Información

¿Qué son los cebadores marcados?


Estoy interesado en amplificar una secuencia para su uso posterior con Gibson Assembly. Quiero crear regiones salientes en mi fragmento de ADN para que haya complementariedad con el plásmido en el que estoy tratando de insertarlo.

Un colega me informó que trabajara con "cartillas marcadas", aunque no puedo encontrar literatura en línea. ¿Alguien puede explicarme este concepto?


Cebadores de PCR para introducir la etiqueta - (22 / Sep / 2008)

Hola, recientemente cloné mi gen de tipo salvaje en un vector pUAST. Quiero introducir etiquetas HA justo antes del gen y justo después del gen (como dos construcciones separadas). También quiero asegurarme de tener una secuencia Kozak y una A en el -3 antes de la etiqueta. ¿Cómo puedo hacer esto por PCR? ¿Alguien puede sugerir?

Es realmente fácil & # 33. La etiqueta HA tiene aproximadamente 27-30 pb, ¿no es así? Entonces, pida oligos más largos.

5 & ​​# 39- (3 pb aleatorios) - (sitio de enzima de restricción) - (etiqueta HA) - (inicio de su gen (20-30 pb))

3 & # 39- (final del gen) - (HAtag) - (sitio RE) - (3 pb aleatorios) -

Después de la PCR, corte el producto con enzimas de restricción y péguelo en el lugar de su gen sin modificar.

Por lo general, la región complementaria al gen es de alrededor de 23-26 pb. Puede agregar su Kozak delante de la etiqueta HA. Tenga cuidado con los codones START y STOP si desea traducir las etiquetas.

Lo hago así todo el tiempo. He agregado etiquetas de hasta 60 pb con imprimaciones. En tal caso, acabo de pedir un oligo de 85 pb (purificado por HPLC) y no hay problema. Normalmente uso Pfu para este tipo de PCR.

Gracias Ramses. ¿Funcionará la PCR si mi plásmido es

10kb? ¿Existe una buena polimerasa que no introduzca mutaciones aleatorias?

Es realmente fácil & # 33. La etiqueta HA tiene aproximadamente 27-30 pb, ¿no es así? Entonces, pida oligos más largos.

5 & ​​# 39- (3 pb aleatorios) - (sitio de enzima de restricción) - (etiqueta HA) - (inicio de su gen (20-30 pb))

3 & # 39- (final del gen) - (HAtag) - (sitio RE) - (3 pb aleatorios) -

Después de la PCR, corte el producto con enzimas de restricción y péguelo en el lugar de su gen sin modificar.

Por lo general, la región complementaria al gen es de alrededor de 23-26 pb. Puede agregar su Kozak delante de la etiqueta HA. Tenga cuidado con los codones START y STOP si desea traducir las etiquetas.

Lo hago así todo el tiempo. He agregado etiquetas de hasta 60 pb con imprimaciones. En tal caso, acabo de pedir un oligo de 85 pb (purificado por HPLC) y no hay problema. Normalmente uso Pfu para este tipo de PCR.

Yo también he utilizado este método con éxito y facilidad para introducir etiquetas HA. Solo una adición, es posible que deba hacer un pcr de aceleración para obtener un producto eficiente. Aquí es donde comienza con un recocido bajo y aumenta con cada ronda. Al principio, su cebador no se hibridará con todo el plásmido, ya que el HA y el sitio de restricción no son complementarios, pero una vez que obtenga un poco de producto, este se convertirá en la nueva plantilla que es complementaria a todo el cebador. De lo contrario, puede hacer un pcr anidado donde toma el producto del primer pcr, que puede no ser tanto, y lo usa como plantilla en un segundo pcr. Esto debería darte una reacción mucho más sólida.

puede probar Phusion. Gran enzima. La plantilla larga de KOD también es otra buena enzima.

Si le preocupa la reacción de PCR de 10 kb, busque un sitio de restricción único en su gen.
es decir (usando NotI y BamHI como ejemplos)

Plásmido ---- 5 & # 39Gene ---- NotI ----- Gen 3 & # 39 --- BamHI --- Plásmido

Construyó un cebador directo que se une a este sitio de restricción único dentro de su gen.
Y construya una cartilla inversa como la describe Ramsés. (Aunque usaría 6 pb como guardia en lugar de 3 pb)

Amplifique por PCR y obtendrá
Guardia---NotI ------ Gene3 y # 39-HA Tag-BamHI--Guardia

Corte este producto de PCR con las enzimas de restricción adecuadas. Cortar el plásmido con las mismas enzimas, quitar el fragmento de ADN que contiene el antiguo extremo 3 & # 39 del gen. Y luego ligarlos juntos el plásmido y el producto de PCR.

Plásmido ---- 5 & # 39Gene ---- NotI ----- Etiqueta de Gene 3 & # 39-HA --- BamHI--- Plásmido


Introducción

Las variantes de la secuencia genómica pueden heredarse verticalmente (es decir, transmitirse a través de la línea germinal) o generarse después de la formación del cigoto (es decir, conducir a un mosaicismo somático o gonadal). Está bien establecido que el mosaicismo somático ocurre en células de individuos fenotípicamente normales [1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17] y puede provocar diversas enfermedades [18]. Sin embargo, es necesario dilucidar la prevalencia del mosaicismo somático y la medida en que contribuye a enfermedades distintas de los cánceres [18].

Estudios recientes han estimado que cada célula dentro del cerebro humano contiene de cientos a algunos miles de variantes somáticas de un solo nucleótido (SNV) y que una fracción más pequeña de células alberga variaciones del número de copias somáticas (CNV) e inserciones de elementos genéticos móviles (es decir, retrotransposón) [10, 15, 17, 19,20,21,22]. Decenas de SNV somáticas están presentes en fracciones de alelos de variante alta (VAF) en múltiples tejidos, lo que indica que surgieron durante el desarrollo temprano [17, 23]. En comparación, algunas SNV somáticas están presentes en VAF bajas y tienen distribuciones tisulares limitadas, lo que sugiere que surgieron más tarde en el desarrollo [15,16,17].

La secuenciación de ADN unicelular es el método más directo para identificar variantes somáticas. Sin embargo, las mutaciones introducidas durante la amplificación del ADN y / o la generación de bibliotecas de secuenciación unicelular, así como los sesgos de amplificación del ADN no uniformes, dificultan la discriminación de los SNV en mosaico auténticos de los artefactos de procedimiento [24]. Además, este enfoque para identificar SNV en mosaico requiere muestrear un gran número de células en un individuo dado y, en consecuencia, es costoso.

Otro enfoque para identificar variantes de mosaico implica comparar poblaciones de células a granel de dos muestras de tejido derivadas del mismo individuo (la muestra de interés y una muestra de control) como se realiza de forma rutinaria durante el análisis de los genomas del cáncer. Sin embargo, este enfoque está limitado por la incapacidad de definir un tejido de control adecuado porque los SNV en mosaico, en particular los que surgen durante el desarrollo temprano, a menudo están presentes en múltiples tejidos en todo el cuerpo. De manera similar, los enfoques de códigos de barras moleculares, como la secuenciación dúplex, pueden corregir los errores introducidos por la amplificación o secuenciación por PCR y ofrecen una mejora de la precisión de & gt 10.000 veces en comparación con la WGS convencional [25, 26]. Sin embargo, los enfoques de consenso molecular más precisos requieren una profundidad de secuenciación extremadamente alta (1000 × o superior) para garantizar que cada molécula de ADN se secuencia varias veces, utilizando así de manera eficaz sólo un pequeño porcentaje de las lecturas generadas para la llamada de variantes [27]. Desde un punto de vista práctico, este requisito restringe el beneficio principal de los códigos de barras a enfoques específicos. Por lo tanto, el desarrollo de un conjunto unificado de mejores prácticas para detectar SNV somáticos a partir de conjuntos de datos de secuenciación del genoma completo (WGS) a granel proporcionaría un enfoque alternativo y rentable para identificar SNV somáticos.

En este estudio, los miembros de Brain Somatic Mosaicism Network (BSMN) llevaron a cabo un estudio coordinado y multiinstitucional que analizó el mosaicismo en una sola muestra de cerebro neurotípico y estableció estándares unificados para llamar y validar mosaicos SNV a partir de datos masivos de WGS y WES.


Etiqueta HA

La hemaglutinina (HA) de la influenza humana es una glicoproteína de superficie necesaria para la infectividad del virus de la influenza humana. La etiqueta HA se deriva de la molécula HA correspondiente a los aminoácidos 98-106. Se ha utilizado ampliamente como etiqueta de epítopo general en vectores de expresión. Se han diseñado muchas proteínas recombinantes para expresar la etiqueta HA, que no parece interferir con la bioactividad o la biodistribución de la proteína recombinante. Esta etiqueta facilita la detección, el aislamiento y la purificación de la proteína de interés. [1]

La etiqueta HA no es adecuada para la detección o purificación de proteínas de células apoptóticas ya que es escindida por Caspasa-3 y / o Caspasa-7 después de su secuencia DVPD, lo que hace que pierda su inmunorreactividad. [2] El etiquetado de proteínas endógenas con HA-tag utilizando CRISPR se logró recientemente in vivo en neuronas diferenciadas. [3]


  • Los estudiantes dominarán el conocimiento crítico en biología relevante para la siguiente etapa de su carrera.
  • Los estudiantes demostrarán capacidad para usar y aplicar métodos cuantitativos apropiados en las ciencias biológicas.
  • Los estudiantes podrán evaluar críticamente e integrar los hallazgos científicos en las ciencias biológicas y aplicar esta comprensión a áreas de interés público y profesional.
  • Los estudiantes podrán comunicarse eficazmente a través del habla y la escritura de los procesos de la ciencia y los resultados de la investigación científica.
  • Los estudiantes dominarán el diseño experimental y las habilidades de laboratorio relevantes para la siguiente etapa de su carrera.

Silla: J. Singer (profesor)

Profesores universitarios distinguidos: W. Fagan

Profesores: G. Borgia, C. Carr, S. Carroll, K. Carleton, M. Cummings, E. Haag, W. Jeffery, T. Kocher, K. Lips, C. Machado, E. Quinlan, M. Rankin, M. Reaka, J. Simon, S. Sukharev, G. Wilkinson

Profesores asociados: I. Ades, R. Araneda, A. Bely, D. Butts, Q. Gaudry,

Profesores asistentes: E. Bruns, M. Caras, H. Fisher, P. Johnson, S. Juntti, C. Speer

Conferencista principal: R. Compton, padre B

Profesor titular: H. Bierman, R. Infantino, S. Lombardi, J. Opoku-Edusei, H. Woodham

Conferencistas: C. Cantemir, N. Fletcher, C. Fox, C. Lin, K. Paczolt, D. Sandstrom

Profesores eméritos: G. Anastos, A. Cohen, M. Colombini, M. Dudash, C. Fenster, D. Gill, W. Higgins (Profesor asociado emérito), R. Highton, D. Inouye, P. Kanold, S. Pierce , A. Popper


Otras tecnologías basadas en homología

Hemos descrito la clonación independiente de secuencia y ligadura (SLIC) en una publicación anterior de Plásmidos 101. Aunque SLIC puede ser más rentable, el ensamblaje de Gibson mejora dos aspectos de los métodos SLIC. En primer lugar, utiliza una exonucleasa 5 'dedicada en lugar de utilizar la función exonucleasa de la ADN polimerasa de T4, que debe controlarse mediante la presencia o ausencia de dNTP. En segundo lugar, en el ensamblaje de Gibson se agrega una ligasa para reparar las mellas in vitro, mientras que en SLIC estas construcciones se reparan en vivo, que termina siendo mucho menos eficiente.

Además de SLIC y Gibson, existen aún más métodos de ensamblaje basados ​​en homología que se han descrito: CPEC (clonación de extensión de polimerasa circular) y SLiCE (Extracto de clonación de ligadura sin costuras) por nombrar dos más. Del mismo modo, existen varios kits de clonación comprados en tiendas disponibles que se basan todos en regiones de superposición prolongada, no tienen requisitos para las enzimas de restricción y no tienen secuencias de cicatrices entre los fragmentos. Algunos de estos productos incluyen:

Aunque estos kits pueden tener un precio elevado, sus fabricantes pregonan una gran eficiencia y un compromiso de tiempo reducido. Estos kits también vienen con protocolos específicos, sugerencias de proporciones de producto a insertar y herramientas para el diseño de imprimaciones, por lo que siempre es mejor consultar las instrucciones del fabricante particular del kit que utilizará. Algunos de estos productos pueden ofrecer ventajas que el ensamblaje de Gibson no ofrece, como una mayor eficiencia, tiempos de incubación más cortos o la capacidad de acomodar fragmentos más pequeños.


Contenido

El desarrollo de métodos para detectar e identificar biomoléculas ha sido motivado por la capacidad de mejorar el estudio de la estructura y las interacciones moleculares. Antes de la llegada del marcaje fluorescente, se usaban radioisótopos para detectar e identificar compuestos moleculares. Desde entonces, se han desarrollado métodos más seguros que implican el uso de tintes fluorescentes o proteínas fluorescentes como etiquetas o sondas como medio para marcar e identificar biomoléculas. [3] Aunque el etiquetado fluorescente a este respecto solo se ha utilizado recientemente, el descubrimiento de la fluorescencia ha existido durante mucho más tiempo.

Sir George Stokes desarrolló la Ley de Fluorescencia de Stokes en 1852, que establece que la longitud de onda de la emisión de fluorescencia es mayor que la de la radiación excitante. Richard Meyer luego denominó fluoróforo en 1897 para describir un grupo químico asociado con la fluorescencia. Desde entonces, la fluoresceína fue creada como un tinte fluorescente por Adolph von Baeyer en 1871 y el método de tinción se desarrolló y utilizó con el desarrollo de la microscopía de fluorescencia en 1911. [4]

El bromuro de etidio y sus variantes se desarrollaron en la década de 1950, [4] y en 1994, se introdujeron las proteínas fluorescentes o FP. [5] La proteína verde fluorescente o GFP fue descubierta por Osamu Shimomura en la década de 1960 y fue desarrollada como una molécula trazadora por Douglas Prasher en 1987. [6] Los FP llevaron a un gran avance en la obtención de imágenes de células vivas con la capacidad de etiquetar selectivamente regiones de proteínas genéticas y observar las funciones y los mecanismos de las proteínas. [5] Por este avance, Shimomura recibió el Premio Nobel en 2008. [7]

Se han desarrollado nuevos métodos para rastrear biomoléculas, incluido el uso de biosensores colorimétricos, compuestos fotocrómicos, biomateriales y sensores electroquímicos. El etiquetado fluorescente también es un método común en el que las aplicaciones se han expandido al etiquetado enzimático, etiquetado químico, etiquetado de proteínas y etiquetado genético. [1]

Actualmente existen varios métodos de etiquetado para rastrear biomoléculas. Algunos de los métodos incluyen los siguientes.

Marcadores de isótopos Editar

Las especies comunes para las que se utilizan los marcadores isotópicos incluyen proteínas. En este caso, los aminoácidos con isótopos estables de carbono, nitrógeno o hidrógeno se incorporan en las secuencias de polipéptidos. [8] Estos polipéptidos luego se someten a espectrometría de masas. Debido al cambio definido exacto que estos isótopos incurren en los péptidos, es posible decir a través del gráfico de espectrometría qué péptidos contenían los isótopos. Al hacerlo, se puede extraer la proteína de interés de varias otras en un grupo. Los compuestos isotópicos juegan un papel importante como fotocromos, que se describen a continuación.

Biosensores colorimétricos Editar

Los biosensores están unidos a una sustancia de interés. Normalmente, esta sustancia no podría absorber la luz, pero con el biosensor adjunto, la luz se puede absorber y emitir en un espectrofotómetro. [9] Además, los biosensores fluorescentes se pueden ver a simple vista. Algunos biosensores fluorescentes también tienen la capacidad de cambiar de color en entornos cambiantes (por ejemplo, de azul a rojo). Un investigador podría inspeccionar y obtener datos sobre el entorno circundante en función del color que pudiera ver visiblemente de la especie híbrida biosensor-molécula. [10]

Los ensayos colorimétricos se utilizan normalmente para determinar cuánta concentración de una especie hay en relación con otra. [9]

Compuestos fotocromáticos Editar

Los compuestos fotocromáticos tienen la capacidad de cambiar entre una gama o variedad de colores. Su capacidad para mostrar diferentes colores radica en cómo absorben la luz. Las diferentes manifestaciones isoméricas de la molécula absorben diferentes longitudes de onda de luz, por lo que cada especie isomérica puede mostrar un color diferente en función de su absorción. Estos incluyen compuestos fotoconmutables, que son proteínas que pueden cambiar de un estado no fluorescente a uno fluorescente en un entorno determinado. [11]

La molécula orgánica más común que se utiliza como fotocromo es el diarileteno. [12] Otros ejemplos de proteínas fotoconmutables incluyen PADRON-C, rs-FastLIME-s y bs-DRONPA-s, que pueden usarse en células de plantas y mamíferos por igual para observar cómo las células se mueven hacia diferentes entornos. [11]

Biomateriales Editar

Los biomateriales fluorescentes son una posible forma de utilizar factores externos para observar una vía de manera más visible. El método implica marcar con fluorescencia moléculas de péptidos que alterarían la vía natural de un organismo. Cuando este péptido se inserta en la célula del organismo, puede inducir una reacción diferente. Este método se puede utilizar, por ejemplo, para tratar a un paciente y luego ver visiblemente el resultado del tratamiento. [13]

Sensores electroquímicos Editar

Los sensores electroquímicos se pueden utilizar para la detección de biomoléculas sin etiquetas. Detectan cambios y miden la corriente entre un electrodo metálico con sonda y un electrolito que contiene el analito objetivo. A continuación, se aplica un potencial conocido al electrodo a partir de una corriente de retroalimentación y se puede medir la corriente resultante. Por ejemplo, una técnica que usa detección electroquímica incluye elevar lentamente el voltaje, lo que provoca que las especies químicas en el electrodo se oxiden o reduzcan. Se traza la corriente de la celda frente al voltaje, lo que finalmente puede identificar la cantidad de especies químicas consumidas o producidas en el electrodo. [14] Las etiquetas fluorescentes se pueden utilizar junto con sensores electroquímicos para facilitar la detección en un sistema biológico.

Etiquetas fluorescentes Editar

De los diversos métodos de etiquetado de biomoléculas, los marcadores fluorescentes son ventajosos porque son muy sensibles incluso a baja concentración y no destruyen el plegamiento y la función de la molécula diana. [1]

La proteína verde fluorescente es una proteína fluorescente natural de las medusas. Aequorea victoria que se usa ampliamente para etiquetar proteínas de interés. GFP emite un fotón en la región verde del espectro de luz cuando es excitado por la absorción de luz. El cromóforo consiste en un tripéptido oxidado -Ser ^ 65-Tyr ^ 66-Gly ^ 67 ubicado dentro de un barril β. GFP cataliza la oxidación y solo requiere oxígeno molecular. La GFP se ha modificado cambiando la longitud de onda de la luz absorbida para incluir otros colores de fluorescencia. YFP o proteína fluorescente amarilla, BFP o proteína fluorescente azul y CFP o proteína fluorescente cian son ejemplos de variantes de GFP. Estas variantes son producidas por la ingeniería genética del gen GFP. [15]

Las sondas fluorescentes sintéticas también se pueden utilizar como marcadores fluorescentes. Las ventajas de estas etiquetas incluyen un tamaño más pequeño con más variedad de colores. Pueden usarse para marcar proteínas de interés de forma más selectiva mediante varios métodos, incluido el marcaje basado en el reconocimiento químico, como el uso de etiquetas de péptidos quelantes de metales, y el marcaje basado en el reconocimiento biológico mediante reacciones enzimáticas. [16] Sin embargo, a pesar de su amplia gama de longitudes de onda de excitación y emisión, así como una mejor estabilidad, las sondas sintéticas tienden a ser tóxicas para la célula y, por lo tanto, no se utilizan generalmente en estudios de imágenes celulares. [1]

Los marcadores fluorescentes se pueden hibridar con ARNm para ayudar a visualizar la interacción y la actividad, como la localización del ARNm. Una hebra antisentido marcada con la sonda fluorescente se une a una única hebra de ARNm y luego se puede ver durante el desarrollo celular para ver el movimiento del ARNm dentro de la célula. [17]

Etiquetas fluorogénicas Editar

Un fluorógeno es un ligando (ligando fluorogénico) que no es fluorescente en sí mismo, pero cuando está unido por una proteína específica o la estructura del ARN se vuelve fluorescente. [18]

Por ejemplo, FAST es una variante de la proteína amarilla fotoactiva que se diseñó para unir imitaciones químicas del cromóforo tripéptido GFP. [19] Del mismo modo, el aptámero de espinaca es una secuencia de ARN diseñada que puede unirse a imitadores químicos cromóforos de GFP, lo que confiere fluorescencia condicional y reversible a las moléculas de ARN que contienen la secuencia. [20]


Introducción

Se notificó un número inusualmente grande de casos de paperas en los Estados Unidos en 2016 y 2017, a pesar de las altas tasas de vacunación [1, 2]. En la era previa a la vacunación, las paperas eran una enfermedad infantil de rutina, con más de 150.000 casos reportados en los EE. UU. Anualmente [1]. Después de la introducción de la vacuna contra las paperas en 1967, la incidencia de las paperas se redujo en más del 99% [1]. El recuento de casos volvió a aumentar brevemente a mediados de la década de 1980 y luego continuó disminuyendo después de que un brote nacional de sarampión motivó la recomendación de 2 dosis de la vacuna contra el sarampión, las paperas y la rubéola (MMR) en 1989 [3]. A principios de la década de 2000, solo se informaban unos pocos cientos de casos de paperas anualmente en los EE. UU. [1], lo que atestigua el éxito de la vacunación, posiblemente combinado con una sospecha clínica decreciente. Esta incidencia aparentemente baja a nivel nacional fue interrumpida por un brote de & gt5,000 casos en el medio oeste de los EE. UU. En 2006 [4], seguido de un período de baja incidencia con brotes menores hasta 2016. Este reciente resurgimiento de las paperas se explica parcialmente por la disminución de la vacuna. inmunidad inducida [5], pero aún no está claro en qué medida han contribuido los cambios genéticos en los virus circulantes.

En Massachusetts, se notificaron más de 250 casos en 2016 y más de 170 en 2017, lo que supera con creces la incidencia estatal habitual de & lt10 casos por año [6]. Como se ha visto en otros brotes recientes, la mayoría de los casos se asociaron con instituciones académicas [4] y otros entornos de contacto estrecho, incluidas las cárceles [7] y comunidades étnicas y religiosas muy unidas [8,9]. Las paperas fueron reportadas al Departamento de Salud Pública de Massachusetts (MDPH) por 18 facultades y universidades en el estado, incluida la Universidad de Harvard (Harvard), la Universidad de Massachusetts Amherst (UMass) y la Universidad de Boston (BU), las 3 instituciones con las mayores número de casos notificados. De los individuos infectados, el 65% tenía las 2 dosis recomendadas de la vacuna MMR (Tabla S1).

Utilizamos la secuenciación del genoma completo, el análisis filogenético y la reconstrucción de la transmisión para investigar la propagación de las paperas en múltiples escalas geográficas, incluso dentro de un campus universitario, más ampliamente en Massachusetts y en los EE. UU. Los datos de la secuencia de patógenos se han convertido en una herramienta importante para comprender la propagación de enfermedades infecciosas casi en tiempo real, lo que permite a los investigadores identificar el origen de los brotes [10,11], resolver patrones de transmisión [12] y detectar cambios en todo el genoma que podrían afectar la gravedad de la enfermedad. o la eficacia de las vacunas y los diagnósticos [13-16]. Se ha demostrado que estos datos son más útiles cuando se analizan junto con los datos epidemiológicos [12, 17, 18], aunque el campo todavía está explorando en detalle cómo la genómica puede contribuir a comprender y controlar los brotes [19]. Los brotes de paperas en 2016 y 2017 en los EE. UU., En particular en las universidades, brindaron la oportunidad de aplicar estas ideas al virus de las paperas y de promover esta exploración en el contexto de un campus universitario en gran parte autónomo y monitoreado de cerca.


Diseño de cebadores de PCR para clonación - (12 / Abr / 2013)

Hola,
Necesito ayuda urgentemente con una pregunta para una tarea que me ha dejado perplejo durante 2 días.

Se supone que debo clonar y expresar un gen que codifica una proteína / enzima conocida como CobT producida por la bacteria Mycobacterium avium paratuberculosis. Ahora necesito diseñar una cartilla que me ayude a amplificar, clonar y expresar la proteína. El problema es que estoy totalmente confundido sobre cómo hacer esto.

¿Cómo se diseña una cartilla? Sé que esta es una pregunta súper básica, pero la multitud de tutoriales que he visto me confunden.
Intenté usar la herramienta de explosión de cebadores ncbi, pero parecía que todos los cebadores que me dio estaban dentro de mi secuencia objetivo, lo que no tiene sentido. ¿Cómo se usa la herramienta ncbi para seleccionar imprimaciones?

¿Existe alguna diferencia entre un cebador para clonación y uno para PCR?

Cualquier ayuda sería apreciada.

La secuencia de nucleótidos de CobT se adjunta a continuación, la secuencia objetivo está resaltada en azul.

Está bien, ya que desea la secuencia de codificación completa del gen; no tiene opción sobre dónde colocar los cebadores, por lo que el cebador BLAST no estaba funcionando para usted. Debe utilizar los primeros 20-25 pb del gen y el complemento inverso de los últimos 20-25 pb del gen, incluidos los codones de inicio y finalización, respectivamente. Intente igualar el contenido de GC y la longitud para obtener temperaturas de hibridación similares para las imprimaciones, pero no es esencial.

Si necesita agregar sitios de restricción o cualquier otra cosa a los cebadores, estos siempre van en el extremo 5 & # 39 del cebador. Si está haciendo esto, también necesita agregar algunos (generalmente 6) pb al final 5 & # 39 antes del sitio de restricción para que el RE tenga un lugar para unirse.

Esencialmente, no hay diferencia entre los cebadores para la clonación y los cebadores para la PCR ordinaria, aparte de que los cebadores de clonación suelen tener colas agregadas que contienen sitios de restricción o etiquetas (para la proteína, por ejemplo, etiqueta de bandera) agregadas. Estos no son esenciales si está realizando una clonación TA o una clonación de extremos romos.

bob1 el sábado 13 de abril 00:08:45 2013 dijo:

De acuerdo, ya que desea la secuencia de codificación completa del gen, no tiene opción sobre dónde colocar los cebadores, por lo que el cebador BLAST no le funcionó. Debe utilizar los primeros 20-25 pb del gen y el complemento inverso de los últimos 20-25 pb del gen, incluidos los codones de inicio y finalización, respectivamente. Intente igualar el contenido de GC y la longitud para obtener temperaturas de hibridación similares para las imprimaciones, pero no es esencial.

Si necesita agregar sitios de restricción o cualquier otra cosa a los cebadores, estos siempre van en el extremo 5 & # 39 del cebador. Si está haciendo esto, también necesita agregar algunos (generalmente 6) pb al final 5 & # 39 antes del sitio de restricción para que el RE tenga un lugar para unirse.

Esencialmente, no hay diferencia entre los cebadores para la clonación y los cebadores para la PCR ordinaria, aparte de que los cebadores de clonación suelen tener colas agregadas que contienen sitios de restricción o etiquetas (para la proteína, por ejemplo, etiqueta de bandera) agregadas. Estos no son esenciales si está realizando una clonación TA o una clonación de extremos romos.

Gracias por la gran respuesta. Tengo algunas preguntas más, así que estoy seguro de que entendí lo que escribiste. Corrígeme si me equivoco.

Digamos que esta era una secuencia de ADN y quería amplificar la región subrayada y en negrita:
GAT CAT AAA ACA TGC TTG TAT AAA GGA TGC TGC CAT GTT CCG TGA ACT GGA AGC GAA CAA TCT TGC GGT
ATA TCA GAA AAA GCC AAA GCT GAT TGC AGT GCT TCT TCA GCG TAA TGC TCA
GTT AAA AGC GAA GGT TGT

1. Mi primer avance sería: 5 & ​​# 39 (GCATGC GGATCC ATG) TTG TAT AAA GGA TGC TGC CAT GTT 3 & # 39
donde las bases azules son las bases adicionales para permitir que la enzima de restricción se una, las rojas son el sitio de restricción y la naranja es el codón de inicio.

2. El cebador inverso sería: 5 & ​​# 39 (CTAAGT CCATGG CTA) TGA GCA TAA CGC TGA AGA AGC ACT 3 & # 39
donde el amarillo son las bases extra, el verde es el sitio de restricción y las bases violetas son el codón de terminación.


-Entonces, ¿cuándo usaría el chorro de imprimación o cualquiera de esas herramientas de diseño de imprimaciones?

-Durante un tutorial se nos dio una secuencia grande y se nos dijo que seleccionáramos cebadores para amplificar una región determinada dentro de la secuencia. Ahora nos dijeron que podíamos elegir cebadores de cualquier lugar de la gran secuencia siempre que flanquearan nuestra región de interés. ¿Es esta otra forma de elegir cebadores? ¿No le llevaría eso a amplificar más bases de las necesarias, de modo que cuando clonara el producto de PCR en un vector y tratara de expresarlo, podría obtener otro producto de proteína mezclándose con la proteína a la que estaba apuntando o tal vez incluso con un producto de proteína diferente? ?
También he visto un tutorial donde los cebadores son las bases justo antes de la región de interés, es decir, el azul es la secuencia de intereses, el rojo es el cebador.
3 & # 39 GAT CAT AAA ACA TGC (TTG TAT AAA GGA TGC TGC CAT GTT CCG TGA ACT GGA AGC GAA CAA TCT) 5 & # 39
5 & ​​# 39 CTA GTA TTT TGT ACG

-¿Hay alguna razón para colocar cebadores en diferentes lugares aunque parezca contraproducente?

Los imprimadores me quedan bien. Algunas personas abogan por colocar de 3 a 6 pb entre el sitio de restricción y el codón de inicio / parada, pero no debería ser necesario.

taiju el sábado 13 de abril 01:58:12 2013 dijo:

-Entonces, ¿cuándo usaría el chorro de imprimación o cualquiera de esas herramientas de diseño de imprimaciones?

-Durante un tutorial se nos dio una secuencia grande y se nos dijo que seleccionáramos cebadores para amplificar una región determinada dentro de la secuencia. Ahora nos dijeron que podíamos elegir cebadores de cualquier lugar de la gran secuencia siempre que flanquearan nuestra región de interés. ¿Es esta otra forma de elegir cebadores? ¿No le llevaría eso a amplificar más bases de las necesarias, de modo que cuando clonara el producto de PCR en un vector y tratara de expresarlo, podría obtener otro producto de proteína mezclándose con la proteína a la que estaba apuntando o tal vez incluso con un producto de proteína diferente? ?
También he visto un tutorial donde los cebadores son las bases justo antes de la región de interés, es decir, el azul es la secuencia de intereses, el rojo es el cebador.
3 & # 39 GAT CAT AAA ACA TGC (TTG TAT AAA GGA TGC TGC CAT GTT CCG TGA ACT GGA AGC GAA CAA TCT) 5 & # 39
5 & ​​# 39 CTA GTA TTT TGT ACG

-¿Hay alguna razón para colocar cebadores en diferentes lugares aunque parezca contraproducente?

comentarios menores sobre los cebadores propuestos:

el tercer triplete de las bases agregadas de la cartilla inversa: escribiste "taa", creo que quisiste decir "tta"

Si termina ambos imprimadores con una "t", es una buena práctica terminar con una "g" o una "c" para sujetar el imprimador.

mdfenko el lunes 15 de abril 13:24:21 2013 dijo:

comentarios menores sobre los cebadores propuestos:

el tercer triplete de las bases agregadas de la cartilla inversa: escribiste "taa", creo que quisiste decir "tta"

Si termina ambos imprimadores con una "t", es una buena práctica terminar con una "g" o una "c" para sujetar el imprimador.

Gracias, no lo había visto.

Acerca de terminar los cebadores con una "G" o "C". las cartillas que hice son básicamente complementos de mis plantillas, para hacer que terminen con "G" o "C", ¿la idea es simplemente acortar mi cartilla hasta obtener un final "C"? es decir, para el cebador directo:

DE:
5 & ​​# 39 (GCATGC GGATCC ATG) TTG TAT AAA GGA TGC TGC CAT GTT 3 & # 39

PARA:
5 & ​​# 39 (GCATGC GGATCC ATG) TTG TAT AAA GGA TGC TGC 3 & # 39

La longitud de imprimación recomendada de 18-30 pb debe incluir todas estas otras bases, ¿verdad? Entonces, ¿su (secuencia de cebador real + bases de unión adicionales + sitio de restricción y codones de inicio y parada) deberían sumar un máximo de 30?

Si su secuencia comienza en ATG, entonces no es realmente necesario agregar un codón de inicio, ¿verdad?

¿Cómo usaría una herramienta de diseño de imprimaciones de tal manera que colocara sus imprimaciones donde las necesita?, como en mi caso, necesito cebadores al comienzo de mi secuencia de codificación para la proteína CobT ya que quiero poder expresar CobT.

De acuerdo, utilicé esta información para hacer cartillas para mi proyecto real.
La cartilla correcta está bien.
La izquierda me está dando problemas con respecto al contenido de GC, está en 68-70%. ¿Hay alguna manera de reducir esto que no sea intentar cambiar los cebadores que uso? Mi secuencia final está bastante llena de bases G y C. Estos son los últimos 36 pb de mi secuencia de proteínas:
CAG GCC GGT GTG TCC GAC CCG TCC GCT CAC CCG TGA

taiju el lunes 15 de abril 14:52:43 2013 dijo:

Acerca de terminar los cebadores con una "G" o "C". las cartillas que hice son básicamente complementos de mis plantillas, para hacer que terminen con "G" o "C", ¿la idea es simplemente acortar mi cartilla hasta obtener un final "C"? es decir, para el cebador directo:

DE:
5 & ​​# 39 (GCATGC GGATCC ATG) TTG TAT AAA GGA TGC TGC CAT GTT 3 & # 39

PARA:
5 & ​​# 39 (GCATGC GGATCC ATG) TTG TAT AAA GGA TGC TGC 3 & # 39

La longitud de imprimación recomendada de 18-30 pb debe incluir todas estas otras bases, ¿verdad? Entonces, ¿su (secuencia de cebador real + bases de unión adicionales + sitio de restricción y codones de inicio y parada) deberían sumar un máximo de 30?

puede aumentar y disminuir. Además, no tiene que hacer el cambio con tríadas, puede cambiar una base a la vez, por lo que podría simplemente quitar la "tt" para llegar a la "g" o podría haber agregado una "c" (o " cc ") hasta el final para configurar la abrazadera.

recuerde, se está extendiendo desde el final de la cartilla para que no tenga que hacer cambios de tres en tres para mantener la secuencia de codificación.

la longitud necesaria del cebador toma en consideración solo la secuencia real del cebador. el resto no se recuece.

mdfenko el lunes 15 de abril 16:27:16 2013 dijo:

taiju el lunes 15 de abril 14:52:43 2013 dijo:

About ending the primers with a "G" or "C". the primers I made are basically just complements of my templates, to make them end with "G" or "C" is the idea to just shorten my primer until I get a "C" end? i.e for the forward primer:

FROM:
5' ( GCATGC GGATCC ATG) TTG TAT AAA GGA TGC TGC CAT GTT 3'

TO:
5' ( GCATGC GGATCC ATG) TTG TAT AAA GGA TGC TGC 3'

The recommended primer length of 18-30bp should include all these other bases right? So your (actual primer sequence+additional binding bases+restriction site and start and stop codons) should all add up to a maximum of 30?

you can increase as well as decrease. also, you don't have to make the change with triads, you can change one base at a time so you could just remove the "tt" to get to the "g" or you could have added a "c" (or "cc") to the end to set up the clamp.

remember, you are extending from the end of the primer so you don't have to make changes in threes to maintain the coding sequence.

the necessary primer length takes into consideration only the actual primer sequence. the rest doesn't anneal.

You just answered a question I was about to ask, thank you as I was wondering about what happens to the rest of the bases you add but if they don't anneal how do you get an amplicon that has the restriction site and the start/stop codons, like if only the actual primer sequence anneals and is replicated and the additional bases are just kind of hanging how do they get into the subsequently produced PCR products.. I hope my question makes sense.

The primer ends get copied by the subsequent cycles of PCR, its just the initial cycles where there are "free" ends.


Additional file 1: Figure S1.

Arabidopsis and human assembly dotplots. Figure S2. M82 RaGOO confidence score distribution. Figure S3. Heinz cDNA alignment. Figure S4. Annotation Edit Distances. Figure S5. S. pennellii dotplots. Figure S6. S. pennellii confidence score distributions. Figure S7. A. thaliana pan-genome SV distribution. Table S1. Sequence statistics for simulated tomato genomes. Table S3. Performance statistics for Tomato chromosome construction.


Ver el vídeo: Η μεγαλύτερη σημαία της Ελλάδας υψώθηκε στην Αλεξανδρούπολη! (Enero 2022).