y zimosan de Sigma-Aldrich. UltraPure LPS se obtuvo de Invivogen (LPS-SM). Rasburicasa (EC 1.7.3.3, uricasa recombinante de Aspergillus flavus) se obtuvo de sanofi-aventis. El anticuerpo policlonal anti-uricasa de cabra era de Santa Cruz Biotechnology Inc. La anti-α-tubulina monoclonal era de Abcam. Ly6G-FITC, anti-CD3e (145-2C11) y estreptavidina-APC eran de BD Bioscience. El anti-7/4 biotinilado era de AbD Serotec. Anti-CD45R (B220, clon RA3-6B2) y F4 / 80 (clon BM8) eran de eBioscience.

Animales y líneas celulares. Los ratones C57BL / 6 y B6129 se adquirieron en Jackson Laboratory. Para producir ratones uricasa Tg, se clonó un ADNc de longitud completa para uricasa a partir de hígado murino mediante RT-PCR. Se construyó una forma secretada de esta enzima mediante la adición de la secuencia señal del adenovirus gp19K al extremo N del cDNA de uricasa. Los ADNc de uricasa secretados o no modificados (intracelulares) se subclonaron en pCAGGS (26) y se inyectaron en huevos fertilizados de ratones C57BL / 6 que luego se implantaron en ratones hembra para producir ratones Tg. Los cebadores utilizados para la determinación del genotipo fueron 5'-CAGCCATTGCCTTTTATGGT-3 'y 5'-CAGGACGTGCACAGTGTTCT-3'. La presencia del transgén de uricasa se verificó adicionalmente mediante transferencia Western de lisados ​​de tejido y midiendo la actividad de uricasa en muestras de sangre. Todos los protocolos para animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Massachusetts. Las células EL4 se mantuvieron en RPMI con FCS al 10% y antibióticos (Invitrogen) y resultaron negativas para contaminación por micoplasmas (Lonza).

Ensayo de actividad uricasa. Para medir la actividad de la uricasa en los tejidos, se recolectaron órganos de ratones y se mezclaron con 4 veces su peso en tampón de lisis (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 1% y 0,1% SDS, inhibidor de proteasa completo Roche Diagnostics GmbH) y homogeneizado con un desgarro de tejido seguido de ultrasonidos. Después de centrifugación a 15.000 gramo durante 10 minutos, se recogió el sobrenadante clarificado y se analizó la concentración de proteína mediante el método del ácido bicinconínico (Thermo Scientific). Se añadió lisado (20 μl) a 1 ml de solución de ácido úrico (1,0 de OD292 en ácido bórico 0,1 M, pH 8,5) y se incubó a 37 ° C. Reducción de OD292 de la solución de ácido úrico se midió mediante espectrofotómetro.

Western blot. Se midió la concentración de proteína de los lisados ​​aclarados preparados como se describió anteriormente y se fraccionó un total de 10 μg de proteína mediante SDS-PAGE en un gel al 10%, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se transfirió con anticuerpos contra uricasa o α-tubulina.

Medición de ácido úrico. Para medir el ácido úrico en la cavidad peritoneal, se lavó la cavidad peritoneal de los ratones con 6 ml de solución salina fisiológica. Se liofilizaron cuatro ml de líquido de lavado peritoneal y se resuspendieron en 150 µl de agua. El reconstituyente se pasó a través de una membrana de ultrafiltración (corte 3K de Pall Life Sciences) y el filtrado se analizó para determinar el contenido de ácido úrico (Bioassay Systems). La concentración de ácido úrico también se verificó mediante HPLC utilizando Superdex 200 (GE Healthcare). Para medir la concentración de ácido úrico en los tejidos, los lisados ​​tisulares preparados como se describió anteriormente se mantuvieron fríos o se incubaron a 37 ° C durante el tiempo indicado, se pasaron a través de una membrana de ultrafiltración y se analizaron para determinar la concentración de ácido úrico.Las concentraciones informadas en las figuras son las que se encuentran en los lisados, que son mucho más bajos que los que se encuentran realmente en las células (13) debido a la dilución en tampón.

Inducción de daño celular. Las células EL4 se lavaron 5 veces con PBS y se resuspendieron en PBS a 10 millones de células / 50 µl. Las células se sometieron a choque térmico a 45 ° C durante 10 minutos y se incubaron a 37 ° C durante 5 horas. El pulmón de ratón se lavó 5 veces con PBS, el pulmón cosechado se pesó y se añadió 5 veces su peso en PBS, y luego se homogeneizó con un desgarrador de tejido de hoja metálica seguido de 5 ciclos de congelación-descongelación e incubación a 37 ° C durante 5 horas. Se añadieron nueve µg de rasburicasa a 150 µl de suspensión celular o homogeneizado de pulmón al comienzo y al final de un período de incubación de 5 horas.

Tratamiento con acetaminofén y ensayo de MPO. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 18 horas y luego se inyectaron i.p. con 300 mg / kg de acetaminofén (APAP) o 20 ml / kg de PBS. Dieciocho horas después de la administración de APAP, se extrajo sangre para la recolección de suero y el ensayo de ALT (Synchron LX Systems Beckman Coulter), y los ratones se sacrificaron para obtener tejidos hepáticos para el ensayo de actividad de MPO. MPO es una enzima de neutrófilos y un marcador que está bien validado para cuantificar neutrófilos. infiltración en tejidos (33). No hubo diferencia en las actividades de MPO en el neutrófilo en ratones UOX Tg (Figura complementaria 6B). En algunos experimentos, los ratones se trataron con 18 μg de rasburicasa i.p. al mismo tiempo que el tratamiento con APAP o con 1 semana de alopurinol (10 mg / kg / d) i.p. inyección diaria antes del tratamiento con APAP. Después de la perfusión con PBS, se homogeneizaron 100 mg de hígado en 1 ml de tampón MPO (50 mM Na2HPO4, pH 5,4, bromuro de hexadecil trimetil amonio al 0,5%, EDTA 10 mM) usando un desgarrador de tejidos y sonicación. Después de centrifugar a 2500 gramo, 15 minutos a 4 ° C, se agregaron 25 μl de sobrenadante con 25 μl de tampón de ensayo (16.7 mg / ml de o-Dianisidina en 50 mM de Na2HPO4, pH 5,4) y 200 μl de solución de revelado (30 μl de 31,1% H2O2 por 10 ml de Na 50 mM2HPO4, pH 5,4). El OD450 El cambio se midió usando un lector de microplacas Bio-Rad 3550 y se calculó la velocidad entre el tiempo 0 y 2 minutos 20 segundos.

Preparación de leucocitos hepáticos y análisis por citometría de flujo. Después de 18 horas de administración de APAP, los hígados se perfundieron con HBSS y tampón de digestión hepática (HBSS, CaCl 1,25 mM2, MgCl 4 mM2, 0,05% de colagenasa de tipo IV, 0,028% de ADNasaI). Los hígados se homogeneizaron y se incubaron en el tampón de digestión durante una hora a 37 ° C y se pasaron a través de un filtro de 70 μm. Las células no parenquimatosas se recolectaron del sobrenadante de centrifugación a 30ºC. gramo y se purificó adicionalmente de la interfaz en 22% de Opti Prep y RPMI 1640. Las células se tiñeron con anticuerpos Ly6G y 7/4 para detectar neutrófilos y monocitos, anticuerpo anti-F4 / 80 para macrófagos, anticuerpo anti-CD3 para células T, y anticuerpo B220 para células B. El número absoluto de células se cuantificó usando un citómetro de flujo con muestreador de alto rendimiento (BD Bioscience). Los datos fueron adquiridos por el software CellQuest (BD Biosciences) y analizados por el software FlowJo (Tree Star Inc.).

Medición del reclutamiento de neutrófilos a la cavidad peritoneal. Para analizar el reclutamiento de neutrófilos a células necróticas, se administró i.p. a ratones. con 30 millones de células de células EL4 necróticas o 150 μl de homogeneizado de pulmón. También se utilizaron 0,2 mg de zimosán o 100 ng de LPS puro para inducir la peritonitis. Quince horas después de la inyección, los animales fueron sacrificados por CO2 exposición y sus cavidades peritoneales se lavaron con 6 ml de RPMI con FCS al 10% que contenía EDTA 3 mM y heparina 10 U / ml. Las células se tiñeron con mAb Ly-6G-FITC y 7/4-biotina durante 30 minutos a 4 ° C en presencia de mAb 2.4G2 (bloqueador del receptor FcγRIIB / III). Las células se incubaron adicionalmente con estreptavidina-APC. Después de la tinción, las células se lavaron con PBS con FCS al 2% y se resuspendieron con el volumen original del material de partida. El número total de neutrófilos o monocitos en las células del exudado peritoneal (PEC) se determinó mediante el recuento de células Ly-6G + 7/4 + o Ly-6G - 7/4 + en 100 μl de células teñidas con un citómetro de flujo, respectivamente (FACSCalibur con muestreador de alto rendimiento). Los resultados de la cuantificación de neutrófilos en este ensayo se correlacionan bien con los niveles de MPO en los lisados ​​del líquido de lavado (Figura complementaria 6A).

Histología. Se cortaron secciones de 5 μm de espesor de hígado fijado con formalina e incluido en parafina en un micrótomo. Para detectar neutrófilos, las secciones se tiñeron con cloroacetato esterasa de naftol AS-D de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich). El número de neutrófilos se contó en 10 campos de alta potencia (× 400) en cada ratón utilizando un microscopio Nikon Eclipse E800. Se obtuvieron diez imágenes de campo de baja potencia (× 100) de cada ratón a partir de secciones teñidas con H & ampE y se cuantificó el área necrótica con el software ImageJ 1.42q (NIH).

Estadísticas. El análisis estadístico en cada experimento independiente se realizó con un Student's de 2 colas no emparejado t prueba. Los datos se expresan como media ± SEM. Se utilizaron ANOVA unidireccional y la prueba posterior de comparación múltiple de Dunnett para comparar las medias de varios grupos con el grupo de control. PAG & lt 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Agradecemos a Karen Dresser, Sharlene Hubbard, Matthew Janko, Zubin Patel y Dipti Karmarkar por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones a K.L. Rock de los NIH y la American Asthma Foundation. Los fondos para este estudio fueron proporcionados parcialmente por sanofi-aventis US a H. Kono. También se utilizaron los recursos básicos respaldados por la subvención DK32520 del Centro de Investigación de Endocrinología de la Diabetes.

Conflicto de intereses: Esta investigación está parcialmente financiada por sanofi-aventis (a H. Kono).

Cita para este artículo: J Clin Invest. 2010120 (6): 1939–1949. doi: 10.1172 / JCI40124.


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DISCUSIÓN

La generación de mutantes puntuales utilizando oligonucleótidos de ADN monocatenario y reactivos de edición del genoma CRISPR / Cas9 es una tecnología emergente en el pez cebra y otros sistemas de modelos animales. El uso de esta técnica permite la precisión de un solo nucleótido de los experimentos de edición del genoma y permitirá la generación de modelos de enfermedades específicas y un análisis mutacional preciso de los procesos biológicos. A pesar de su obvia promesa, los knock-ins de mutaciones puntuales siguen siendo ineficaces en el pez cebra y los métodos para probar su eficiencia siguen siendo laboriosos o no son fácilmente accesibles para muchos laboratorios, como la secuenciación de clones de plásmidos individuales mediante secuenciación de Sanger y NGS de amplicones de PCR (11, 30) . En un primer estudio de knock-in basado en TALEN en pez cebra, se introdujeron sitios de restricción en sitios genómicos específicos y se demostró que eran digeridos por la enzima correspondiente (7, 8), pero aún no se ha demostrado que este enfoque funcione para CRISPR. knock-ins en el pez cebra. La introducción del sitio de restricción como un medio para genotipar los knock-ins es potencialmente atractiva, pero tendrán que ser mutaciones silenciosas en genes que codifican proteínas en lugar de inserciones de sitios completos. Además, los productos de PCR con mutaciones silenciosas pueden comportarse de manera diferente a aquellos con secuencias agregadas. En los estudios complementarios que describimos aquí, introdujimos mutaciones sin sentido en tp53, cdh5 y lmna genes, así como mutaciones sinónimos en sitios PAM o sgRNA para prevenir el corte mediado por Cas9 o para introducir sitios de restricción para tp53 knock-ins. Inicialmente, las enzimas de restricción no lograron genotipar los embriones inyectados con knock-in, pero tuvieron éxito en la genotipificación de embriones knock-in heterocigotos F1. Esta discrepancia puede explicarse por el hecho de que en los últimos ciclos de PCR, las hebras de diferentes productos de PCR se pueden barajar aleatoriamente, de lo que se deduce que la fracción de productos de PCR que tienen ambas hebras que contienen mutaciones knock-in tiene una dependencia cuadrática de la knock- en frecuencia alélica.Por lo tanto, a bajas tasas de absorción (1 y 3%) (x), solo una fracción muy pequeña (x 2) (0,01 y 0,09%) de los productos de amplicón totales contendrá hebras completamente complementarias y se digiere. Por el contrario, en heterocigotos knock-in (frecuencia de alelos del 50%), se puede digerir el 25% del producto de la PCR, lo que fue totalmente consistente con nuestros resultados. Por lo tanto, cambiamos a la estrategia de PCR específica de alelo para detectar mutaciones puntuales en todos nuestros knock-ins y hemos demostrado que es muy sensible a la presencia de knock-in en frecuencias de alelos & lt0,5%. Previamente se usaron estrategias de detección similares para los knock-ins de etiquetado de epítopos (9, 10), donde uno de los cebadores era específico para los insertos de etiqueta y el otro estaba fuera de la región oligo donante. Las PCR de detección de etiquetado de epítopos y los ensayos AS-PCR de mutación puntual son conceptualmente similares. Sin embargo, el número relativamente pequeño de diferencias de nucleótidos entre los alelos WT y knock-in puede hacer que sea difícil evitar la amplificación de fondo de una PCR de ensayo knock-in en ADN genómico de WT. Empleamos un protocolo touchdown PCR (31) para hacer nuestras estrategias AS-PCR más específicas, lo cual fue esencial para el éxito de algunos ensayos AS-PCR y mejoró otros. AS-PCR también se utilizó recientemente en un estudio con ratones de enfoques de knock-in de mutaciones puntuales basados ​​en CRISPR / Cas9 (32) que respaldan la utilidad universal de este enfoque.

En general, nuestros estudios de los knock-ins de mutaciones puntuales revelaron tres métodos principales para mejorar la eficiencia. El primer método fue reducir la distancia entre la mutación y el sitio de corte Cas9 (13). La primera aplicación de AS-PCR también indicó que esta estrategia puede ser útil en el pez cebra ya que tp53 los knock-ins donde las distancias eran de 10 y 13 nt eran mucho menos eficientes que los cdh5 knock-in donde la mutación estaba ubicada exactamente en el sitio de corte. Este experimento, aunque sugerente, podría mejorarse mediante la variación sistemática de la posición de la mutación en relación con el sitio de corte. El segundo enfoque, a saber, el uso de oligos asimétricos surgió como la optimización clave en el pez cebra. Los AS-PCR knock-in mostraron una estimulación muy fuerte usando esta estrategia en el caso de tp53 los knock-ins y NGS confirmaron la importancia de este resultado y nos permitieron medir el grado de estimulación (aproximadamente 3 y 10 veces para los knock-ins de R143H y R217H, respectivamente). Otra explicación de por qué los oligonucleótidos asimétricos pueden funcionar mejor proviene de un modelo bien establecido que propone que las regiones 3 'monocatenarias que sobresalen son el resultado de la resección de los DSB (33). El equipo que exploró este modelo realizó knock-ins con múltiples oligos de 97 nt con diferentes brazos de homología y encontraron que los oligos más eficientes tenían 97 nt de longitud y se diseñaron con brazos de homología más cortos (30 nt) complementarios al único resecado. extremos de ADN de cadena producidos después de DSB (12). Estos oligos asimétricos 30-67 introdujeron knock-ins igualmente bien a ambos lados del DSB, apoyando así el modelo de resección mucho más que el modelo original propuesto por Richardson et al. (14). Será necesario trabajar en el futuro para establecer si la estimulación mediante oligos asimétricos en cualquiera de las cadenas puede ser igualmente eficaz, pero nuestro estudio proporciona pruebas y un ejemplo de cómo se puede lograr. Sin embargo, la estimulación de la eficacia de knock-in por ssODN asimétricos antisentido puede no ser universal. Por ejemplo, Moreno-Mateos et al. no encontraron ninguna diferencia en la eficiencia de knock-in entre los oligos asimétricos sentido o antisentido correspondientes al mismo tramo de ADN genómico cuando se usaba SpCas9, pero midieron que los oligos antisentido eran típicamente más eficientes que los sentido cuando el ADN estaba cortado por Cpf1 independientemente de las proporciones de longitud de brazo de homología (34). Por tanto, tanto el sitio genómico como la naturaleza de la nucleasa relacionada con CRISPR pueden desempeñar un papel en la determinación de la eficacia de edición. En la tercera optimización, probamos la modificación de PS de los extremos del oligo mientras realizamos una lmna Montaje a presión R471W. Para desacoplar los efectos potenciales de esta modificación de los de los oligos asimétricos antisentido y para evitar la posible unión de los oligos a las regiones de ssDNA en sitios de sgRNA fuera del objetivo, elegimos oligos asimétricos con sentido de 90 nt con o sin dos enlaces PS en cada extremo de el oligo. De hecho, el oligo modificado con PS fue significativamente más eficiente y consistente en introducir knock-ins que el oligo de ADN estándar. Anteriormente, el grupo que desarrolló la estimulación de knock-in mediada por PS solo pudo identificar algunos eventos de knock-in imprecisos en el pez cebra y no probó la mejora de knock-in (15). Creemos que todos estos nuevos métodos de optimización tienen utilidad e incluso pueden tener efectos multiplicativos cuando se implementan simultáneamente. Por lo tanto, en esta etapa del desarrollo de la tecnología de edición del genoma, es recomendable probar varias versiones de oligos que incorporen las optimizaciones deseadas, así como un oligo de control no optimizado para determinar si las versiones optimizadas se comportan de la manera esperada.

En el proceso de genotipado de los fundadores knock-in, desarrollamos un flujo de trabajo general para identificar verdaderos fundadores knock-in. El resultado inesperado que surgió de la secuenciación de embriones F1 individuales fue que hubo muchos falsos positivos o trans fundadores en cadena (25-78% del número total de fundadores). Estos podrían descartarse por secuenciación o digestión de restricción, pero también revelaron una debilidad de las estrategias AS-PCR, que pueden producir falsamente una señal positiva probablemente debido a la hibridación de cadenas simples de ADN de productos de PCR abortivos de la diana y trans loci. Un posible mecanismo de trans lo más probable es que el origen knock-in tenga que ver con sitios de sgRNA fuera del objetivo, en los que el oligo puede ligarse. Curiosamente, la proporción de trans Los fundadores knock-in fueron mucho más bajos en todas nuestras estrategias de knock-in de sentido que en todos los knock-ins anti-sentido. Los oligos asimétricos antisentido pueden tener cierta complementariedad con las regiones de ssDNA generadas en sitios fuera del objetivo, pero esta posibilidad necesita más investigación.

En conclusión, hemos proporcionado y validado estrategias para optimizar y mejorar la eficiencia del knock-in de mutaciones puntuales en el pez cebra. La proximidad de las mutaciones knock-in a los sitios de corte de Cas9 y los oligos asimétricos antisentido se identificaron como las optimizaciones más efectivas. Las modificaciones de PS también mejoraron la eficiencia de la reacción y mejoraron la consistencia entre diferentes embriones. Estas optimizaciones fueron habilitadas por ensayos AS-PCR y NGS. Los sitios de restricción introducidos por la mutación silenciosa como parte del proceso de knock-in también fueron muy útiles para el genotipado de mutantes puntuales, pero solo cuando estaban presentes con alta frecuencia (por ejemplo, al 50%). También identificamos el fenómeno de trans knock-ins, que se pueden filtrar mediante digestiones de sitios de restricción introducidos con mutaciones silenciosas. Prevemos que este trabajo hará que la generación de mutaciones puntuales sea un procedimiento sencillo accesible para todos los investigadores del pez cebra y otros investigadores de sistemas de modelos dada la aplicabilidad universal de la metodología para la introducción y optimización de mutaciones puntuales en una variedad de modelos animales.


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