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¿Cómo se replica cada región del ADN solo una vez?

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En "Biología Molecular de LA CÉLULA" 3ª Edición, 1994, por Alberts, et al. (Sí, sé que hay una edición más reciente.)

la pregunta se plantea en la página 362

¿Cómo se replica cada región del ADN solo una vez?

Se ofrecen dos sugerencias:

  1. Modelo de adición de inhibidor
  2. Modelo de iniciación-remoción

Dado que la tercera edición del libro tiene ahora 24 años, ¿se ha descubierto la respuesta y, de ser así, cuál es?

Estoy leyendo la 3ª edición ahora porque eso es lo que tengo y planeo comprar la 6ª edición más nueva si no saldrá una 7ª edición en los próximos meses. Esto es para autoaprendizaje, por lo que no es necesario que me apresure o tenga la información más reciente y mejor para el primer paso de aprendizaje, ya que solo estoy leyendo.


La replicación de ADN asegura que solo ocurra una vez mediante el uso de factores de licencia. Estos factores se liberan y se unen a los orígenes de la replicación durante una fase distinta. Una vez que se han publicado los factores y ha finalizado la primera fase, se inicia la replicación real.

Información sobre los factores de la licencia:

Los factores de autorización utilizados para crear el complejo de prerreplicación son la proteína de mantenimiento de minicromosomas (Mcm2-7), Cdc6 y Cdt1. Se requiere que Cdc6 y Cdt1 carguen los Mcm en el ADN y, por lo tanto, están altamente controlados durante el ciclo celular. El hexámero Mcm2-7 es la helicasa de ADN real que se utiliza durante la replicación del ADN.

La forma en que se evita la re-replicación del ADN es que cuando comienza la replicación del ADN, la helicasa Mcm se aleja del ORC y del ADN recién replicado, lo que significa que no puede reiniciarse. Junto con el movimiento físico de la helicasa, la actividad de Cdt1 es suprimida por la proteína Geminina, que evita la licencia de la helicasa durante tiempos de no replicación.

Imagen del artículo sobre la licencia.

Más información sobre este tema: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2688777/#!po=21.8085


3 fases del proceso de replicación del ADN (con diagrama)

Lea este artículo para conocer las tres fases del proceso de replicación del ADN.

Las tres fases del proceso de replicación son: (1) Inicio (2) Alargamiento y (3) Terminación.

La replicación en procariotas y eucariotas ocurre por mecanismos muy similares y, por lo tanto, la mayor parte de la información presentada aquí para la replicación bacteriana también se aplica a las células eucariotas.

Está compuesto por tres fases que se enumeran a continuación:

Implica el reconocimiento de las posiciones en una molécula de ADN donde comenzará la replicación.

Incluye los eventos que ocurren en la bifurcación de replicación, donde se copian los polinucleótidos originales.

Se comprende menos. Ocurre cuando la molécula madre se ha replicado por completo.

(a) Iniciación:

En una célula, la replicación del ADN comienza en lugares específicos del genoma, llamados & # 8220origins & # 8221. En el caso de E. coli, el origen de la replicación es una secuencia de aproximadamente 245 pares de bases (pb) denominada oriC. Los orígenes contienen secuencias de ADN reconocidas por proteínas iniciadoras de la replicación (por ejemplo, DnaA en E. coli y el Complejo de reconocimiento de origen en la levadura), estas proteínas se unen para iniciar el proceso de replicación. Las proteínas iniciadoras reclutan otras proteínas para separar las dos cadenas e iniciar horquillas de replicación.

El desenrollado del ADN en el origen y la síntesis de nuevas hebras forman una bifurcación de replicación. La bifurcación de replicación es una estructura que se forma cuando se replica el ADN. Se crea mediante la acción de la helicasa, que rompe los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de ADN. La estructura resultante tiene dos & # 8220 puntas & # 8221 ramificadas, cada una formada por una sola hebra de ADN.

En las bacterias, que tienen un solo origen de replicación en su cromosoma circular, este proceso eventualmente crea una & # 8220theta estructura & # 8221 (que se asemeja a la letra griega theta: 8). En contraste, los eucariotas tienen cromosomas lineales más largos e inician la replicación en múltiples orígenes y cuyas bifurcaciones de replicación progresan a distancias más cortas. Por ejemplo, la levadura tiene aproximadamente 322 orígenes, lo que corresponde a 1 origen por cada 36 kb de ADN, y los seres humanos tienen unos 20.000 orígenes, o 1 origen por cada 150 kb de ADN. Una vez iniciadas, dos horquillas de replicación pueden emerger del origen y progresar en dirección opuesta a lo largo del ADN. Por tanto, la replicación es bidireccional con la mayoría de los genomas (fig. 3.4).

Inicio de la replicación del ADN en microorganismos (E. coli):

Sabemos mucho más sobre la síntesis de ADN en procariotas que en eucariotas. Como hemos comentado, el oriC de E. coli abarca 245 pb de ADN. El análisis de secuencia de este segmento muestra que contiene dos motivos repetidos cortos, uno de nueve nucleótidos y el otro de 13 nucleótidos. Las cinco copias del motivo de repetición de nueve nucleótidos se presentan dispersas a lo largo de oriC.

Estas regiones son el sitio de unión de una proteína llamada DnaA. Como hay cinco copias de las secuencias de unión, podría imaginarse que cinco copias de DnaA se unen al origen, pero de hecho las proteínas de DnaA unidas cooperan con las moléculas no unidas hasta que unas 30 copias se asocian con el origen. La unión ocurre solo cuando el ADN está superenrollado negativamente, como es la situación normal para el cromosoma de E. coli.

El resultado de la unión de DnaA es que la doble hélice se abre (se funde) dentro de la matriz en tándem de tres repeticiones de 13 nucleótidos ricas en AT ubicadas en un extremo de la secuencia oriC. Se desconoce el mecanismo exacto, pero el DnaA no parece poseer la actividad enzimática necesaria para romper los pares de bases y, por lo tanto, se supone que la hélice se funde por las tensiones de torsión introducidas por la unión de las proteínas DnaA.

Un modelo atractivo imagina que las proteínas DnaA forman una estructura en forma de barril alrededor de la cual se enrolla la hélice. La fusión de la hélice es promovida por HU, la más abundante de las proteínas de empaquetamiento de ADN de E. coli. La fusión de la hélice inicia una serie de eventos que construyen una nueva bifurcación de replicación en cada extremo de la región abierta. El primer paso es la unión de un complejo de cebado previo en cada una de estas dos posiciones.

Cada complejo de pre-cebado inicialmente comprende 12 proteínas, seis copias de DnaB y seis copias de DnaC, pero DnaC tiene un papel transitorio y se libera del complejo poco después de su formación, probablemente su función sea simplemente ayudar a la unión de DnaB. .

Esta última es una helicasa, una enzima que puede romper los pares de bases. DnaB comienza a aumentar la región monocatenaria dentro del origen, lo que permite a las enzimas involucradas en la fase de elongación de la replicación en E. coli a medida que las horquillas de replicación comienzan a alejarse del origen y comienza la copia del ADN.

Inicio de la replicación del ADN en levadura:

Los orígenes identificados en la levadura se denominan secuencias de replicación autónoma o ARS. El origen de la levadura atípica es más corto que el E. coli oriC, y suele tener menos de 200 pb de longitud. En él se reconocen cuatro subdominios.

Dos de estos subdominios A y B1 & # 8211 forman la secuencia de reconocimiento de origen, un tramo de unos 40 pb en total que es el sitio de unión para el complejo de reconocimiento de origen (ORC), un conjunto de seis proteínas que se unen al origen.

Los ORC se han descrito como versiones de levadura de las proteínas DnaA de E. coli, pero esta interpretación probablemente no sea estrictamente correcta porque los ORC parecen permanecer unidos a los orígenes de la levadura durante todo el ciclo celular. Más bien, estas son proteínas iniciadoras genuinas. Es más probable que los ORC estén involucrados en la regulación de la replicación del genoma, actuando como mediadores entre los orígenes de replicación y las señales reguladoras que coordinan el inicio de la replicación del ADN con el ciclo celular.

Hay secuencias similares en levaduras a las de oriC de E. coli. Esto nos lleva a las otras dos secuencias conservadas en el origen típico de levadura, los subdominios B2 y B3. Nuestro conocimiento actual sugiere que estos dos subdominios funcionan de manera similar al origen de E. coli. El subdominio B2 parece corresponder a la matriz de repeticiones de 13 nucleótidos del origen de E. coli, siendo la posición en la que las dos hebras de la hélice se separan por primera vez.

Esta fusión es inducida por el estrés de torsión introducido por la unión de una proteína de unión al ADN, el factor de unión a ARS 1 (ABF1), que se une al subdominio B3. Como en E. coli, la fusión de la hélice dentro de un origen de replicación de levadura es seguida por la unión de la helicasa y otras enzimas de replicación al ADN, completando el proceso de iniciación y permitiendo que las horquillas de replicación comiencen su progreso a lo largo del ADN. Los orígenes de las replicaciones en eucariotas superiores no se han entendido mucho.

(b) Alargamiento:

Una vez que se ha iniciado la replicación, las horquillas de replicación avanzan a lo largo del ADN y participan en la síntesis de una nueva hebra. A nivel químico, la síntesis de ADN dependiente de la plantilla es muy similar a la síntesis de ARN dependiente de la plantilla que se produce durante la transcripción, pero los dos procesos son bastante diferentes.

1. La síntesis de hebras discontinuas y el problema del cebado: durante la replicación del ADN, deben copiarse ambas hebras de la doble hélice. Sin embargo, las enzimas ADN polimerasa solo pueden sintetizar ADN en la dirección 5 & # 8242 3 & # 8242. Esto significa que una hebra de la doble hélice principal, llamada hebra principal, se puede copiar de manera continua, pero la replicación de la hebra retrasada debe realizarse de forma discontinua, lo que da como resultado una serie de segmentos cortos que deben ligarse entre sí para producir la hebra hija intacta.

Estos segmentos cortos de polinucleótidos se denominan fragmentos de Okazaki. Estos fragmentos se aislaron por primera vez de la bacteria E. coli en 1969. Los fragmentos de Okazaki tienen una longitud de 1000-2000 nucleótidos, pero en eucariotas los fragmentos equivalentes parecen ser mucho más cortos, quizás menos de 200 nucleótidos de longitud.

2. La otra característica de la replicación del ADN es que la ADN polimerasa no puede iniciar la síntesis de ADN en una molécula que es completamente monocatenaria: debe haber una región monocatenaria corta para proporcionar un extremo 3 & # 8242 en el que la enzima pueda agregar nuevos nucleótidos. Los nucleótidos se añaden a una velocidad de 50.000 bases por minuto. La elección del nucleótido está determinada por la naturaleza complementaria.

A este ritmo, las posibilidades de error son de uno en mil pares de bases replicados. Sin embargo, la tasa real es bastante baja (uno en mil millones). Esto equivale a aproximadamente un error por genoma por mil ciclos de replicación bacteriana. Este error se corrige aún más mediante la corrección de pruebas (Eliminación del nucleótido de desajuste por la ADN polimerasa III). Esto significa que se necesitan cebadores, uno para iniciar la síntesis de la hebra complementaria en el polinucleótido principal y uno para cada segmento de ADN discontinuo sintetizado en la hebra retrasada.

Como la ADN polimerasa no puede lidiar con una plantilla completamente monocatenaria, las ARN polimerasas no tienen dificultades a este respecto, por lo que los cebadores para la replicación del ADN están hechos de ARN. En las bacterias, los cebadores se sintetizan mediante primasa, una ARN polimerasa especial con cada cebador de 4-15 nucleótidos de longitud y la mayoría comienza con la secuencia 5 & # 8242-AG-3 & # 8242. Una vez que se ha completado el cebador, la ADN polimerasa III continúa la síntesis de la hebra.

En eucariotas, la situación es más compleja porque la primasa está estrechamente unida a la ADN polimerasa ay coopera con esta enzima en la síntesis de los primeros nucleótidos de un nuevo polinucleótido. Esta primasa sintetiza un cebador de ARN de 8-12 nucleótidos y luego se entrega a la ADN polimerasa a, que extiende el cebador de ARN agregando aproximadamente 20 nucleótidos de ADN. Después de completar el cebador de ADN-ARN, la principal enzima replicativa, la ADN polimerasa 5, continúa la síntesis de ADN.

El cebado debe ocurrir solo una vez en la hebra principal, dentro del origen de replicación, porque una vez cebado, la copia de la hebra principal se sintetiza continuamente hasta que se completa la replicación. En la hebra rezagada, el cebado es un proceso repetido que debe ocurrir cada vez que se inicia un nuevo fragmento de Okazaki.

3. Alargamiento de horquilla de replicación: al igual que con la unión de DnaB helicasa, seguida de la extensión de la región fundida del origen de replicación, finaliza la fase de iniciación. Después de que la helicasa se ha unido al origen para formar el complejo de pre-cebado, la primasa está involucrada, lo que da como resultado el primosoma, que inicia la replicación de la cadena principal. Lo hace sintetizando el cebador de ARN que la ADN polimerasa III necesita para comenzar a copiar la plantilla. Se conoce más de una helicasa y esta enzima está involucrada en varios procesos, como la transcripción, recombinación además de replicaciones.

4. Las hebras complementarias de un ADN tienden a convertirse en dúplex. Durante el proceso de replicación, se evita que estos ADN monocatenarios pegajosos se conviertan en dúplex mediante proteínas especiales denominadas proteínas de unión monocatenarias (SSB). Una vez que se añaden 1000-2000 nucleótidos en la cadena principal, comienza la síntesis de la cadena rezagada o fragmentos de Okazaki. Esto también requiere un cebador de ARN y una ADN polimerasa III similar a la cadena principal.

5. La ADN polimerasa I participa en la eliminación del cebador de ARN de los fragmentos de Okazaki, que tiene actividad exonucleasa 5 & # 8242 → 3 & # 8242. El espacio creado por el cebador se rellena añadiendo nucleótidos en el extremo 3 & # 8242. La muesca entre dos fragmentos de Okazaki está sellada por ADN ligasa mediante la formación de enlaces fosfodiéster (Fig. 3.5).

(c) Terminación:

Debido a que las bacterias tienen cromosomas circulares, la terminación de la replicación ocurre cuando las dos horquillas de replicación se encuentran en el extremo opuesto del cromosoma parental. E. coli regula este proceso mediante el uso de secuencias de terminación que, cuando están unidas por la proteína Tus, permiten que solo pase una dirección de la horquilla de replicación.

Como resultado, las horquillas de replicación están obligadas a encontrarse siempre dentro de la región de terminación del cromosoma. Los eucariotas inician la replicación del ADN en múltiples puntos del cromosoma, por lo que las horquillas de replicación se encuentran y terminan en muchos puntos del cromosoma; no se sabe que estén regulados de ninguna manera en particular.


La primera etapa de la interfase se llama G1 fase, o primera brecha, porque se aprecian pocos cambios. Sin embargo, durante el G1 etapa, la célula es bastante activa a nivel bioquímico. La célula está acumulando los componentes básicos del ADN cromosómico y las proteínas asociadas, además de acumular suficientes reservas de energía para completar la tarea de replicar cada cromosoma en el núcleo.

A lo largo de la interfase, el ADN nuclear permanece en una configuración de cromatina semi-condensada. En la fase S (fase de síntesis), Replicación de ADN da como resultado la formación de dos copias idénticas de cada cromosoma (cromátidas hermanas) que están firmemente adheridas a la región del centrómero. En esta etapa, cada cromosoma está formado por dos cromátidas hermanas y es un cromosoma duplicado. El centrosoma se duplica durante la fase S. Los dos centrosomas darán lugar al huso mitótico, el aparato que orquesta el movimiento de los cromosomas durante la mitosis. El centrosoma consta de un par de centríolos en forma de varillas que forman ángulos rectos entre sí. Los centríolos ayudan a organizar la división celular. Los centríolos no están presentes en los centrosomas de muchas especies eucariotas, como las plantas y la mayoría de los hongos.


RESULTADOS

Fundamentos de Rerep-Seq

Rerep-Seq aprovecha la naturaleza semiconservadora de la replicación del ADN para fragmentar y enriquecer selectivamente el ADN re-replicado. Las células se marcan con el análogo de timidina BrdU durante un ciclo celular para permitir la incorporación de BrdU en el ADN recién replicado (panel izquierdo de la Figura 1A). La replicación da como resultado la incorporación de BrdU en una sola hebra de ADN, mientras que la repetición da como resultado la incorporación de BrdU en ambas hebras.

Fundamentos de Rerep-Seq. (A) Esquema de fragmentación selectiva de ADN replicado. La replicación del ADN incorpora BrdU en una hebra recién sintetizada, la replicación del ADN adquiere BrdU en ambas hebras. Digestión de Rerep-Seq: las fotólisis de exposición a UVA incorporaron BrdU para producir uracilo, seguido de la escisión de nucleótidos por UDG, para producir un sitio abásico y la generación de roturas de hebra única a través de la digestión con APE1. El ADN normalmente replicado genera roturas monocatenarias y roturas bicatenarias escalonadas en el ADN repetido. (B yC) La fragmentación selectiva del ADN genómico de levadura (B) y humano (C) requiere digestión con BrdU, UVA y UDG / APE-1. Se trató el ADN genómico de las células marcadas con BrdU durante cero o dos ciclos celulares (-, + BrdU) para imitar el ADN repetido doblemente marcado con los pasos indicados del procedimiento de digestión Rerep-Seq. (D ymi) Optimización del tamaño de los fragmentos de levadura y ADN humano. ADN genómico expuesto a dosis variables de UVA seguido de tratamiento con UGD / APE1, y ADN expuesto a UVA seguido de tiempo de digestión variable de UDG y APE1. (F yGRAMO) Fragmentación selectiva y enriquecimiento de ADN de levadura marcado con doble BrdU. (H yI) Fragmentación selectiva y enriquecimiento de ADN humano marcado con doble BrdU. Vuelva a digerir en ADN genómico tratado con BrdU durante 1, 2 o 3 ciclos celulares. Los fragmentos de ADN se extrajeron en gel y se analizaron volúmenes iguales mediante qPCR con cebadores dentro de ARS307 (levadura) y el gen ACTb (humano). Los datos representan el promedio de tres réplicas biológicas (norte = 3), las barras de error representan el SEM.

Fundamentos de Rerep-Seq. (A) Esquema de fragmentación selectiva de ADN replicado. La replicación del ADN incorpora BrdU en una hebra recién sintetizada, la replicación del ADN adquiere BrdU en ambas hebras. Digestión de Rerep-Seq: las fotólisis de exposición a UVA incorporaron BrdU para producir uracilo, seguido de la escisión de nucleótidos por UDG, para producir un sitio abásico y la generación de roturas de hebra única a través de la digestión con APE1. El ADN normalmente replicado genera roturas monocatenarias y roturas bicatenarias escalonadas en el ADN repetido. (B yC) La fragmentación selectiva del ADN genómico de levadura (B) y humano (C) requiere digestión con BrdU, UVA y UDG / APE-1. El ADN genómico de las células marcadas con BrdU durante cero o dos ciclos celulares (-, + BrdU) para imitar el ADN repetido de doble marcado se trató con los pasos indicados del procedimiento de digestión Rerep-Seq. (D ymi) Optimización del tamaño de los fragmentos de levadura y ADN humano. ADN genómico expuesto a dosis variables de UVA seguido de tratamiento con UGD / APE1, y ADN expuesto a UVA seguido de tiempo de digestión variable de UDG y APE1. (F yGRAMO) Fragmentación selectiva y enriquecimiento de ADN de levadura marcado con doble BrdU. (H yI) Fragmentación selectiva y enriquecimiento de ADN humano marcado con doble BrdU. Vuelva a digerir en ADN genómico tratado con BrdU durante 1, 2 o 3 ciclos celulares. Los fragmentos de ADN se extrajeron en gel y se analizaron volúmenes iguales mediante qPCR con cebadores dentro de ARS307 (levadura) y el gen ACTb (humano). Los datos representan el promedio de tres réplicas biológicas (norte = 3), las barras de error representan el SEM.

El ADN genómico de las células marcadas con BrdU se purifica y se somete a un procesamiento bioquímico para inducir roturas del ssDNA en los sitios de incorporación de BrdU. El ADN se somete a tratamiento con UVA en presencia de Hoechst 33258 para fotolizar el bromo de BrdU dejando desoxiuracilo (panel central de la Figura 1A). A continuación, el desoxiuracilo se elimina mediante tratamiento con UDG (uracil DNA glicosilasa) dejando un sitio abásico. Luego, el sitio abásico se convierte en una ruptura de ADN de una sola hebra por escisión de desoxirribosa por APE1 (endodesoxirribonucleasa apurínica / apirimidínica), lo que produce cortes de ADN simples en el ADN normalmente replicado, pero cortes escalonados (es decir, rupturas de ADN de doble cadena) en el ADN repetido (Figura 1A) panel derecho). El ADN fragmentado repetido puede aislarse mediante fraccionamiento por tamaño y analizarse mediante PCR cuantitativa o secuenciación de próxima generación.

Parámetros que afectan el cizallamiento de ADN de Rerep-Seq

La cantidad de fragmentación de ADN repetida se puede controlar empíricamente para que coincida con las preferencias del experimentador (Figura 1B-E). Cada paso en el procedimiento de digestión de Rerep-Seq: etiquetado con BrdU, tratamiento con UVA y digestión con UDG + APE1 son todos necesarios para la fragmentación del ADN tanto del ADN de levadura como del humano (Figura 1B y C). Cada uno de estos pasos se puede utilizar para controlar el grado de fragmentación. En particular, la cantidad de tiempo de exposición a UVA es un fuerte determinante de la cizalladura del ADN (Figura 1D y E), que puede refinarse alterando la cantidad de tiempo de digestión enzimática de UDG y APE1. Las pruebas empíricas de estas condiciones dieron como resultado el uso de BrdU 30 μM para células humanas y BrdU 0,1 mM para células de levadura con 7,5 min de UVA y 2 h de digestión para generar fragmentos centrados de 300 a 600 pb para la construcción de bibliotecas óptimas utilizando Illumina Nextera. Kit de preparación de la biblioteca DNA Flex (19). Con estas condiciones, validamos la fragmentación de Rerep-Seq marcando células de levadura y humanas durante hasta tres ciclos celulares para determinar si el ADN enriquecido con Rerep-Seq solo en las células marcadas durante más de dos ciclos celulares con BrdU, simulando así la repetición (Figura 1F– I). El ADN fragmentado extraído en gel se analizó con qPCR (Figura 1G e I). Pudimos fragmentar y enriquecer significativamente el ADN solo de las células marcadas con BrdU durante al menos dos ciclos celulares.

Validación de Rerep-Seq mediante replicación de ADN simulada en S. cerevisiae

La falta de tecnología previa para evaluar el ADN replicado presentó un problema único para validar Rerep-Seq utilizando regiones que se sabe que se replican. Para superar este problema, simulamos la repetición del ADN mediante el doble etiquetado de células a través de un experimento de tiempo de replicación de una manera que las regiones de replicación temprana conocidas se replicarían por segunda vez (imitando la repetición) y actuarían como representantes de la repetición del ADN (Figura 2A y B). Para validar este enfoque, primero detuvimos el cultivo en factor α para sincronizar las células en G1 (Figura 2A y C). Luego liberamos las células en medios que contienen BrdU y después de 40 minutos agregamos factor α nuevamente para sincronizar las células a través de una división en G1 (Figura 2C). Luego liberamos las células por segunda vez en un medio que contenía BrdU y recolectamos ADN de las células en los intervalos de tiempo indicados después de la liberación. Utilizando este enfoque, durante el segundo ciclo celular, el ADN debe marcar con BrdU de doble hebra las regiones de replicación temprana antes de las regiones de replicación tardía (Figura 2B). En esta segunda versión, las regiones de replicación temprana deberían enriquecerse preferentemente de Rerep-Seq primero, seguido de la detección de regiones de replicación posteriores en puntos de tiempo posteriores (Figura 2C y D). A modo de comparación, también aislamos ADN marcado completamente en cultivo asincrónico durante tres ciclos celulares. Como era de esperar, observamos una mayor fragmentación a medida que las células progresaban a través del segundo ciclo celular (Figura 2D).

Simulación de la replicación del ADN en células de levadura. (A) Esquema de la replicación de ADN simulada en células de levadura. La levadura sincronizada con el factor α luego se libera en un medio fresco que contiene BrdU 0,1 mM seguido de una segunda detención y liberación en BrdU con muestras recolectadas en los puntos de tiempo indicados. (B) Esquema de fragmentación selectiva y enriquecimiento de regiones de replicación temprana en el segundo ciclo celular. Después del primer ciclo celular, una hebra de ADN se marca con BrdU (preetiquetado). A medida que el cultivo sincronizado comienza la segunda fase S, las regiones de replicación temprana incorporan BrdU en ambas cadenas de ADN y ahora son propensas a la fragmentación y al enriquecimiento. (C) Confirmación de la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo. (D) La fragmentación del ADN aumenta a medida que la levadura avanza a través del segundo ciclo celular. (mi) Confirmación del enriquecimiento de la región de replicación temprana. Volúmenes iguales de ADN fragmentado extraído en gel analizado por qPCR con cebadores contra regiones de replicación temprana (ARS307) y tardía (ACT1). Los datos representan el enriquecimiento medio de un promedio de tres réplicas biológicas (norte = 3), las barras de error representan el SEM.

Simulación de la replicación del ADN en células de levadura. (A) Esquema de la replicación de ADN simulada en células de levadura. La levadura sincronizada con el factor α luego se libera en un medio fresco que contiene BrdU 0,1 mM seguido de una segunda detención y liberación en BrdU con muestras recolectadas en los puntos de tiempo indicados. (B) Esquema de fragmentación selectiva y enriquecimiento de regiones de replicación temprana en el segundo ciclo celular. Después del primer ciclo celular, una hebra de ADN se marca con BrdU (preetiquetado). A medida que el cultivo sincronizado comienza la segunda fase S, las regiones de replicación temprana incorporan BrdU en ambas cadenas de ADN y ahora son propensas a la fragmentación y al enriquecimiento. (C) Confirmación de la progresión del ciclo celular mediante citometría de flujo. (D) La fragmentación del ADN aumenta a medida que la levadura avanza a través del segundo ciclo celular. (mi) Confirmación del enriquecimiento de la región de replicación temprana. Volúmenes iguales de ADN fragmentado extraído en gel analizado por qPCR con cebadores contra regiones de replicación temprana (ARS307) y tardía (ACT1). Los datos representan el enriquecimiento medio de un promedio de tres réplicas biológicas (norte = 3), las barras de error representan el SEM.

Analizamos el ADN fragmentado antes de la preparación de la biblioteca mediante qPCR. Utilizamos cebadores para una región de replicación temprana conocida, un origen de replicación de ADN definido por secuencia en la levadura denominada Secuencia de replicación autónoma 307 (ARS307), y la región de replicación tardía que contiene el gen ACT1. Determinamos que Rerep-Seq fue capaz de enriquecer específicamente las regiones de replicación temprana antes de la detección de regiones de replicación posterior (Figura 2E) (18). Las muestras verificadas se sometieron a la preparación de la biblioteca mediante el protocolo del kit de preparación de biblioteca Nextera DNA Flex Library de Illumina, aunque la ligadura del adaptador estándar y otros procedimientos de preparación de la biblioteca deberían funcionar en el ADN fragmentado. Es importante destacar que, incluyendo un in vitro El paso de reparación del ADN (utilizamos el kit de reparación NEBs FFPE para reparar las mellas y la oxidación) antes de iniciar el protocolo de preparación de la biblioteca Nextera DNA Flex Library aumentó significativamente los rendimientos de la biblioteca (datos no mostrados) y recomendamos incluir este paso de reparación.

Normalización de las lecturas de Rerep-Seq

Tanto en levaduras como en células humanas, las mitocondrias se replican de forma asincrónica (independientemente de la detención del ciclo celular) y mucho más rápido que el ADN genómico (20, 21). Esto significa que, en la práctica, todo el ADN mitocondrial está doblemente marcado sistémicamente con BrdU y, por lo tanto, debe digerirse por igual en cada muestra. Elegimos utilizar el ADN mitocondrial como control interno para la normalización. Si se desea, también se podría usar un spike-in marcado con BrdU, como un plásmido marcado, para la normalización, sin embargo, el control interno del ADN mitocondrial marcado es preferible en la mayoría de las circunstancias. Después de la normalización de lectura a RPM, las muestras individuales se escalaron en función de la proporción de lecturas que se alineaban con las mitocondrias (consulte la sección "Materiales y métodos").

Rerep-Seq enriquece el ADN de replicación temprana

Se esperaba que la señal Rerep-Seq de nuestro experimento de tiempo de replicación exhibiera picos en ARS de disparo temprano en puntos de tiempo tempranos, seguido de un ensanchamiento gradual de picos en regiones de replicación tardía con fusión eventual de picos y aplanamiento de la señal a medida que las células progresaban a través del segundo ciclo celular. . Como se esperaba, los picos de señal de Rerep-Seq emergen de los ARS de disparo temprano a los 15 minutos después de la liberación de G1. Estos picos aumentaron en intensidad, se amplían y finalmente se fusionan con regiones de replicación tardía a medida que la célula avanza a través de la fase S (Figura 3A). El patrón es claramente evidente en cada una de las tres réplicas biológicas (Figura complementaria S1) y se mantiene cuando las réplicas se promedian juntas (Figura 3A). Es importante destacar que Rerep-Seq realizado en células marcadas durante más de tres generaciones con BrdU no demuestra el enriquecimiento de los dominios de replicación temprana (Figura 3A, muestra cc).

Enriquecimiento global de regiones de replicación temprana en levadura usando Rerep-Seq. (A) Repita la secuencia en Chr II a medida que las células avanzan a través de la fase S. RPM normalizada, señal Rerep-Seq escalada mitocondrial. Las pistas representan el promedio de tres réplicas biológicas para cada punto de tiempo (dos para el etiquetado de tres ciclos celulares, 3 cc). Los puntos de tiempo tempranos exhiben enriquecimiento en ARS de disparo temprano (ERD, en LRD azules, en rojo en la parte inferior del gráfico) seguido de una ampliación de la señal en regiones de replicación tardía a medida que la célula avanza a través de la fase S. Los ARS se indican mediante marcas grises en la parte inferior del gráfico. (B) Mapa de calor de Rerep-Seq que rodea a 410 ARS confirmados a los 25 minutos después del lanzamiento de G1. Se centran 410 ARS confirmados ± 25 kb, ordenados por intensidad de señal Rerep-Seq. Las marcas azules indican ARS de disparo temprano. (C yD) Metanálisis de enriquecimiento en todos los ERD (C) y todos los LRD (D).

Enriquecimiento global de regiones de replicación temprana en levadura usando Rerep-Seq. (A) Repita la secuencia en Chr II a medida que las células avanzan a través de la fase S. RPM normalizada, señal Rerep-Seq escalada mitocondrial. Las pistas representan el promedio de tres réplicas biológicas para cada punto de tiempo (dos para el etiquetado de tres ciclos celulares, 3 cc). Los puntos de tiempo tempranos exhiben enriquecimiento en ARS de disparo temprano (ERD, en LRD azules, en rojo en la parte inferior del gráfico) seguido de una ampliación de la señal en regiones de replicación tardía a medida que la célula avanza a través de la fase S. Los ARS se indican mediante marcas grises en la parte inferior del gráfico. (B) Mapa de calor de Rerep-Seq que rodea a 410 ARS confirmados a los 25 minutos después del lanzamiento de G1. Se centran 410 ARS confirmados ± 25 kb, ordenados por intensidad de señal Rerep-Seq. Las marcas azules indican ARS de disparo temprano. (C yD) Metanálisis de enriquecimiento en todos los ERD (C) y todos los LRD (D).

Para validar aún más el enriquecimiento de Rerep-Seq de las regiones de replicación temprana, clasificamos 410 elementos de ARS confirmados como regiones de replicación temprana o tardía (17). Definimos los ERD como regiones en el cuartil superior de la señal y los LRD como el cuartil inferior de la señal en los datos de tiempo de replicación informados anteriormente (17-18, 22-23). Luego trazamos la señal Rerep-Seq 25 minutos después de la liberación dentro de los 25 kb de cada ARS. Los ARS se clasificaron según la intensidad de la señal Rerep-Seq de mayor a menor. Observamos un fuerte enriquecimiento de Rerep-Seq en los ARS de replicación temprana indicados por marcas de verificación azules (Figura 3B). Un metanálisis de ARS temprano y ARS tardío (Figura 3C y D) demuestra que la señal se enriquece sobre las secuencias de ARS de replicación temprana en puntos de tiempo tempranos después de la liberación, mientras que las regiones posteriores no ganaron intensidad hasta que las células progresaron más a través del ciclo celular. Juntos, estos datos demuestran que Rerep-Seq enriquece el ADN marcado con doble BrdU de una manera temporal y específica del locus.

Validación de Rerep-Seq a través de la replicación de ADN simulada en células humanas

Para validar Rerep-Seq en células humanas, realizamos un experimento de tiempo de replicación sincronizado similar. Aunque las células humanas no tienen orígenes definidos en secuencia, como los ARS de levadura, la replicación del ADN sigue un programa de tiempo orquestado con regiones de replicación temprana y tardía definidas (24). Marcamos las células MDA-MB-231 durante 4 h con BrdU antes de inducir una detención de G2 / M con nocodazol durante 12 h. Esto permitió un ciclo celular de etiquetado con BrdU (Figura 4A). Recolectamos células detenidas en G2 / M, las lavamos dos veces y las liberamos en medios nuevos que contenían BrdU. A medida que las células entraban en la fase S posterior, las regiones de replicación temprana deberían adquirir primero el marcaje de BrdU de la segunda hebra, imitando la repetición de estas regiones. (Figura 4A). Recolectamos células a las 0, 10, 15 y 25 h después de la liberación y analizamos su contenido de ADN mediante citometría de flujo para confirmar la progresión del ciclo celular (Figura 4B). El ADN genómico purificado de estos cultivos se sometió al procedimiento de digestión Rerep-Seq (Figura 4C). Fragmented DNA, sizes ranging from 100 to 3000 bp, was separated on an agarose gel, excised, purified, repaired and then analyzed for early and late replicating regions by qPCR.

Simulation of DNA Rereplication in human cells. (A) Schematic of simulated DNA rereplication in human cells. MDA-MB-231 cells were treated with BrdU for 4 h followed by a 12-h treatment with nocodazole (with BrdU) to generate a synchronized culture arrested at G2/M with single strand BrdU incorporation. G2/M arrested cells were released into fresh media with BrdU. Samples were collected at 0, 10, 15 and 25 h for analysis by flow cytometry and Rerep-Seq. (B) Confirmation of cell-cycle progression by flow cytometry. (C) Fragmentation of DNA increases as cells progress through the second cell cycle. (D) Enrichment of early replicating human regions. Mean fold enrichment of qPCR signal over T0, using primers against the early replicating region on Chr16-telomere and the late replicating region containing the HCN1 gene. Data represent the average of three biological replicates (norte = 3), error bars represent the SEM.

Simulation of DNA Rereplication in human cells. (A) Schematic of simulated DNA rereplication in human cells. MDA-MB-231 cells were treated with BrdU for 4 h followed by a 12-h treatment with nocodazole (with BrdU) to generate a synchronized culture arrested at G2/M with single strand BrdU incorporation. G2/M arrested cells were released into fresh media with BrdU. Samples were collected at 0, 10, 15 and 25 h for analysis by flow cytometry and Rerep-Seq. (B) Confirmation of cell-cycle progression by flow cytometry. (C) Fragmentation of DNA increases as cells progress through the second cell cycle. (D) Enrichment of early replicating human regions. Mean fold enrichment of qPCR signal over T0, using primers against the early replicating region on Chr16-telomere and the late replicating region containing the HCN1 gene. Data represent the average of three biological replicates (norte = 3), error bars represent the SEM.

As expected, we observed an increase in DNA fragmentation as cells progressed through S-phase (Figure 4C). This correlated with Rerep-Seq signal enrichment of the early replicating sub-telomeric region of chromosome 16 at 10 and 15 h post-release, while the late replicating region at the HCN1 gene was not enriched until 25 h post-release (Figure 4D) ( 25). We then processed these validated samples for sequencing using Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kit.

For comparison to our Rerep-Seq data, we used publicly available replication timing data from the related MCF-7 breast cancer cell line ( 16, 26). This replication timing data segmented the genome into ERDs, LRDs and TZs ( 16). Rerep-Seq signal from cells 10 to 15 h post-nocodazole release (correlating with early S phase Figure 4B) strongly correlated with the predefined ERDs from MCF-7 cells (Figure 5A and Supplementary Figure S2 ). Twenty-five hours after release from nocodazole, late regions accumulated signal connecting the intervening ERDs.

Global enrichment of early replicating regions in human cells using Rerep-Seq. (A) Rerep-Seq at Chr 16 as cells progress through S-Phase. RPM normalized and mitochondrial DNA scaled Rerep-Seq signal exhibits enrichment at ERDs (blue), followed by a broadening of signal into LRDs (red) as cell progress through S-phase. (B) Heat Map of Rerep-Seq Surrounding ERDs and LRDs 15 h post-nocodazole release. Heatmap is centered on either the ERD or LRD of interest and extends to the midpoint of the adjacent TZ. Each region was scaled from 0 to 100% to size normalize the ERDs and LRDs. The heatmap is sorted from highest to lowest based on signal intensity. Blue ticks indicate the ERDs. (C y D) Meta analysis of enrichment at all ERDs (C) and all LRDs (D).

Global enrichment of early replicating regions in human cells using Rerep-Seq. (A) Rerep-Seq at Chr 16 as cells progress through S-Phase. RPM normalized and mitochondrial DNA scaled Rerep-Seq signal exhibits enrichment at ERDs (blue), followed by a broadening of signal into LRDs (red) as cell progress through S-phase. (B) Heat Map of Rerep-Seq Surrounding ERDs and LRDs 15 h post-nocodazole release. Heatmap is centered on either the ERD or LRD of interest and extends to the midpoint of the adjacent TZ. Each region was scaled from 0 to 100% to size normalize the ERDs and LRDs. The heatmap is sorted from highest to lowest based on signal intensity. Blue ticks indicate the ERDs. (C y D) Meta analysis of enrichment at all ERDs (C) and all LRDs (D).

To confirm ERD enrichment genome wide, we analyzed Rerep-Seq signal 15 h after release across 462 ERDs and 470 LRDs. To define each region, we included half the TZ on either side of the ERD or LRD. Since these domains ranged in size from 1000 to 20 272 173 bps, we scaled across each domain and plotted the data from 0% (middle of preceding TZ) to 100% (middle of following TZ). Each region was then sorted by signal intensity, which resulted in a clear enrichment of ERDs (blue ticks) with higher signal intensity than LRDs (Figure 5B). As with yeast, a meta-analysis of both ERDs and LRDs (Figure 5C and D) demonstrates that signal enriches over ERDs 10 and 15 h post-release, while LRDs gain intensity 25 h post-release. Importantly, MDA-MB-231 cells labeled for two complete cell cycles (2cc, Figure 5A, bottom track) did not exhibit enrichment of Rerep-Seq signal over ERDs or LRDs (Figure 5C and D).

Analysis of rereplication following licensing deregulation in budding yeast

Disruption of replication licensing has been shown to induce DNA rereplication (by flow cytometry) in yeast, drosophila and human cells ( 27–30). However, we know little about which sequences are rereplicated or if the whole genome is rereplicated evenly. To address this question, we took advantage of a CDK-bypass strain, courtesy of Dr Hiroyuki Araki, which harbors a mutant Cdc45 H22Y (JET1), that binds unphosphorylated Sld3, along with galactose inducible DBF4 and a phosphomimetic mutant of Sld2, sld2-11D. Together these mutants facilitate the interaction between Cdc45, Sld2, Sld3 and Dpb11, without phosphorylation, activating DNA replication origins independently of S-phase CDK activity (Figure 6A) ( 31). When grown in galactose, this strain exhibits greater than 2N DNA content even when arrested with α-factor, demonstrating bypass of normal licensing requirements ( 31). We transformed this strain to facilitate BrdU uptake with the BrdU-Inc cassette ( 15) to allow application of Rerep-Seq (Strain YJB18).

Deregulation of replication licensing induces non-random DNA rereplication in Yeast. (A) Schematic of genetic CDK bypass inducing DNA rereplication. Mutant Cdc45 H22Y (JET1) in combination with galactose inducible DBF4 and a galactose inducible phospho-mimetic Sld2-11D mutant, binds Sld3 and then facilitates the interaction between Sld3 and Dpb11 without phosphorylation. This results in activating DNA replication origins independently of S-phase CDK activity. (B) Schematic of CDK bypass experiment. YJB18 (JET1 GALp-sld2-11D, GALp-DBF4) cells grown in raffinose are then treated with α-factor to arrest culture in G1. Culture was then split into two: one grown in galactose the other in raffinose. BrdU was added to both. Cells were collected at 5 h post-galactose addition for DNA extraction and PI flow cytometry. (C) Cell-cycle analysis of YJB18 confirms increased DNA content indicative of DNA rereplication. (D) Fragmentation of rereplicated DNA by Rerep-Seq. (mi) RPM normalized and mitochondrial DNA scaled reads were plotted. Data represent the average of three biological replicates. Gray ticks indicate ARS, ERDs are indicated in blue, LRDs in red. Green lines indicate position of Topologically Associating Domains (TADs).

Deregulation of replication licensing induces non-random DNA rereplication in Yeast. (A) Schematic of genetic CDK bypass inducing DNA rereplication. Mutant Cdc45 H22Y (JET1) in combination with galactose inducible DBF4 and a galactose inducible phospho-mimetic Sld2-11D mutant, binds Sld3 and then facilitates the interaction between Sld3 and Dpb11 without phosphorylation. This results in activating DNA replication origins independently of S-phase CDK activity. (B) Schematic of CDK bypass experiment. YJB18 (JET1 GALp-sld2-11D, GALp-DBF4) cells grown in raffinose are then treated with α-factor to arrest culture in G1. Culture was then split into two: one grown in galactose the other in raffinose. BrdU was added to both. Cells were collected at 5 h post-galactose addition for DNA extraction and PI flow cytometry. (C) Cell-cycle analysis of YJB18 confirms increased DNA content indicative of DNA rereplication. (D) Fragmentation of rereplicated DNA by Rerep-Seq. (mi) RPM normalized and mitochondrial DNA scaled reads were plotted. Data represent the average of three biological replicates. Gray ticks indicate ARS, ERDs are indicated in blue, LRDs in red. Green lines indicate position of Topologically Associating Domains (TADs).

To determine which regions are rereplicated upon deregulation of licensing, we arrested cells in α-factor, shifted cells to galactose or raffinose and added BrdU for 5 h (Figure 6B). When YJB18 was grown in galactose, we observed the expected increase in cellular DNA content by flow cytometry (Figure 6C). YJB18 grown in raffinose was arrested in G1 using α-factor, then split into two cultures: one grown in raffinose with BrdU (no rereplication induction) and one grown in galactose with BrdU (induced rereplication). Five hours of galactose induction was sufficient for G1 arrested cells to attain greater than 2N DNA content and exhibit substantial DNA fragmentation using the Rerep-Seq digest protocol (Figure 6C and D). Fragmented DNA was gel purified, repaired then prepared for sequencing with Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kits.

Analysis of Rerep-Seq data demonstrated that not all chromosomes were rereplicated evenly (Figure 6E and Supplementary Figure S3 ). Generally, we observed large broad domains on multiple chromosomes. Some domains were centered on the chromosomes (chromosomes 12,16), some had two large domains (chromosomes 4,13), while other domains were enriched toward either end of the chromosome (chromosomes 2,3,5,7,10,11,14,15). Some chromosomes either did not rereplicate or were completely rereplicated that we could not distinguish using Rerep-Seq (chromosome 1,6,8,9). These broad domains spanned across multiple ARSs (Figure 6E and Supplementary Figure S3 ) making it difficult to determine the ARS of origin, if any. The broad domains spanned both early and late replication domains and contained both early and late firing ARS sequences. Consistent with crossing multiple replication timing domains, the rereplicated regions also crossed multiple topological boundaries defined previously in α-factor arrested cells ( 32). These data demonstrate that DNA rereplication following licensing disruption in yeast is non-random and does not result in uniform whole genome duplication.


Chromosome Dimer Resolution by Site-Specific Recombination

Introducción

Chromosome replication is a key function of living cells, and any factor that impedes progression of replication forks can result in mutagenesis and genome instability. Several pathways have evolved to rescue replication forks stalled by DNA damage, some of them involving homologous recombination between sister chromosomes. These exchanges pose a unique threat to the integrity of circular genomes because they generate chromosome dimers, which must be converted back to monomers for a correct segregation to daughter cells ( Figure 1 ). To overcome the problem of chromosome dimerization, bacteria with circular chromosome(s) have evolved a site-specific recombination mechanism, the Xer system, to resolve dimers prior to cell division. The activity of this system is tightly controlled and integrated into the cell cycle via the activity of a DNA translocase associated with the cell division apparatus, the FtsK protein.

Figure 1 . Formation of chromosome dimers. The top panel represents a replicating chromosome undergoing a recombinational repair event after breakage of the lagging-strand template ahead of a replication fork. The action of recombination enzymes leads to the formation of an HJ and a substrate for replication fork restart. Old DNA strands are in blue and newly synthesized strands are in red. The arrowheads show 3′ DNA ends. Resolution of the HJ can occur by cutting either pair of strands: A-cuts or B-cuts indicated by the open and black triangles, respectively. As shown in the bottom panels, A-cuts lead to chromosome dimerization. Notably, the enzyme resolving HJs, the RuvABC complex, prefers A-cut and thus tends to produce dimers from the recombination intermediate drawn here.

Because chromosome dimers do not form in every cell, the Xer system is not essential for growth. En Escherichia coli, it is estimated that about 15% of the cells in a standard laboratory culture require Xer activity to produce viable progeny. In cells carrying unresolved dimers (i.e., mutated for Xer), division proceeds and traps DNA, bisecting the dimeric chromosome. This induces chromosome breakage by an unknown mechanism, which provokes extensive DNA degradation and induction of the SOS response, thereby preventing further cell division. Cells thus form long aseptate filaments containing aberrant DNA masses and finally die. Although few data are available, it is largely anticipated that both the rate of chromosome dimerization and the fate of unresolved dimers vary in different bacteria.


Lysogenic Cycle

The lysogenic cycle is a method by which a virus can replicate its DNA using a host cell. Typically, viruses can undergo two types of DNA replication: the lysogenic cycle or the lytic cycle. In the lysogenic cycle, the DNA is only replicated, not translated into proteins. In the lytic cycle, the DNA is multiplied many times and proteins are formed using processes stolen from the bacteria. While the lysogenic cycle can sometimes happen in eukaryotes, prokaryotes or bacteria are much better understood examples.

A bacteriophage, or bacteria virus, injects its DNA into the bacteria. The DNA is then replicated when the bacteria undergo cell division. Because all DNA is made of the same base molecules, and viral DNA is no exception, the same chemical reaction that replicates bacterial DNA can replicate viral DNA. Since these processes are already happening in the bacteria, the lysogenic cycle can be thought of as the virus hitching a ride on the efforts already being spent by the bacteria. Typically, the bacteria is unharmed by this process because the amount of viral DNA produced is small, and the bacterial machinery has not been hijacked by the virus, like in the lytic cycle.

In this way, through no effort of its own, the virus can replicate its DNA through the lysogenic cycle, or the continued replication of viral DNA through bacterial division. When the conditions are right, the viral DNA will undergo induction and the DNA will switch to the lytic cycle, in which the DNA is actively transcribed and translated into protein shells which can harbor viral DNA outside of the cell. At a certain point, the infected bacteria will be full of viruses, each encapsulated in a viral capsid protein. The cell will lyse, or burst, and the viruses will be released into the environment, able to infect other bacteria.

Once a new capsid, containing viral DNA, finds its way to a bacteria, the process starts over. If the conditions are no longer right for the lytic cycle, the lysogenic cycle resumes. No capsids are produced, but the DNA is replicated when the bacteria undergo replication. To an observer, the virus would appear to be dormant, or the bacteria would look uninfected. Simply replicating the DNA in the lysogenic cycle is not enough to kill or damage the bacteria. In this way, it looks healthy. Once conditions become favorable for the virus to leave the bacteria, it will exit the lysogenic cycle and enter the lytic cycle.

Lysogenic Cycle Steps

Step 1: A bacteriophage virus infects a bacteria by injecting its DNA into the bacterial cytoplasm, or liquid space inside of the cell wall.

Step 2: The viral DNA is read and replicated by the same bacterial proteins that replicate bacterial DNA.

  • Bacteriophage – A virus that infects bacteria, also known simply as phages.
  • Lytic Cycle – One of two methods of viral reproduction, in which DNA is replicated and capsid cases are made to carry it.
  • Induction – The process by which viral DNA is switched from the lysogenic cycle to the lytic cycle.
  • Viral Capsid Protein – A protein, translated by bacterial mechanisms from viral DNA, meant to encapsulate viral DNA and protect it from the environment while providing a delivery mechanism into the next host.

1. A eukaryotic virus, such as one that can infect humans, typically proliferates by using the cellular machinery of the host it infects to produce more virus DNA, each contained in a capsid. Rarely does the virus only replicate its DNA and not produce a capsid. Which viral reproduction cycle do eukaryotic viruses most display?
A. Lysogenic Cycle
B. Bacteriophagic Cycle
C. Lytic Cycle

2. The virus that causes Dengue Fever, a tropical disease found in areas with high mosquitos, is transferred from human to human via mosquito. In the human cells, the virus multiplies, encapsulates in capsids, and bursts from cells into the bloodstream. The mosquito then picks these capsids up, where they infect some of the mosquito’s cells. The Dengue virus, after multiplying, encapsulating, and making its way to the salivary gland of the mosquito, is then deposited in the next human to be bitten by that mosquito. Which is true?
A. The Dengue virus goes through both the lysogenic and lytic cycles.
B. The Dengue virus goes through the lytic cycle.
C. The Dengue virus goes through the lysogenic cycle.

3. What is the main difference between the lysogenic cycle and the lytic cycle?
A. The fact that DNA is replicated.
B. The amount of DNA replicated and the production of capsid protein covers.
C. The use of the host’s machinery to complete the process.


The Replicon Model of Replication Initiation

The initial replication fork requires the separation of the two strands of the DNA duplex to provide a template for the synthesis of both the RNA primer and new DNA. Specific genomic DNA sequence direct the initiation of DNA Replication. The specific sites at which DNA unwinding and initiation of replication occur are called Origin of Replication.

The Replicon Model of Replication Initiation:

In 963 Frabcois Jacob, Sydney Brenner and Jacques Cuzin proposed a model to explain the events controlling the initiation of replication in bacteria. It proposed two components that control the initiation of replication :

  • Replicator: Replicator is defined as the entire set of cis-acting DNA sequences that is sufficient to direct the initiation of Replication.
  • Initiator: Initiator is the protein which specifically recognizes a DNA elements in the replicator and activates the initiation of replication. The initiator protein is the only sequence specific DNA-binding protein involved in the initiation of replication.

The model proposed that all the DNA replicated from a particular origin as a replicon. In prokaryotes since there is only one origin of replication at the single chromosome, the entire chromosome is a single replicon. In contrast the presence of multiple origins of replication divides each eukaryotic chromosomes into multiple replicons.

Replicator:

The origin of replication is the site on DNA where the DNA is unwound and DNA synthesis initiates. Although the origin of replication is always part of the replicator, sometimes the origin of replication is only a fraction of the replicator.

DNA Sequences of Replicator Share two common features:

  • First, they include a binding site for the initiator protein.
  • They include a stretch of AT-rich DNA that unwinds readily but not spontaneously. Unwinding of DNA at replicators is controlled by the replication Initiation Proteins.

The single replicator required for E-Coli chromosomal replication is called oriC. There are two repeated motif that are critical for oriC function. The 9-mer motif is the binding site for the E-Coli initiator, DnaA, and is repeated four times at oriC. The 1 3-mer motif, repeated 3 times, is the initial site of ssDNA formation during initiation.

Initiator:

Initiator proteins typically perform 3 different functions:

  1. Binding to the replicator – Bind a specific sequence DNA sequence within the replicator.
  2. Unwind DNA – once bound to the DNA, they frequently distort or unwind a region of DNA adjacent to the site of binding.
  3. Recruiting other replication proteins – Initiator proteins interact with additional factors required for replication initiation, thus recruiting them to the replicator.

In Prokaryotes, for example, the E-coli initiator, DnaA binds the repeated 9-mer elements in oriC and is regulated by ATP. When bound to ATP, DnaA also interacts with DNA in the region of the repeated 1 3-mer repeats of oriC. These additional interactions result in the separation of the DNA strands over more than 20bp within the 1 3-mer repeat region. this unwound DNA provides an ssDNA template for additional replication proteins such ad DNA helicase to begin the RNA and DNA synthesis steps of replication.

In Eukaryotes, the initiator is known as the origin recognition complex (ORC). It is a complex formed of 6 proteins. Like DnaA in E-Coli, ORC binds and hydrolyze ATP. ATP is required for sequence-specific DNA binding at the origin. Unlike DNA binding ORC at the replicator does not separate the DNA strands. ORC is , however, required to recruit all the remaining replication proteins to the replicator before it unwinds. Unwinding the strands requires the origin to get activated. Origin activation occurs only when the cell enters S phase of cell cycle.

Unlike prokaryotic initiator, ORC of eukaryotes have two functions:

once the initiator binds to the replicator, the remaining steps in the initiation of replication is largely driven by the protein-protein interactions and protein-DNA interactions that are sequence independent. The end result is the assembly of two replication fork.


Two proteins slow down the train of DNA replication in Drosophila

Quantitative droplet-digital PCR (ddPCR) copy number assay for multiple underreplicated regions. Each bar is the average enrichment relative to a fully replicated control region for three biological replicates. Credit: Jared Nordman

Two major factors matter when it comes to cells copying DNA: getting everything accurate in the sequence and how much of it is replicated. Mistakes can result in mutations, which can lead to diseases such as cancer.

Jared Nordman, assistant professor of biological sciences at Vanderbilt, said scientists already understood the amount of DNA replicated had to do with where the duplication process started and ended – akin to a train carrying passengers from point A to point B. The train's starting point and destination are important, but so is its speed. When it comes to DNA replication, that area hasn't been explored as broadly.

"We knew that the Suppressor of Underreplication (SUUR) protein was involved in slowing down the replication machinery, but we didn't know how it worked," Nordman said. "In fruit flies, which have all the machinery necessary to copy DNA virtually identically to humans, the SUUR protein physically interacts with the Rif1 protein, bringing it to the train. Once there, Rif1 has the capacity to inhibit or slow down replication."

Rif1 controls how much DNA gets copied in human cells too, but nobody knows how it does this job. While humans don't have SUUR, they likely use another adaptive protein to help Rif1 slow down the replication machinery. This work was the foundation for a new National Science Foundation grant to interrogate how the Rif1 protein controls DNA replication, Nordman said.

His team's latest findings on the subject are outlined in a paper titled "Rif1 inhibits replication fork progression and controls DNA copy number in Drosophila," published Oct. 2 in the journal eLife.


Initiation

  • Helicase &ndash The point at which the replication begins is known as the Origin of Replication. Helicase brings about the procedure of strand separation, which leads to the formation of the replication fork. It breaks the hydrogen bond between the base pairs to separate the strand. It uses energy obtained from ATP Hydrolysis to perform the function.
  • SSB Protein &ndash Next step is for the Single-Stranded DNA Binding Protein to bind to the single-stranded DNA. Its job is to stop the strands from binding again.
  • DNA Primase &ndash Once the strands are separated and ready, replication can be initiated. For this, a primer is required to bind at the Origin. Primers are short sequences of RNA, around 10 nucleotides in length. Primase synthesizes the primers.

Origin of Replication in Viruses

Viruses often have a single Replicative origin.

A variety of proteins have been described as being involved in viral replication. For instance, Polyomaviruses utilize host cell DNA polymerases, which attach to a viral origin of replication if the T antigen is present.