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Aislamiento de ADN genómico de trigo

Aislamiento de ADN genómico de trigo



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¿Puedo usar semilla seca, trigo por ejemplo, en lugar de hojas jóvenes para el aislamiento y purificación del ADN genómico para la amplificación por PCR?

El objetivo de mi experimento es validar un gen nuevo que está ausente o presente en un cromosoma en particular.


Sí, seguro que probé esto y doy un buen resultado. Pero la mayoría elige el mejor protocolo y debe hacerlo manualmente. Recomiendo que use el método de extracción CTAB-PVP (que usa 3 tampones EBA EBB SDS% 10) de "Tecnologías de ADN integradas" y si no puede encontrar esto, se lo diré.


EL PROYECTO MACGYVER: EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO Y EXPERIMENTOS DE ELECTROFORESIS EN GEL CON MATERIALES DIARIOS


Abstracto:
La extracción y separación de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa es un proceso simple y emocionante que cualquiera puede realizar. Sin embargo, el alto costo de los equipos y productos químicos especializados a menudo impide que los miembros de la comunidad de la escuela secundaria realicen un experimento de este tipo. Aquí, describimos una forma rentable de extraer y someter a electroforesis el ADN bajo una limitación prescrita por MacGyver, es decir, utilizando solo materiales disponibles en una tienda de comestibles o un centro comercial.

Para llevar a cabo este proyecto, decidimos dividir primero el procedimiento en tres apartados específicos, cada uno de los cuales se abordará de forma individual. Al hacer esto, encontrará que los siguientes desafíos están presentes. Estos son: (i) extracción de ADN, (ii) electroforesis en gel de ADN y (iii) visualización de ADN.

Extracción de ADN en un entorno de investigación:
En un entorno de investigación convencional, el primer paso para extraer ADN implica romper la membrana de la célula mediante el uso de medios físicos o químicos. Los ejemplos incluyen el uso de sonicación (ondas sónicas), equipo de homogeneización (licuadora, prensa francesa, mortero) o uso de detergente selectivo. Para nosotros, la exploración de detergentes (o jabones) o pasos físicos (mortero) eran las opciones más obvias.

Una vez que se ha lisado la célula / tejido, los pasos subsiguientes generalmente implican un intento de purificar o enriquecer la muestra para su ADN (es decir, deshacerse de las otras cosas). Esto se puede hacer de varias formas, muchas de las cuales no son técnicamente factibles según nuestra rúbrica MacGyver. Sin embargo, un lisado celular se puede enriquecer fácilmente en ADN usando alcohol para precipitar selectivamente el ADN, formándolo para que se aglutine en una entidad similar a un "moco". En consecuencia, hemos decidido centrarnos en la extracción de ADN genómico, ya que este tipo de muestra funciona mejor bajo el protocolo de precipitación de alcohol y también es la especie de ADN más abundante para facilitar la visualización tanto en la extracción como en la etapa de gel.

Una preparación genómica también es interesante desde un punto de vista educativo. Un profesor podría plantear `` ¿por qué la gente quiere obtener ADN genómico? '', Una pregunta que puede llevar a numerosas discusiones relacionadas con la clonación de nuevos genes, organismos (Dolly the Sheep) que tienen una fuente de ADN para tomar huellas dactilares (CSI, forensics ), o incluso la preparación de una muestra para la secuenciación del genoma completo del organismo (Proyecto Genoma Humano). Centrarse en el ADN genómico también permite al estudiante explorar muestras de diferentes fuentes, donde existe una posibilidad razonable de que se puedan discernir las diferencias en el tamaño del genoma. Como beneficio adicional, la precipitación de ADN en una forma de "mocos" agrega un factor "sorpresa" adicional a la actividad.

Extracción MacGyver de ADN:
Los reactivos y materiales para esta parte del experimento son bastante sencillos. Aquí, es necesario encontrar una fuente de tejido, algún tipo de rotura física, agua limpia / solución tampón, un jabón y un alcohol. Además, se requerirá algún tipo de recipiente para hacer esto, preferiblemente uno que sea de naturaleza transparente.

Fuente de tejido:
Aunque las características químicas del ADN aislado son prácticamente idénticas de un organismo a otro, la célula en la que se aloja puede variar mucho. En consecuencia, la elección del tejido es la variable más importante, pero posiblemente el mejor elemento para que juegue un estudiante. Hemos intentado extraer ADN de cebolla, guisantes, maíz, levadura, brotes de soja, germen de trigo, kiwi, plátano e incluso células de mejillas humanas, todo con diversos grados de éxito. Descubrimos que, en general, se puede lograr un buen ADN con cualquier producto o material de grano fresco, siempre que el experimentador esté dispuesto a jugar para encontrar las condiciones óptimas. Sin embargo, en general, recomendamos el tejido de cebolla o plátano como las mejores fuentes de extracción de ADN de bajo mantenimiento. También recomendamos el germen de trigo, ya que existe un procedimiento “rápido” que funciona muy bien. Por último, el ADN aislado de las propias células de la mejilla de un alumno es una alternativa interesante, ya que aporta un elemento personal a la actividad. Sin embargo, cabe señalar que el aislamiento de las células de las mejillas es menos fiable.

Paso físico:
Dependiendo del tejido que use, puede estar justificado un paso físico. Esto podría ser tan complicado como cortar el tejido y luego usar un mortero, o tan pequeño como golpear con un palillo de madera. En general, el material vegetal y los cortes de carne se beneficiarían de este paso, ya que las plantas tienen una pared celular resistente con la que lidiar y la carne generalmente contiene estrías musculares duras.

Solución tampón:
Este es el líquido en el que debe sumergirse la muestra y, como tal, tiene la función de simplemente mantener a salvo su ADN. Hay muchos búferes de tipo MacGyver posibles que se pueden usar para el procedimiento de extracción, que básicamente funcionan (consulte la Tabla 1). Sin embargo, debemos tener en cuenta que se debe utilizar agua destilada o embotellada. El agua del grifo parece tener un efecto menor en el procedimiento de extracción y, en realidad, es muy perjudicial en los siguientes pasos de gel que se describen más adelante.

A: "Tampón salino"
Solución salina al 0,9% (solución para lentes de contacto)

B: "Búfer normal"
1,5 g de sal de mesa (NaCl)
5,0 g de bicarbonato de sodio (bicarbonato de sodio)
hasta un volumen final de 120ml con agua

C: "Tampón ácido"
1,5 g de sal de mesa (NaCl)
5,0 g de bicarbonato de sodio (bicarbonato de sodio)
5 ml de vinagre
hasta un volumen final de 120ml con agua

D: "Tampón de proteinasa"
1,5 g de sal de mesa
5,0 g de bicarbonato de sodio
2,5 ml de solución ocular completa o 2 tabletas de proteína (marca completa)
hasta un volumen final de 120ml con agua

E: "Tampón ablandador de carne"
100 ml de agua caliente
Ablandador de carne 3g

* Tenga en cuenta que el agua sola también se puede utilizar de forma eficaz.

Jabón / Detergente:
Generalmente se usaba jabón líquido para lavar platos. En términos de detalles, encontramos mejores resultados cuando el jabón era incoloro y encontramos que las versiones sin perfume pueden funcionar mejor en general. Esencialmente, la mayoría de los jabones disponibles en las tiendas de comestibles tienen aditivos que juegan un papel importante en la conservación, el aroma, el color, la eliminación de manchas, etc. no está teniendo éxito con su extracción. En general, descubrimos que usar aproximadamente 5 ml (o menos) de detergente por 120 ml de solución funciona bien.

Filtración:
Dependiendo de su elección de tejido y también de la cantidad de tejido que haya decidido utilizar, puede ser pertinente incluir un paso de filtrado para eliminar los residuos. Esto permite una mejor visualización del efecto de los mocos del ADN al final. El filtrado se puede lograr fácilmente usando filtros de café o gasa. Tenga en cuenta que cuando use una gasa, necesitará utilizar de 3 a 4 capas de gasa. Los filtros de café son generalmente más fáciles porque son más baratos, más accesibles y más fáciles de limpiar.

Precipitación con alcohol:
La precipitación del ADN se realiza por contacto con alcohol. Este alcohol está disponible en las farmacias como alcohol isopropílico de la variedad 99% isopropanol. Alternativamente, la mayoría de las escuelas tendrán acceso a existencias de etanol al 95%. El alcohol debe agregarse en capas para que se pueda ver cómo se forma el ADN en la interfaz entre la muestra y el alcohol. Debe agregar al menos dos veces el volumen de su muestra original. Si no ve que se forman "mocos", entonces mezclar todo junto debería obtener el efecto deseado. Tenga en cuenta que si tiene la intención de recurrir a la mezcla, el paso de filtrado puede ser especialmente necesario para facilitar la visualización.

El ADN se precipita bajo tratamiento con alcohol porque es naturalmente hidrófobo y, como tal, tenderá a agruparse si el disolvente no es óptimo (es decir, agua). Como resultado, agregar un alcohol a su preparación significará que el ADN no está completamente solvatado en su ambiente óptimo (agua) y, por lo tanto, se agregará y precipitará de la solución. Se debe enfatizar que el grado y la facilidad de aglutinación dependerán de la cantidad de ADN presente y también de la concentración a la que exista. Por lo tanto, si ve cantidades mínimas de ADN, debería poder corregir esto (i) tratando de aislar de más tejido y (ii) resuspender el material en un volumen menor de líquido.

TABLA 2: PROTOCOLOS SUGERIDOS DE EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO DE MACGYVER:

PROTOCOLO GENERAL
1. Si es necesario, corte la fuente de ADN de su elección. Use una cantidad del tamaño de una fresa.
2. Usando un mortero, triture la muestra mientras agrega gradualmente 10 ml de solución tampón preparada con el detergente ya agregado. Muela durante al menos 5 minutos con todo su peso y fuerza para asegurarse de romper la membrana celular y alcanzar una consistencia de sopa cremosa. Si la muestra es demasiado espesa después de la trituración, agregue más solución salina para lograr el espesor óptimo de modo que la porción líquida de la muestra pueda pasar a través del filtro, mientras que el material celular más grande permanece en el filtro. Nota: Si la muestra de ADN está congelada, es considerablemente más fácil de moler.
3. Filtre el jugo de su muestra en un vaso pequeño. Deje que la solución gotee en el vaso de precipitados hasta que todo el líquido haya pasado por el filtro. Si esto toma demasiado tiempo, simplemente exprima todo el jugo de la muestra a través del filtro.
4. Agregue 2 volúmenes (esto significa aproximadamente dos veces el volumen de la muestra presente) de alcohol enfriado con hielo por el costado del vaso de precipitados con una pajita o una pipeta pasteur. Haga este paso lentamente para permitir que el alcohol forme una capa sobre la capa de jugo. Mientras deja reposar el vaso de precipitados, el ADN debería precipitar. Cuanto más espere, más ADN debería ver. Si no ve precipitaciones, mezcle todo con cuidado.
5. Los precipitados de ADN deben parecerse a un hilo de moco blanco translúcido, en la interfaz entre el jugo y el alcohol. Después de un tiempo considerable, el ADN puede eventualmente flotar hasta la parte superior de la capa de alcohol.
6. Puede quitar el ADN con un palito de paleta de madera o una varilla de vidrio. El ADN se adhiere bien a la madera.

PROTOCOLO RÁPIDO
1. Coloque una cucharadita o menos de germen de trigo en su taza.
2. Agregue aproximadamente 10 ml de agua destilada y triture suavemente con un palito de helado / palillo durante 1 minuto.
3. Luego agregue un chorrito de detergente para platos y triture suavemente con un palito de helado durante 2 minutos.
4. Vierta lentamente alcohol a lo largo de la varilla, colocando el alcohol encima del agua.
5. Deje el recipiente sobre una mesa y busque el ADN en la interfaz entre el alcohol y el agua.

PROTOCOLO DE CÉLULAS DE MEJILLAS
1. Mida 10 ml de “tampón regular (de la Tabla 1), vierta el tampón en la boca y gírelo alrededor de las mejillas durante aproximadamente 1 minuto.
2. Vuelva a escupir el agua en un recipiente, preferiblemente algo relativamente estrecho como un tubo de ensayo.
3. Vierta un poco de jabón líquido en la muestra y mezcle bien con un palito de paleta. Si puede mezclar por inversión, hágalo suavemente unas 20 veces.
4. Agregue lentamente 10 ml de alcohol frío a la muestra y asegúrese de verterlo en un ángulo por el costado del tubo de ensayo para que se formen dos capas. Hágalo con mucha suavidad, con una pajita, etc. Es importante que no se alteren las dos capas.
5. Espere unos 10 minutos y el ADN aparecerá a flote en la capa de alcohol.

Electroforesis en gel de ADN en un entorno de investigación:
La electroforesis es una forma de separar moléculas en función de la carga y el tamaño. En nuestro caso, queremos separar diferentes tamaños de moléculas de ADN genómico obtenidas de frutas, verduras y levadura. Generalmente, se utilizan polímeros de polisacáridos tales como agarosa o acrilamida para formar los geles de electroforesis. Debido a que el ADN está cargado negativamente, se puede forzar a que viaje a través del gel aplicando un campo eléctrico en el sistema. Normalmente, esto se logra mediante el uso de un aparato de gel especial diseñado para facilitar la producción o fundición del "gel", así como para permitir que una plataforma sumerja el gel en un tampón que contiene iones para crear un campo eléctrico. Tal aparato funcionará con un mínimo de alrededor de $ 500, y los paquetes de energía normalmente se utilizan para entregar

80 V de voltaje pueden funcionar en un rango de precio similar. En consecuencia, este aspecto del proyecto MacGyver se centra posiblemente en el ahorro de costes y se concentra principalmente en encontrar un sustituto de la agarosa y las instrucciones para producir un aparato de gel.

Electroforesis de ADN en gel de MacGyver:
Material de gel:
La agarosa es un componente de las algas y, como tal, es una molécula purificada refinada derivada de un espesante de alimentos común conocido como "Agar Agar". que, por cierto, se pueden encontrar fácilmente en la mayoría de las tiendas de alimentos de estilo oriental. El “Agar Agar” se puede comprar en escamas, fideos o en polvo. Trate de asegurarse de que no contenga ningún ingrediente adicional (como glucosa), ya que estos ingredientes pueden interferir con la formación de la matriz de gel. Para hacer el gel, se recomienda utilizar "Agar Agar" en forma de polvo en lugar de la forma de hojuelas o fideos. Las otras formas más grandes tienden a requerir corte y filtrado adicional, lo cual es problemático y muy complicado.

Búfer de ejecución:
Deberá preparar un tampón de funcionamiento que se requiere para hacer el gel, y también se requiere como el fluido que finalmente sumergirá su gel solidificado para permitir que se conduzca el campo eléctrico. La receta del búfer de ejecución de Macgyver es la siguiente:

& # 8211 0.05g de NaCl (este es el ion principal)
& # 8211 2g de bicarbonato de sodio (bicarbonato de sodio)
& # 8211 llevar a 1L con botella de agua destilada

Usaría el kit de pH del acuario de la tienda de mascotas a un pH aproximado de 7.5. (utilizamos tampón alcalino fabricado por Seqchem).

Aparato de gel:
Aunque una caja de gel de grado de investigación es costosa, de hecho es un equipo relativamente simple. En esencia, es un recipiente grande (llamémoslo una cámara de amortiguación) que puede contener líquido, por lo que los extremos opuestos se conectan a una fuente de energía configurando un escenario de electrodo positivo / negativo. La cámara de amortiguación debe poder contener convenientemente un recipiente más pequeño (llamémoslo cámara de fundición de gel) que se utiliza para fabricar y contener el gel. Además, la cámara de colada de gel más pequeña debe encajar de tal manera que quede en el medio entre los dos electrodos de la cámara tampón.

El montaje de esta caja de electroforesis debería ser bastante sencillo e incluso agradable para aquellos a los que les gusta "hacer cosas". Hemos incluido aquí una guía de dibujos animados (Figura 1) para hacer estas dos cámaras con artículos de plástico comunes (tupperware, jabonera, etc.). Para las conexiones de los electrodos, nos limitamos a tornillos de acero inoxidable (5 cm) y alambre de acero inoxidable (calibre 20), que funcionaron bien. Sin embargo, un sistema de electrodos más elaborado sería fácil de hacer con una visita a una ferretería adecuada.

Como alternativa al uso de tupperware, también hemos descubierto que Lego es extremadamente útil en la fabricación personalizada de una cámara de amortiguación para adaptarse a su cámara de fundición de gel. Tenga en cuenta que las cámaras de Lego deberán revestirse con un material impermeable, pero recientemente Glad ha desarrollado un nuevo material "Glad Press'N Seal" que funciona perfectamente y es fácil de manejar.

Finalmente, será necesario hacer un “peine”. Este es un artilugio que permite que se formen pequeños pozos en su gel. Aquí, encontramos que lego es especialmente útil, pero en un apuro, también hicimos peines cortando pedazos de plástico o pegando los dientes de un peine de pelo real.

FIGURA 1: NOTAS DE CONSTRUCCIÓN DE LA CAJA DE MACGYVER GEL.

Preparación del gel:
Usando el “Agar Agar” en polvo, querrá hacer un gel de 1,2% a 1,5% (p / vo 1,2 ga 1,5 g por 100 ml de tampón de funcionamiento). En un recipiente separado (un matraz, por ejemplo) pese la cantidad requerida de “Agar Agar” y agregue la cantidad requerida de tampón de funcionamiento (las cantidades específicas vendrán dictadas por el tamaño de su configuración de fundición de gel). El matraz debe ser lo suficientemente grande para que la solución de “Agar Agar” forme una capa de 2 cm en la base. Esto es necesario para asegurar una gran superficie en contacto con la placa calefactora para una fusión eficaz. Se recomienda utilizar una placa caliente y seguir revolviendo para calentar la solución de agar de manera uniforme. Una alternativa es usar un microondas, pero con este método se debe usar un nivel de calor bajo a intervalos cortos mientras se agita la mezcla con frecuencia. Si este procedimiento no se lleva a cabo con cuidado, es probable que la solución hierva en exceso y cree un gran lío. Tenga en cuenta que si la solución de "Agar Agar" no se disuelve por completo, esto afectará en gran medida la movilidad del ADN a medida que viaja a través del gel. Además, los trozos de agar sin disolver se teñirán durante el procedimiento de tinción, lo que dificultará la visualización de las bandas de ADN.

Nota: algunas escuelas tienen acceso al "Agar" que se usa para hacer placas bacterianas. Este material funciona muy bien en el vertido de geles (mucho mejor que el “Agar Agar”). Recomendamos hacer un gel al 1% p / v para fines de visualización genómica.

Asegúrese de haber sellado los extremos abiertos de su cámara de gel de fundición con cinta adhesiva o material similar. Vierta la mezcla derretida en su cámara de gel de fundición. Recuerde insertar también el “peine” para que se pueda formar el pozo. El gel tardará aproximadamente de 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en solidificarse. Durante este tiempo, no altere el gel. El gel es bastante delicado, así que tenga mucho cuidado cuando retire el peine antes de cargar su muestra.

El gel debe verterse hasta un espesor de aproximadamente 0,5 cm a 1,0 cm. Los geles más espesos brindan la oportunidad de hacer pozos más profundos, lo que permite cargar una muestra más grande. Los geles más delgados deberían correr más rápido. Tenga en cuenta que si el gel es demasiado fino, puede flotar al sumergirlo. Intente utilizar el gel lo antes posible. Aunque puede envolverlo en una envoltura de plástico y guardarlo en el refrigerador durante la noche, funcionará mejor cuando se use fresco.

Preparación de la muestra de ADN:
El ADN de su moco genómico se puede eliminar al final del procedimiento de extracción con una varilla de madera. Luego, el ADN debe sumergirse en una solución de alcohol al 70% que facilita la eliminación del exceso de sales. Esto es muy importante para que el gel se disuelva y se corra de forma eficaz. A continuación, el ADN se puede secar al aire durante aproximadamente 10 minutos para evaporar el alcohol residual y luego se desaloja en un pequeño volumen de tampón de funcionamiento (cuanto más pequeño, mejor, es decir, & lt0,5 ml). Cabe señalar que el ADN genómico a menudo puede tardar días en disolverse correctamente. Sugerimos dejar que el ADN se disuelva durante la noche a temperatura ambiente (si tiene acceso a una temperatura de hasta 50 ° C, entonces es mejor). Sea cuidadoso con su muestra, ya que el ADN genómico grande es muy propenso a cortarse. Una vez finalizado el paso de disolución durante la noche, considérelo su muestra de ADN independientemente de si se ha disuelto por completo.

Luego, su muestra deberá tratarse con un tampón de carga. Esto es esencialmente algo que hará que su muestra sea viscosa de modo que pueda "hundirse" en sus pozos durante la carga. A menudo, un tampón de carga también tiene un tinte, que viajará en la misma dirección que el ADN y también hace que la carga del gel sea más fácil de ver.

Nuestra receta es la siguiente:
& # 8211 0,5 ml de glicerol / glicerina (disponible en la sección de farmacia)
& # 8211 0,1 ml de agua destilada
& # 8211 varias gotas de colorante rojo para alimentos Club House (tenga en cuenta que la elección del tinte puede afectar en gran medida el resultado; no tuvimos mucho éxito al encontrar algo bueno aquí, por lo que un último recurso sería usarlo sin tinte).

Este tampón de carga se puede utilizar de 5X a 10X, lo que significa que para 0,5 ml de muestra, deberá agregar de 0,05 a 0,1 ml de tampón de carga. Mezclar con cuidado. Su muestra ahora está lista para el gel.

Gel Running.
Coloque su gel solidificado (en la cámara de fundición de gel) dentro de la cámara tampón más grande. Agregue tampón de funcionamiento hasta que el gel se sumerja de manera que haya al menos 3 mm de líquido por encima del gel. Tenga en cuenta que cuanto más líquido agregue, más lento correrá el gel.
En sus pozos, cargue tanta muestra (con tampón de carga) como sea posible. Probablemente, esto se haga mejor con una varilla de plástico unida a algún tipo de bulbo de goma. Básicamente, le gustaría ensamblar algo que pueda administrar líquido a través de un tubo pequeño. Una vez que se hayan cargado todas las muestras, querrá conectar los electrodos a una serie de baterías de 9V. Su ADN está cargado negativamente, por lo que debe colocar el electrodo positivo en el extremo "alejado" de los pocillos. Básicamente, una batería será suficiente, pero será muy, muy lenta (escenario de funcionamiento durante la noche). 5 a 7 o alineados en un circuito en serie deberían entregar una buena cantidad de voltaje. Tenga en cuenta que cuando el gel esté funcionando, NO meta el dedo en el líquido. Dependiendo de la cantidad de baterías que use, se entregan hasta 100 mA de corriente (suficiente para darle una pequeña descarga).

Cuando el circuito está funcionando, una buena verificación visual es ver que se están formando burbujas en los electrodos de alambre, y generalmente son más visibles en el extremo positivo.

La cantidad óptima de tiempo para ejecutar el gel es, francamente, algo que es difícil de predecir, ya que depende del tamaño de su gel, el grosor de su gel, la cantidad de búfer de funcionamiento en el sistema, la cantidad de voltaje aplicado , e incluso la configuración de cableado utilizada. En consecuencia, esta es la única cosa con la que definitivamente tendrás que jugar. Sin embargo, con una configuración de batería de 5 a 7, necesitará al menos un mínimo de 1 hora, y posiblemente más. Además, si es necesario diferenciar las preparaciones genómicas (es decir, diferente tamaño del genoma), es posible que deba experimentar más con el tiempo de ejecución para ver esta diferencia potencial.

Visualización del ADN en un entorno de investigación:
Una vez completada la electroforesis, es necesario visualizar la ubicación de las bandas. Una forma común de detectar las bandas es teñir el gel con bromuro de etidio, que emite fluorescencia bajo luz ultravioleta para ver el ADN. Desafortunadamente, tanto el bromuro de etidio como la luz ultravioleta son peligrosos (el etidio es altamente cancerígeno y la luz ultravioleta puede quemar los ojos de una persona sin las medidas de seguridad adecuadas) y, por lo tanto, no son ideales para su uso entre estudiantes de secundaria.

Manera MacGyver de visualizar el ADN:
Para visualizar las bandas de ADN, el gel se tiñó con una solución de azul de metileno. El azul de metileno consiste en la sal cloruro de azul de metileno. En el agua, la sal se disocia en un ion azul de metileno cargado positivamente que es de color azul y un ion cloruro cargado negativamente, que es incoloro. Este cromóforo azul puede entonces unirse al ADN cargado positivamente en el gel. El azul de metileno es un tinte conveniente para usar en el laboratorio porque es químicamente seguro, reutilizable y detecta la presencia de más de 20 ng de ADN / banda.

Más importante aún, el azul de metileno se puede encontrar convenientemente en la mayoría de las tiendas de mascotas. Generalmente se vende como desinfectante para acuarios a una concentración del 5%. Los mejores resultados de tinción de gel se obtuvieron sumergiendo el gel terminado en una solución de azul de metileno al 0,02% (en agua destilada) durante la noche a temperatura ambiente. Usando este protocolo, no se requirió decolorar el exceso de color en exceso con incubaciones de agua destilada. Descubrimos que las soluciones de mayor concentración tendían a teñir el gel demasiado oscuro, lo que dificultaba diferenciar el fondo de las bandas de ADN. Esto se observó incluso después de la decoloración con agua destilada. Además, si el polvo de “Agar Agar” no se disolvió completamente en el gel, las escamas no disueltas se tiñeron de azul oscuro, evitando la formación de bandas visibles distintas.

FIGURA 2: PREPARACIÓN DE ADN GENÓMICO DE MAÍZ ESTILO MACGYVER.

Conclusiones:
En general, hemos descrito un esquema eficaz de métodos para realizar algunas técnicas básicas de biología molecular bajo la limitación de MacGyver (Figura 2). Sin embargo, debemos enfatizar que hacer esto en su propia clase requerirá inevitablemente un poco de trabajo por su cuenta. Esto se debe a una multitud de consideraciones como "¿Tengo suficiente ADN?" "¿Cuál es mi configuración de gel?" "¿Qué tipo de reactivos especializados tengo a mi disposición para hacer las cosas aún más eficientes?" etc. Sin embargo, se espera que la información presentada aquí facilite la resolución de problemas. ¡Buena suerte!


Aislamiento eficaz de retrotransposones y familias de ADN repetitivo del genoma del trigo.

Se identificaron eficazmente nuevas clases de elementos de ADN repetitivos aislando pequeños fragmentos de los elementos del genoma del trigo. Se construyó una biblioteca de genoma de trigo A a partir de Triticum monococcum mediante escisión degenerada con EcoO109I, cuyos sitios de reconocimiento consistían en múltiples secuencias de 5'-PuGGNCCPy-3 '. Tres nuevas secuencias repetitivas pTm6, pTm69 y pTm58 derivadas del genoma A fueron seleccionadas y probadas para un alto número de copias usando un método de transferencia. pTm6 mostró identidad con dominios de integrasa de la cebada Ty1-Copia-retrotransposón BARE-1 ​​y pTm58 mostró similitud con el retrotransposón Romani tipo gitano de cebada Ty3. pTm69, sin embargo, constituía una matriz en tándem con especificidades genómicas útiles, pero no compartía ninguna identidad con elementos repetitivos conocidos. Este estudio también buscó aislar elementos repetitivos específicos del genoma D del trigo independientemente del nivel de metilación, mediante sustracción genómica. El ADN genómico total de Aegilops tauschii se escindió en fragmentos cortos con un cortador de 4 pb insensible a la metilación, MboI, y luego secuencias de ADN comunes entre Ae. tauschii y Triticum turgidum se restaron por hibridación con exceso de ADN genómico de T. turgidum. Se aisló la secuencia repetitiva pAt1 del genoma D y se usó para identificar una nueva familia de secuencias repetitivas adicional a partir de cromosomas artificiales bacterianos de trigo con un intervalo de tamaño de 1 395-1 850 pb. Los métodos llevaron con éxito la búsqueda de caminos de dos familias repetitivas únicas.


Reactivos de extracción de ADN / ARN en la investigación de plantas

La extracción de ADN / ARN suele ser el primer paso necesario para la mayoría de las investigaciones de biología molecular en la investigación de plantas. Las plantas presentan algunos desafíos únicos en comparación con los tejidos animales en la extracción de ADN / ARN. Por ejemplo, la pared celular resistente de muchos tejidos vegetales a menudo requiere técnicas enzimáticas o mecánicas que requieren mucho tiempo para romperse. Además, se pueden encontrar otros problemas, incluida la presencia de grandes cantidades de polisacáridos, altos niveles de RNasas, varios tipos diferentes de fenoles, incluidos taninos, bajas concentraciones de ácidos nucleicos (alto contenido de agua), tejido, como lignina (madera), que es difícil. romper y así sucesivamente. Para superar estos problemas y dificultades, TransGen proporciona el método de columna de giro basado en sílice y el método CTAB modificado diseñado para la extracción de ADN / ARN de plantas. Además, también está disponible un reactivo de extracción de ADN del suelo basado en el método de perlas magnéticas.

Extracción de ADN vegetal en la investigación de plantas-Método de columna de giro basado en sílice

Flujo de trabajo rápido y alto rendimiento (hasta 15 μg / 100 mg de tejido vegetal).

Eliminación completa de pigmentos, polisacáridos, fenoles y otras impurezas para mejorar la eficiencia de unión del ADN.

Datos de aplicación de la publicación: Zhang Y, Li Z X, Yu X D y col. Caracterización molecular de dos isoformas de un gen de la farnesil pirofosfato sintasa en el trigo y sus funciones en la síntesis de sesquiterpenos y la defensa inducible contra la infestación de áfidos [J]. Nuevo fitólogo, 2015, 206 (3): 1101-1115.

Fig.1 Estructura genómica de Tafps detectada por análisis GSDS después de que se extrajo el ADN genómico del trigo usando

EasyPure ® Kit de ADN genómico vegetal (Cat. No. EE111) .

Extracción de ADN vegetal en Investigación Vegetal- Método CTAB modificado

Adecuado para muestras ricas en polisacáridos y polifenoles.

Datos de aplicación de la publicación: Zhang L, Lan Q, Han S y col. Un gen similar a GH3, LaGH3, aislado de alerce híbrido (Larix leptolepis × Larix olgensis) está regulado por auxina y ácido abscísico durante la embriogénesis somática [J]. Árboles, 2019, 33 (6): 1723-1732.

Fig.2 Estructura de la región promotora del gen LaGH3 obtenida por análisis bioinformático tras extracción de ADN genómico

de L. leptolepis × L. olgensis utilizando PlantZol (Cat. No. EE141), PCR y clonación de la región promotora.

Extracción de ARN vegetal en Investigación Vegetal-Método de columna de centrifugación a base de sílice

Alta pureza sin contaminación de proteínas / ADN.

Datos de aplicación de la publicación: Liu Q, Deng S, Liu B y col. Una variante de RabGDIα inducida por helitrón causa una resistencia recesiva cuantitativa a la enfermedad del enano rugoso del maíz [J]. Comunicaciones sobre la naturaleza, 2020, 11 (1): 1-14.

Fig.3 Las plantas transgénicas que expresan el gen ZmGDIα exógeno se validaron mediante experimentos de RT-PCR después

El ARN total se extrajo de la hoja de maíz utilizando EasyPure ® Kit de ARN vegetal (n.º de cat. ER301) .

Extracción de ARN vegetal en Investigación Vegetal-Método CTAB modificado

Adecuado para muestras ricas en polisacáridos y polifenoles, como champiñón, fruta de plátano, fruta de mango, tubérculos de patata, zanahoria, hoja de Tiger Piran, etc.

Datos de aplicación de la publicación: Tang G, Xing S, Wang S y col. Regulación de residuos de cisteína en proteínas LsrB de Sinorhizobium meliloti bajo estrés oxidativo simbiótico y de vida libre [J]. Microbiología ambiental, 2017, 19 (12): 5130-5145.

Fig.4 La expresión de lsrB, lrp3, katA y gshA en nódulos de alfalfa detectados por análisis qRT-PCR después de nódulos radiculares de

Se trataron 20 plantas de alfalfa de dos semanas de edad mediante extracción de ARN utilizando TransZol Planta (Cat. No. ET121).

Extracción de ADN del suelo en Investigación Vegetal-Método CTAB modificado

Simple y rapido

Alto rendimiento y pureza

Suelo arenoso de ribera 1 Suelo arenoso de ribera 2 Suelo arenoso de ribera 3 Muestra de suelo de tierra de cultivo

Fig.5 Resultados de la electroforesis en gel de agarosa para ADN genómico extraído de 250 mg de diferentes tipos de muestras de suelo utilizando

MagicPure ® Kit de ADN genómico de suelo y heces (Cat. No. EC801) y el producto de la Compañía T, respectivamente.

Tamari F, Hinkley C S. Extracción de ADN de tejido vegetal: revisión y protocolos [M] // Técnicas de preparación de muestras para muestras de suelo, plantas y animales. Humana Press, Nueva York, NY, 2016: 245-263.

Yockteng R, Almeida A M R, Yee S, et al. Un método para extraer ARN de alta calidad de diversas plantas para análisis de secuenciación y expresión génica de próxima generación [J]. Aplicaciones en ciencias de las plantas, 2013, 1 (12): 1300070.

Páginas relacionadas para reactivos de extracción de ADN / ARN en la investigación de plantas


Aislamiento de ADN genómico de trigo - Biología

I Aislamiento de núcleos

Precaución: Use ropa protectora adecuada y tome las medidas de seguridad apropiadas cuando trabaje con sangre humana.

  1. Transfiera 5 ml de sangre completa (que contiene EDTA como anticoagulante) a un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml.
    Nota: Cuando trabaje con sangre aviar, o sangre de otras especies que tienen glóbulos rojos nucleados, use 0,2 ml de sangre y 4,8 ml de solución salina tamponada con Tris 1x (TBS, Tris-Cl 50 mM, NaCl 200 mM, KCl 3 mM, sodio al 0,02%). Azida, pH 7,5) en lugar de 5 ml de sangre.
  2. Añada 5 ml de tampón de lisis 2x (sacarosa 0,65 M, Tris-Cl 20 mM, pH 7,8, MgCl2 10 mM, Triton X-100 al 2%) y mezcle mediante inversión suave.
  3. Incubar la solución durante 5 minutos en hielo.
  4. Pellet nuclei by centrifugation at 1000 x g for 12 minutes at 4C.
  5. Decant supernatant and drain any residual supernatant by inverting the tube on a paper towel for 2 minutes.
    Nota: The pelleted nuclei may be stored at 70C for several weeks at this point, however, higher molecular weight DNA is obtained when genomic DNA is isolated from freshly prepared nuclei.

At this point, the DNA should have been extracted with both Phenol and Phenol-Chloroform and should be in a clean 15 ml polypropylene screw cap centrifuge tube.

  1. Add 100 l 2 M KCI and mix by gentle inversion.
  2. Overlay DNA solution with 5 ml 95% Ethanol by slowly pipetting the Ethanol down the side of the tube.
  3. Place a Pasteur pipet tip at the interface of the DNA-Ethanol solution and spool the DNA onto the pipet tip by swirling the pipet, keeping the tip at the interface, until the 2 phases are completely mixed.
  4. Place pipet tip with the spooled DNA in 1 ml 70% Ethanol for about 2 minutes.
  5. Remove pipet from the 70% Ethanol and hold upright (tip up) for a few seconds to allow the excess Ethanol to drain away. Do not allow the DNA to dry.
  6. Set pipet tip in a microcentrifuge tube containing 200 l TE (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0) and incubate f or 20 minutes at room temperature. The DNA should slide from the pipet into the TE. If necessary, gently remove the DNA from the pipet by scraping the DNA onto the interior of the tube.
  7. Redissolve DNA completely by incubating overnight at 4C. Store DNA at 4C. Do not freeze.
  1. Herrmann, B.G. and Frischauf, A.M. (1987) Isolation of genomic DNA. Métodos Enzymol. 152:180-183.
  2. Laws, G.M. and S.P. Adams. (1996) Measurement of 8-OHdG in DNA by HPLC/ECD: The importance of DNA purity. BioTechniques 20:36-38.
  3. Murphy, N.R. and Hellwig, R. J. (1996) Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier matrix. BioTechniques 21:934-939.

Source:


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Ancient Wheat Genome Reveals Clues to the Agricultural Past

Jef Akst
Mar 1, 2020

A s soon as he learned about the existence of ancient wheat specimens at University College London’s Petrie Museum of Egyptian Archaeology from a 2018 BBC documentary, Richard Mott of the UCL Genetics Institute wanted to study them. The samples likely contained bits of ancient wheat DNA, he reasoned, which could yield valuable insights into the history of cultivation of this all-important crop species.

Archaeobotanists at UCL helped Mott and a team of collaborators choose a handful of well-preserved husks from the museum’s collection of ancient emmer wheat, a variety native to the Near East and one of the first crops to be domesticated in the region, from which the researchers selected two husks for DNA extraction. After carefully removing the husks from the box, photographing them, and wrapping them in foil, the scientists transported the centuries-old plant material to a freshly bleached cleanroom used exclusively to process ancient and forensic samples.

It’s fascinating to see this gene flow happening in an area important for human history.

There, team member Laura Botigué, a population geneticist and visiting researcher from the Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG) in Barcelona, Spain, donned a hairnet, two Tyvek suits, two pairs of latex gloves, and a mask—part of a protocol designed to avoid contaminating the samples with her own cells. Uncertain how the delicate husks would hold up to the standard decontamination protocol of bleaching the samples, Botigué bleached one and left the second untouched. Then, to lyse the plant’s cells, she put the samples in a rotator that gently shook the husks inside an oven over the next several days. Finally, she used a centrifugation protocol to separate any DNA from the degraded cell walls and proteins.

Once the samples had been prepped and delivered to the UCL Genomics facility for sequencing, it was a waiting game to see if the procedure had yielded any readable wheat DNA. “This is the more stressful part,” Botigué says. Because they lack the type of protective collagen matrix found in bones, plants don’t preserve ancient DNA as well as animals. “You finish, the DNA is theoretically extracted, but you don’t see it in the tube,” says Botigué. “You’re in the blind until you hear back from the sequencing services.”

Within just a few weeks, the team got good news. For the husk that Botigué had bleached, about two-thirds of the reads aligned with genomes of modern wild and domesticated emmer wheat varieties—a relatively good success rate for ancient DNA, according to evolutionary geneticist Michael Scott, a postdoc in Mott’s lab who conducted the bioinformatics analysis of the sequences. “The first surprise was how well it worked,” he says. “It appears that the dry conditions in Egypt were good for DNA preservation.” The unbleached husk had yielded a smaller quantity of sequences, but those fragments mostly matched the ones in the bleached sample, validating the identity of those sequences as coming from the ancient wheat samples rather than from contaminants.

The museum wheat, which carbon dating showed was from between 1130 and 1000 BC, was genetically much more similar to modern domesticated varieties than to modern wild ones, suggesting that the plant lineage the samples came from had already been domesticated. Specifically, the sequences most resembled those of modern domesticated strains grown in Turkey, Oman, and India. There was also evidence for genetic exchange between the museum wheat strain and the wild emmer wheat that grew in the Levant, a large region in the Eastern Mediterranean that was a center of agricultural development in the Neolithic period, and where emmer was first cultivated. The genetic exchange could have occurred before the wheat’s introduction to Egypt from the Levant, says Scott. Alternatively, it’s possible that the ancient Egyptians’ wheat was able to interbreed with wild wheat in the Southern Levant thanks to interactions between the people in the two regions.

“With big data and with a really good analysis method they were able to detect this gene flow,” says M. Timothy Rabanus-Wallace, an agricultural geneticist at the Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research in Germany who coauthored a perspective published alongside the study in Nature Plants last October. “It’s fascinating to see this gene flow happening . . . in an area important for human history.”

See “Confessing to Plant Blindness”

The bioinformatics analysis also uncovered some genetic variants in the ancient samples that weren’t found in any of the modern emmer wheat genomes the researchers studied. If these variants helped the wheat survive in arid locations around the Near East, perhaps introducing those sequences into modern varieties could help make them more sustainable or more drought resistant, Scott says, though he admits that this “is very much just an idea.”

The detection of ancient genetic variation is a notable achievement because wheat genomes are large—three to five times the length of a human genome—and repetitive, making the “analysis . . . incredibly complex,” says James Breen, head of the bioinformatics core at the South Australian Health and Medical Research Institute who reviewed the study and coauthored the perspective with Rabanus-Wallace, a PhD student in his lab at the Australian Centre for Ancient DNA at the time. “So being able to find unique pieces of DNA in that genome is very difficult.” He adds that after a couple of additional validation tests performed by the UCL team, he was convinced that “the data that came out was legitimately ancient.”

Botigué and Scott emphasize that the study is primarily a proof of concept that museum-kept plant samples can yield readable genetic material. “We were able to look at DNA from specimens that had been stored in the museum for over 90 years without special preservation conditions—the museum was actually even bombed and flooded during wartime,” says Scott. “We think our study helps demonstrate the importance of museum collections as sources of genetic data, which”—in combination with new samples—“can be used to uncover the history of selection on crops and their movement around the globe.”

See “The Narluga: New Insights from Old Bones”

“I think that’s one of the biggest values of ancient DNA in plants,” adds Nathan Wales, an archaeologist at the University of York who was not involved in Scott and Botigué’s study—“to draw connections between different cultures and the different agricultural products they were growing and trading, and seeing how that changed over time.”


  • Store RNase A and Proteinase K at -20°C.
  • Add ethanol (&ge 95%) to the gDNA Wash Buffer concentrate as indicated on the bottle label.
  • Set a thermal mixer (e.g. ThermoMixer ® ) or, if not available, a heating block to 56°C for sample lysis.
  • Set a heating block to 60°C. Preheat the appropriate volume of elution buffer to 60°C (35-100 &mul per sample).
  • Do not load a single column with the lysed sample more than once over-exposure of the matrix to the lysed sample can cause the membrane to expand and dislodge.

PART 1: Sample Lysis

PART 2: Genomic DNA Binding and Elution

PART 1: SAMPLE LYSIS

Cultured Cells:

    Start with a cell pellet containing 1 x 10 4 &ndash 5 x 10 6 cells (typical starting amount is 1 x 10 6 cells).

Frozen cells: thaw cell pellet slowly on ice and loosen by flicking the tube several times. Resuspend in 100 &mul cold PBS by pipetting up and down.

Fresh cells: pellet by centrifugation at 1000 x g for 1 minute and resuspend in 100 &mul cold PBS by pipetting up and down.

Ensure pellet is resuspended completely. If using lower cell inputs, the use of carrier RNA may be beneficial see product manual for details.

1400 rpm). Incubation for longer than 5 minutes is not necessary, but will not negatively affect the quality of the purified gDNA. If a thermal mixer is not available, use a heating block and vortex occasionally.

Mammalian Whole Blood (non-nucleated)

    Transfer 100 &mul of whole blood to a 1.5 ml microfuge tube. If processing less than 100 &mul of blood, add cold PBS to bring the total volume to 100 &mul. For pre-aliquoted frozen samples, do not thaw add Proteinase K, RNase A and Blood Lysis Buffer to the frozen sample in step 2.

1400 rpm). Incubation for longer than 5 minutes is not necessary, but will not negatively affect the quality of the purified gDNA from most species. If a thermal mixer is not available, use a heating block and vortex occasionally.

Nucleated Whole Blood (birds, reptiles)

    Transfer 10 &mul whole blood to a 1.5 ml microfuge tube.

1400 rpm). Incubation for longer than 5 minutes is not necessary, but will not negatively affect the quality of the purified gDNA.

Animal Tissue

  1. Cut tissue into small pieces to ensure rapid lysis and high yields. Weigh the appropriate tissue amount and place in a 1.5 ml microfuge tube (see table below or Choosing Input Amounts for recommended input amounts)
    STARTING MATERIALRECOMMENDED INPUT AMOUNT
    Rodent tailup to 25 mg
    Cerebroup to 12 mg
    Fibrous tissue (muscle, heart)up to 25 mg
    Ear clips, skinup to 10 mg
    Liver, lungup to 15 mg
    Spleen, kidneyup to 10 mg
  2. Add Proteinase K (according to the table below) and 200 &mul of Tissue Lysis Buffer to each sample. Mix immediately by vortexing. Ensure tissue particles are able to move freely in the lysis mix and do not remain stuck on the bottom of the tube. When working with multiple samples, prepare a master mix of Tissue Lysis Buffer and Proteinase K to save pipetting steps.
    TISSUE TYPEPROTEINASE K AMOUNT
    Brain, Kidney, Skin, Ear Clips3 &mul
    All other tissues10 &mul
  3. Incubate at 56°C in a thermal mixer with agitation at full speed (1400 rpm) until tissue pieces have completely dissolved (typically 30-60 minutes). If time is not limiting, additional incubation up to 3 hours can further improve yields and decrease residual RNA. If an incubator with agitation is not available, use a tube rotator placed within an incubator, shaking water bath or a heating block (vortex samples every 5-15 minutes to speed up lysis).

PART 2: GENOMIC DNA BINDING AND ELUTION

  1. Add 400 &mul gDNA Binding Buffer to the sample and mix thoroughly by pulse-vortexing for 5-10 seconds. Thorough mixing is essential for optimal results.
  2. Transfer the lysate/binding buffer mix (

20&ndash40% and eliminates the need for a second elution. For applications in which a high DNA concentration is required, using a small elution volume and then eluting again with the eluate may increase yield (


Introducción

Puccinia triticina, the causal organism for leaf rust in wheat is a biotrophic pathogen. Hence its urediniospores cannot be grown artificially in culture media, es decir., outside its living host. So, samples needed for RNA isolation had to be collected from infected plants, which often was a mixture of both host and pathogen RNA. An efficient RNA isolation method from Puccinia spores became necessary when high amount and good quality of RNA is required for strain identification, polymerase chain reaction (PCR)-based studies or small RNA library preparation. Earlier research on pathogen-derived sequences relied mostly on en silico methodologies based on transcriptome or genomic data analysis (Kiran et al., 2016 Kumar et al., 2017 Dutta et al., 2017). Validation of pathogen sequences were not possible due to unavailability of suitable technique for isolation of good quality RNA from pathogen spores.

Several methods exist for successful isolation of RNA from different plant and animal tissues, a basic requirement for most molecular biology studies (Tan and Yiap, 2009). Earlier, to obtain RNA free of DNA was a tedious task even after the introduction of Guanidinium thiocyanate in extraction buffers. Later with the development of Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, which combines multiple steps, made RNA isolation comparative easy (Chomczynski and Sacchi, 2006 Sambrook and Russel, 2001). Other methods, quite different from the conventional methods, were also developed like chromatography on oligo (dT) columns or magnetic oligo (dT) beads to specifically separate poly (A) containing RNA.

These different techniques developed for RNA isolation using conventional or kit-based methods (Peng et al., 2007) are applicable for a wide range of plant and animal tissues. A few kits are available for yeast cells also, but no method suitable for spores like urediniospores with very hard and tough cell wall are available. Spores have tough cell wall. Therefore, RNA isolation using urediniospores primarily needs a proper technique for cell lysis. A recent report on RNA isolation from Puccinia Striiformis urediniospores compared several techniques using low cost reagents and the authors suggested a NaCl-based method as the most appropriate for extracting RNA (Li-Jie et al., 2016). But the method required adequate amounts (minimum 0.1 g) of spores to be pulverized in liquid nitrogen using mortar and pestle which is commonly associated with sample loss during transfer processes. In the present study, a method for rapid RNA isolation was developed which requires minuscule quantity of spores but yields good quantity and high quality of RNA that could be used for almost all molecular biology studies.


Isolation of Genetic Materials

The knowledge of gene isolation was developed after gaining the concept of physical and chemical characteristics of described DNA fragments their sizes, shapes and conformation can aid in the selection of methods used to isolate and purify those segments.

Plants provide several special challenges for researchers interested in the recombinant DNA research. No other class of living organisms has three separate genomes to analyze a nuclear genome containing high molecular weight linear chromosomes, a circular mitochondrial genome, and a circular chloroplast genome. Intact, high molecular weight (>150kbp) plant nuclear gDNA is used to construct genomic DNA libraries and to probe the plant genome for the presence of DNA markers, such randomly amplified polymorphic DNAs (RAPDs) and restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). Chloroplast cpDNA and mitochondrial mtDNA, which are thought to incur fewer structural changes over time, are often used to study plant systematic. They are also used to study in vitro synthesis and assembly of organelle proteins.

Isolating the DNA (Gene) for interest

For isolation of DNA from linear chromosomes of living organisms like plants, animals or from simple bacteria, it is necessary to break the cell for release of DNA which may be done by physical (homogenization or pressure), or biochemical means like solubilization with detergents or enzymes. The selection of enzyme for this process is dependent on the composition of the Particular cells that are used for plant materials, for fungal sample, chitinase is used.

Lysozyme is commonly used for both bacterial and animal tissue samples. The DNA so obtained is then separated from the cell walls, membranes, and other cellular debris by means of centrifugation, often followed by density gradient centrifugation. The localization of DNAs is the gradient may be done by instrumental method (absorption at 260 nm or visually by means of fluorescence). The isolation of DNA is done by inserting a syringe into the side of the soft plastic centrifuge tube and withdrawing the bands visible in UV radiation. The isolated DNA may be further purified and physically characterized (for example, for size) by means of electrophoresis in gel made up of agarose or of acryl amide.

Isolation of genes is the in vitro gene manipulation as it gives us the ability to bypass the multiplicity of mechanisms that restrict gene transfer between unrelated organisms and are far more accurate and subtle in nature. The broad outlines of this technique is: isolation of gene of interest, insertion of a gene into an appropriate vector, transfer of foreign DNA (gene) through the vector into an appropriate host organism to produce recombinant DNA and identification of recombinants.

DNA Isolation Methods

Many different methods and technologies are available for the isolation of genomic DNA. In general, all methods involve disruption and lysis of the starting material followed by the removal of proteins and other contaminants and finally recovery of the DNA. Removal of proteins is typically achieved by digestion with proteinase K, followed by salting-out, organic extraction, or binding of the DNA to solid-phase support (either anion-exchange or silica technology).DNA is usually recovered by precipitation using ethanol or isopropanol. The choice of a method depends on many factors: the required quantity and molecular weight of the DNA, the purity required for downstream applications, and the time and expense.

The separation of DNA from cellular components can be divided into four stages:

  1. Disruption
  2. Lysis
  3. Removal of proteins and contaminants
  4. Recovery of DNA

Preparation of crude lysates

An easy technique for isolation of genomic DNA is to incubate cell lysates at high temperatures (e.g., 90°C for 20 minutes), or to perform a proteinase K digestion, and then use the lysates directly in downstream applications. Considered “quick-and-dirty” techniques, these methods are only appropriate for a limited range of applications. The treated lysate usually contains enzyme inhibiting contaminants, such as salts, and DNA is often not at optimal pH. Furthermore, incomplete inactivation of proteinase K can result in false negative results and high failure rates. It is not recommended to store DNA prepared using this method, as the high levels of contamination often result in DNA degradation.

Salting-out methods

Starting with a crude lysate, ”salting-out” is another conventional technique where proteins and other contaminants are precipitated from the cell lysate using high concentrations of salt such as potassium acetate or ammonium acetate. The precipitates are removed by centrifugation, and the DNA is recovered by alcohol precipitation. Removal of proteins and other contaminants using this method may be inefficient, and RNase treatment, dialysis, and/or repeated alcohol precipitation are often necessary before the DNA can be used in downstream applications. DNA yield and purity are highly variable using this method.

Organic extraction methods

Organic extraction is a conventional technique that uses organic solvents to extract contaminants from cell lysates. The cells are lysed using a detergent, and then mixed with phenol, chloroform, and isoamyl alcohol. The correct salt concentration and pH must be used during extraction to ensure that contaminants are separated into the organic phase and that DNA remains in the aqueous phase. DNA is usually recovered from the aqueous phase by alcohol precipitation. This is a time consuming and cumbersome technique. Furthermore, the procedure uses toxic compounds and may not give reproducible yields. DNA isolated using this method may contain residual phenol and/or chloroform, which can inhibit enzyme reactions in downstream applications, and therefore may not be sufficiently pure for sensitive downstream applications such as PCR. The process also generates toxic waste that must be disposed of with care and in accordance with hazardous waste guidelines. In addition, this technique is almost impossible to automate, making it unsuitable for high-throughput applications.

Cesium chloride density gradients

Genomic DNA can be purified by centrifugation through a cesium chloride (CsCl) density gradient. Cells are lysed using a detergent, and the lysate is alcohol precipitated. Resuspended DNA is mixed with CsCl and ethidium bromide and centrifuged for several hours. The DNA band is collected from the centrifuge tube, extracted with isopropanol to remove the ethidium bromide, and then precipitated with ethanol to recover the DNA. This method allows the isolation of high-quality DNA, but is time consuming, labor intensive, and expensive (an ultracentrifuge is required), making it inappropriate for routine use. This method uses toxic chemicals and is also impossible to automate.

Fragmentation by Mechanical Shearing:

Random fragments of DNA can be generated by mechanical shearing. The desired fragments obtained by this method are without cohesive ends therefore, the ligation (joining) with the vector can be facilitated with a process known as homopolymer tailing. For example, a tail of dC residues (deoxynucleotide triphosphate) can be added to 3-OH terminus of DNA of sheared fragment and a tail of dG residues vector. The fragments to be cloned can then be joined to the reactor by annealing the tails.

Short- Gun method:

There is a restriction enzyme which is specific for a six-base sequence of DNA. It is used to cut foreign DNA to get a piece of interest. One can obtained fragments of 3 to 4 genes by this method, if distribution of bases is random. The fragments obtained can be too small or too big if the no of cutting sites recognized by enzyme used are too frequent and too sparse in the distribution. It is also important that is cutting sites falls on either end of gene of interest and not in between. When the same enzyme is used to cut the vector DNA, cohesive ends are created, in most cases depending on the nature of enzyme, the joining of vector and the isolated DNA is possible.

Shotgun Sequencing

cDNA method:

If animal gene is to be expressed in a bacterium or yeast, a suitable method is to isolate the messenger RNA (mRNA), first, concerned with the specific protein production. It is often impossible to express animal gene directly in bacteria because of the introns within the gene. The protein encoding parts of the genes are exons. Mature mRNA molecules in animals cells do not contain sequences complementary to introns as they are removed by processing. Introns are the sequences in DNAs which are in fact transcribed into mRNAs but are subsequently split out are therefore form no permanent consequents of the mRNAs (only reverse transcriptase and DNA polymerase. Thus cDNA produced for a particular product can be then joined to the appropriate vector for cloning by homopolymer tailing as described above or proper linkers.


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Resultado de la investigación: Contribución a la revista ›Artículo› revisión por pares

T1 - Isolation of a D-genome specific repeated DNA sequence from Aegilops squarrosa

N2 - Three repeated sequence clones, pAS1(1.0 Kb), pAS2(1.8 Kb) and pAS12(2.5 Kb), were isolated from Aegilops squarrosa (Triticum tauschii). The inserts of the three clones did not hybridize to each other. Two of the clones, pAS2 and pAS12, contain repeated sequences which were distributed throughout the genome. The clone pAS1 sequence was more restricted and was located in specific areas on telomeres and certain interstitial sites along the chromosome length. This cloned sequence was also found to be restricted to the D genome at the level of in situ hybridization. The pAS1 sequence will be useful in chromosomal identification and phylogenetic analysis. All three clones will allow assessment of genome plasticity in Aegilops squarrosa. Nuclear DNA content varies over a range of 10,000 fold among all organisms (Nagl et al., 1983). Among angiosperms, at least a 65-fold range in genome size occurs in diploid species (Sparrow, Price and Underbrink, 1972 Bennett, Smith and Heslop-Harrison, 1982). This DNA variation has been reported within families, genera, and species (Rothfels et al., 1966 Rees and Jones, 1967 Miksche, 1968 Price, Chambers and Bachmann, 1981). Much of the interspecific variation in genome size among angiosperms appears to be due to amplification and/or deletion of DNA within chromosomes. The variation in genome size does not appear to result in changes in the number of coding genes (Nagl et al., 1983). While the number of coding genes, with the exception of rDNA in specific examples, appears to remain constant, the remaining non-coding regions are quite flexible. This non-coding DNA encompasses over 99% of the plant genome and consists of sequences that exist as multiple copies throughout the genome and are identified as repeated DNA sequences (Flavell et al., 1974). Flavell et al. (1974) have reported that increasing genome size in higher plants is associated with increasing repetitive DNA amounts. Subsequent reports have substantiated this correlation (Bachmann and Price, 1977 Narayan, 1982). In various cereals, heterochromatin, which has been demonstrated to be correlated with the location of specific repeated DNA sequences, has been positively correlated with genome size (Bennett, Gustafson and Smith, 1977 Rayburn et al., 1985). Furuta, Nishikawa and Makino (1975) found significant DNA content variation among different accessions of Aegilops squarrosa L. This species contains the D genome, a pivotal genome in several polyploid species and also found in hexaploid wheat (AABBDD). The importance of this genome to the study of bread wheat genomes makes the mechanism(s) of this genomic plasticity of particular interest. In order to determine which sequences are varying, one must first have a way to identify specific types of chromatin and/or DNA. Specific types of chromosome banding such as C- and N-banding have been used to identity types of chromatin in previous studies. C-banding of the D genome results in very lightly staining bands whose pattern is somewhat indistinct. N-banding alternatively has been shown to be useful in identifying certain chromosomes of hexaploid wheat but is limited by the lack of major bands in the D genome (Endo and Gill, 1984). Specific DNA sequences have been isolated from Triticum aestivum cultivar "Chinese Spring" (hexaploid wheat). However, these sequences are representatives of the A and/or B genomes of hexaploid wheat and are not found in significant quantities in the D genome (Hutchinson and Lonsdale, 1982). Various other repeated DNA sequences have been successfully isolated from rye (Bedbrook et al., 1980) and identified on rye chromosomes (Appels et al., 1981 Jones and Flavell, 1982). Certain of these sequences are found in wheat genomes, but the sequences are representative of only a minor fraction of the D genome (Bedbrook et al., 1980 Rayburn and Gill, 1985). The purpose of this report is to describe three distinct repeated DNA sequences isolated from A. squarrosa (D genome). Two clones appear to be distributed throughout the total genome, and the third clone is restricted to specific sites along the chromosomes. This latter clone will prove useful in cytologically defining the D genome chromosomes. These sequences appear representative of two types of repeated DNA genome organization: 1) sequences distributed throughout the genome and 2) specific arrays of repeated sequences. The availability of such repeated DNA sequence clones along with the known intraspecific DNA content variation in A. squarrosa will allow the study of genomic plasticity of this species.

AB - Three repeated sequence clones, pAS1(1.0 Kb), pAS2(1.8 Kb) and pAS12(2.5 Kb), were isolated from Aegilops squarrosa (Triticum tauschii). The inserts of the three clones did not hybridize to each other. Two of the clones, pAS2 and pAS12, contain repeated sequences which were distributed throughout the genome. The clone pAS1 sequence was more restricted and was located in specific areas on telomeres and certain interstitial sites along the chromosome length. This cloned sequence was also found to be restricted to the D genome at the level of in situ hybridization. The pAS1 sequence will be useful in chromosomal identification and phylogenetic analysis. All three clones will allow assessment of genome plasticity in Aegilops squarrosa. Nuclear DNA content varies over a range of 10,000 fold among all organisms (Nagl et al., 1983). Among angiosperms, at least a 65-fold range in genome size occurs in diploid species (Sparrow, Price and Underbrink, 1972 Bennett, Smith and Heslop-Harrison, 1982). This DNA variation has been reported within families, genera, and species (Rothfels et al., 1966 Rees and Jones, 1967 Miksche, 1968 Price, Chambers and Bachmann, 1981). Much of the interspecific variation in genome size among angiosperms appears to be due to amplification and/or deletion of DNA within chromosomes. The variation in genome size does not appear to result in changes in the number of coding genes (Nagl et al., 1983). While the number of coding genes, with the exception of rDNA in specific examples, appears to remain constant, the remaining non-coding regions are quite flexible. This non-coding DNA encompasses over 99% of the plant genome and consists of sequences that exist as multiple copies throughout the genome and are identified as repeated DNA sequences (Flavell et al., 1974). Flavell et al. (1974) have reported that increasing genome size in higher plants is associated with increasing repetitive DNA amounts. Subsequent reports have substantiated this correlation (Bachmann and Price, 1977 Narayan, 1982). In various cereals, heterochromatin, which has been demonstrated to be correlated with the location of specific repeated DNA sequences, has been positively correlated with genome size (Bennett, Gustafson and Smith, 1977 Rayburn et al., 1985). Furuta, Nishikawa and Makino (1975) found significant DNA content variation among different accessions of Aegilops squarrosa L. This species contains the D genome, a pivotal genome in several polyploid species and also found in hexaploid wheat (AABBDD). The importance of this genome to the study of bread wheat genomes makes the mechanism(s) of this genomic plasticity of particular interest. In order to determine which sequences are varying, one must first have a way to identify specific types of chromatin and/or DNA. Specific types of chromosome banding such as C- and N-banding have been used to identity types of chromatin in previous studies. C-banding of the D genome results in very lightly staining bands whose pattern is somewhat indistinct. N-banding alternatively has been shown to be useful in identifying certain chromosomes of hexaploid wheat but is limited by the lack of major bands in the D genome (Endo and Gill, 1984). Specific DNA sequences have been isolated from Triticum aestivum cultivar "Chinese Spring" (hexaploid wheat). However, these sequences are representatives of the A and/or B genomes of hexaploid wheat and are not found in significant quantities in the D genome (Hutchinson and Lonsdale, 1982). Various other repeated DNA sequences have been successfully isolated from rye (Bedbrook et al., 1980) and identified on rye chromosomes (Appels et al., 1981 Jones and Flavell, 1982). Certain of these sequences are found in wheat genomes, but the sequences are representative of only a minor fraction of the D genome (Bedbrook et al., 1980 Rayburn and Gill, 1985). The purpose of this report is to describe three distinct repeated DNA sequences isolated from A. squarrosa (D genome). Two clones appear to be distributed throughout the total genome, and the third clone is restricted to specific sites along the chromosomes. This latter clone will prove useful in cytologically defining the D genome chromosomes. These sequences appear representative of two types of repeated DNA genome organization: 1) sequences distributed throughout the genome and 2) specific arrays of repeated sequences. The availability of such repeated DNA sequence clones along with the known intraspecific DNA content variation in A. squarrosa will allow the study of genomic plasticity of this species.


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