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¿Existen desventajas para los anticuerpos PRIMARIOS conjugados con HRP?


Necesito detectar una proteína etiquetada con FLAG en una transferencia de Western y tengo que pedir un anticuerpo. No espero ver una gran cantidad de mi proteína. Para mantener el tiempo de análisis al mínimo, estoy considerando un anti-FLAG conjugado con HRP. ¿Tiene alguna desventaja (por ejemplo, sensibilidad)? ¿Experiencias / problemas de primera mano?


Puede comparar los anticuerpos acoplados directamente con los sistemas primarios-secundarios indirectos clásicos:

Anticuerpos acoplados directamente

Ventajas:

  • Flujo de trabajo más rápido ya que solo se usa un anticuerpo
  • elimina la posibilidad de una reacción cruzada de un anticuerpo secundario (posiblemente menos antecedentes)
  • posibilidad de utilizar anticuerpos marcados de forma diferente en la misma transferencia

Desventajas:

  • menor sensibilidad porque la señal no se amplifica
  • solo unas pocas etiquetas están disponibles
  • Los anticuerpos primarios marcados directamente tienden a ser costosos y se necesitan cantidades relativamente altas de ellos.
  • el etiquetado puede dañar o reducir la inmunorreactividad del anticuerpo

Sistemas de anticuerpos primarios-secundarios indirectos

Ventajas:

  • el anticuerpo secundario amplifica la señal (que es especialmente interesante para proteínas expresadas débilmente)
  • Se pueden utilizar anticuerpos secundarios marcados de forma diferente en el mismo
  • Los anticuerpos primarios de diferentes especies se pueden usar simultáneamente.
  • se puede usar un anticuerpo secundario con diferentes anticuerpos primarios (por ejemplo, para la proteína de interés y el control de carga)
  • la reacción de marcado no afecta al anticuerpo primario

Desventajas:

  • La reactividad cruzada del anticuerpo secundario puede conducir a bandas no específicas.
  • el método lleva más tiempo, ya que se necesitan más pasos en el proceso

Para mí, el punto más importante es la mayor sensibilidad del método indirecto, para comparar, vea estas imágenes (de Life Technologies):


Tinción DAB

Contenido

Para obtener resultados fáciles con la tinción DAB, utilice un kit de sustrato DAB simple o un kit de tinción DAB completo, como los kits de estreptavidina-biotina HRP / DAB y los kits de método de polímero HRP / DAB. Alternativamente, puede ensamblar los reactivos para la tinción DAB usted mismo, utilizando anticuerpos secundarios conjugados con biotina, anticuerpos secundarios conjugados con HRP-polímero y conjugados con estreptavidina-HRP.

Principios y aplicación de la tinción DAB

DAB (3,3′-diaminobencidina) es un derivado del benceno. Se utiliza con mayor frecuencia en la tinción inmunohistoquímica (IHC) como cromógeno. También se utiliza en en el lugar hibridación (ISH) y, a veces, en dot blot y en western blot.

En la tinción con DAB, el peróxido de hidrógeno oxida el DAB en una reacción típicamente catalizada por la peroxidasa de rábano picante (HRP). El DAB oxidado forma un precipitado marrón, en la ubicación del HRP, que puede visualizarse mediante microscopía óptica.

El precipitado DAB es insoluble en agua, alcohol y otros disolventes orgánicos más comúnmente utilizados en el laboratorio (como xileno e isopropanol). Esto permite una gran flexibilidad en el tratamiento posterior de la sección de tejido, como en la elección de la contratinción y el medio de montaje. La tinción DAB también es resistente al calor, por lo que se puede utilizar en experimentos de IHC / ISH de doble marcaje y es extremadamente estable; de ​​hecho, los portaobjetos teñidos suelen ser estables durante muchos años.

Cuando se usa junto con una solución de níquel o cobalto como potenciador de DAB, la tinción DAB se vuelve un color negro más intenso.

Vinculación de HRP y anticuerpos primarios para la tinción DAB

En IHC, hay tres métodos principales para unir HRP al anticuerpo primario utilizado para la tinción. Estos tienen las siguientes ventajas y desventajas:

- Anticuerpos primarios directamente conjugados con HRP
Menos amplificación y, por tanto, menos sensible que los siguientes métodos. Protocolo muy sencillo. Requisito para la conjugación de HRP del anticuerpo primario.

- Anticuerpos secundarios biotinilados, combinados con estreptavidina-HRP en el método ABC (Avidin Biotin Complex)
Requisito de bloqueo de la biotina endógena para evitar la tinción de fondo. El método más utilizado en los laboratorios de investigación.

- Anticuerpos secundarios de polímero HRP
Protocolo más corto que el método ABC. Muy sensible con fondo bajo. Abcam utiliza este método para la validación de anticuerpos en IHC.

Jovicic N et al utilizaron el kit de método ab64259 HRP / DAB estreptavidina-biotina ABC para teñir CD68 en secciones de hígado de ratón incluidas en parafina. La tinción con DAB marrón muestra la presencia de CD68.

Alternativas a la tinción DAB

En comparación con los métodos fluorescentes utilizados para IHC, la detección cromogénica, como la tinción DAB, suele ser más sensible debido a la amplificación enzimática utilizada con la tinción DAB y métodos similares. Sin embargo, no es posible resolver estructuras subcelulares usando tinción DAB en el mismo grado que con microscopía fluorescente.

Aunque DAB es abrumadoramente el cromógeno más popular, existen alternativas. Consulte nuestra guía de cromógenos y potenciadores para obtener detalles completos sobre los diferentes cromógenos y sus ventajas y desventajas.

Errores que se deben evitar con la tinción DAB

Una desventaja del DAB es que reacciona lentamente con el peróxido de hidrógeno, incluso sin la presencia de una enzima peroxidasa. Esto significa que una vez que el DAB se combina con peróxido de hidrógeno, debe usarse con relativa rapidez para evitar generar un precipitado marrón en la solución, que contribuirá a la tinción de fondo. Por lo general, los kits para la tinción DAB se suministran con sustrato DAB concentrado y un tampón separado que contiene peróxido de hidrógeno, para combinarse poco antes de su uso.

Tenga en cuenta que el DAB es tóxico: se sospecha que es un teratógeno y carcinógeno, por lo que debe manipularse de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio.

Protocolos de tinción DAB

Para conocer los protocolos completos de inmunotinción con DAB, consulte nuestra colección de protocolos IHC validados basados ​​en nuestra propia experiencia con la validación de anticuerpos.

Muchas tinciones DAB utilizan soluciones DAB preparadas previamente, como en el kit de sustrato DAB ab64238. También es posible preparar DAB usando tabletas DAB. Por lo general, se utilizan tabletas en lugar de polvo de DAB para minimizar los riesgos para la salud y la seguridad al preparar la solución de DAB.

Ya sea que use tabletas o soluciones preparadas previamente, lea las instrucciones del fabricante para la preparación, ya que pueden variar, por ejemplo, si el peróxido de hidrógeno ya está incluido o debe agregarse.

Una vez que la solución de DAB se prepara con peróxido de hidrógeno incluido, y después de que las secciones se hayan teñido con HRP, las secciones simplemente deben incubarse con la solución de DAB durante unos minutos, seguido de enjuague en un tampón, como PBS, o en agua. La tinción DAB suele ir seguida de contratinción, deshidratación en una serie de etanol y montaje.

Para evitar una tinción excesiva con DAB, es mejor controlar el proceso de tinción con un microscopio y retirar el DAB cuando se observe una tinción marrón claro.


Formatos ELISA

El primer paso en un experimento ELISA es la inmovilización del antígeno en una muestra en la pared de los pocillos de una placa de microtitulación. Esto se puede lograr mediante la adsorción directa a la superficie de la placa y rsquos o mediante el uso de un & ldquocapture anticuerpo & rdquo. El anticuerpo de captura tiene que ser específico del antígeno diana y se utiliza principalmente en un tipo de ELISA específico llamado & ldquosandwich ELISA & rdquo. Después de la inmovilización, se agrega un anticuerpo de detección, que se une al antígeno adsorbido, lo que conduce a la formación de un complejo antígeno-anticuerpo. El anticuerpo de detección se conjuga directamente con una enzima, como la peroxidasa de rábano picante (HRP), o proporciona un sitio de unión para un anticuerpo secundario marcado. En general, los ELISA se pueden agrupar en cuatro categorías principales:


¿Hay alguna desventaja de los anticuerpos PRIMARIOS conjugados con HRP? - Biología

Se han utilizado varias enzimas como sondas de detección en inmunoquímica debido a su alta sensibilidad, simplicidad y amplias aplicaciones de uso. Las dos sondas enzimáticas más comunes que se utilizan en los inmunoensayos y la quimioluminiscencia son la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina (AP). Estas dos enzimas se han utilizado para detectar compuestos biológicos mediante quimioluminiscencia, salidas cromogénicas o fluorescentes.

Introducción a las sondas enzimáticas

Las enzimas se han utilizado como sondas de detección durante muchas décadas. Para muchos usos, se han usado una variedad de enzimas para detectar proteínas, antígenos u otros agentes biológicos extraños después de ser conjugados con otra proteína, generalmente un anticuerpo que se une a la diana, que generalmente es un antígeno. En general, un anticuerpo se une a un complejo avidina-biotina. A esto le sigue la adición de la enzima específica. El complejo se expone a la proteína o antígeno extraño y aparece un producto de reacción visible o puede haber emisión de luz o fluorescencia. Esta señal se puede detectar mediante un método de exploración o espectrofotometría.

¿Cuáles son los beneficios de utilizar sondas enzimáticas?

El uso de sondas enzimáticas como HRP y AP tiene varias ventajas para detectar una proteína objetivo, entre las que se incluyen las siguientes:

Larga vida útil: la enzima peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina son relativamente estables cuando se almacenan adecuadamente. Debido a que estas enzimas son insensibles a la luz, no se ven afectadas por la luz generada durante la quimioluminiscencia.

Buena sensibilidad: cuando se produce la reacción química, la salida de señal resultante puede detectarse con relativa facilidad, lo que permite la identificación de niveles incluso muy bajos de proteína o antígeno diana. Además, también hay otros métodos disponibles para amplificar las señales para que la prueba sea más sensible. Finalmente, debido a la alta renovación de las enzimas, esto también da como resultado una mayor unión de la enzima a la proteína y la emisión de señal puede eliminarse durante mucho tiempo.

Sistema versátil. Hoy en día existen muchos sustratos que tienen propiedades de quimioluminiscencia, cromogénesis o fluorescencia, lo que hace que el sistema enzimático sea muy versátil y fácil de usar.

Sondas disponibles. La otra característica de la fosfatasa alcalina y la HRP es que ambas sondas están fácilmente disponibles y no tienen un costo prohibitivo.

Quimioluminiscencia mejorada (ECL)

Se sabe que el HRP cataliza la oxidación de luminol a 3-aminoftalato a través de varios intermedios. Durante esta reacción, se genera una luz de baja intensidad a 428 nm. Sin embargo, cuando se agregan ciertos productos químicos, la emisión de luz se puede aumentar 1000 veces, lo que hace que la luz sea mucho más fácil de detectar mediante espectrofotómetros. Además, los productos químicos también pueden aumentar la sensibilidad de la reacción. Esta mayor generación de luz se conoce como quimioluminiscencia mejorada. Hoy en día existen varios tipos de potenciadores que se pueden utilizar en la reacción de HRP. La mayoría de estos potenciadores son fenoles modificados (principalmente yodofenol). La quimioluminiscencia mejorada se utiliza ahora en muchos laboratorios para detectar picogramos de ácidos nucleicos en transferencias norte y sur. amplia gama de longitudes de onda. Por otro lado, cuando se utilizan sustratos cromogénicos, los precipitados coloreados tienen una emisión de luz limitada solo en el rango visible.

¿Cuáles son algunos aspectos negativos del uso de AP y HRP?

1. Necesidad de un sustrato. Cuando se usa AP y HRP, se requiere un sustrato para detectar la proteína o antígeno extraño y el sustrato usado puede inducir una reacción que puede ser sensible a la luz.

2. Interferencia de tamaño: en general, la fosfatasa alcalina y la HRP son enzimas grandes y, por lo tanto, el tamaño puede interferir con la función bioquímica de la proteína a la que están unidas.

3. Señales de fondo: debido a que las enzimas utilizadas para detectar proteínas diana también se encuentran en las células del cuerpo, esto también puede resultar en una señal de fondo no específica, a menos que se tomen precauciones para inhibir las enzimas endógenas.

Indicadores de sondas enzimáticas comunes y sustratos cromogénicos

Tanto AP como HRP se utilizan como indicadores de ensayo porque al reaccionar con el sustrato producen señales quimioluminiscentes o fluorescentes coloreadas que pueden medirse y cuantificarse.

El sustrato puede ser sólido (precipitando) o soluble.

Las sondas enzimáticas tienen muchas aplicaciones de laboratorio principalmente porque son versátiles y pueden conjugarse con una variedad de sustratos. Tanto la AP como la HRP pueden usarse para detectar proteínas o antígenos mediante una prueba de detección de anticuerpos directa o indirecta, donde la enzima se conjuga con el anticuerpo primario que luego se une al antígeno diana o un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario. Tanto AP como HRP se pueden conjugar con avidina o biotina para su uso en sistemas de amplificación de señal de avidina biotina.

Peroxidasa de rábano picante

La enzima peroxidasa de rábano picante (HRP) se encuentra comúnmente en las raíces de la planta de rábano picante. Esta metaloenzima con varias isoformas se usa ampliamente en una variedad de aplicaciones bioquímicas. Esencialmente, las enzimas catalizan la oxidación del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso.

Sustratos para HRP

Cuando se utiliza HRP en reacciones bioquímicas, su presencia suele hacerse visible mediante un sustrato que cuando se oxida por HRP utilizando el agente oxidante peróxido de hidrógeno, produce un cambio de color clásico que se detecta mediante métodos espectrofotométricos.

Se han desarrollado varios sustratos para HRP y se dividen en dos grupos básicos:

HRP cataliza la conversión del sustrato cromogénico TMB, DAB, ABTS en subproductos coloreados

Produce luz cuando actúa sobre luminol o sustrato quimioluminiscente.

Etiqueta de enzima

Ácido 2,2'-azinobis [3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico] (ABTS)

diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD)

HRP como reportero enzimático para sondas

La peroxidasa de rábano picante (HRP) tiene la capacidad de catalizar la transferencia de dos electrones de un sustrato al peróxido de hidrógeno para generar agua y un sustrato oxidado. La HRP se usa con frecuencia en conjugados para detectar la presencia de una proteína diana. Por ejemplo, cuando la HRP se conjuga con un anticuerpo, se puede usar para detectar trazas de una proteína específica en una transferencia de Western. El anticuerpo proporciona la especificidad para localizar el antígeno de interés y la HRP, en presencia de un sustrato, genera una señal detectable. El HRP se utiliza en inmunohistoquímica y ELISA porque genera compuestos coloreados. Para la detección de una molécula de antígeno o proteína, se han diseñado sustratos de HRP para que generen una señal quimioluminiscente, cromogénica o fluorescente tras la oxidación.

Ventajas de usar HRP

Talla pequeña: El peso molecular de HRP es 40.000, que es relativamente pequeño en comparación con muchos otros conjugados de enzimas. El tamaño pequeño también es una ventaja, ya que permite una penetración más eficaz en las células de muestra y disminuye la probabilidad de interferencia con la función de la proteína conjugada. Además, la HRP tiene cuatro moléculas de lisina, cada una de las cuales puede conjugarse, lo que mejora aún más la eficacia de la reticulación con el antígeno o la proteína que se está analizando.

Alta rotación: La otra característica clave del HRP es que tiene una alta tasa de renovación y esto da como resultado una reacción eficiente, produciendo una gran cantidad de productos reactivos en un corto período de tiempo a pH normal. Los estudios muestran que la HRP unida a IgG es mucho más eficaz que la fosfatasa alcalina debido a la formación constante de conjugado debido a su mayor actividad enzimática específica (es decir, hay más HRP / mol de anticuerpo).

Obstáculo menos estérico: Otros conjugados de HRP tienen una reactividad inmunológica mejorada debido a su pequeño tamaño, lo que da como resultado un impedimento estérico menor y señales más efectivas.

Estable: La característica más importante de los conjugados de HRP es que son estables a pH neutro durante mucho tiempo.

Costo: En general, HRP es menos costoso que AP.

Inconvenientes de HRP como enzima en quimioluminiscencia

1. El primer inconveniente menor del uso de HRP es que puede resultar en una tinción no específica que puede ocurrir por la actividad de peroxidasa endógena que se encuentra en ciertos tejidos o células. Cuando se fabrican secciones finas congeladas de tejidos, a menudo revelan una cantidad de leve a moderada de actividad de peroxidasa endógena. Sin embargo, para solucionar este problema, existen inhibidores comerciales de peroxidasa disponibles que pueden disminuir o eliminar por completo la actividad de peroxidasa endógena en los tejidos.

Otro aspecto negativo menor del HRP está relacionado con su sensibilidad a la rotura. Algunos microorganismos, así como algunos antibióticos, pueden potenciar la degradación del HRP. Un potente inhibidor de la HRP es la azida sódica, pero para solucionar este problema, se puede utilizar timerosal al 0,01%. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la actividad de HRP también puede ser inhibida por sulfuros, cianuros y azidas.

3. Un último aspecto negativo del HRP es que hay informes de que algunos de los productos de reacción de los sustratos del HRP pueden tener el potencial de ser mutagénicos o cancerígenos. Hasta el momento solo hay unos pocos informes en animales pequeños. Sin embargo, si esto es una preocupación, se deben utilizar otros sustratos como AP.

Uso de fosfatasa alcalina en quimioluminiscencia

La fosfatasa alcalina (AP) contiene cinco residuos de cisteína, un átomo de magnesio y dos átomos de zinc que son necesarios para su función enzimática. La enzima es óptimamente activa a un pH alcalino. La fosfatasa alcalina esencialmente juega un papel en la desfosforilación de compuestos, la enzima se encuentra ampliamente en el cuerpo e incluso en las bacterias. La fosfatasa alcalina es termoestable y se encuentra en varias isoformas del cuerpo. Debido a su alta concentración en el hígado y los huesos, a menudo se usa como biomarcador para determinar la presencia de daño hepático o incluso trastornos óseos como la osteomalacia.

Las fosfatasas alcalinas son una familia de enzimas que pueden hidrolizar fosfatos de proteínas y nucleótidos. Esta clase familiar funciona mejor a pH alcalino (alrededor de 9) y se activa mediante cationes divalentes como el calcio y se inhibe con cianuro, cisteína, fosfato inorgánico, arseniato y agentes quelantes divalentes como EDTA.

En los seres humanos, las dos formas predominantes de fosfatasa alcalina incluyen una que se distribuye en los órganos y la otra se encuentra solo en el tracto gastrointestinal. Los dos subtipos de fosfatasas alcalinas están influenciados de manera diferente por los inhibidores de calor y químicos. Está establecido que el levamisol en el sustrato amortiguador suprimirá la actividad de la AP de tejido endógeno. Por otro lado, la PA intestinal es inhibida por ácido acético al 20%, seguido por borohidruro de potasio. Por lo tanto, cuando se usa AP, es importante conocer la fuente de la enzima.

En la mayoría de los laboratorios, los conjugados de fosfatasa alcalina intestinal de terneros son ideales en aplicaciones donde los altos niveles de peroxidasa endógena contraindican el uso de conjugados de HRP, como en las secciones de criostato donde los inhibidores de peroxidasa son ineficaces.

Etiqueta de enzima

Combinación de cloruro de tetrazolio azul nitro

(NBT) y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP)

Fosfato de p-nitrofenilo (PNPP)

Ventajas de Calf Intestinal AP

A diferencia de la HRP, el peso molecular de la AP intestinal del ternero es aproximadamente 3,5 veces mayor, o 140.000. Algunas de las ventajas de usar calf AP incluyen las siguientes:

Las velocidades de reacción son lineales y se miden fácilmente.

La sensibilidad de la reacción se puede mejorar permitiendo que la reacción ocurra durante un largo período de tiempo.

A diferencia de la HRP, la actividad de la PA intestinal de los terneros no se ve alterada por la exposición a antibióticos y otros agentes como el timerosal o la azida sódica. Esto significa que la enzima se puede almacenar durante un período de tiempo definido, incluso en un entorno no estéril.

Finalmente, dado que la actividad AP no intestinal puede ser suprimida por levamisol, los anticuerpos marcados con esta enzima pueden usarse como marcadores biológicos en varios tipos de células diferentes.

Usos de la fosfatasa alcalina en el laboratorio

La fosfatasa alcalina tiene muchas aplicaciones en el laboratorio de biología molecular.

Eliminación de grupos fosfato. Debido a que el ADN normalmente contiene grupos fosfato en el extremo 5-terminal, la eliminación de estos fosfatos terminales evita que el ADN forme una espiral. Por tanto, esto mantiene lineal la molécula de ADN durante la fase de preparación. La eliminación adicional de los grupos fosfato por la fosfatasa alcalina también permite el radiomarcaje y esto permite medir la presencia de ADN marcado en experimentos.

Inmunoensayos enzimáticos: la fosfatasa alcalina ahora se usa ampliamente como etiqueta para los inmunoensayos enzimáticos.

La tinción inmunohistoquímica es una técnica invaluable para detectar antígenos específicos en células y tejidos. Para realizar la tinción inmunohistoquímica, primero se debe desparafinar la sección de tejido y luego rehidratarla antes de empaparla con el anticuerpo primario. A continuación, se aplican anticuerpos secundarios conjugados con enzimas a la sección y se puede visualizar la tinción específica una vez que se añade el sustrato específico de la enzima. A veces, puede observarse poca o ninguna tinción y, en tales casos, es posible que sea necesario desenmascarar el antígeno mediante digestión enzimática.

Dado que muchas células diferenciadas contienen altas concentraciones de fosfatasa alcalina en la superficie celular, la tinción con fosfatasa alcalina se puede utilizar para detectar la presencia o la recurrencia de ciertos cánceres.

La fosfatasa alcalina también se encuentra en los huesos y el hígado y la medición de su concentración en la sangre puede revelar un proceso patológico.

En general, tanto los conjugados de fosfatasa alcalina como de HRP se pueden usar para obtener resultados quimioluminiscentes en pruebas de inmunotransferencia occidental u otras, inmunoquímica o ELISA. La HRP es una enzima que contiene hemo que cataliza la oxidación del luminol, lo que da como resultado una emisión de luz de baja intensidad a 428. Esta emisión de luz se puede aumentar 100 veces mediante la adición de ciertos productos químicos. La fosfatasa alcalina desfosforila proteínas, nucleótidos y alcaloides en un ambiente alcalino. La fosfatasa alcalina generalmente se deriva del intestino de ternera y se usa en inmunoensayos para obtener una detección cromogénica. Cuando se agrega el sustrato AP, el conjugado da como resultado un cambio de color que puede ser visible a 405 y cuantificarse fácilmente.


Manual técnico de avidina-biotina

Nuestro manual técnico de 48 páginas sobre avidina y biotina reúne todo lo necesario para biotinilar, purificar o detectar proteínas. Los productos destacados incluyen kits de biotinilación y purificación de proteínas de la superficie celular, etiquetado de anticuerpos y nuevos reactivos de biotinilación fotorreactivos. Este manual incluye docenas de referencias junto con protocolos, consejos para la resolución de problemas, guías de selección y una lista completa de herramientas disponibles.

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Desventajas de usar el sistema Avidin-biotin

Aunque el sistema Avidin-biotin es fácil de configurar y usar, tiene ciertas limitaciones. Debido a que cualquier molécula biotinilada se unirá a cualquier proteína de unión a biotina, estos reactivos deben usarse en combinación con otros sistemas de sonda de detección (es decir, anticuerpos primarios-secundarios) para experimentos múltiples.

Además, debido a que la biotina es una molécula biológica, la biotina endógena puede causar problemas de fondo y especificidad al realizar ensayos con ciertos tejidos y extractos ricos en biotina (es decir, cerebro, hígado, leche, huevos, maíz). Esto también se aplica a muestras que contienen proteínas de unión a biotina endógenas, como huevos (fuente de avidina) o bacterias como Streptomyces avidinii (fuente de estreptavidina).

Estructura química de HNS-Desthiobiotin. Tenga en cuenta la estructura de anillo modificada a la derecha (la biotina nativa tiene una estructura de anillo doble que encaja en el sitio de unión de Avidin, Streptavidin o NeutrAvidin).

Para aplicaciones de purificación, la fuerza de la interacción de unión entre biotina y avidina es un factor que limita su utilidad. Esto se debe a que se requieren condiciones severas para romper los enlaces avidina-biotina (es decir, para disociar y eluir), y estos pueden desnaturalizar las proteínas diana. Para superar esta limitación, están disponibles comercialmente versiones modificadas de resinas de Avidina y formas modificadas de reactivos de marcaje de biotina que hacen que la interacción sea fácilmente reversible. Estos incluyen avidina monomérica, reactivos de biotina de disulfuro escindible y derivados de iminobiotina y destiobiotina (consulte la discusión de Aislamiento y enriquecimiento de proteínas a continuación).

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Detección cromogénica frente a detección fluorescente

  • Multiplexación más sencilla: Más colores y espectros de emisión más estrechos que los tintes cromogénicos.
  • Mejor coubicación de objetivos: Los tintes fluorescentes permiten la identificación separada de objetivos co-localizados.
  • Mayor rango dinámico: Es más fácil visualizar objetivos raros y muy abundantes en la misma diapositiva.
  • Menos pasos: Sin paso para la adición de sustrato.
  • Menor sensibilidad: Los anticuerpos conjugados con enzimas se pueden amplificar mediante detección indirecta para aumentar la sensibilidad (ver más abajo)
  • Susceptible al fotoblanqueo: La exposición a la luz puede disminuir la señal fluorescente con el tiempo.
  • Mayor sensibilidad: La amplificación de la señal a través de la detección cromogénica indirecta (ver más abajo) aumenta la fuerza de la señal.
  • Señal de mayor duración: Los tintes cromogénicos son más resistentes al fotoblanqueo que los fluorocromos.
  • Co-localización de objetivos difíciles: Es difícil distinguir un color mezclado de un color único cuando los objetivos se localizan conjuntamente.
  • Rango dinámico más estrecho: Es difícil visualizar objetivos raros y muy abundantes en la misma diapositiva.
  • Multiplexación difícil: Menos colores y espectros de emisión más amplios que los tintes fluorescentes.

Detección fluorescente

¿Cómo funciona la detección fluorescente? La detección fluorescente requiere un anticuerpo conjugado con fluorocromo para emitir luz cuando se estimula con una luz de longitud de onda más corta.

¿Puedo usar un anticuerpo primario conjugado en mi experimento IF? En el método indirecto de detección, múltiples anticuerpos secundarios pueden unirse a un único anticuerpo primario. Debido a su capacidad para amplificar la señal, la detección indirecta es a menudo el método de elección para los experimentos de IHC / IF. La tinción del antígeno tisular con un anticuerpo conjugado primario solo se recomienda para antígenos tisulares muy abundantes donde no es necesaria la amplificación de la señal.

¿Puedo ejecutar IHC multiplex con detección fluorescente? La gran cantidad de fluorocromos disponibles permite la detección simultánea de múltiples objetivos debido a su capacidad para emitir luz en longitudes de onda únicas. Los fluorocromos deben elegirse cuidadosamente en experimentos múltiples para minimizar la superposición espectral. Además, deben diseñarse experimentos fluorescentes múltiples para limitar la reactividad cruzada. Al elegir anticuerpos primarios de diferentes especies de huéspedes, las dificultades relativas a la reactividad cruzada pueden ignorarse en gran medida. En este caso, los anticuerpos secundarios específicos de especie reconocerán solo un anticuerpo primario.

Ejemplo de detección de IHC por inmunofluorescencia (IF):

CD31 / PECAM-1 en embrión de ratón. Tinción de CD31 utilizando Anticuerpo policlonal purificado por afinidad de antígeno de cabra anti-ratón CD31 / PECAM 1 (nº de catálogo AF3628).

GFAP en neuronas de rata. Tinción de GFAP (verde) y Neurofilament Heavy (rojo) usando Anticuerpo policlonal de conejo anti-rata GFAP (catálogo n. ° NB300-141) y anticuerpo policlonal de pollo anti-rata NF-H (catálogo n. ° NB300-217).

Detección cromogénica

¿Cómo funciona la detección cromogénica? La expresión del antígeno se visualiza en la detección cromogénica cuando una enzima convierte un sustrato soluble en un producto coloreado insoluble que se deposita en el sitio de expresión del antígeno. Las enzimas peroxidasa de rábano picante (HRP) y fosfatasa alcalina se utilizan a menudo en la detección cromogénica y funcionan convirtiendo la 3,3 'diaminobencidina (DAB) y el 3-amino-9-etilcarbazol (AEC), en productos finales marrones y rojos, respectivamente.

¿Debería usar DAB, AEC o un cromógeno diferente? DAB es más popular que AEC debido a su longevidad y resistencia a la decoloración cuando se expone a la luz. Si se realiza una multiplexación, se recomienda elegir cromógenos con colores opuestos para limitar la superposición espectral.

¿Puedo ejecutar IHC multiplex mediante detección cromogénica? Aunque la visualización de múltiples antígenos es posible mediante detección cromogénica, la deposición de dos colores en proteínas co-localizadas puede oscurecer los resultados. Por lo tanto, se recomienda multiplexar solo cuando los antígenos están confinados a ubicaciones celulares únicas. Esto permitirá una diferenciación más fácil de cada objetivo.

Survivina en el cáncer de recto humano. Tinción de Survivina utilizando Anticuerpo Policlonal purificado por afinidad de antígeno de Survivina antihumano de conejo (Catálogo # NB500-201).

Stella / Dppa3 en tejido ovárico de ratón. La tinción distintiva distingue los ovocitos de ratón en desarrollo del tejido ovárico utilizando anticuerpo policlonal Stella / Dppa3 anti-ratón de cabra (nº de catálogo AF2566).


  • Inactivación de HRP.
  • Inestabilidad del enlace que une HRP al anticuerpo.
  • Ataque microbiano.
  • Desnaturalización del anticuerpo.
  • La pérdida de rendimiento se acelera al aumentar la temperatura y al aumentar la dilución de los conjugados.

El estabilizador / diluyente conjugado es un sistema de reactivos multicomponente patentado que protege los conjugados anticuerpo-HRP de todos los factores negativos mencionados anteriormente, asegurando así el mejor rendimiento posible en experimentos realizados a temperatura ambiente. Además, la capacidad de almacenar conjugados de HRP en diluciones de trabajo elimina el desperdicio y mejora la consistencia de un experimento a otro.

Además de sus estabilizadores enzimáticos patentados, contiene agentes antimicrobianos y bloqueadores para mejorar la señal de fondo en aplicaciones de inmunoensayos.


Tipos de prueba ELISA

ELISA es principalmente de cuatro tipos, a saber, ELISA directo, sándwich, indirecto y competitivo.

ELISA directo

Incluye los siguientes pasos:

  1. En primer lugar, agregue la muestra de proteína tamponada en los pocillos de la placa de microtitulación.
  2. Luego, agregue proteínas que bloquean la superficie o que no reaccionan como BSA (albúmina de suero bovino), caseína, etc. para bloquear la superficie inferior para cubrir el espacio adicional y evitar la unión falsa o la señalización falsa.
  3. Agregue anticuerpos primarios específicos conjugados con las enzimas, que se adherirán directamente a la proteína o antígeno deseado.
  4. Luego, inunde el tampón de lavado para eliminar las proteínas no unidas.
  5. Agregue sustrato al complejo anterior, que reaccionará aún más con las enzimas y producirá señales significativas en forma de cambio de color.

ELISA indirecto

Incluye los siguientes pasos:

  1. En primer lugar, agregue la muestra de proteína tampón en los pocillos de la placa de microtitulación.
  2. Luego, agregue proteínas de bloqueo de superficie o que no reaccionan como BSA (albúmina de suero bovino), caseína, etc. para bloquear la superficie inferior para cubrir el espacio adicional y evitar una unión falsa o una señalización falsa.
  3. Agregue anticuerpos primarios específicos que se unirán a la proteína de interés.
  4. Luego, agregue el tampón de lavado para eliminar las proteínas no unidas.
  5. Agregue un anticuerpo secundario conjugado con enzimas, que se unirá al complejo antígeno-anticuerpo.
  6. Nuevamente, agregue tampón de lavado para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.
  7. Agregue sustrato al complejo anterior, que reaccionará aún más con las enzimas y producirá señales significativas en forma de cambio de color.

ELISA sándwich

Incluye los siguientes pasos:

  1. En esta técnica, agregue el antisuero a los pocillos de la placa de microtitulación.
  2. Después de eso, los anticuerpos que están presentes en el antisuero se adherirán a la superficie del pozo.
  3. Luego, agregue los antígenos de prueba, que luego se acoplan con los anticuerpos homólogos.
  4. Agregue enzimas etiquetadas como anticuerpos específicos, que eventualmente se unirán a los antígenos que se acoplan con los anticuerpos adheridos a la superficie del pozo. Esta reacción da como resultado la formación de un complejo anticuerpo-antígeno-anticuerpo, que se asemeja a un sándwich.
  5. Add the enzyme-substrate to the above complex, after which it will react with the enzymes and degrade the substrate molecules by the enzymatic activity.

Competitive ELISA

It includes the following steps:

  1. Firstly, coat the bottom of the well that will capture the antibody.
  2. Then, add surface blocking proteins with BSA or detergents.
  3. Mix the sample with enzyme-conjugated proteins.
  4. After that, add the mixture to the well-containing antibodies that are adhered to its surface.
  5. Wash the wells with washing buffer to remove unbound proteins.
  6. Add substrate to the above complex, which will react with the enzymes and indicate the presence of protein or antigen in the given sample by giving a significant colour.

Qualitative Measure of ELISA

For the qualitative measure or to detect the presence of antigens or antibodies, the enzimas are used. It is very much clear from the name itself that the Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay makes the use of an enzyme system. In the ELISA method, the most commonly used enzymes are as follows:

  1. HRP: It stands for Horseradish peroxidase. HRP uses the following substrates viz. OPD, TMB, ABTS etc.
    • OPD gives Amber colour to the solution.
    • TMB gives Azul colour to the solution.
    • ABTS gives a verde colour to the solution.
  2. AP: It stands for Alkaline phosphatase. AP makes the use for PNPP substrate that gives a amarillo colour to the solution.

Therefore, in ELISA, positive and negative results are made based on the colour change. If the solution remains colourless even by the addition of substrate, then it results in negative ELISA. If the colour of the solution changes from colourless, then it will indicate the presence of analyte or protein of interest.

Quantitative Measure of ELISA

For the quantitative measure of ELISA, there are some key points that we have to remember, like:

  • Muestra: The sample is added either in duplicates or triplicates. Suppose, we have 40 samples, then the sample is added twice, and if we have 20 samples, then it is added thrice. Therefore, the addition of a sample depends upon the number of samples we have. Triplicates of a sample are considered to be better than the duplicates because it reduces the chances of error in the result.
  • Estándar: To prepare standard of the given sample, the sample is diluted in a series of 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, and 32.
  • Positive control: Positive control is the known concentration of the sample.
  • Blank samples: It contains everything as protein.
  • Standard-curve: The standard curve is prepared by diluting the concentrated samples to find the unknown concentration of the protein by plotting a graph between adsorption and concentration.

Advantages of ELISA Test

  1. ELISA is the qualitative y quantitative assay, i.e. it not only detects the presence of the analyte but also detects the concentration or quantity of the analyte.
  2. It can screen a large number of samples in a single take.
  3. ELISA can be easily automated.

Disadvantages of ELISA Test

  1. ELISA does not give any information about the biochemical properties of the analyte such as molecular weight, distribution among the living organisms etc.
  2. To know the molecular weight and more information about the analyte, a technique like Western blotting is generally employed.
  3. ELISA is a very sensitive method to perform, which requires more precautions while experimenting.

Therefore, the ELISA has both advantages along with some disadvantages. Inspite of this, it is an advantageous technique in medical science and research.


HRP-conjugated Beta Tubulin Monoclonal antibody

HeLa cells were subjected to SDS PAGE followed by western blot with HRP-66240 (beta Tubulin antibody) at dilution of 1:50000 incubated at room temperature for 1.5 hours.

HeLa cells were subjected to SDS PAGE followed by western blot with HRP-66240 (beta Tubulin antibody) at dilution of 1:50000 incubated at room temperature for 1.5 hours.

Proteintech Guarantee

The Proteintech guarantee covers Proteintech antibodies in any species and any application, including those not listed on the datasheet. If the antibody doesn’t perform, you can receive a hassle-free refund or credit note.

Tested Applications

Recommended dilution

SolicitudDilution
Western Blot (WB)WB : 1:20000-1:100000
Sample-dependent, check data in validation data gallery

Product Information

HRP-66240 targets Beta Tubulin in WB applications and shows reactivity with human, mouse, rat, nematode, pig, zebrafish samples.

Tested Reactivity human, mouse, rat, nematode, pig, zebrafish
Host / Isotype Mouse / IgG2a
Class Monoclonal
Type Antibody
Immunogen Beta Tubulin fusion protein Ag0117
Nombre completo tubulin, beta 3
Calculated molecular weight 450 aa, 50 kDa
Observed molecular weight 50-55 kDa
GenBank accession numberBC000748
Gene symbol TUBB3
Gene ID (NCBI) 10381
Conjugate HRP Fluorescent Dye
Formulario Liquid
Purification Method Protein A purification
Storage Buffer PBS with 50% Glycerol, 0.05% Proclin300, 0.5% BSA, pH 7.3.
Storage ConditionsStore at -20°C. Avoid exposure to light. Stable for one year after shipment. Aliquoting is unnecessary for -20 o C storage.

Background Information

There are five tubulins in human cells: alpha, beta, gamma, delta, and epsilon. Tubulins are conserved across species. They form heterodimers, which multimerize to form a microtubule filament. An alpha and beta tubulin heterodimer is the basic structural unit of microtubules. The alpha and beta tubulins (+/- 55 kDa MW) are homologous but are not identical. Beta tubulins have been widely used as loading control.

What is the molecular weight of beta-tubulin? Are there any isoforms of beta-tubulin?

The molecular weight of tubulin is 50-52 kDa. Humans have eight beta-tubulin isotypes, encoded by different genes, that differ in their C-terminal sequences. They have different tissue expression profiles and can rise to microtubules of different properties (PMID: 20191564).

How to use beta-tubulin as a loading control

Beta-tubulin is one of the most commonly used references as a loading control for cell lysates in western blotting. It is abundantly expressed across various tissues and developmental stages and highly conserved across species. However, since some variability has been observed in the expression levels of commonly used housekeeping genes (PMID: 15627964), it is recommended that more than one loading control antibody is used while developing new assays. More information can be found here: https://www.ptglab.com/news/blog/loading-control-antibodies-for-western-blotting/.

What drugs can influence beta-tubulin and organization of microtubules?

Many drugs that affect microtubule dynamics target beta-tubulin, mainly by interfering with the GTP hydrolysis (PMID: 21381049). Paclitaxel (Taxol) is used to stabilize microtubules by slowing down their depolymerization, while colchicine and vinca alkaloids (vinblastine) destabilize microtubules. They are used in research and also in the clinic as anti-cancer agents.

Is beta-tubulin post-translationally modified?

Yes, tubulins are subject to extensive post-translational modifications (PTMs) that affect the organization of microtubules and their dynamics. The most common modifications include polyglutamylation, polyglycylation, polyamination, glycososylation, glycation, phosphorylation, and acetylation (PMID: 24801181 and 25468068).