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¿Por qué volver a etiquetar los extremos de la hebra en el etiquetado de ADN 3 '?

¿Por qué volver a etiquetar los extremos de la hebra en el etiquetado de ADN 3 '?



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Tengo un problema con una cuestión de biología molecular; No entiendo cómo funciona el etiquetado de ADN 3 '. Tomé un diagrama de mi lección y traté de entender con él; esto es lo que entendí. Si me equivoco, por favor dímelo y corrígeme.

  • Tomamos una enzima de restricción que cortará ambas hebras. La hebra inferior será un extremo de 5 '. Entonces, la hebra superior es más corta que la inferior.

  • Agregaremos un fragmento de Klenow que, con su actividad polimerasa, polimeriza en la dirección 5 '-> 3' la parte faltante de la hebra superior, con dNTP α 32P (marcado por un fosfato radiactivo en la posición alfa).

  • Obtenemos dos hebras que tienen el mismo tamaño, de las cuales una estará fuertemente etiquetada.

  • Terminamos con una transferasa terminal que catalizará la adición de dNTP α 32P en los extremos 3'OH de ambas cadenas de ADN (para etiquetar estos extremos).

Pero, si estoy en lo cierto, ¿podría explicar la necesidad del último paso? ¿Por qué etiquetar ambos extremos si ya hemos etiquetado la hebra superior?


Hay muchas formas de etiquetar los ácidos nucleicos para las sondas (Resumen de métodos).

Si bien hay casos en los que el relleno mediado por fragmentos de Klenow debería etiquetar suficientemente ambas hebras de su sonda, hay muchos otros en los que esto no sería suficiente. Aquí hay dos ejemplos ilustrativos, aunque algo artificiales:

Ejemplo 1: digestión doble con voladizos de 5 'y 3'
Imagina que hiciste un doble resumen con BamHola y KpnYo para liberar su secuencia de sonda del plásmido en el que propaga la secuencia. BamHI le dará un voladizo de 5 ', pero KpnDoy un voladizo de 3 '.

Resultante BamHOLA & KpnDoy doble digestión del fragmento: 5'- GATCCNNNNNNNG - 3 '||||||||| 3'- GNNNNNNNCCATG - 5 '

Tratamiento posterior con el fragmento de Klenow + $ alpha $ P32-dATP + dNTP fríos rellenarán el saliente 5 '(actividad polimerasa 5' -> 3 'de Klenow) y eliminarán el saliente 3' (actividad exonucleasa 3 '-> 5' de Klenow).

Reacción post-Klenow (negrita = nuevas bases, * = nucleótido radiomarcado): 5'- GATCCNNNNNNNG - 3 '|||||||||||||| 3'- CTAGGNNNNNNNC - 5 '*

En este punto, solo una hebra está radiomarcada, por lo que se necesita el paso de transferasa terminal para agregar una etiqueta a la hebra superior.

Cuando se usa $ alpha $ P32-dNTPs, a menudo se elige solo una base para que sea radiactiva (por ejemplo, dATP como se indicó anteriormente). A veces, también aumenta la reacción con dNTP radiactivo dejando una población de dNTP fríos para que se utilice la mayor parte del tiempo. En cualquier caso, ahora tiene la posibilidad de no incorporar solo bases no radiactivas.

Ejemplo 2: reacción de relleno que no incorpora $ alpha $ P32-dATP:

Imagina un resumen con PspYo y quiero completar los voladizos de 5 'usando $ alpha $ P32-dATP + dNTP fríos. PspReconozco secuencias CCWGG donde W es A o T para que algunos rellenos incorporen $ alpha $ P32-dATP, pero otros no lo harán.

Posibles resúmenes y reacciones de relleno: 5'- CCTGGNNNNNNNNNNCCTGG - 3 '|||||||||||||||||||| 3'- GGACCNNNNNNNNNNGGACC - 5 '| Digerir con PspYo | V 5'- CCTGGNNNNNNNNNN - 3 '|||||||||| 3'- NNNNNNNNNNGGACC - 5 '| Rellenar con Klenow + dATP caliente + dNTP fríos | V 5'- CCTGGNNNNNNNNNNCCTGG - 3' |||||||||||||||||||| 3'- GGACCNNNNNNNNNNGGACC - 5 '*

Una vez más, se queda con solo una hebra etiquetada (o sin etiqueta de hebra si la secuencia era 5'-CCAGGNNNNNCCTGG - 3 ') y la necesidad del paso de transferasa terminal.


¿Por qué hay una hebra adelantada y retrasada durante la replicación del ADN?

El ADN de doble hebra primero se descomprime mediante una enzima llamada helicasa. La helicasa separa las dos hebras de ADN y crea la bifurcación de replicación. Esencialmente se crean dos cadenas de ADN monocatenarias, ambas en direcciones diferentes. En la cadena principal, se crea un cebador de ARN mediante la ARN ploimerasa y la ADN polimerasa III construirá continuamente esa cadena, ya que está construyendo la cadena de ADN en la misma dirección en que la helicasa desabrocha el ADN. En la hebra rezagada, la ADN plimerasa se mueve en la dirección opuesta a la helicasa, por lo que solo puede copiar una pequeña porción de ADN a la vez. Debido a las diferentes direcciones en que se mueven las dos enzimas en la hebra rezagada, la cadena de ADN solo se sintetiza en pequeños fragmentos. De ahí que se le llame la hebra rezagada.


Pregunta : 3. Dada la siguiente pieza de ADN, dibuja la hebra complementaria. Etiquete los extremos 5 & # x27 y 3 & quot. 5 & ​​# x27- ATG CTACCCTGCATG CATTCCC-3 & # x27 4. Escribe cada una de las hebras simples de la secuencia de ADN que tienes arriba. En cada hebra, dibuje un cebador de ARN de 5 nucleótidos en el lugar adecuado. Etiquete los extremos 5 & # x27 y 3 & # x27 TA TA 7 5] entre ambas moléculas de ADN bicatenario después

No estoy seguro de cómo hacer el número 5


ADN: mapeo de restricción y secuenciación de nucleótidos

Lea este artículo para obtener más información sobre el mapeo de restricción del ADN que implica el análisis de tamaño de los fragmentos de restricción y también para aprender sobre la secuenciación de nucleótidos del ADN para lo cual se han desarrollado dos técnicas:

(1) basado en el método enzimático llamado secuenciación de Sanger y (2) basado en el método químico llamado secuenciación de Maxam y Gilbert.

Mapeo de restricción de fragmentos de ADN:

Esto implica el análisis de tamaño de los fragmentos de restricción producidos por varias enzimas de restricción individualmente y en combinación. Por ejemplo, en la Fig. 3.2 se mapean los sitios de restricción de dos enzimas A y B. La escisión con A da fragmentos de 2 y 7 kilo bases de una molécula de 9 kb, por lo que podemos tener la posición de un solo sitio A desde un extremo.

De manera similar, B da fragmentos a 3 kb y 6 kb de distancia, por lo que tiene un solo sitio a 3 kb de un extremo, pero aún no está claro si este sitio está cerca del sitio A & # 8217s o está en el extremo opuesto del ADN. Esto se puede resolver mediante doble digestión. Si los fragmentos resultantes están a 2 kb, 3 kb y 4 kb de distancia, entonces A y B cortan en los extremos opuestos de la molécula si están a 1 kb, 2 kb y 6 kb de distancia, los sitios están cerca uno del otro. Vale la pena señalar aquí que el mapeo de moléculas reales rara vez es tan simple como esto.

Secuenciación de nucleótidos del ADN:

El uso preciso de codones, la información sobre mutaciones y polimorfismos y la identificación de secuencias de control de regulación de genes solo se pueden dilucidar analizando las secuencias de ADN. Se han desarrollado dos técnicas para esto, una basada en un método enzimático frecuentemente llamado secuenciación de Sanger y un método químico llamado secuenciación de Maxam y Gilbert.

Terminadores de cadena de secuenciación o didesoxinucleótido Sanger & # 8217s:

En este, la mezcla de reacción se divide en cuatro grupos, que representan los cuatro dNTP A, C, G y T. Además de todos los dNTP presentes en el tubo A, se añade un análogo de dATP (2 & # 8242, 3 & # 8242 ddATP ) que es similar a A pero no tiene grupo hidroxilo 3 & # 8242 y por lo tanto terminará la cadena en crecimiento. La situación para otros tubos ddC, ddG y ddT es idéntica excepto que contienen ddCTP, ddGTP y ddTTp respectivamente.

Dado que la incorporación de ddNTP en lugar de dNTP es un evento aleatorio, la reacción producirá una nueva molécula de longitud muy variable, pero todas terminando en el mismo tipo de base. Por tanto, se generan cuatro conjuntos de secuencias de ADN, cada una terminando en un tipo diferente de base, pero todas tienen un extremo 5 & # 8242- común. Las cuatro muestras etiquetadas y terminadas en cadena se desnaturalizan luego por calentamiento y se cargan una al lado de la otra para la electroforesis.

La electroforesis se realiza a 70 ° C en presencia de urea, para evitar la renaturalización del ADN. Se utilizan geles muy delgados y largos para una resolución máxima en una amplia gama de longitudes de fragmentos. Después de la electroforesis, la posición de las bandas de ADN radiactivo en el gel se determina mediante autorradiografía.

Dado que cada banda en la pista de trifosfato de didesoxiadenosina debe contener moléculas que terminan en adenina, y las de ddCTP terminan en citosina, etc., es posible leer la secuencia de la hebra recién sintetizada de la autorradiografía, siempre que el gel pueda resolver las diferencias. de longitud igual a un solo nucleótido. En condiciones ideales, se pueden leer secuencias de hasta aproximadamente 400 bases de longitud de un gel.

Secuenciación de PCR directa:

Es posible llevar a cabo la secuenciación de nucleótidos a partir de moléculas de doble hebra, como los vectores de clonación de plásmidos y los productos de PCR, pero el ADN de doble hebra debe desnaturalizarse antes de la hibridación con el cebador. En el caso de plásmidos, es suficiente una etapa de desnaturalización alcalina. Sin embargo, para los productos de PCR esto es más problemático y un foco de mucha investigación. A diferencia de los plásmidos, los productos de PCR son cortos y se reasocian rápidamente, por lo que evitar el proceso de reasociación o desviar la amplificación hacia una hebra mediante el uso de una relación de cebador de 100: 1 puede superar este problema hasta cierto punto.

Los desnaturalizantes como la amida de forma o el dimetilsulfóxido (DMSO) se emplean generalmente para prevenir la renaturalización de las cadenas de PCR después de su separación, es posible separar físicamente y retener una cadena de PCR incorporando una molécula como biotina en uno de los cebadores, que puede recuperarse. después de la PCR mediante cromatografía de afinidad con estreptavidina, dejando la cadena de PCR complementaria. Por lo tanto, proporcionó ADN monocatenario de alta calidad para la secuenciación.

Uno de los métodos más útiles para secuenciar productos de PCR se denomina secuenciación del ciclo de PCR. Esto no es estrictamente una PCR, ya que implica una amplificación lineal con un solo cebador en aproximadamente 20 ciclos de PCR. A continuación, se introducen didesoxinucleótidos marcados radiactivamente o con fluorescencia en las etapas finales de la reacción para generar productos de extensión de terminación de cadena. La secuenciación de PCR directa automatizada se está refinando cada vez más, lo que permite analizar mayores longitudes de ADN en una secuencia de secuenciación.

Secuenciación de ADN fluorescente automatizada:

Se trata de didesoxinucleótidos marcados con diferentes flurocromos y se utilizan para llevar a cabo la terminación de la cadena como en las reacciones estándar. La ventaja de esta modificación es que, dado que se incorporan diferentes marcadores en cada ddNTP, todos los productos se procesan en el mismo gel de electroforesis desnaturalizante.

Cada producto con su tinte específico de base es excitado por un láser y luego el tinte emite luz en su longitud de onda característica. Una rejilla de difracción separa las emisiones, que son detectadas por un dispositivo de par de carga (CCD) y la secuencia es interpretada por computadora. Además de la secuenciación en tiempo real, la longitud de la secuencia que puede analizarse supera los 500 pb.

Secuenciación de Maxam y Gilbert:

Este es un método químico de secuenciación desarrollado por Maxam y Gilbert y el método se usa a menudo para secuenciar pequeños fragmentos de ADN como oligonucleótidos. Se añade un marcador radiactivo al extremo 3 & # 8242 o al extremo 5 & # 8242 de una preparación de ADN bicatenario. A continuación, las hebras se separan mediante electroforesis en condiciones de desnaturalización y se analizan por separado.

El ADN marcado en un extremo se divide en cuatro alícuotas, cada una de las cuales se trata con sustancias químicas que actúan sobre bases específicas mediante metilación o eliminación de bases. Las condiciones se eligen de modo que cada molécula se modifique en una sola posición a lo largo de su longitud y cada base en la cadena de ADN tenga las mismas posibilidades de ser modificada.

Después de las reacciones de modificación, las muestras separadas se escinden con piperidina, que rompe los enlaces fosfodiéster exclusivamente en el lado 5 & # 8242 de los nucleótidos cuya base se ha modificado. El resultado es similar al producido por el método Sanger, ya que cada muestra ahora contiene moléculas marcadas radiactivamente de varias longitudes, todas con un extremo común (el extremo marcado) y con el otro extremo cortado en el mismo tipo de base. El análisis de los productos de reacción por electroforesis es como ya se describió para el método Sanger.


Etiquetado de ADN

Los ácidos nucleicos se etiquetan fácilmente con etiquetas que facilitan la detección o purificación. Se encuentran disponibles una variedad de métodos enzimáticos o químicos para generar ácidos nucleicos marcados con fosfatos radiactivos, fluoróforos o nucleótidos modificados con biotina o digoxigenina, por ejemplo.

Los ácidos nucleicos pueden marcarse en su extremo 5 y agudo, en su extremo 3 y agudo o en toda la molécula, según la aplicación. Para las reacciones de hibridación (Southern o Northern Blot) suele ser ventajoso generar sondas de alta actividad específica con marcaje distribuido por todo el ácido nucleico, mediante técnicas como traducción de mellas, cebado aleatorio, por PCR o in vitro transcripción utilizando dNTP o NTP etiquetados. Para aplicaciones que involucran interacciones de proteínas, como ensayos de cambio de gel o pull-downs, generalmente es beneficioso generar sondas marcadas en los extremos para evitar la interferencia estérica de la interacción. Esto se puede lograr con protocolos de etiquetado final o con PCR utilizando cebadores que lleven la modificación requerida.

New England Biolabs ofrece una serie de reactivos y kits adecuados para marcar ADN y ARN monocatenario o bicatenario en los extremos de la molécula o al azar en todo el ácido nucleico.

Elija el tipo:

Este producto está protegido por una o más patentes, marcas comerciales y / o derechos de autor propiedad o controlados por New England Biolabs, Inc (NEB).

Si bien NEB desarrolla y valida sus productos para diversas aplicaciones, el uso de este producto puede requerir que el comprador obtenga derechos de propiedad intelectual adicionales de terceros para ciertas aplicaciones.

Para obtener más información sobre los derechos comerciales, comuníquese con el equipo de Desarrollo comercial global de NEB en [email protected]

Este producto está destinado únicamente a fines de investigación. Este producto no está destinado a ser utilizado con fines terapéuticos o de diagnóstico en humanos o animales.


Marcado transcripcional de sondas de ARN

Para algunas aplicaciones, el ARN marcado con DIG es una sonda de hibridación más eficaz que el ADN marcado con DIG. Por ejemplo, las sondas de ARN marcadas con DIG pueden detectar ARNm raros en cantidades de nanogramos de ARN total. Estas sondas de ARN marcadas son generadas por in vitro transcripción de una plantilla de ADN. En el método de transcripción de ARN, el ADN se clona en el sitio de clonación múltiple de un vector de transcripción entre promotores de diferentes ARN polimerasas (como la ARN polimerasa de T7, SP6 o T3). A continuación, la plantilla se linealiza mediante escisión del vector en un sitio único (cerca del inserto). Una ARN polimerasa transcribe el ADN insertado en una copia de ARN antisentido en presencia de una mezcla de ribonucleótidos (incluido DIG-UTP). Durante la reacción, el ADN se puede transcribir muchas veces (hasta cien veces) para generar una gran cantidad de copias de ARN marcadas con DIG de longitud completa (10-20 μg de ARN a partir de 1 μg de ADN en una reacción estándar). La DIG se incorpora al ARN aproximadamente cada 25-30 nucleótidos.

Principio de reacción

La plantilla de ADN que se va a transcribir se clona en el sitio policonector de un vector de transcripción apropiado, que contiene promotores para las ARN polimerasas SP6 y / o T3 y T7. Después de la linealización en un sitio adecuado, el ARN se transcribe en presencia de DIG-11-UTP. En condiciones estándar, se transcriben aproximadamente 10 μg de ARN marcado con DIG de longitud completa a partir de 1 μg de plantilla.

Los siguientes consejos son fundamentales para el éxito del etiquetado de la sonda de ARN:

RNasas

Las RNasas son ubicuas y no requieren ningún cofactor para su actividad. Si quiere tener éxito, tome todas las precauciones posibles para evitar la contaminación por ARNasa. Por ejemplo:

  • Se recomienda utilizar recipientes de plástico desechables, recipientes de vidrio horneados al horno o recipientes de plástico descontaminados con RNase ZAP o reactivos similares.
  • Prepare todas las soluciones con agua que haya sido tratada con dietil-pirocarbonato (DEPC) o dimetildicarbonato (DMDC) y esterilice las soluciones en autoclave.
  • Use guantes durante todo el procedimiento.
  • La eficacia del etiquetado depende en gran medida de la pureza de la plantilla de ADN. La plantilla debe estar muy purificada.
  • La plantilla final debe linealizarse, extraerse con fenol / cloroformo y precipitarse con etanol.

Secuencia de plantilla

  • Algunas regiones de cebadores y / o polienlazadores en moldes de ADN son homólogas a porciones de las secuencias de ARN ribosómico 28s y 18s. Por lo tanto, las sondas marcadas pueden generar señales específicas, pero no deseadas, en muestras que contienen estos ARN prominentes. Para minimizar este efecto, elimine la mayor cantidad posible de secuencias de polienlazadores de su plantilla.
  • Si usa PCR para hacer la plantilla de ADN, el producto de la reacción Expandir alta fidelidad contiene algunos fragmentos con un solo saliente 3´ A. Este saliente puede producir productos envolventes en la reacción de marcado transcripcional.

Longitud de la plantilla

  • La longitud óptima de la plantilla es de aproximadamente 1 kb
  • La longitud mínima debe ser de al menos 200 pb

Almacenamiento de sonda

  • Para una estabilidad a largo plazo, las sondas de ARN deben dividirse en alícuotas y almacenarse a -20 ° C o -70 ° C
  • Las sondas de ARN marcadas con DIG son estables durante al menos 1 año a -20 ° C o -70 ° C en etanol

Sensibilidad de la sonda

  • Para determinar rápidamente la sensibilidad de una sonda de ARN antisentido marcada con DIG, prepare el ARN sentido correspondiente (sin etiquetar) mediante in vitro transcripción. Luego use la transcripción de sentido purificada en concentraciones variables como diana en una transferencia Northern. A partir del resultado de la transferencia, puede determinar fácilmente la cantidad más baja de objetivo (transcripción con sentido) que puede detectarse mediante una sonda marcada (transcripción antisentido).

¿Cómo se produce la hibridación de la sonda?

Tradicionalmente, el método se conoce como transferencia Southern (para hibridación de ADN) o transferencia Northern (para hibridación de ARN).

En el primer paso, la secuencia de ADN de nuestro interés se digiere con la endonucleasa de restricción y se deja inmovilizar sobre el papel de nitrocelulosa.

Primero se selecciona, marca y desnaturaliza una sonda complementaria.

Luego, en el siguiente paso, la mezcla de la sonda permite la unión sobre el papel de nitrocelulosa, si encuentra la secuencia complementaria exacta, se unirá.

Las sondas no unidas se eliminan lavando el papel de nitrocelulosa con el tampón de lavado.

Los resultados finales se recogen mediante el método de autorradiografía.

En la versión moderna de esta técnica, llamada microarreglo, las sondas se hibridan en lugar de la muestra de ADN.

Se permite que la muestra se hibride en la superficie que contiene millones de sonda, por lo que el microarray permite seleccionar muchas mutaciones o alteraciones a la vez.


ADN y ARN (con diagrama)

Watson y Crick (1953) han propuesto un modelo para la estructura de la molécula de ADN que ahora es aceptado por todos. De acuerdo con este modelo llamado Watson Crick Model, la molécula de ADN es una estructura doble he & shylix que consta de dos largas cadenas de polinucleótidos enrolladas una alrededor de la otra alrededor de un eje imaginario y que corren opuestas entre sí. (Figura 9.14).

Cada cadena de polinucleótidos consta de miles de unidades de nucleótidos.

La columna vertebral de las dos hélices de la cadena de polinucleótidos consta de fosfatos de desoxirribosa, mientras que las bases están presentes en los lados internos.

Las bases de una cadena polinucleotídica son complementarias a las bases de la otra cadena polinucleotídica y están unidas por enlaces de hidrógeno (fig. 9.16).

El emparejamiento de bases es muy específico (Fig 9.15), Las bases complementarias son: -

La proporción de bases de purina y pirimidina es 1: 1.

La distancia entre dos pares de bases subsiguientes en la cadena de polinucleótidos es 3,4 Å.

Cada vuelta de las dos cadenas de polinucleótidos se completa después de 10 pares de bases, es decir, una distancia de 34 Å.

La distancia entre el eje y la región de fosfato de azúcar es de aproximadamente 10 Å. El arrollamiento helicoidal es para diestros.

(1. Las moléculas de D.N.A. son gigantes. Sus pesos moleculares están en la región de varios millones. 2. En algunos bacteriófagos, es decir, los virus que atacan a las bacterias, el ADN es monocatenario).

Hay diferentes formas de ADN en los organismos vivos, a saber, A, B, C, y rara vez D y E. En todas estas formas, el enrollamiento helicoidal de la molécula de ADN es hacia la derecha. Estas formas difieren en el número de pares de bases (pb) por vuelta, el diámetro de la hélice y otros detalles menores similares. La forma más común y habitual de ADN que se encuentra en los organismos vivos es la forma B, que se denomina B-ADN. El relato anterior de la estructura del ADN, de hecho, pertenece al B-ADN.

Recientemente, se ha sintetizado artificialmente otra forma de ADN en la que el enrollamiento helicoidal del ADN es a la izquierda y la cadena principal de fosfato de los polinucleótidos sigue un curso en zig-zag. Por lo tanto, esta forma de ADN se ha denominado Z-ADN. Algunas de las otras características importantes y tímidas de Z-DNA one: 1. Cada vuelta de las dos cadenas de polinucleótidos se completa después de 12 pares de bases, es decir, una distancia de aproximadamente 45 Å. 2. La distancia entre dos pares de bases subsiguientes es de 3,7 Å. 3.

La distancia entre el eje y el azúcar-fosfato es de 9 Å. 4. Las unidades alternativas de azúcar desoxi-ribosa en la cadena de polinucleótidos tienen orientación inversa (una de dichas unidades tiene el oxígeno etéreo y tímido mirando hacia arriba y la otra unidad posterior mirando hacia abajo).

Ácido nucleico ribosa (ARN):

El ARN es una estructura monocatenaria que consta de una sola cadena polinucleotídica. Si en algún momento las bases complementarias se acercan mucho entre sí, se establecen enlaces de hidrógeno entre ellas para dar a la cadena de polinucleótidos una apariencia helicoidal como el ADN.

El ARN consta de las siguientes bases:

La proporción de bases de purina y pirimidina no es 1: 1.

El azúcar pentosa es β-D-Ribosa.

El tamaño de la molécula de ARN es muy pequeño en comparación con la molécula de ADN. Peso molecular de ARN puede variar desde varios miles hasta algunos lakhs.

Hay 3 formas diferentes de ARN en las células vegetales:

Peso molecular de m-ARN es más alto entre los diferentes tipos de ARN que generalmente varían de 5 a 10 mil rupias. Estos constituyen el 5-10% del ARN total que tiene la célula.

El m-ARN se sintetiza en el nucleolo y, después de tomar información genética del ADN, ingresa al citoplasma y ayuda en la formación de una proteína específica. Los ARNm son de corta duración.

La secuencia de 3 bases de nucleótidos en la molécula de m-ARN constituye un codón. En realidad, la información genética obtenida del ADN está codificada en codones que son específicos (para de & shytails ver código genético).

(ii) ARN ribosómico (r-ARN):

El r-ARN se encuentra en el ribosoma que actúa como molde para la síntesis de proteínas. Es del tipo más estable y constituye aproximadamente el 80% del ARN total en la célula.

(iii) ARN de transferencia o soluble (t-ARN o s-ARN):

Las estructuras de muchas moléculas de t-RNA se conocen con bastante detalle. Estos son comparativamente muy pequeños con un peso molecular de aproximadamente 25000. La estructura básica de todos los mol y shyecules de t-ARN está en el patrón de la hoja del trébol. El modelo de hoja de trébol de t-RNA se muestra en la figura 9.17.

Los t-RNA se encuentran en el citoplasma y constan de solo unas 80 bases. Éstos constituyen el 10-15% del ARN total en la célula.

Los t-RNA contienen muchas bases y nucleótidos inusuales. Estos son, por ejemplo, pseudouridina (Ψ), dihidrouridina (DHU), inosina (I), etc. La metilación de bases también es común.

Todas las moléculas de t-RNA contienen guanina (G) en el extremo 5 & # 8242. El extremo 3 & # 8242 siempre termina en la secuencia de bases Citosina-Citosina-Adenina (CCA). Durante la síntesis de proteínas, este extremo, de hecho, recoge el aminoácido y lo transfiere a la cadena polipeptídica en crecimiento y, por lo tanto, estos ARN se denominan t-ARN o ARN de transferencia.

Estos t-RNA también se denominan s-RNA o RNA solubles porque son solubles en IM NaCl.

Las moléculas de t-ARN se pliegan en un patrón de hoja de trébol con tres o más regiones helicoidales dobles (como el ADN) que terminan en bucles.

Tres bucles importantes de t-RNA son:

(ii) Bucle de unión de amino acil sintetasa

(iii) Bucle de unión ribosomal.

El bucle Anticodon consta de 7 bases. En el extremo libre, 3 bases no apareadas constituyen el anticodón que es complementario al codón en el m-ARN. El bucle de unión de la aminoacil sintetasa consta de 8-12 bases. Debido a la presencia de dihidrouridinas en este bucle, también se lo conoce como bucle DHU.

El bucle de unión ribosomal consta de 7 bases. En contiene la secuencia de GTΨC y, por lo tanto, también se denomina bucle GTΨC.

Existen diferentes moléculas de t-RNA con anticodones específicos para captar aminoácidos específicos. Sin embargo, muchos t-RNA pueden ser específicos de un aminoácido particular o una única especie de t-RNA puede reconocer varios aminoácidos.

La molécula de t-RNA cuya estructura fue dada por primera vez en detalle por Holley es alanil-t-RNA de levadura (fig. 9.18).


Ácidos nucleicos 7.1 HL

Los conceptos básicos de la estructura del ADN y la replicación del ADN se cubrieron en el tema SL, por lo que este tema analiza algunos detalles adicionales, incluidos los extremos 3 & # 39 y 5 & # 39 de las dos hebras antiparalelas y más detalles sobre las enzimas responsables de la replicación del ADN y algunos de las regiones de ADN que no codifican proteínas pero que regulan la expresión génica, forman intrones, telómeros o genes para el ARNt. Para comprender cómo funcionan las máquinas de secuenciación modernas, también se requiere una comprensión clara de la PCR y la electroforesis en gel.

Conceptos clave

Aprenda y pruebe su vocabulario biológico para los ácidos nucleicos 7.1 usando estas tarjetas.

Conceptos básicos: revisión rápida de todo el tema

Estas diapositivas resumen la comprensión y las habilidades esenciales en este tema.
Contienen explicaciones breves en texto e imágenes, una buena revisión para todos los estudiantes.

Lea las diapositivas y busque cualquier palabra o detalle que le resulte difícil de entender.

Pregunta de estilo de examen

Cómo prepararse para responder una pregunta difícil del IB sobre la replicación del ADN.
A partir de sus notas de revisión, cree entre 8 y 10 preguntas rápidas.
Pruébate. ¿Puedes recordar las respuestas?

1. ¿Qué hace la helicasa?
2. ¿Qué proteínas mantienen separadas las hebras de ADN?
3. ¿Cuál es el papel de la enzima primasa?
4. ¿En qué se diferencia la ADN polimerasa III de la primasa?
5. ¿En qué dirección se encuentra la ADN polimerasa III a lo largo de la plantilla?
6. ¿Cuál es la hebra principal?
7. ¿Qué es la hebra rezagada?
8. ¿Por qué se producen fragmentos de okazaki en la hebra rezagada?
9. ¿Cuál es el papel de la enzima ADN polimerasa I?
10. ¿Cuál es el papel de la enzima ADN ligasa?

Separa las dos cadenas de ADN rompiendo los enlaces de hidrógeno.

2. ¿Qué proteínas mantienen separadas las hebras de ADN?

Proteínas de unión monocatenarias.

3. ¿Cuál es el papel de la enzima primasa?

Primase une un cebador de ARN a la cadena de ADN.

4. ¿En qué se diferencia la ADN polimerasa III de la primasa?

La ADN polimerasa III agrega nucleótidos de ADN, Primase agrega nucleótidos de ARN a la hebra.

5. ¿En qué dirección se encuentra la ADN polimerasa III a lo largo de la plantilla?

6. ¿Cuál es la hebra principal?

La hebra a la que la ADN polimerasa III puede agregar nucleótidos de forma continua.

7. ¿Qué es la hebra rezagada?

La hebra en la que la ADN polimerasa III solo puede funcionar en secciones cortas.

8. ¿Por qué se producen fragmentos de okazaki en la hebra rezagada?

La ADN polimerasa III no puede producir una nueva hebra de forma continua.

9. ¿Cuál es el papel de la enzima ADN polimerasa I?

La ADN polimerasa I reemplaza los nucleótidos de ARN del cebador con nucleótidos de ADN.

10. ¿Cuál es el papel de la enzima ADN ligasa?

La ADN ligasa une los fragmentos de okazaki.

Lista resumida del tema 7.3 Traducción

  • Parte del superenrollamiento del ADN son estructuras llamadas nucleosomas.
  • La estructura del ADN da una pista sobre el mecanismo de replicación del ADN.
  • Las regiones no codificantes del ADN tienen otras funciones importantes, limitadas a reguladores de la expresión génica, intrones, telómeros y genes para los ARNt.

Replicación del ADN (solo en procariotas)

  • Las enzimas ADN polimerasa solo pueden agregar nucleótidos al extremo 3 y rsquo de un cebador.
  • La replicación continua del ADN ocurre en la hebra principal y discontinua en la hebra retrasada.
  • Un grupo complejo de enzimas realiza la replicación del ADN que incluye helicasa, ADN girasa, proteínas de unión de una sola hebra, ADN primasa y ADN polimerasas I y III.
  • La replicación del ADN produce una segunda cromátida en cada cromosoma en interfase antes de la meiosis.
  • El cruce intercambia fragmentos de ADN entre cromátidas homólogas no hermanas y forma nuevas combinaciones de alelos en los cromosomas formados en la meiosis.
  • Vea que el trabajo de difracción de rayos X de Rosalind Franklin & rsquos y Maurice Wilkins & rsquo dio evidencia de hélice y dos hebras en la estructura del ADN.
  • Conciencia de que el método Sanger de secuenciación de bases utiliza nucleótidos que contienen ácido didesoxirribonucleico (ADN con desoxirribosa sin 2 moléculas de oxígeno) para detener la replicación del ADN en una base específica que permite la secuenciación mediante marcadores fluorescentes y computadoras. (Terminación de la cadena Sanger. Video aquí).
  • Conciencia de que en la elaboración de perfiles de ADN se utilizan repeticiones en tándem, ya que varían mucho de una persona a otra.
  • Capacidad para analizar los resultados del experimento de Hershey y Chase proporcionando evidencia de que el ADN es el material genético (este es un gráfico agradable).
  • Analizar visualizaciones moleculares de la asociación entre proteína y ADN en un nucleosoma.

Mapas mentales

Estos resúmenes de diagramas cubren los detalles principales del tema 3.5 Modificación genética.
Estúdialos y dibuja tu propia lista o mapa conceptual, de memoria si puedes.

Ponte a prueba: preguntas de opción múltiple

Este cuestionario contiene preguntas de opción múltiple que cubren la comprensión y las habilidades de este tema.

7.1 Estructura y replicación del ADN 1 / 1

Se estima que un gran porcentaje del ADN humano es "no codificante".

¿Cuál de las siguientes respuestas enumera las funciones importantes de estas regiones no codificantes?

Alelos y genes recesivos para moléculas de ARNt

Reguladores de la expresión génica y genes para las enzimas de replicación del ADN.

Exones y genes para moléculas de ARNt

Las regiones no codificantes del ADN tienen otras funciones importantes, limitadas a reguladores de la expresión génica, intrones, telómeros y genes para los ARNt.

¿Cuál de los siguientes es un papel de los nucleosomas en eucariotas?

Parte del superenrollamiento del ADN.

Inicio de la traducción.

El superenrollamiento del ADN implica muchos pasos, pero la formación de nucleosomas es una parte importante de esto. El ADN se envuelve dos veces alrededor de un grupo de proteínas histonas.
Además: la transcripción está parcialmente regulada por nucleosomas en eucariotas.

¿A qué parte de un cebador de ARN pueden agregar nucleótidos las enzimas de la ADN polimerasa III?

Las enzimas ADN polimerasa solo pueden agregar nucleótidos al extremo 3 y rsquo de un cebador.

Este diagrama muestra un diagrama simplificado de la replicación del ADN.

¿Qué enunciado describe mejor lo que se muestra en el diagrama?

La replicación se realiza en una dirección de 5 & # 39 a 3 & # 39 en la hebra principal, pero al revés en la hebra retrasada.

La replicación es más rápida en la hebra rezagada que en la hebra principal.

La replicación es continua en la hebra principal y discontinua en la hebra rezagada.

La replicación ocurre de la misma manera tanto en las hebras iniciales como en las rezagadas.

La replicación continua del ADN ocurre en la hebra principal y discontinua en la hebra retrasada.

¿Cuál de las siguientes afirmaciones da un orden lógico en la acción de solo tres de las enzimas del complejo grupo de enzimas que llevan a cabo la replicación del ADN?

ADN polimerasa III, ADN girasa, ADN polimerasa I

Helicasa, ADN polimerasa I, ADN polimerasa III

Helicasa, ADN primasa, ADN polimerasa III

ADN polimerasa I, ADN girasa, ADN primasa

Un grupo complejo de enzimas realiza la replicación del ADN que incluye helicasa, ADN girasa, proteínas de unión de una sola hebra, ADN primasa y ADN polimerasas I y III. (también ADN ligasa)

La ADN girasa y la helicasa desenrollan y abren la hebra de ADN, de modo que la ADN primasa pueda unir un cebador.
Luego, la ADN poimerasa III agrega nucleótidos de ADN al extremo 3 & # 39 del cebador. Los nucleótidos de ARN del cebador se reemplazan por nucleótidos de ADN por la ADN polimerasa I.

¿Cuál es la mejor descripción de & # 39crossing-over & # 39?

El intercambio de fragmentos de ADN entre cromátidas hermanas de cromosomas homólogos.

El intercambio de fragmentos de ADN entre cromátidas hermanas de autosomas.

El intercambio de fragmentos de ADN entre cromátidas no hermanas de cromosomas homólogos.

El intercambio de fragmentos de ADN entre cromátidas no hermanas de cromosomas sexuales.

La replicación del ADN produce una segunda cromátida en cada cromosoma en interfase antes de la meiosis.

El cruce intercambia fragmentos de ADN entre cromátidas homólogas no hermanas y forma nuevas combinaciones de alelos en los cromosomas formados en la meiosis.

El diagrama muestra dos partículas de virus bacteriófagos utilizadas en un famoso experimento de Hershey y Chase.

¿Por qué usaron ADN etiquetado en uno y proteína etiquetada en otro?

Buscaban evidencia de cruzamiento en el ADN.

Querían identificar las enzimas y los nucleótidos en la replicación del ADN.

Querían saber si la proteína o el ADN eran heredados por la descendencia.

Querían ver qué molécula entraba en las células de la bacteria huésped.

El experimento de Hershey y Chase proporcionó evidencia de que el ADN es el material genético.

En sus experimentos, demostraron que la etiqueta radiactiva pasaba al ADN en la próxima generación de bacteriófagos.


RESPUESTAS CORRECTAS

La centrifugación en gradiente de cloruro de cesio fracciona las macromoléculas de acuerdo con sus densidades de flotación: al final de la centrifugación, las macromoléculas de mayor y menor densidad están más cerca o más lejos del fondo del tubo, respectivamente (MCQ 2: A). Density labeling of nitrogen containing macromolecules (MCQ 1: E) with heavy ( 15 N) and light ( 14 N) nitrogen isotopes as described in the protocol of this test generated DNA molecules of three distinct densities: heavy (Peak I), intermediate (Peak II), and light (Peak III). Analysis of the appearance and amount (MCQ 3: C) of these DNA species provided information to describe the mechanism of replication in E. coli células.

DNA replication, theoretically, could proceed according to three mechanisms [ 3 ]. According to the conservative model (Fig. 3 a), at the end of the replication, the template would remain intact and the daughter DNA would consist of two newly synthesized strands.

Possible models of DNA replication: conservative (a), semiconservative (B), and dispersive (C).

This mechanism would generate heavy and light DNA molecules only. In the semiconservative mechanism (Fig. 3 B), the two strands of the parental DNA molecule would unwind and serve as templates for the synthesis of new, complementary strands. The dispersive model (Fig. 3 C) predicts that both strands of the daughter DNA molecule contain old and newly synthesized regions. In both latter cases, the appearance of DNA molecules of intermediate density is expected after the first replication on the 14 NH4Cl containing medium (MCQ 4: C). Upon heat-denaturation and alkaline cesium chloride gradient centrifugation of Peak II DNA (that triggers and maintains the separation of the DNA strands, respectively MCQ 5: A, MCQ 6: B), two absorption peaks appeared corresponding to heavy and light DNA molecules (MCQ 9: A, MCQ 10: A). This observation strongly supports the semiconservative mechanism (MCQ 11: E). (In the case of dispersive DNA replication, denaturation of Peak II DNA would not change the behavior of the DNA molecules during cesium chloride gradient centrifugation.) The semiconservative model would predict that the ratio of light versus intermediate density DNA would increase in successive DNA replication cycles (Fig. 4 MCQ 12: D). DNA replication was completed in 48 min in this experiment (note the complete disappearance of the original, “heavy” template DNA in Fig. 1 B MCQ 7: A). By 92 min (Fig. 1 C), the second replication cycle was finished (MCQ 8: B).

Density distribution of DNA molecules generated during the first 3 replication cycles of the Meselson-Stahl experiment.


Ver el vídeo: DNA (Agosto 2022).