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¿Hay nudos en el ADN?


Esta pregunta puede parecer una tontería. ¿Cómo es posible que las moléculas de ADN no estén totalmente entrelazadas con el tiempo en la célula? Si pongo cuerdas largas en una caja y la agito, eso crearía nudos y no podría aislar fácilmente cada cuerda.

Pero durante las mitosis, los cromosomas están totalmente aislados entre sí, mientras que por lo demás, el ADN flota libremente en el núcleo.


Creo que un factor clave es que las moléculas de ADN no son trozos pasivos de cuerda que se dejan moverse libremente (que es lo que causa nudos en cosas parecidas a cuerdas que se dejan solos demasiado tiempo).

Por un lado, la molécula de ADN es una parte activa del metabolismo celular, ya que se transcribe constantemente (para generar ARN y proteínas) o se copia o corrige, etc. Y como parte de su papel en el metabolismo, la molécula de ADN está estrechamente asociada con moléculas de ARN, proteínas y específicamente proteínas que envuelven el ADN llamadas "histonas". La página de Wikipedia para "Cromatina" (de qué están hechos los cromosomas, básicamente) describe varios aspectos de esta organización, que incluyen:

Ese ADN que codifica genes que se transcriben activamente ("activados") está más suelto y asociado con ARN polimerasas (denominadas eucromatina), mientras que el ADN que codifica genes inactivos ("desactivados") está más condensado y asociado con estructuras proteínas (heterocromatina).

Entonces, el ADN está siendo manipulado constantemente por todo tipo de proteínas y enzimas que afectan su forma y posición en el espacio; no está simplemente ahí tirado. Y en la medida en que pudiera enredarse, eso probablemente sería parte de las manipulaciones de las enzimas y proteínas, o sería bastante fácil de manejar por ellas. Sin embargo, esto no significa que el ADN no tenga nudos, de hecho, parece que puede:

TEORÍA DEL ADN Y DEL NUDO (del Instituto de Modelado Ambiental de la Universidad de Tennessee)

Conclusiones: Los principios de topología brindan a los biólogos celulares una forma cuantitativa, poderosa e invariable de medir las propiedades del ADN. Los principios de la teoría de los nudos han ayudado a dilucidar los mecanismos por los que las enzimas descomponen el ADN. Además, los métodos topológicos han influido en la determinación del devanado zurdo del ADN alrededor de las histonas. La medición de los cambios en el número de cruces también ha sido fundamental para comprender la terminación de la replicación del ADN y el papel de las enzimas en la recombinación.

(tenga en cuenta que este artículo analiza el ADN en E. coli, que no organiza su ADN en cromatina como lo hacen los eucariotas).

Desenredar el ADN (del Naturaleza blog CreatureCast, 2013)

Este enlace incluye un video sobre las topoisomerasas, enzimas también mencionadas en el enlace anterior que desenredan el ADN.

Un estudio de Monte Carlo de nudos en cadenas largas de ADN de doble hebra (PLOS Biología Computacional, 2016)

Cita del resumen:

Aunque nuestro modelo de grano grueso solo se basa en probabilidades experimentales de anudado de hebras cortas de ADN, reproduce la longitud de persistencia correcta del ADN. Esto indica que los nudos no solo son un calibre fino para las propiedades estructurales, sino una herramienta prometedora para el diseño de modelos de polímeros.

El sitio activo del dominio SET se construye sobre un nudo (Biología estructural de la naturaleza, 200)
¿Un nudo o no un nudo? Dejando las cosas claras sobre las proteínas (Biología y Química Computacional, 2003)

Estos artículos discuten los posibles nudos dentro de una proteína de histona, no el ADN, pero ilustran que la topología y los nudos pueden ser importantes en las macromoléculas:

Un nudo dentro del dominio SET ayuda a formar el sitio activo de metiltransferasa, donde AdoHcy se une y es probable que ocurra la metilación de lisina.

Un nuevo nudo encontrado en el dominio SET se examina a la luz de cinco estructuras cristalinas recientes y sus descripciones en la literatura. Utilizando el algoritmo de Taylor se estableció que la cadena principal no forma un verdadero nudo.

El descubrimiento de un nudo de ADN predicho fundamenta un modelo para la recombinación específica del sitio (Ciencias, 1985)

Este enlace es un poco doloroso de leer (y de 1985, así que no sé si fue reemplazado, pero tiene más de 200 citas), así que lo dejaré en el título.

Y finalmente este artículo, que miré por último pero que probablemente debería haberlo mirado primero porque la primera oración del resumen responde literalmente a su pregunta:

Observación directa de los nudos de ADN utilizando un nanoporo de estado sólido (Nanotecnología de la naturaleza, 2016)

Las moléculas de ADN largas pueden autoenredarse en nudos. Las técnicas experimentales para observar tales nudos de ADN (principalmente electroforesis en gel) se limitan a métodos de volumen y moléculas circulares de menos de 10 kilopares de bases de longitud. Aquí, mostramos que los nanoporos de estado sólido se pueden usar para observar directamente los nudos individuales en moléculas de ADN individuales lineales y circulares de longitud arbitraria.


Observar el paso del ADN anudado deslizarse a través de los nanoporos

Cualquiera que haya estado en un barco de vela sabe que hacer un nudo es la mejor manera de sujetar una cuerda a un gancho y evitar que se resbale. Lo mismo ocurre con los hilos de coser en los que se introducen nudos para evitar que se deslicen a través de dos piezas de tela. Entonces, ¿cómo pueden los filamentos de ADN largos, que tienen una estructura enrevesada y muy anudada, lograr pasar a través de los diminutos poros de varios sistemas biológicos? Ésta es la fascinante cuestión que abordan Antonio Suma y Cristian Micheletti, investigadores de la Escuela Internacional de Estudios Avanzados (SISSA) de Trieste que utilizaron simulaciones por ordenador para investigar las opciones disponibles para el material genético en tales situaciones. El estudio se acaba de publicar en PNAS.

"Nuestro estudio computacional arroja luz sobre los últimos avances experimentales en la manipulación del ADN anudado y agrega elementos interesantes e inesperados", explica Micheletti. "Primero observamos cómo los filamentos de ADN anudados atraviesan poros minúsculos con un diámetro de aproximadamente 10 nanómetros (10 mil millonésimas de metro). El comportamiento observado en nuestras simulaciones concuerda bien con las mediciones experimentales obtenidas por un equipo de investigación internacional dirigido por Cees Dekker. , que se publicaron hace sólo unos meses en Nature Biotechnology. Estos experimentos avanzados y sofisticados marcaron un punto de inflexión para comprender el anudado del ADN. Sin embargo, los experimentos actuales no pueden "ver" cómo los nudos del ADN pasan realmente a través del poro estrecho ". De hecho, el fenómeno se produce en una escala espacial diminuta y, por tanto, inaccesible para los microscopios. Esta es precisamente la razón por la que nuestro grupo recurrió a lo que el gran biofísico alemán Klaus Schulten llamó "el microscopio computacional", es decir, simulaciones por computadora ".

Suma y Micheletti explican: "Las simulaciones revelaron que el paso del nudo puede ocurrir de dos formas distintas: una donde el nudo está apretado y otra donde el nudo está más deslocalizado. En ambos casos, el nudo no solo logra pasar a través del poro, pero lo hace en muy poco tiempo ". Además, el nudo suele pasar en las etapas finales de la translocación, cuando ya ha pasado la mayor parte de la hebra de ADN. "Pero hay algo más que es contradictorio" afirman los autores, "el tamaño del nudo, sea pequeño o grande, no parece afectar mucho el tiempo de obstrucción de los poros. Este último depende en cambio de la velocidad de translocación, que, en giro, depende de la posición inicial del nudo a lo largo del filamento ". Estos resultados, dicen los investigadores, deberían ayudar al diseño de futuros experimentos que investiguen el anudado espontáneo del ADN, un lugar aún en gran parte inexplorado, especialmente en lo que respecta al tamaño de los nudos del ADN.

Avanzar en nuestra comprensión actual de los nudos en las moléculas biológicas es importante para aclarar sus implicaciones en contextos biológicos y aplicativos, como la secuenciación de ADN mediante nanoporos. Suma y Micheletti esperan que las direcciones prometedoras sugeridas por su estudio puedan conducir a un perfil más detallado y preciso del entrelazamiento en ADN, ARN y proteínas.


¿Hay nudos en los cromosomas?

Desarrollos recientes han permitido por primera vez la determinación de estructuras tridimensionales de cromosomas y genomas individuales en núcleos de células madre embrionarias (ES) de ratón haploides individuales basadas en datos de contacto de conformación cromosómica Hi⁻C. Aunque estas primeras estructuras tienen una resolución relativamente baja, proporcionan los primeros datos experimentales que pueden usarse para estudiar el plegamiento de cromosomas y genomas intactos. Aquí analizamos más a fondo estas estructuras y proporcionamos la primera evidencia de que los cromosomas de la fase G1 están anudados, en consonancia con el hecho de que las gráficas de probabilidad de contacto frente a separación de secuencia muestran una dependencia de la ley de potencia que es intermedia entre la de un glóbulo fractal y una estructura de equilibrio.

Palabras clave: ADN cromosomas territorios cromosomas fractal glóbulos nudos.

Declaracion de conflicto de interes

No hay conflictos que declarar.

Cifras

Estructura del genoma intacto ...

Estructura del genoma intacto del modelo 3 de la célula No. 2. Cromosomas ...

Variación en la probabilidad de contacto experimental ...

Variación en la probabilidad de contacto experimental con separación de secuencia calculada en las 8 celdas.…

Dibujos esquemáticos de los cinco ...

Dibujos esquemáticos de los cinco nudos más simples (0 0, 3 1…

Estructura del cromosoma 14 de…

Estructura del cromosoma 14 de la celda 2 [48]. Panel ( a ) muestra ...

La estabilidad de un nudo frente a los desplazamientos aleatorios de sus nodos. La probabilidad…


ADN: resolviendo los nudos

El ADN, como otras macromoléculas, tiene la propensión a enredarse. Sin embargo, los factores que controlan la formación de nudos y su papel en los procesos biológicos son poco conocidos debido a la falta de técnicas de observación adecuadas. Ahora, utilizando un sistema de nanoporos de estado sólido, los investigadores pueden sondear la naturaleza de estas esquivas características.

Anteriormente se han utilizado varias técnicas experimentales para investigar los nudos de ADN; sin embargo, todas son métodos a granel que están restringidos a ADN relativamente corto (& lt10 kilopares de bases) y / o circular. Por el contrario, la técnica de nanoporos informada por Cees Dekker y sus colaboradores en Nanotecnología de la naturaleza permite la observación de nudos individuales en ADN lineal y circular bicatenario de longitud arbitraria. “Aunque tales nudos son más frecuentes en longitudes largas, no existía un método para observar nudos en moléculas de ADN largas antes de nuestra técnica”, explica Dekker.

Los nanoporos de estado sólido se utilizan para estudiar las propiedades fundamentales de las biomoléculas a nivel de una sola molécula y sus interacciones (por ejemplo, entre el ADN y las proteínas), así como la separación y secuenciación del ADN. La técnica implica la aplicación de un potencial eléctrico a través de una membrana que contiene un nanoporo (normalmente de unos 20 nm de ancho) con un depósito lleno de electrolito a cada lado. Una biomolécula cargada (como el ADN) es impulsada a través del nanoporo por una fuerza electroforética, donde provoca un bloqueo en la corriente iónica que depende del volumen de polímero en el poro y, en el caso del ADN, de los pares de bases específicos. .

Aunque la translocación de ADN a través de nanoporos es la base de varias aplicaciones en desarrollo comercial (por ejemplo, en detección y secuenciación) y es adecuada para moléculas de ADN grandes, la técnica no ha proporcionado información sobre la presencia y naturaleza de los nudos. El equipo de Dekker ha estado estudiando la detección de ADN en nanoporos durante más de 15 años. “Desde que comencé a trabajar en la translocación del ADN a través de nanoporos, me preguntaba por qué el ADN atravesaría un poro tan pequeño de una manera agradable de la cabeza a la cola sin encontrar nudos”, dice Dekker. Ahora, armados con una resolución temporal mucho más alta en comparación con su sistema de nanoporos anterior, demostraron que es posible no solo detectar nudos, sino también obtener información detallada y sin precedentes sobre sus propiedades.

Los investigadores investigaron cómo la aparición de nudos depende de la longitud del ADN (hasta 166 kilopares de bases), así como del tamaño y la posición de los nudos individuales. La ocurrencia de anudados aumentó con la longitud, con una probabilidad constante por unidad de longitud, lo que es consistente con los resultados de simulaciones teóricas previas. Además, bajo alto voltaje, observaron que los nudos en el ADN lineal se deslizaban cuando el ADN pasaba a través del nanoporo. El hallazgo más notable, sin embargo, fue que los nudos eran extremadamente apretados (& lt100 nm).

Las implicaciones de este trabajo se extienden a cualquier aplicación que involucre polímeros largos así como a estudios fundamentales de anudado en sistemas biológicos. “La presencia de nudos se ha ignorado en gran medida en muchas aplicaciones de nanoporos, porque la resolución limitada de las mediciones nos impidió observarlos”, explica Dekker. "Ahora que hemos demostrado que los nudos están ahí, es importante tenerlos en cuenta en aplicaciones, como la detección de proteínas unidas al ADN, y particularmente al sondear longitudes de ADN largas".

"La presencia de nudos se ha ignorado en gran medida en muchas aplicaciones de nanoporos, porque la resolución limitada de las mediciones nos impidió observarlos"

Cristian Micheletti, teórico y experto en nudos poliméricos de la Escuela Internacional de Estudios Avanzados de Trieste, Italia, que no participó en el estudio, comenta: “Esto confirma vívidamente la predicción de que, para cadenas de ADN equilibradas, la longitud más probable del nudo es relativamente pequeño. Sin embargo, el paso a través del poro también puede haber contribuido al endurecimiento del nudo, como hemos observado en simulaciones de translocación de ADN monocatenario anudado ". En cuanto a una extensión natural (aunque desafiante) de este trabajo, Micheletti agrega: "Espero que este avance pueda ayudar a detectar el entrelazamiento de ADN monocatenario también en un futuro próximo". Esto sería particularmente relevante para la secuenciación, que requiere ADN monocatenario.


La estructura del ADN proporciona un mecanismo de herencia

Los genes transportan información biológica que debe copiarse con precisión para transmitirla a la siguiente generación cada vez que una célula se divide para formar dos células hijas. De estos requisitos surgen dos cuestiones biológicas centrales: ¿cómo se puede transportar en forma química la información para especificar un organismo y cómo se copia con precisión? El descubrimiento de la estructura de la doble hélice del ADN marcó un hito en la biología del siglo XX porque inmediatamente sugirió respuestas a ambas preguntas, resolviendo así a nivel molecular el problema de la herencia. Discutimos brevemente las respuestas a estas preguntas en esta sección y las examinaremos con más detalle en los capítulos siguientes.

El ADN codifica información a través del orden o secuencia de los nucleótidos a lo largo de cada hebra. Cada base & # x02014A, C, T o G & # x02014 puede considerarse como una letra en un alfabeto de cuatro letras que explica mensajes biológicos en la estructura química del ADN. Como vimos en el Capítulo 1, los organismos se diferencian entre sí porque sus respectivas moléculas de ADN tienen diferentes secuencias de nucleótidos y, en consecuencia, llevan diferentes mensajes biológicos. Pero, ¿cómo se usa el alfabeto de nucleótidos para hacer mensajes y qué deletrean?

Como se discutió anteriormente, se sabía mucho antes de que se determinara la estructura del ADN que los genes contienen las instrucciones para producir proteínas. Por lo tanto, los mensajes de ADN deben codificar proteínas de alguna manera (Figura 4-6). Esta relación facilita inmediatamente la comprensión del problema, debido al carácter químico de las proteínas. Como se discutió en el Capítulo 3, las propiedades de una proteína, que son responsables de su función biológica, están determinadas por su estructura tridimensional, y su estructura está determinada a su vez por la secuencia lineal de los aminoácidos que la componen. La secuencia lineal de nucleótidos en un gen debe, por lo tanto, explicar de alguna manera la secuencia lineal de aminoácidos en una proteína. La correspondencia exacta entre el alfabeto de nucleótidos de cuatro letras del ADN y el alfabeto de aminoácidos de veinte letras de las proteínas & # x02014el código genético & # x02014 no es obvia a partir de la estructura del ADN, y tomó más de una década después del descubrimiento de la doble hélice anterior. se resolvió. En el Capítulo 6 describimos este código en detalle en el transcurso de la elaboración del proceso, conocido como la expresion genica, a través del cual una célula traduce la secuencia de nucleótidos de un gen en la secuencia de aminoácidos de una proteína.

Figura 4-6

La relación entre la información genética contenida en el ADN y las proteínas.

El conjunto completo de información en el ADN de un organismo se llama genoma y contiene la información de todas las proteínas que el organismo sintetizará alguna vez. (El término genoma también se usa para describir el ADN que lleva esta información). La cantidad de información contenida en los genomas es asombrosa: por ejemplo, una célula humana típica contiene 2 metros de ADN. Escrita en el alfabeto de nucleótidos de cuatro letras, la secuencia de nucleótidos de un gen humano muy pequeño ocupa un cuarto de página de texto (Figura 4-7), mientras que la secuencia completa de nucleótidos en el genoma humano llenaría más de mil libros del tamaño de este. Además de otra información crítica, contiene las instrucciones de unas 30.000 proteínas distintas.

Figura 4-7

La secuencia de nucleótidos del gen de la globina de & # x003b2 humana. Este gen transporta la información de la secuencia de aminoácidos de uno de los dos tipos de subunidades de la molécula de hemoglobina, que transporta oxígeno en la sangre. Un gen diferente, la & # x003b1-globina (más.)

En cada división celular, la célula debe copiar su genoma para pasarlo a ambas células hijas. El descubrimiento de la estructura del ADN también reveló el principio que hace posible esta copia: dado que cada hebra de ADN contiene una secuencia de nucleótidos que es exactamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de su hebra asociada, cada hebra puede actuar como molde o molde. , para la síntesis de una nueva hebra complementaria. En otras palabras, si designamos las dos cadenas de ADN como S y S & # x02032, la cadena S puede servir como plantilla para hacer una nueva cadena S & # x02032, mientras que la cadena S & # x02032 puede servir como plantilla para hacer una nueva cadena S (Figura 4-8). Por lo tanto, la información genética en el ADN se puede copiar con precisión mediante el proceso maravillosamente simple en el que la hebra S se separa de la hebra S & # x02032, y cada hebra separada sirve como plantilla para la producción de una nueva hebra de pareja complementaria que es idéntica a su hebra. antiguo compañero.

Figura 4-8

El ADN como plantilla para su propia duplicación. Como el nucleótido A se empareja con éxito solo con T y G con C, cada hebra de ADN puede especificar la secuencia de nucleótidos en su hebra complementaria. De esta manera, el ADN de doble hélice se puede copiar con precisión. (más. )

La capacidad de cada hebra de una molécula de ADN de actuar como plantilla para producir una hebra complementaria permite que una célula copie, o reproducir exactamente, sus genes antes de transmitirlos a sus descendientes. En el siguiente capítulo describimos la elegante maquinaria que utiliza la célula para realizar esta enorme tarea.


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Comunicado de prensa

Es ADN, pero no como lo conocemos.

Por primera vez en el mundo, los investigadores australianos han identificado una nueva estructura de ADN y ndash llamada i-motif y ndash dentro de las células. El i-motivo, un rsquo y lsquoknot y rsquo retorcido de ADN, nunca antes se había visto directamente dentro de las células vivas.

Los nuevos hallazgos, del Instituto Garvan de Investigación Médica, se publican hoy en la revista líder Química de la naturaleza.

En lo profundo de las células de nuestro cuerpo se encuentra nuestro ADN. La información en el código de ADN y todos los 6 mil millones de letras A, C, G y T proporciona instrucciones precisas sobre cómo se construyen nuestros cuerpos y cómo funcionan.

La icónica forma de & lsquodouble helix & rsquo del ADN ha capturado la imaginación del público desde 1953, cuando James Watson y Francis Crick descubrieron la estructura del ADN. Sin embargo, ahora se sabe que los tramos cortos de ADN pueden existir en otras formas, al menos en el laboratorio y los científicos sospechan que estas diferentes formas podrían desempeñar un papel importante en cómo y cuándo el código de ADN es "lsquoread".

La nueva forma se ve completamente diferente a la doble hélice de ADN de doble hebra.

"Cuando la mayoría de nosotros pensamos en el ADN, pensamos en la doble hélice", dice el profesor asociado Daniel Christ (director del Laboratorio de Terapéutica de Anticuerpos, Garvan), quien codirigió la investigación. & ldquoEsta nueva investigación nos recuerda que existen estructuras de ADN totalmente diferentes y que bien podrían ser importantes para nuestras células. & rdquo

& ldquoThe i-motif es un & lsquoknot & rsquo de ADN de cuatro cadenas, & rdquo, dice el profesor asociado Marcel Dinger (director del Centro Kinghorn de Genómica Clínica, Garvan), quien codirigió la investigación con el profesor Christ.

& ldquoEn la estructura del nudo, las letras C en la misma hebra de ADN se unen entre sí y ndash, por lo que esto es muy diferente de una doble hélice, donde las & lsquoletters & rsquo en hebras opuestas se reconocen entre sí, y donde Cs se unen a Gs [guaninas]. & rdquo

Aunque los investigadores han visto el i-motif antes y lo han estudiado en detalle, solo se ha visto in vitro & ndash, es decir, en condiciones artificiales en el laboratorio y no dentro de las células.

De hecho, los científicos en el campo han debatido si i-motif & lsquoknots & rsquo existirían dentro de los seres vivos y ndash, una pregunta que se resuelve con los nuevos hallazgos.

Para detectar los i-motivos dentro de las células, los investigadores desarrollaron una nueva herramienta precisa y ndash un fragmento de una molécula de anticuerpo que podría reconocer específicamente y adherirse a i-motivos con una afinidad muy alta. Hasta ahora, la falta de un anticuerpo que sea específico para los motivos i ha obstaculizado gravemente la comprensión de su función.

Fundamentalmente, el fragmento de anticuerpo no detectó el ADN en forma helicoidal, ni reconoció las "estructuras lsquoG-quadruplex" (una disposición de ADN de cuatro hebras estructuralmente similar).

Con la nueva herramienta, los investigadores descubrieron la ubicación de & lsquoi-motifs & rsquo en una variedad de líneas celulares humanas. Usando técnicas de fluorescencia para identificar dónde se ubicaban los i-motivos, identificaron numerosas manchas verdes dentro del núcleo, que indican la posición de los i-motivos.

"Lo que más nos entusiasmó es que pudimos ver las manchas verdes y los i-motifs y ndash aparecer y desaparecer con el tiempo, por lo que sabemos que se están formando, disolviendo y formando de nuevo", dice el Dr. Mahdi Zeraati, cuya investigación respalda los hallazgos del estudio.

Los investigadores demostraron que los i-motifs se forman principalmente en un punto particular del ciclo celular y rsquos y lsquolife y rsquo y ndash en la fase G1 tardía, cuando el ADN está activo y rsquo. También demostraron que los i-motivos aparecen en algunas regiones promotoras (áreas de ADN que controlan si los genes se activan o desactivan) y en los telómeros, "secciones finales" de los cromosomas que son importantes en el proceso de envejecimiento.

El Dr. Zeraati dice: “Creemos que el ir y venir de los i-motifs es una pista de lo que hacen. Parece probable que estén ahí para ayudar a activar o desactivar genes, y para afectar si un gen se lee activamente o no. & Rdquo

"También creemos que la naturaleza transitoria de los i-motivos explica por qué ha sido tan difícil rastrearlos en las celdas hasta ahora", agrega A / Prof Christ.

El profesor Marcel Dinger dice: `` Es emocionante descubrir una forma completamente nueva de ADN en las células '', y estos hallazgos prepararán el escenario para un nuevo impulso para comprender para qué es realmente esta nueva forma de ADN y si tendrá un impacto en la salud. y enfermedad. & rdquo

Papel destacado: Mahdi Zeraati, David B. Langley, Peter Schofield, Aaron L. Moye, Romain Rouet, William E. Hughes, Tracey M. Bryan, Marcel E. Dinger y Daniel Christ. Las estructuras de ADN con motivo I se forman en los núcleos de las células humanas. Química de la naturaleza 2018 DOI: 10.1038 / s41557-018-0046-3

Apoyo: Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (Australia) y el Consejo Australiano de Investigación.


ANUDADO Y SUPECOILING DEL ADN

Equilibrio anudado

Una cuestión importante relacionada con la interacción del superenrollamiento del ADN y el anudado del ADN es cómo el equilibrio del anudado se ve afectado por el superenrollamiento del ADN. Para explicar el concepto de equilibrio anudado, consideremos primero una situación imaginaria, en la que moléculas de ADN circular altamente diluidas y relajadas por torsión de un tamaño dado sufren fluctuaciones térmicas durante las cuales las topoisomerasas de ADN tipo II ideales permiten pasajes intersegmentales cada vez que dos segmentos de ADN chocan entre sí. . Tal reacción alcanzará el equilibrio de anudado cuando las nuevas rondas de pasajes tengan tanta probabilidad de formar nuevos nudos de ADN como de deshacerlos, y a medida que la reacción avance más desde este punto, la fracción de moléculas que estén anudadas permanecerá bastante constante. Dado que los pasajes de ADN-ADN mediados por ADN topoisomerasas no son en realidad aleatorios, el equilibrio de anudado se logró generalmente en experimentos en los que las moléculas de ADN lineales estaban experimentando una reacción de ciclación lenta debido a la hibridación de sus extremos cohesivos largos. Tras dicho recocido, algunas moléculas se anudan y se cree que la fracción de moléculas anudadas es la misma que la obtenida en el equilibrio de anudado debido a los pasajes libres (35, 36). Varios estudios bioquímicos y numéricos confirmaron la idea intuitiva de que la fracción de nudos en el equilibrio de los nudos aumenta con el tamaño de la cadena de las moléculas de ADN y disminuye al aumentar la repulsión electrostática entre los segmentos de ADN, que a su vez depende de la concentración de contraiones (35-37). Consideremos ahora cómo cambia el equilibrio anudado cuando el ADN estudiado se mantiene activamente en forma superenrollada, como es el caso de las células bacterianas vivas. Consideramos una situación hipotética e idealizada en la que el Topo IV bacteriano realiza pasajes intersegmentales que pueden llevar a anudarse o desanudarse cada vez que dos segmentos de ADN chocan entre sí (en realidad, como se discute a continuación, los pasajes mediados por Topo IV son selectivos y dependen del espacio disposición de los segmentos de ADN). Además, consideramos que la ADN girasa y el Topo I compensan la posible disminución o aumento del estrés torsional del ADN debido a la formación de nudos al restablecer el nivel inicial de estrés torsional típico del superenrollamiento del ADN nativo. ¿El equilibrio de anudado en estado estacionario en tales condiciones dará como resultado una fracción mayor o menor de moléculas de ADN anudadas que en el equilibrio de anudado que involucra moléculas de ADN relajadas por torsión?

Estudios de en vivo formado nudos en Escherichia coli reveló que los plásmidos pBR322 cultivados en E. coli las cepas con ADN girasa defectuosa se anudaron hasta 10 veces más frecuentemente que los plásmidos cultivados en cepas de tipo salvaje (38). Dado que la ADN girasa es responsable de mantener el ADN en una forma superenrollada y no es la topoisomerasa desatadora per se, como lo es Topo IV (39), este resultado proporciona una fuerte indicación de que el superenrollamiento del ADN está ayudando a Topo IV a mantener el ADN sin anudar en las células bacterianas vivas. También se investigó el efecto del superenrollamiento en el desanudado. in vitro comparando el desanudado de moléculas de ADN superenrollado y no superenrollado por Topo IV (39), es decir, la enzima que se cree que es responsable del desanudado y decantación del ADN en E. coli. Los autores de ese estudio llegaron a la conclusión de que el superenrollamiento del ADN no aumenta apreciablemente la tasa de desanudado por Topo IV (39). Sin embargo, una mirada más cercana a los datos presentados revela claramente que, mientras que los nudos de ADN complejos parecían transformarse con la misma rapidez en nudos más simples por Topo IV independientemente de si estaban superenrollados o no, el desanudo de nudos menos complejos, como nudos de trébol, fue claramente estimulados por el superenrollamiento del ADN, mientras que los nudos de trébol se acumulaban cuando Topo IV actuaba sobre una mezcla de nudos de ADN complejos que no estaban superenrollados [ver Figura 7 en la ref. (39)]. Una explicación probable de este comportamiento es que la presencia de nudos simples en moléculas de ADN no superenrolladas no produce un gradiente de energía suficiente que podría conducir al desanudado y, por lo tanto, este gradiente debe mejorarse mediante el superenrollamiento del ADN. Sin embargo, para los nudos complejos, la ganancia de energía debida al paso de una hebra que conduce a la simplificación de los nudos es lo suficientemente grande como para dirigir estos pasos incluso en ausencia de superenrollamiento del ADN.

Componentes energéticos de la interacción entre el anudado y el superenrollamiento del ADN

Como se discutió anteriormente, en vivo y in vitro Los estudios apoyan la idea de que el superenrollamiento del ADN inhibe el anudado del ADN. Sin embargo, esta inhibición puede no estar relacionada con un cambio del gradiente de energía libre introducido por el superenrollamiento del ADN, sino más bien ser el resultado de la acción de Topo IV que consume ATP que no necesita seguir el gradiente de energía libre de las moléculas de ADN. Más precisamente, el superenrollamiento del ADN podría ayudar a Topo IV a elegir los pasajes que conducen al desanudado, incluso si estos no siguieran el gradiente de energía libre del sistema. Por lo tanto, los estudios discutidos anteriormente no nos dicen realmente si el superenrollamiento del ADN cambia el gradiente de energía de una manera que desfavorece el anudado del ADN. Sin embargo, los estudios de simulación, donde se puede controlar la energía y la topología de las moléculas de ADN modeladas, y donde también se puede imponer la condición de que los pasajes ocurran independientemente de una disposición espacial particular de segmentos en colisión, podrían darnos esta información.

Curiosamente, dos estudios de simulación diferentes que investigan el efecto del superenrollamiento del ADN en el anudado del ADN llegaron a conclusiones opuestas. Mientras Podtelezhnikov et al. (11) concluyó que el superenrollamiento del ADN estimulaba el anudamiento del ADN, Burnier et al. (40) concluyó lo contrario. Investiguemos las razones de esa discrepancia. Ambos estudios utilizaron un método de simulación Metropolis-Monte Carlo muy similar que tiene en cuenta las propiedades elásticas del ADN y el diámetro efectivo del ADN (4). Durante el procedimiento de simulación Metropolis-Monte Carlo, las moléculas modeladas cambian constantemente de forma y exploran el espacio de configuración disponible. Este último puede verse como el conjunto de todas las configuraciones posibles de la cadena elástica bajo la influencia de la agitación térmica y, por supuesto, en ese conjunto, aparecerán con mayor frecuencia configuraciones energéticamente favorables. Por lo tanto, si el anudado de moléculas superenrolladas fuera energéticamente favorable, se debería observar una fuerte tendencia de las moléculas de ADN superenrolladas a anudarse. El movimiento térmico por sí solo no puede pasar dos segmentos de ADN entre sí. Therefore, to account for the action of DNA topoisomerases, during the simulation one has to permit segment moves leading to strand passages, and thus possibly to knotting or unknotting. However, if intersegmental passages are permitted without any restriction regarding the topological state of the molecules, the simulated supercoiled DNA molecules quickly relax. This invalidates the simulations aiming to test the effect of maintaining the DNA in supercoiled form on the tendency of DNA molecules to become knotted or unknotted.

Several earlier simulation studies showed that, upon setting a fixed ΔLk (the difference between the actual Lk of the modelled molecules and their Lk0), and upon permitting intersegmental passages that did not result in formation of knots, the simulated supercoiled DNA molecules maintained their original supercoiling and even sampled in a more efficient way the configuration space as compared to simulations in which intersegmental passages were not allowed ( 4). For example, with this technique, simulated configurations of supercoiled DNA molecules looked like those observed by electron microscopy ( 41). Podtelezhnikov et al. ( 42), in their simulations investigating the interplay between DNA supercoiling and DNA knotting, permitted also these moves that resulted in passages from unknots to knots and vice versa while keeping the ΔLk fixed. With that setting, the simulated supercoiled DNA molecules were becoming progressively knotted, forming left-handed torus knots with increasing complexity. On this basis, the authors concluded that DNA molecules that keep the ΔLk typical for negatively supercoiled DNA molecules would have the tendency to undergo passages leading to formation of left-handed torus knots.

Indeed that would have been the case if Topo II-mediated passages were not changing the linking number of DNA molecules upon each intramolecular passage. We know however that topo II mediated passage from unknotted DNA molecules to left-handed trefoil knots necessitate the decrease of the linking number by 2. So for example, if one starts with a supercoiled molecule with ΔLk = −5 and would perform a necessary passage leading to formation of a left-handed trefoil knot, the ΔLk of that molecule would change to −7 ( Figure 3A). Consequently, a real passage would be energetically not favourable as opposed to an imaginary topo II-mediated passage with unrealistic property of maintaining the ΔLk constant ( Figure 3A). In addition, even if the realistic passage has happened, then afterwards DNA gyrase would act to re-establish the previous level of torsional stress, which would push the molecule to the state with the ΔLk oscillating ∼−8.41. ( Figure 3A) This is the consequence of the formula: Lk = Tw + Wr and the fact that the Wr of a torsionally relaxed left-handed trefoil knot is of ∼−3.41 ( 43). Therefore, the Lk0 in torsionally relaxed left-handed trefoil knots is smaller than in torsionally relaxed unknotted DNA molecules. To account for the change of Lk0 due to knotting, Burnier et al. ( 40) introduced the concept of the effective ΔLk (ΔLke), which is the linking number difference between the Lk0 of a torsionally relaxed knot of a given type including unknot and the actual Lk of the modelled DNA forming the same knot type. When modelled molecules are permitted to change the knot type but keep the same ΔLke, their torsional tension is roughly conserved. Simulations performed under such conditions revealed that supercoiling directs intersegmental passages toward unknotting since the lowest energy-state of DNA molecules with a given ΔLke is attained for unknotted DNA molecules, and this is independent of whether the formed knots are left- or right-handed ( 40). However, it needs to be stated here that simulations performed under conditions maintaining the same ΔLke before and after passages leading to knot formation are based on the unrealistic assumption that the torsional tension is re-established instantly after the passage, while in reality it will take some time until the homeostatic mechanisms controlling the level of torsional stress will re-establish the original level of torsional stress ( 27). The second assumption is that topoisomerase-mediated passages are driven by the free energy gradient, while in reality type II DNA topoisomerases couple the energy of ATP hydrolysis to the performed passage and can act against the free energy gradient ( 26). However, these assumptions are needed to evaluate the importance of energetic considerations in the study of the steady-state knotting equilibrium in the presence of homeostatic mechanisms that maintain a quasi-constant level of DNA torsional stress in supercoiled DNA.

DNA knots, supercoiling and the geometric chirality. (A) Comparison of the elastic energies of simulated negatively supercoiled DNA molecules with 3000 bp that were either unknotted or formed left-handed trefoil knots [the energy graph is reproduced from ref. ( 40)]. ΔLk refers to the difference between the actual linking number of knotted or unknotted DNA molecules and that of torsionally relaxed unknotted DNA molecules. The light blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules with the same ΔLke. The dark blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules resulting from one round of a Topo II-like action. The black arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules under the unrealistic assumption that topoisomerase II could mediate an intramolecular passage reaction without changing the linking number. Note that left-handed trefoil knots reach their minimal energy state for ΔLk ≈3.5 and that this closely corresponds to the average writhe of torsionally relaxed left-handed trefoil knots ( 43) (shown in the inset). For the convenience of the presentation the figure shows three different energetic consequences of formation of left-handed trefoil knot starting from unknotted DNA molecules that were kept at their supercoiling equilibrium at ΔLk ≈ −5. However, natural supercoiling of 3000 bp-long DNA would rather keep the unknotted molecules at ΔLk ≈−15. Therefore, at physiological level of negative supercoiling the passages leading to knot formation will be much stronger opposed by the free energy gradient than for the case analysed here. (B) The concept of geometrical chirality. To determine the geometrical chirality of a crossing one looks what is the smallest rotation of the overlying segment that brings it parallel with the underlying one. If that rotation is clockwise the crossing is left-handed and it is right-handed otherwise. (C) Knot 52L with indicated geometrical chirality of their crossings. An intersegmental passage at any of left-handed crossing will unknot the knot, while a passage at any of right-handed crossings will convert the 52L knot into 31L knot.

DNA knots, supercoiling and the geometric chirality. (A) Comparison of the elastic energies of simulated negatively supercoiled DNA molecules with 3000 bp that were either unknotted or formed left-handed trefoil knots [the energy graph is reproduced from ref. ( 40)]. ΔLk refers to the difference between the actual linking number of knotted or unknotted DNA molecules and that of torsionally relaxed unknotted DNA molecules. The light blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules with the same ΔLke. The dark blue arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules resulting from one round of a Topo II-like action. The black arrow indicates the energy difference between unknotted and knotted DNA molecules under the unrealistic assumption that topoisomerase II could mediate an intramolecular passage reaction without changing the linking number. Note that left-handed trefoil knots reach their minimal energy state for ΔLk ≈3.5 and that this closely corresponds to the average writhe of torsionally relaxed left-handed trefoil knots ( 43) (shown in the inset). For the convenience of the presentation the figure shows three different energetic consequences of formation of left-handed trefoil knot starting from unknotted DNA molecules that were kept at their supercoiling equilibrium at ΔLk ≈ −5. However, natural supercoiling of 3000 bp-long DNA would rather keep the unknotted molecules at ΔLk ≈−15. Therefore, at physiological level of negative supercoiling the passages leading to knot formation will be much stronger opposed by the free energy gradient than for the case analysed here. (B) The concept of geometrical chirality. To determine the geometrical chirality of a crossing one looks what is the smallest rotation of the overlying segment that brings it parallel with the underlying one. If that rotation is clockwise the crossing is left-handed and it is right-handed otherwise. (C) Knot 52L with indicated geometrical chirality of their crossings. An intersegmental passage at any of left-handed crossing will unknot the knot, while a passage at any of right-handed crossings will convert the 52L knot into 31L knot.

Geometric components of the interplay between DNA supercoiling and DNA knotting

The free energy gradient provided by DNA supercoiling helps to guide DNA topoisomerases towards efficient unknotting, but this is not sufficient to explain the complexity of the interplay between DNA supercoiling, knotting and catenation. If DNA topoisomerases were simply catalysing reactions along the free energy gradient, then supercoiled DNA molecules in living bacterial cells would be subject to topoisomerase-mediated reactions leading to their rapid torsional relaxation. So for example, bacterial type I DNA topoisomerases, which perform passages of one strand through the other, would relax the torsional stress in supercoiled DNA. However, as the negative torsional stress is required for normal functioning of bacterial DNA, a metabolic short circuit would appear in this case, with type I topoisomerases constantly relaxing negatively supercoiled DNA molecules and with many molecules of DNA gyrase using ATP to re-establish the original level of negative supercoiling. Such a metabolic short-circuit would exhaust the cellular pool of ATP, and is in reality avoided trough molecular mechanisms that evolved to ensure that bacterial type I topoisomerases are only activated by an excessive torsional stress of the DNA or by the appearance of atypical DNA structures ( 27). The excessive torsional stress can be directly sensed at the local DNA level by the facility of strand separation, for example, and this provides the molecular basis of the mechanism protecting normally supercoiled DNA from the action of type I topoisomerases ( 27).

However, it seems more difficult to imagine molecular mechanisms that make naturally supercoiled DNA very good substrate for Topo IV-mediated passages leading to decatenation and unknotting but not to relaxation of negative supercoils ( 39). Since DNA topoisomerases are relatively small compared to overall dimensions of plasmid or chromosomal DNA, they can only distinguish between some local features that are characteristic for unperturbed negatively supercoiled DNA and these that appear in DNA molecules that are knotted and catenated. If there are such structural differences, then type II DNA topoisomerases could have acquired during the evolution the capacity to act preferentially on the DNA–DNA juxtapositions arising due to knotting or catenation, but not on those arising due to negative supercoiling.

Single molecule studies investigating the action of bacterial topoisomerase IV on braided DNA molecules revealed that it acts preferentially on left-handed braids having a local segment juxtaposition geometry similar to that of positively supercoiled DNA, while it leaves right-handed braids, comparable to negative supercoils, practically untouched (see Figure 3 for the explanation of the geometrical chirality of DNA–DNA juxtapositions) ( 44– 46). These observations made a perfect sense as they explained why DNA molecules that are negatively supercoiled are practically immune to Topo IV relaxation, while positive supercoiling that arises during DNA replication can be efficiently relaxed by Topo IV, permitting further progression of the replication forks ( 47). Comparing DNA–DNA juxtapositions in positively- and negatively-supercoiled DNA, one notices that both types have a hooked character ( 48) but can be distinguished by the opposite geometric chirality of winding of juxtaposing segments ( 45, 46).

It is important to mention here the difference between topological and geometric chirality. To determine the topological chirality one needs to operate with the concept of oriented curves and be aware in which direction the imaginary orientation vectors are pointing when two segments of DNA contact each other. Clearly, enzymes cannot recognize imaginary vectors. However, enzymes can recognize geometrical chirality of crossings if their DNA binding sites are arranged in such a way that, when the first DNA molecule is bound, the second can be bound on top of it but only at a certain relative inclination angle with respect to the already bound DNA segment. Depending on that angle, the enzyme may preferentially interact with DNA segments that wind around each other in left- or right-handed way ( 49, 50). In negatively supercoiled DNA the topological sign of perceived intramolecular crossings is negative, however, the opposing DNA segments of negatively supercoiled DNA molecules wind around each other in a right-handed way. The left-handed direction of winding is then characteristic for the juxtapositions in positively supercoiled DNA molecules ( Figure 4) and those are preferentially recognized by Topo IV.

Topological transitions during replication of circular DNA. (A) Supercoiled DNA that just started its process of DNA replication. The molecule is still negatively supercoiled and shows right-handed interwinding. The negative supercoiling helps to initiate the process of DNA replication ( 7). (B) Partially replicated DNA molecule with positive torsional stress causing formation of left-handed interwinding in the unreplicated portion and of right-handed interwinding of precatenanes in the replicated portion. The left-handed interwinding can be easily relaxed by DNA gyrase or by topoisomerase IV. Right-handed interwinding is a poor substrate for the relaxation reaction by Topo IV. (C) Standard representation of freshly replicated molecules forming multiply interlinked DNA catenanes. All crossings in this representation have right-handed chirality but this representation is not the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. (D) Schematic presentation of the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. Minimization of the elastic energy of multiply interlinked catenanes leads to the formation of a left-handed folding of the entire catenanes ( 21, 78). This folding leads to the apparition of left-handed DNA–DNA juxtapositions that are very good substrates for Topo IV-mediated passages that lead to decrease of DNA catenation. (mi) Catenanes with decreasing number of interlinks. Individual rings get supercoiled by DNA gyrase, and left-handed crossings may form in the region deformed by the extrusion of supercoils. (F) Singly interlinked catenanes have a complete freedom to form left-handed juxtapositions. Supercoiling provides the necessary ‘pressure’ leading to unlinking. The representations of DNA molecules at different steps of DNA replication are not shown at the same scale but their size was chosen in order to make important points clear. However, all the drawings correspond to sequential stages of DNA replication of a molecule with 800 bp.

Topological transitions during replication of circular DNA. (A) Supercoiled DNA that just started its process of DNA replication. The molecule is still negatively supercoiled and shows right-handed interwinding. The negative supercoiling helps to initiate the process of DNA replication ( 7). (B) Partially replicated DNA molecule with positive torsional stress causing formation of left-handed interwinding in the unreplicated portion and of right-handed interwinding of precatenanes in the replicated portion. The left-handed interwinding can be easily relaxed by DNA gyrase or by topoisomerase IV. Right-handed interwinding is a poor substrate for the relaxation reaction by Topo IV. (C) Standard representation of freshly replicated molecules forming multiply interlinked DNA catenanes. All crossings in this representation have right-handed chirality but this representation is not the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. (D) Schematic presentation of the equilibrium form of multiply interlinked DNA catenanes. Minimization of the elastic energy of multiply interlinked catenanes leads to the formation of a left-handed folding of the entire catenanes ( 21, 78). This folding leads to the apparition of left-handed DNA–DNA juxtapositions that are very good substrates for Topo IV-mediated passages that lead to decrease of DNA catenation. (mi) Catenanes with decreasing number of interlinks. Individual rings get supercoiled by DNA gyrase, and left-handed crossings may form in the region deformed by the extrusion of supercoils. (F) Singly interlinked catenanes have a complete freedom to form left-handed juxtapositions. Supercoiling provides the necessary ‘pressure’ leading to unlinking. The representations of DNA molecules at different steps of DNA replication are not shown at the same scale but their size was chosen in order to make important points clear. However, all the drawings correspond to sequential stages of DNA replication of a molecule with 800 bp.

The geometry of positively supercoiled DNA favours not only left-handed crossings of the formed DNA–DNA juxtapositions but also hooking of contacting DNA segments. Interestingly, the preferential action of type II DNA topoisomerases on hooked juxtapositions was also proposed as the mechanism that explained the seminal experiment by Rybenkov et al. ( 30, 51). This experiment demonstrated that type II DNA topoisomerases acting in vivo on torsionally relaxed DNA keep the level of DNA knotting and catenation much below the topological equilibrium that would have arisen if the passages were simply driven by the free energy gradient ( 30). Type II DNA topoisomerases couple their DNA–DNA passage reaction to ATP hydrolysis and therefore there is no violation of thermodynamic principles connected to the fact that action of type II DNA topoisomerases on a statistical set of plasmid DNA molecules can push this set out of its lowest free-energy state. However, it was very intriguing how DNA topoisomerases, that can only sense local information, may get hints whether performing a DNA–DNA passage in a given place will rather unknot the DNA than lead to DNA knotting.

Several complex mechanisms were proposed over the years to explain how DNA topoisomerases could get these hints: the active sliding model ( 30), the kinetic proofreading ( 52) or the three-site interaction ( 53). While some of these models were incompatible with the known properties of type II topoisomerases (active sliding model), the other models seemed to be unnecessarily complex (kinetic proofreading, three site interaction). In 2002 Vologodskii et al. ( 51) proposed a model according to which type II DNA topoisomerases were actively bending the DNA in the so called G region (G stands for the gate as that DNA region will be later cut and will serve as a gate for the passage of transferred segment known as T segment). According to that model, the DNA topoisomerase was placing itself in the bend in such a way that the T segment could only be transferred if it approached the G region from the inside of the bend. As a consequence, the topoisomerase was providing directionality for the passage of the T segment from the inside to the outside of the strongly bent DNA loop with the G site in its centre. Simulations performed to test this model revealed that this relatively simple mechanism permits a 10-fold reduction of the knotting level below the topological equilibrium ( 51). However, biochemical experiments using Topo IV from E. coli showed ∼50-fold reduction of the knotting level below the topological equilibrium and therefore the mechanism proposed by Vologodskii et al. was not sufficient to explain the observed effect.

In 2004, a theoretical paper by Buck and Zechiedrich proposed that type II topoisomerases can keep a very low steady-state level of DNA knotting and of DNA catenation by preferentially acting on inter-hooked juxtapositions and performing passages there ( 48, 54). The idea behind that model was that, in freely fluctuating, torsionally relaxed DNA, the interhooked juxtapositions form preferentially in the region where DNA is knotted or catenated ( 48, 54). For entropic reasons the knotted domains in freely fluctuating knotted polymers tend to be rather tight ( 55, 56) and this favours that hooked juxtapositions form there. Indeed, simulation studies using polygons confined to a cubic lattice confirmed that preferential action on hooked juxtapositions can decrease the level of knotting by ∼50 times as compared to random passages ( 57). Also, simulations performed using polygonal chains off-lattice revealed that selection of interhooked juxtapositions can result in a reduction of the knotting level as strong as that observed experimentally ( 58).

The hooked juxtapositions proposed by Buck and Zechiedrich ( 48) and tested in simulations by Liu et al. ( 57, 59) were not assumed to wind in a right- or left-handed way but were modelled as achiral, interhooked juxtapositions where the planes of hooking were perpendicular to each other. Such achiral hooked juxtapositions were sufficient to explain the experiment by Rybenkov et al. ( 30) where the tested DNA was not supercoiled. However, even for unsupercoiled DNA there were other experiments requiring a chirality criteria to explain the observed results. Mann et al. ( 60) reported that human topoisomerase IIα has the very interesting ability to unknot left-handed five crossing twist knots (with the topological notation 52L) in just one passage. These results were puzzling since, even if DNA topoisomerases could specifically recognize hooked juxtapositions resulting from tight knotting of 52 knot, there are possibilities of forming five such juxtapositions and only passages occurring at two of them could lead to a direct conversion of the 52 knot into an unknot ( 61). The question arose then what structural difference could exist between DNA–DNA juxtapositions at these two different types of crossings in freely fluctuating DNA forming 52L knots?

Burnier et al. ( 58) used numerical simulations to test whether, by recognizing and performing passages within inter-hooked juxtapositions in which opposing segments wind around each other in a left-handed way ( Figure 3), the topoisomerases could unknot 52L knots by performing just one passage. The simulations showed that this criteria was indeed very efficient in favouring unknotting of the 52L knot by a single topo II-mediated passage ( 58). In addition, the preferential action on inter-hooked juxtapositions with left-handed character explains also the mechanism by which human topoisomerase IIα relaxes positively supercoiled DNA molecules at least 10 times faster than negatively supercoiled ones ( 62).

Additional support for the hooking model was provided recently by crystallographic analysis of Topo IV DNA complexes ( 63). In these complexes, the DNA to which the topoisomerase is bound (G segment) is strongly bent in the direction consistent with the models proposing that Topo IV induces DNA bends ( 51, 64) or that it preferably binds hooked juxtapositions ( 48, 54). The observation mentioned earlier that plasmids isolated from bacterial strains with defective gyrase are frequently knotted ( 38) is consistent with the interpretation that DNA supercoiling may help Topo IV to distinguish better DNA juxtapositions that are due to knotting from other DNA juxtapositions.

As mentioned earlier, bacterial topoisomerases evolved in such a way that negatively supercoiled DNA molecules are protected against their relaxing activity. In the case of Topo IV, this protection is ensured by the chirality sensing mechanism explained above ( 44– 46): right-handed juxtaposition present in negatively supercoiled DNA are practically immune to its action, whereas left-handed juxtapositions that are predominant in positively supercoiled DNA are very efficiently recognized by Topo IV and are substrate of processive passage reactions ( 44– 46, 65). Presumably, when knots are present in negatively supercoiled DNA molecules they promote formation of DNA–DNA juxtapositions with geometries that are somewhat different than the typical geometry of DNA–DNA juxtapositions in negatively supercoiled DNA. This is certainly the case of DNA molecules forming left-handed trefoil knots whose crossings have a natural tendency to form left-handed dsDNA–dsDNA juxtapositions. However, also DNA molecules forming right-handed trefoil knots, despite their preference to form right-handed dsDNA–dsDNA crossings, may in fact promote formation of juxtapositions that are more hooked or have somewhat different inclination angle than these normally present in negatively supercoiled DNA. In such a case also these knots may be efficiently unknotted by Topo IV action while regular DNA–DNA juxtapositions due to negative supercoiling would not serve as substrates of Topo IV.


Computer model unravels knotty problems in DNA

If you've ever tried to untangle a pair of earbuds, you'll understand how loops and cords can get twisted up. DNA can get tangled in the same way, and in some cases, has to be cut and reconnected to resolve the knots. Now a team of mathematicians, biologists and computer scientists has unraveled how E. coli bacteria can unlink tangled DNA by a local reconnection process. The math behind the research, recently published in Scientific Reports, could have implications far beyond biology.

E. coli bacteria can cause intestinal disease, but they are also laboratory workhorses. E. coli's genome is a single circle of double-stranded DNA. Before an E. coli cell divides, that circle is copied. Opening up the double helix to copy it throws twisting strains elsewhere down the molecule -- just as uncoiling a cord in one place will make it over-coil somewhere else. The process results in two twisted loops of DNA that pass through each other like a "magic rings" trick.

To separate the rings, E. coli uses an enzyme called topoisomerase IV, which precisely cuts a DNA segment, allows the loops to pass through the break and then reseals the break. Because topoisomerase IV is so important to bacteria, it's a tempting target for antibiotics such as ciprofloxacin. But when topoisomerase IV is absent, another enzyme complex can step in to carry out this unlinking, although less efficiently. This complex introduces two breaks and unlinks by reconnecting the four loose ends.

"There are other ways to unlink the rings, but how do they do it?" said Mariel Vazquez, professor of mathematics and of microbiology and molecular genetics at the University of California, Davis.

One pathway, Vazquez said, is that the reconnection enzymes remove one link at a time until they get to zero. That solution was favored by the biologists.

But mathematicians look at the problem slightly differently. They understand the DNA as a flexible curve in three-dimensional space. Certain points on the curve can be broken and reconnected. To a mathematician, there are many potential routes for reconnection processes to work -- including some where the number of links actually goes up before going back down.

"These are all the same to a mathematician, but not to a biologist," Vazquez said. To determine the most likely route and resolve the problem, they turned to computational modeling.

Vazquez and colleagues developed computer software with DNA represented as flexible chains to model the possible locations where reconnection enzymes could cut and reconnect the chains. Overall, they modeled millions of configurations representing 881 different topologies, or mathematical shapes, and identified hundreds of minimal pathways to get two DNA circles linked in up to nine places down to two separate circles.

The computer model confirmed the biologists' hunch: Undoing one link at a time is the preferred route to separate the circles of DNA.

The results could have implications far beyond DNA biology, Vazquez said. There are other examples in nature of objects that collide, break and reconnect -- like the dynamics of linked fluid vortices, or the patterns formed by smoke rings, for example. When solar flares are ejected from the sun, powerful magnetic field lines cross and reconnect.

"The math is not DNA specific, and the computation can be adapted," Vazquez said.


Abstract

Various site-specific recombination enzymes produce different types of knots or catenanes while acting on circular DNA in vitro y in vivo. By analysing the types of knots or links produced, it is possible to reconstruct the order of events during the reaction and to deduce the molecular “architecture” of the complexes that different enzymes form with DNA. Until recently it was necessary to use laborious electron microscopy methods to identify the types of knots or catenanes that migrate in different bands on the agarose gels used to analyse the products of the reaction. We reported recently that electrophoretic migration of different knots and catenanes formed on the same size DNA molecules is simply related to the average crossing number of the ideal representations of the corresponding knots and catenanes. Here we explain this relation by demonstrating that the expected sedimentation coefficient of randomly fluctuating knotted or catenated DNA molecules in solution shows approximately linear correlation with the average crossing number of ideal configurations of the corresponding knots or catenanes.


Ver el vídeo: Los nudos, la mecánica cuántica y el ADN - Dra. María Trigueros (Enero 2022).