Información

¿Cultiva E. coli a temperatura ambiente?


Si tuviera que hacer una selección azul / blanco de transformado E. coli en placas de agar LB con ampicilina en temperatura ambiente (23⁰C) durante aproximadamente 2 días y 18 horas, ¿me encontraré con el problema de las colonias satélites o con cualquier otro problema?


Definitivamente obtendrás colonias satélites. La ampicilina se degrada después de aproximadamente un día, especialmente cuando se expone a la luz. Kan, se mantiene bastante bien a temperatura ambiente, pero eso no te sirve :)


Dado que el tramado en blanco y negro es un medio de selección, desea una presión de selección máxima. Esto se obtendrá incorporando todas las condiciones óptimas. Las muchas enzimas del operón lac funcionarán mejor a su temperatura óptima.

¿Por qué harías esto? Si es porque no puedes ir al día siguiente, es mejor hacerlo cuando estés disponible. Solo dudará de sus resultados cuando los obtenga.


Pregúntele a un experto: preparación adecuada de placas de cultivo con E. coli

Estoy haciendo un experimento que implica probar las propiedades antimicrobianas de varios compuestos contra la bacteria E. coli. Algunos de mis experimentos preliminares no funcionaron como esperaba, ya que NO conseguí que crecieran muchas bacterias.

Aquí hay un resumen de lo que hice:
La cepa K12 de E. coli solicitada (en agar inclinado) de Carolina Biological Supply Company
http://www.carolina.com/product/escherichia+coli+k12%2C+living.do?keyword=e.+coli&sortby=bestMatches
Placas de cultivo preparadas con agar nutient (en cantidades estándar)
Esterilizó un asa de inoculación de 4 mm en un mechero Bunsen y lo usó para 1 asa extra de bacterias. Luego lo extendí sobre la superficie del plato, lo giré 120 grados, continué extendiéndolo y luego lo giré 120 grados nuevamente para extender un poco más.
Se incubaron las placas a 37 grados C durante 24 horas.

Los resultados fueron extremadamente irregulares y no el piso de bacterias que esperaba. Pensé en posibles fuentes de error. ¿Podrían otros comentar sobre las posibles fuentes para que, cuando regrese a la escuela, pueda ajustar mi procedimiento para que la E. coli crezca con éxito?

Las posibles fuentes de error son:
1. Usé E. coli directamente del tubo de ensayo cuando posiblemente debería haber diluido las bacterias para hacer una especie de caldo bacteriano. ¿Es mejor usar las bacterias como caldo para hacer crecer un piso de bacterias?
2. No dejé que el asa de inoculación se enfriara el tiempo suficiente y es posible que haya "matado" la bacteria para que no creciera. ¿Necesito dejar que el asa se enfríe a temperatura ambiente antes de pegarlo en el cultivo bacteriano?
3. Usé un bucle lleno de bacterias para toda la placa de Petri, por lo que puede que no haya sido suficiente. Después de realizar este experimento, encontré algunas referencias que recomendaban que debería haber usado 3 bucles llenos de bacterias (por ejemplo, 1 bucle cada 120 grados de rotación).
4. Usé un asa de inoculación en lugar de un instrumento de extensión. Aunque he visto algunas referencias que recomiendan un bucle de inoculación para esparcir las bacterias alrededor del plato, más tarde encontré otras referencias que recomiendan un instrumento de esparcimiento para obtener un piso uniforme de bacterias en el plato.
5. Usé un asa de inoculación en lugar de un hisopo de algodón esterilizado. Mis referencias iniciales recomendaban usar un bucle incoculatorio. Pensé que si usaba un hisopo estéril, no podría asegurarme de obtener una cantidad eterna de bacterias de un plato a otro. Pero, ¿el asa de inoculación proporciona suficiente cobertura?
6. Es posible que la incubadora no esté funcionando correctamente. Los controles de temperatura de la incubadora son un poco delicados, por lo que es difícil lograr que funcione con precisión a 37 grados C. Sin embargo, creo que funciona en la vecindad de 36 a 40 grados C. Leí que el cultivo de E. coli a temperaturas por debajo de 37 grados C, pero no sé a qué temperatura es demasiado alta para matar las bacterias en la incubadora.

Agradezco cualquier sugerencia que me ayude a identificar mis errores y hacer que cultive E. coli con éxito.

Re: Preparación adecuada de placas de cultivo con E. Coli

Post por un baile & raquo Domingo 28 de diciembre de 2008 9:31 am

Creo que está en el camino correcto con su solución de problemas.

1. Hacer una suspensión de bacterias es sin duda una opción.

2. ¡Sí, esto es importante! Déjelo enfriar unos segundos después de quemarlo. Debería volver a su color normal, no al rojo vivo, cuando lo coloque en el cultivo.

3. Quizás. Si no hay suficientes bacterias, simplemente les tomará más tiempo crecer y extenderse por el plato. Durante 24 horas, la E. coli produce colonias bastante pequeñas, pero con más tiempo deberían extenderse.

4. Un cultivo líquido y un esparcidor (solo un tubo o varilla de vidrio doblado, esterilizado) deberían proporcionarle un césped más uniforme de bacterias. La técnica que usó, creo que a partir de su descripción, se usa más comúnmente para rayar colonias individuales, exactamente lo contrario de lo que quiere aquí.

5. Depende simplemente de la cantidad de bacterias con la que empiece. Un hisopo de algodón los esparcirá más, creo.

6. Creo que un rango de 36-40 probablemente esté bien, a menos que tenga una cepa particularmente sensible a la temperatura. E coli también crecerá a temperatura ambiente, solo que lleva más tiempo.

Creo que su idea de un cultivo líquido es la mejor. Si inoculas un líquido y lo dejas crecer durante la noche con agitación, debes tener una suspensión uniforme y agradable en el plato. (También puede diluir una gota de células en un medio líquido, pero es posible que la gota no se disperse por completo). Probablemente desee diluirla un poco con un medio estéril. Luego tome 100 ul y extiéndalo sobre sus platos con una varilla de vidrio doblada. Déjelo reposar con el lado derecho hacia arriba durante unos minutos para que el líquido pueda absorberse en el agar. Solo entonces dale la vuelta y ponlo en la incubadora.

Si no está satisfecho con el césped que ve al día siguiente, intente dejarlo pasar otra noche en la incubadora o comenzar con más bacterias.

Si tiene tiempo, creo que lo mejor sería un experimento piloto para determinar qué protocolo le da el mejor césped. Pruebe algunos procedimientos diferentes y luego elija el que más le guste para su experimento & quot real & quot.


INTRODUCCIÓN

El serotipo O157: H7 de la verotoxina productora Escherichia coli (VTEC) fue reconocido por primera vez como un patógeno humano grave en 1982. Este organismo estaba implicado como el agente causante de la colitis hemorrágica y también está asociado con el síndrome urémico hemolítico y la púrpura trombocitopénica trombótica. La mayoría de los brotes están relacionados con los alimentos o el agua y se han relacionado, en particular, con el consumo de carne molida poco cocida. Escherichia coli O157: H7 es en realidad un patógeno transmitido por los alimentos de principal preocupación para la salud pública en América del Norte, Europa y Japón, cuyo ganado lechero ha sido identificado como el reservorio (6 4).

Dada la gravedad de las enfermedades asociadas con E. coli O157: H7, es necesario dotar a la industria alimentaria de procedimientos para prevenir su presencia y controlar su crecimiento. Se ha investigado la cinética de crecimiento del serovar O157: H7 en condiciones ambientales variables (temperatura de incubación, pH inicial, contenido de NaCl). Esto ha permitido el posterior desarrollo de modelos matemáticos que predicen su comportamiento en los alimentos (2 1 14).

Conociendo el Tmin (la temperatura por debajo de la cual ya no se observa crecimiento) y Tmax (la temperatura por encima de la cual no se produce crecimiento) para E. coli O157: H7 es particularmente importante para conservar los alimentos y detectar esta bacteria. Toptar (la temperatura a la que la tasa máxima de crecimiento específico μmax es igual a su valor óptimo) es un parámetro importante en microbiología predictiva. Se ha observado una fuerte correlación entre las tres temperaturas cardinales (Tmin, Tmax y Toptar) en varias cepas de diversas especies bacterianas (12). Sus valores para tres no O157 E. coli Las cepas se evaluaron entre 4 · 9 ° C y 11 · 2 ° C para Tmin, 47 · 3 ° C y 48 · 0 ° C para Tmax y 40 · 3 ° C y 41 · 3 ° C para Toptar (12). La incapacidad de E. coli O157: H7 crece bien, si es que crece, a 44–45 · 5 ° C para el caldo de tripticasa de soja (TSB) (7) y para el medio de E. coli (11). Los resultados, obtenidos en cada caso con una única cepa, se interpretaron posteriormente en el sentido de que las temperaturas cardinales para este serovar serían más bajas. En contraste con estos hallazgos, 10 observaron que la mayoría de las cepas O157 crecieron en un rango de 8 a 10 ° C hasta al menos 45 ° C en infusión cerebro-corazón (BHI). Además, el crecimiento de los aislados O157: H7 se describió adecuadamente mediante un modelo de E. coli cepas (13), y al mismo tiempo, el crecimiento de cepas no patógenas fue adecuadamente descrito por un modelo para patógenos E. coli cepas (1 14). Estos datos divergentes podrían explicarse a través de la variabilidad entre las cepas y las condiciones de cultivo. De hecho, 8 observaron que la capacidad de E. coli El crecimiento de O157: H7 a 45 · 5 ° C dependió del medio, el tamaño del inóculo y la cepa. A esta temperatura, solo tres de las 18 cepas estudiadas crecieron bien en caldo EC, con una densidad inicial de 100 ufc ml -1, mientras que todas las cepas crecieron con densidades iniciales más altas. En TSB, todas las cepas pudieron crecer incluso con una densidad inicial de 10 ufc ml -1.

Este estudio se llevó a cabo para comparar la Toptar de serovar O157 con otros E. coli serotipos en un medio de laboratorio complejo. De hecho, la precisión de Toptar Los valores experimentales fueron mejores que los de Tmin y Tmax. Se incluyeron varias cepas para tener en cuenta la variabilidad descrita entre los aislamientos (10 13).


¿Crecimiento de E. coli a 4 grados? - (15 / Sep / 2010)

Recientemente hice un experimento de transformación con algunas de las 10 mejores células de E. Coli de Invitrogen, la transformación no pareció funcionar demasiado bien, pero esa es una historia diferente.

Conté el número de colonias en las placas de ampacilina y puse pequeños puntos negros frente a cada colonia mientras contaba, luego envolví las placas en Parafilm y las coloqué en el refrigerador. Una semana después, volví a sacar algunas de las placas y vi muchas más colonias de las que conté en toda la placa y más que las que estaban frente a los puntos negros, y estas no eran microcolonias diminutas, eran aproximadamente del mismo tamaño que las colonias originales.

¿Puede E. Coli desarrollar colonias a 4 grados C? y si es así, ¿cómo guardo los platos durante períodos de tiempo prolongados?

La ampicilina tiende a degradarse más fácilmente que otros antibióticos. Si desea almacenar sus células, le recomiendo que las coloque en un plato nuevo con un mondadientes, las deje crecer durante la noche y luego las almacene a 4 ° C. Aun así, no querrás guardarlos más de un par de semanas de esa forma sin tener que volver a palpar los dientes.

philman el miércoles 15 de septiembre 12:31:16 2010 dijo:

Recientemente hice un experimento de transformación con algunas de las 10 mejores células de E. Coli de Invitrogen, la transformación no pareció funcionar demasiado bien, pero esa es una historia diferente.

Conté el número de colonias en las placas de ampacilina y puse pequeños puntos negros frente a cada colonia mientras contaba, luego envolví las placas en Parafilm y las coloqué en el refrigerador. Una semana más tarde, volví a sacar algunas de las placas y vi muchas más colonias de las que conté en toda la placa y más que las que estaban frente a los puntos negros, y estas no eran microcolonias diminutas, eran aproximadamente del mismo tamaño que las colonias originales.

¿Puede E. Coli desarrollar colonias a 4 grados C? y si es así, ¿cómo guardo los platos durante períodos de tiempo prolongados?

En una nota muy divertida, Phil, tienes demasiadas colonias en tu plato.
Teníamos una habitación a 4oC en nuestra univ. y he guardado (olvidado) platos durante un mes sin casi ningún crecimiento en ellos. ¿La nevera funcionaba bien mientras no estabas? o tiene un estudiante nuevo en su laboratorio que podría haberlos sacado y vuelto a colocar al día siguiente.
Sé que no tengo ayuda técnica, pero no puedo pensar en nada para los dos problemas que ha mencionado aquí.

gt_ameya el miércoles 15 de septiembre 12:55:58 2010 dijo:

Sí, sé que tengo demasiadas colonias, más bien sobrestimé la cantidad de transformantes que obtendría & # 33 estoy volviendo a recubrir hoy con una dilución más alta & # 33 y el refrigerador debería haber estado funcionando bien, solo se dejaron por una semana. Podría meter un termómetro allí dentro un poco para ver qué tan frío hace en realidad, es un frigorífico bastante viejo.

y YO SOY el nuevo estudiante, y no recuerdo haberlos dejado fuera

y sí, sé que la ampicilina es un poco cutre, dejé mi placa de control negativo en la incubadora durante 5 días por curiosidad y salió con colonias (aunque no había ninguna el día después de la transformación, por lo que los controles aún eran viables )

fue y metió un termómetro en un frasco de líquido que había estado almacenado allí durante bastante tiempo, el refrigerador estaba solo a 13 grados & # 33

He rechazado esto ahora y espero que la temperatura se acerque a los 4 grados para mañana, pero una forma molesta de descubrir que ha estado tan caliente, Dios sabe cuánto tiempo.

philman el miércoles 15 de septiembre 15:13:43 2010 dijo:

fue y metió un termómetro en un frasco de líquido que había estado almacenado allí durante bastante tiempo, el refrigerador estaba solo a 13 grados & # 33

He rechazado esto ahora y espero que la temperatura se acerque a los 4 grados para mañana, pero una forma molesta de descubrir que ha estado tan caliente, Dios sabe cuánto tiempo.

Es exactamente por eso que necesitas estudiantes nuevos cada verano. Suceden cosas inusuales con sus experimentos y usted descubre lo que REALMENTE está sucediendo en su laboratorio.

gt_ameya el viernes 17 de septiembre 04:47:21 2010 dijo:

philman el miércoles 15 de septiembre 15:13:43 2010 dijo:

fue y metió un termómetro en un frasco de líquido que había estado almacenado allí durante bastante tiempo, el refrigerador estaba solo a 13 grados & # 33

He rechazado esto ahora y espero que la temperatura se acerque a los 4 grados para mañana, pero una forma molesta de descubrir que ha estado tan caliente, Dios sabe cuánto tiempo.

Es exactamente por eso que necesitas estudiantes nuevos cada verano. Suceden cosas inusuales con sus experimentos y usted descubre lo que REALMENTE está sucediendo en su laboratorio.


Bajé el refrigerador al mínimo y la temperatura solo bajó a 9 grados al día siguiente. He sospechado de todos los frigoríficos del laboratorio y he puesto un tubo de 15 ml de agua del grifo en cada uno ayer para comprobar las temperaturas más tarde hoy. podría ser un problema.

Esto no tiene nada que ver con su refrigerador: está viendo que surgen colonias satélites en el plato.

Cuando se coloca una mezcla de transformación, contiene muchas células que no se han transformado y (con suerte) algunas que sí. Inicialmente, estas células sin plásmido no crecen debido a la ampicilina en el medio. Sin embargo, a medida que las células transformadas crecen, secretan beta-lactamasa (la enzima que destruye la ampicilina y confiere resistencia a los transformantes). A medida que esta enzima se acumula en el medio y se difunde hacia el exterior, la concentración de ampicilina desciende, porque la enzima está destruyendo la ampicilina. Ahora las células no transformadas pueden crecer, ya que la concentración de ampicilina restante es demasiado baja para detener su crecimiento.

Entonces, sí, la E. coli crece a 4 grados, y no debe almacenar sus placas de transformación directamente, sino que debe recoger sus transformantes en un plato nuevo y almacenarlo.

philman el miércoles 15 de septiembre 12:31:16 2010 dijo:

Recientemente hice un experimento de transformación con algunas de las 10 mejores células de E. Coli de Invitrogen, la transformación no pareció funcionar demasiado bien, pero esa es una historia diferente.

Conté el número de colonias en las placas de ampacilina y puse pequeños puntos negros frente a cada colonia mientras contaba, luego envolví las placas en Parafilm y las coloqué en el refrigerador. Una semana después, volví a sacar algunas de las placas y vi muchas más colonias de las que conté en toda la placa y más que las que estaban frente a los puntos negros, y estas no eran microcolonias diminutas, eran aproximadamente del mismo tamaño que las colonias originales.

¿Puede E. Coli desarrollar colonias a 4 grados C? y si es así, ¿cómo guardo los platos durante períodos prolongados de tiempo?

Por lo general, estas colonias solo aparecen cuando selecciona ampicilina, ya que esta se degrada gradualmente en el refrigerador.
Creo que la mejor manera es simplemente volver a dividir las colonias en una placa nueva con ampicilina y almacenar esas placas. Después de todo, las colonias nunca aparecerán si no las ha colocado allí.


Tasa de crecimiento de Escherichia coli.

Debería ser posible predecir la tasa de crecimiento de Escherichia coli de un genotipo dado en un ambiente específico. La idea de que la tasa de síntesis de ATP determina la tasa de crecimiento y que el rendimiento de ATP determina el rendimiento de crecimiento está arraigada en la fisiología bacteriana, pero esta idea es incompatible con los resultados experimentales. En medios mínimos, la tasa de crecimiento y el rendimiento varían con la fuente de carbono de una manera independiente de la tasa de formación y rendimiento de ATP. Con acetato como fuente de carbono, las reacciones anapleuróticas, no la síntesis de ATP, limitan la tasa de crecimiento. Para el acetato y otros sustratos gluconeogénicos, el paso limitante parece ser la formación de triosa fosfato. Concluyo que la tasa de crecimiento está controlada por la tasa de formación de un metabolito precursor y, por tanto, de monómeros como los aminoácidos derivados de él. El sistema de síntesis de proteínas se regula de acuerdo con la demanda de síntesis de proteínas. Examino la conjetura de que la señal para esta regulación es la proporción de ARNt no cargado a aminoacil-ARNt, que esta señal controla la concentración de tetrafosfato de guanosina y que la concentración de tetrafosfato de guanosina controla la transcripción de genes rrn. Las ecuaciones diferenciales que describen este sistema se resolvieron numéricamente para estados estables de crecimiento, los valores calculados de ribosomas y tetrafosfato de guanosina y la tasa de crecimiento máxima concuerdan con los valores experimentales obtenidos de la literatura de los últimos 35 años. Estas ecuaciones también se resolvieron para estados dinámicos correspondientes a cambios nutricionales hacia arriba y hacia abajo.


Patógeno E. coli: El lado oscuro de un microbio amigable

E. coliLa presencia en el medio ambiente es motivo de preocupación porque su relación con los humanos no es del todo benigna. En efecto, E. coli es una de las principales causas de enfermedades diarreicas, peritonitis, colitis, bacteriemia, mortalidad infantil e infecciones del tracto urinario que en todo el mundo cuestan miles de millones de dólares tratar y matar aproximadamente a 2 millones de seres humanos cada año (Russo y Johnson, 2003 Kaper et al., 2004). Algunas cepas incluso pueden causar cáncer (Arthur et al., 2012). Algunos oportunistas E. coli Las infecciones son causadas por cepas normalmente inofensivas o beneficiosas cuando se introducen en huéspedes enfermos o en partes del cuerpo de un huésped fuera del intestino (Kaper et al., 2004). Sin embargo, también existen cepas patógenas que producen factores de virulencia y pueden causar enfermedades incluso en el huésped más sano. Estas cepas se clasifican por dónde y cómo causan la enfermedad en grupos llamados patotipos (ver & # x02018Glosario & # x02019), que incluyen enteroagregantes, enterohemorrágicos, enteropatógenos, enterotoxigénicos, uropatógenos, asociados a meningitis y asociados a septicémicos. E. coli (Kaper et al., 2004 Leimbach et al., 2013) (ver & # x02018Glossary & # x02019).

El más notorio de estos es E. coli O157: H7, una cepa enterohemorrágica que produce una shiga-como toxina (Griffin y Tauxe, 1991 Robinson et al., 2006). Esta toxina (ver & # x02018Glosario & # x02019) ataca los vasos sanguíneos pequeños, mata las células intestinales y causa diarrea con sangre y dolor abdominal intenso, así como síndrome urémico hemolítico (SUH), una afección potencialmente mortal que puede involucrar coágulos generalizados en los capilares y anemia hemolítica, trombocitopenia e insuficiencia renal (ver & # x02018Glossary & # x02019 Griffin et al., 1988 Kaper et al., 2004). El tratamiento puede ser difícil porque los antibióticos aumentan el riesgo de SUH. Como resultado, el tratamiento generalmente se limita al suministro de líquidos, nutrición adecuada, medicación para el dolor y la fiebre y transfusiones de sangre cuando sea necesario (Bitzan, 2009 Smith et al., 2012).

O157: H7 es particularmente peligroso porque puede contaminar fácilmente los suministros de alimentos para humanos. Reside asintomáticamente en el ganado y en otros animales, y puede ser transferido a los humanos a través de la contaminación fecal de la carne durante su despiece y empaque (Ferens y Hovde, 2011). También puede contaminar vegetales a través de fertilizantes y agua, y a través del contacto con aves asociadas al ganado (Callaway et al., 2009, 2014). A través de estos puntos de entrada a la cadena alimentaria humana, el O157 ha provocado numerosos brotes de enfermedades (Frenzen et al., 2005 Rangel et al., 2005). Solo en los EE. UU., Estos brotes han afectado anualmente a & # x0223c63,000 personas, matando a 20 y con un costo de alrededor de $ 405 millones en atención médica y pérdida de productividad (Mead et al., 1999 Scallan et al., 2011). Cuando E. coli recibe mala prensa, O157: H7 es casi siempre el culpable, y con razón.


Introducción a E. coli y enfermedades diarreicas

Escherichia coli es una pequeña bacteria gramnegativa que vive en el intestino de muchos mamíferos, incluidos los humanos. Esta bacteria tiene una tasa de crecimiento rápida. Si se le da un medio rico, puede duplicarse cada 20 minutos. También es fácil de cultivar y no necesita suplementos nutricionales especiales. Aunque crece bien a la temperatura del cuerpo humano (aproximadamente 37 ° C), también puede crecer a temperatura ambiente. Es una bacteria versátil y puede utilizar muchos sustratos para su crecimiento. Puede crecer tanto aeróbicamente como anaeróbicamente (es decir, es un anaerobio facultativo y puede crecer con o sin oxígeno). Las bacterias crecen bien en medios líquidos con o sin aireación. También crecen bien en superficies sólidas, incluido el medio de agar de laboratorio elaborado en placas de Petri. La cepa de laboratorio de E. coli contiene genes que codifican alrededor de 4.000 proteínas. Las bacterias son genéticamente flexibles y pueden intercambiar ADN mediante conjugación. En el laboratorio, pueden tomar ADN del medio ambiente si se tratan con cationes divalentes como magnesio y calcio (transformación). Existe evidencia de que también pueden absorber ADN exógeno en su hábitat natural en el intestino. Hay varios virus de ADN bacteriano (bacteriófagos) que pueden infectar a E. coli. Estos virus pueden transferir ADN entre bacterias. La versatilidad genética y la facilidad para trabajar con E. coli lo han convertido en un organismo modelo en el laboratorio durante más de 80 años. Se ha utilizado para muchos estudios de fisiología y genética bacteriana. Debido a que se entiende tan bien, también es un organismo favorito para usar como vehículo para el ADN clonado.

Cepas de E. coli

Existe una gran cantidad de cepas de E. coli. Las cepas de laboratorio son algo atípicas en comparación con las cepas aisladas del intestino de animales o humanos o del medio ambiente. Las cepas naturales contienen más genes que las cepas de laboratorio. Aproximadamente 2.000 genes forman el genoma central, que consiste en aquellos genes que cualquier cepa de E. coli debe tener para vivir y crecer. El resto de los genes varían entre las cepas (hay más de 15.000 genes diferentes que se han encontrado en diferentes cepas) 1. Los genes que se encuentran solo en algunas cepas incluyen genes involucrados en la patogénesis y en la supervivencia en un huésped mamífero. Esta composición genética variable significa que diferentes cepas de E. coli causan diferentes enfermedades. Por tanto, hay E. coli diarreogénica (DEC), E. coli uropatógena (UPEC) y E. coli que causan meningitis. En este artículo, me centraré en las cepas DEC.

Cepas de E. coli diarrheagenic (DEC)

DEC vive en el intestino de muchos animales, incluidas las vacas, los ciervos y otros animales que pastan. La infección por cepas que causan enfermedades en los seres humanos puede ser asintomática en los animales. Las bacterias viven en el intestino y se excretan en las heces. La carne en las plantas de procesamiento puede contaminarse con DEC debido a la contaminación de la carne por bacterias del intestino del animal. En el medio natural, DEC que se excreta en las heces necesita sobrevivir y alcanzar un nuevo huésped. Una estrategia de supervivencia implica que las bacterias se unan a las superficies de las plantas. Cuando la planta es devorada por un huésped potencial, las bacterias entran y crecen en el tracto digestivo del huésped. Los seres humanos se infectan con DEC al comer carne o plantas contaminadas. En los últimos cinco años en los EE. UU., DEC se ha transmitido a través de brotes de trébol, ensalada picada, lechuga romana, harina, carne molida y bisonte, mantequilla de nuez de soya y brotes de alfalfa. Los brotes de enfermedades resultantes han dado lugar a retiradas de los productos contaminados siempre que ha sido posible, lo que ha provocado pérdidas económicas.

Casos estimados de DEC, hospitalizaciones resultantes y muertes en los EE. UU. 2 Casos estimados de DEC y muertes resultantes en todo el mundo3

La enfermedad causada por DEC es informada por el CDC (Centro para el Control de Enfermedades) de EE. UU. En cuatro categorías: cepas que portan el gen de la toxina Shiga (STEC), una cepa particularmente virulenta que porta el gen de la toxina Shiga y varios otros genes de virulencia (O157: H7), cepas portadoras de genes para otras toxinas (ETEC) y otras cepas DEC. En los países en desarrollo con sistemas de saneamiento y purificación de agua deficientes o nulos, la DEC puede transmitirse fácilmente de persona a persona a través de la vía fecal-oral y causar grandes brotes de enfermedades. En las tablas se muestra el número estimado de casos, hospitalizaciones y muertes causadas por cada uno de los grupos de cepas anualmente en los EE. UU. Y en todo el mundo. Como ocurre con todas las enfermedades diarreicas, las infecciones por DEC son más graves en los bebés y los ancianos.

Mirando hacia el futuro

Este es el primero de una serie de artículos. Los artículos futuros considerarán la transmisión y reducción de DEC, y un estudio de patógenos humanos transmitidos por plantas.


Resultados

Evaluación de la temperatura de preinducción

El recombinante E. coli BL21 (DE3) Star ™ / pAE / LigB (131-645aa) se cultivó a 28 ° C y 37 ° C, y se controló mediante absorbancia a 600 nm cada 30 min con el fin de obtener curvas de crecimiento para estas temperaturas y evaluar la especificidad tasas de crecimiento en la fase exponencial. Puede verse en la Figura 2 (a) y los cálculos de tasas de crecimiento específicas en las fases de crecimiento exponencial que la tasa de crecimiento máxima a 28 ° C (μmax = 0,62 h -1) fue alrededor de un 40% menor que la tasa de crecimiento obtenida en el óptimo E. coli temperatura de crecimiento de 37 ° C (μmax = 1,05 h ^ {- 1}). Se tardó 1 h 50 min en alcanzar una absorbancia de 0,75 (fase exponencial temprana) a 37 ° C, mientras que tardó 3 h en alcanzar la misma absorbancia a 28 ° C. A 37 ° C, la célula se cultivó durante 4,5 h hasta alcanzar la absorbancia a 600 nm de alrededor de 4, mientras que se necesitaron 6 h para alcanzar este crecimiento celular a 28 ° C, como se muestra en la Figura 2 (a). A 37 ° C, μmax de 1,05 h -1 se mantuvo hasta 3 h de crecimiento, a una absorbancia (medida a 600 nm) de alrededor de 2, cuando las células alcanzan la fase final de crecimiento exponencial.

Curvas de crecimiento de E. coli BL21 (DE3) Star ™ / pAE / LigB (131-645aa). (a) Crecimiento celular a 37 ° C y 28 ° C en TB a 200 rpm (errores de absorbancia medidos a 600 nm entre 1 y 2%). (B) Comparación entre el crecimiento no inducido y el inducido por IPTG a 28 ° C. La inducción se realizó durante 4 h después de la adición de IPTG (equivalente a 7 h de proceso) en AbsIndiana = 0,75 (el tiempo en el que se añadió IPTG 0,55 mM se indica mediante una flecha en el proceso de 3 h). Como se indica en la escala, se alcanzó 1 h de inducción después de 4 h de proceso, 2 h de inducción después de 5 h de proceso y 3 h de inducción después de 6 h de proceso, respectivamente.

En otras dos pruebas, las bacterias se cultivaron a 28 ° C y 37 ° C hasta que la absorbancia alcanzó 0,75, momento en el que se añadió IPTG para inducir la expresión de la proteína recombinante LigB (131-645aa). En ambos experimentos, la temperatura de post-inducción se mantuvo a 28 ° C durante 4 h, mientras que la absorbancia se controló a 600 nm y el nivel de expresión se verificó cada hora usando SDS-PAGE. En el experimento realizado a 28 ° C (tanto antes como después de la inducción con IPTG), se identificó una caída de más del 60% en la tasa de crecimiento bacteriano después de la inducción con IPTG (de 0,62 h -1 a 0,24 h -1) (Figura 2b). ). La reducción de la tasa de crecimiento después de la inducción puede haber sido causada por el efecto tóxico del IPTG y / o la carga metabólica impuesta a las células debido a la expresión génica heteróloga o la toxicidad de las proteínas [19-24].

Cuando se comparó la cinética de expresión de LigB (131-645aa) a 28 ° C para los ensayos utilizando diferentes temperaturas de preinducción (28 ° C y 37 ° C), no se encontró una diferencia significativa entre el crecimiento obtenido bajo los dos condiciones tras la inducción con IPTG, ni entre los niveles de expresión obtenidos en 4 h (Tabla 1).

Como la tasa de crecimiento específico durante la fase de preinducción fue mayor a 37 ° C, el proceso se realizó inicialmente a 37 ° C (temperatura óptima para E. coli crecimiento), y solo en la fase de inducción se redujo la temperatura a 28 ° C (temperatura óptima para la expresión de LigB (131-645aa) en E. coli). Para la evaluación del efecto de la inducción de IPTG en la fase exponencial, el cultivo tardó alrededor de 3 ha 37 ° C en alcanzar una absorbancia cercana a 2 (concentración celular más alta a la que μmax se mantiene constante, es decir, el final de la fase de crecimiento exponencial). La misma absorbancia tomó casi 5 h con crecimiento a 28 ° C, lo que reduciría la productividad del proceso.

Expresión de LigB recombinante utilizando un diseño experimental para evaluar el crecimiento celular para la inducción (AbsIndiana) y concentración de IPTG

Se probaron diferentes condiciones experimentales para variar la absorbancia para la inducción de la expresión de LigB (131-645aa) recombinante y la concentración de IPTG, utilizando un diseño compuesto central para dos variables. E. coli BL21 (DE3) Star ™ se cultivó a 37 ° C y 200 rpm hasta que se alcanzó la fase exponencial (AbsIndiana de entre 0,75 y 2,0), momento en el que se añadió IPTG (entre 0,1 mM y 1 mM) para la expresión de LigB recombinante (131-645aa) a 28 ° C durante 4 h.

Las bandas para el extracto de proteína total, la fracción soluble y la fracción insoluble analizadas en gel se normalizaron mediante el crecimiento celular medido por absorbancia a 600 nm, como se describe en Métodos. Las bandas SDS-PAGE son similares para todos los AbsIndiana y las concentraciones de IPTG ensayadas, lo que indica que la expresión normalizada por el crecimiento celular no dependía de estas variables. En todas las condiciones probadas, LigB (131-645aa) se obtuvo en su forma soluble en el tampón de lisis (Tris 20 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 al 0,1%) con alrededor del 15% de la proteína total expresada en su insoluble fracción en todas las condiciones probadas, excepto en el ensayo 4 (en AbsIndiana 2,0 e IPTG 1 mM) donde la fracción insoluble era mayor, cerca del 35% de la proteína total expresada. Los análisis de SDS-PAGE realizados para evaluar la expresión de LigB (131-645aa) normalizada por el crecimiento celular y la solubilidad por densitometría se muestran en la Figura 3. Los resultados del crecimiento celular y la expresión de LigB (131-645aa) en la fracción soluble se muestran en la Tabla. 2.

SDS-PAGE con no inducido e inducido por IPTG E. coli BL21 (DE3) Estrella / pAE/Muestras de LigB (131-645aa) normalizadas por absorbancia a 600 nm del ensayo 3 (Abs Indiana = 2,0 e IPTG 0,1 mM), extracto de proteína total separado en fracciones solubles e insolubles de proteína recombinante en Tris 20 mM / EDTA 1 mM / Triton X-100 al 0,1% (pH 8). Desenrollar = Ind no inducido = TE inducido = Extracto total.

En los ensayos 1 y 2, inducidos en AbsIndiana = 0,75, las células crecieron durante 1 h 45 min y 1 h 50 min, respectivamente, a 37 ° C antes de la inducción, las células crecieron durante 2 h 45 min y 3 h en los ensayos 3 y 4 (AbsIndiana = 2,0), respectivamente. En los puntos centrales, las células crecieron durante 2 h 15 min para que la absorbancia alcanzara 1,4 cada una. Estos tiempos de crecimiento celular en cada experimento antes de la adición del inductor se agregaron al tiempo de inducción de 4 h para los cálculos de productividad que se muestran en la Tabla 2.

Con respecto al crecimiento celular en el que se induciría LigB (131-645aa), se encontró que había un aumento significativo en el crecimiento celular y la expresión de proteínas recombinantes cuando AbsIndiana 0.75 was compared with 2.0, while the IPTG concentration was kept the same (Table 2). In assays 1 and 3, where induction was done at 0.75 and 2.0, respectively, and the IPTG concentration was the same (0.1 mM), cell growth of 0.95 and 1.6 g (dry cell)/L was obtained (respectively 3.75 and 6.33 in terms of absorbance at 600 nm) while 180 mg/L and 288 mg/L LigB (131-645aa) was expressed, representing around 70% higher cell growth and 60% higher protein expression. When assays 2 and 4 are compared, where induction with 1 mM IPTG was made at different absorbances, cell growth and LigB (131-645aa) expression were also found to be higher when the Absind was higher. When the concentration of inducer was varied, the comparison of assays 1 and 2 (Absind 0.75) and the comparison of assays 3 and 4 (Absind 2.0) show that cell growth and LigB (131-645aa) expression were both higher at 0.1 mM (Table 2), although the difference was lower than when the cell concentration was varied at induction. The productivity data (amount of expressed target protein per volume of bacterial culture per process time) indicated that at the lower concentration of IPTG (0.1 mM), expressing the target protein at Absind 2.0 was better.

In the analysis of the triplicate at the central point (Absind = 1.4 and 0.55 mM IPTG), the errors associated with each of the response variables were assessed by calculations of means and their respective standard deviations, resulting in 1.15 ± 0.05 g (dry cell)/L for cell growth (equivalent of 4.61 ± 0.20 measured by absorbance at 600 nm), and 207 ± 8 mg/L for the yield of soluble LigB (131-645aa) expressed, while productivity was found to be 33.2 ± 1.3 (mg/L)/h. The errors calculated for the intermediate Absind and IPTG conditions, in triplicate (Central Points 1-3), were lower than 5%. The errors in the data obtained from the densitometry analysis that were used to calculate protein expression were found to be around 8%.

There was no significant reduction in the pH at the end of the experiments, as they were buffered with potassium salts in the TB medium (Table 2). The final pH at the central points was measured at around 6.6 ± 0.1 (errors of less than 1%). The glucose uptake after the 4 h induction period was found to be 30-50% of the initial concentration (9-10 g/L confirmed by the enzyme colorimetric method used) (Table 2). This indicates that the initial glucose concentration could have been lower. The assessment of the central point indicated the error in the glucose measurements to be around 12%, averaging 5.8 ± 0.7 g/L. The experiments that resulted in the greatest drop in pH and the greatest glucose uptake were the ones that yielded the highest cell growth.

Experimental design techniques were developed so that the maximum of process information could be gathered using the smallest number of experiments. Experimental design techniques usually rely on empirical model structures in order to interpret experimental data and provide optimal process operation conditions [23]. The linear effects and the effect of the interaction between Absind and IPTG concentration (X1 y X2 for codified variables, respectively) on cell growth (in g (dry cell)/L), the yield of expressed soluble LigB (131-645aa) (mg/L) and productivity ((mg/L)/h) can be described by linear models obtained by the statistical analysis with 95% confidence level (pag < 0.05 for statistically significant parameters), according to the equations below (in terms of codified variables):

Experimental and model data for each experiment were compared in order to check if the models are realist (shown in Table 2). The relative errors confirmed the models were representative of the experimental data. The correlation coefficients (R 2 ) obtained were around 0.98 and FCalifornia> > Fpestaña en el F-test analysis of variance (ANOVA), shown in Table 3, indicating that the models are statistically significant and predictive.

The models were evaluated by the correlation coefficients R 2 and ANOVA, demonstrating that they represent the experimental data (good agreement between the experimental values and the values predicted by the models) as such, the response surfaces could be obtained from the models. The response surfaces for cell growth and soluble LigB (131-645aa) productivity can be seen in Figure 4, where the linear effects of Absind and IPTG and the effect of their interactions on the response variables can be assessed.

Model representation for the effects of Abs ind and IPTG on (a) cell growth measured at 600 nm (Abs 600nm ) and (b) LigB (131-645aa) productivity ((mg/L)/h) in E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE.

The models indicate that the growth of E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE/LigB (131-645aa) (measured by absorbance at 600 nm and converted to g (dry cell)/L), the yield of soluble protein (mg/L) at the end of 4 h induction and the productivity of the process taken as a whole, in (mg/L)/h, were influenced both by the cell growth at which protein expression was induced by IPTG, and by the concentration of the inducer. It was also found that the interaction between the two variables, Absind and IPTG, had a significant effect on soluble LigB (131-645aa) expression: the concentration of IPTG that yielded increased protein production depended on the cell growth when induction was begun. The interaction between these two variables did not have a statistically significant effect only on cell growth, since pag > 0.05 for this parameter. The statistical analysis for the densitometry values of the bands corresponding to the soluble fractions in SDS-PAGE (that means the soluble expression of LigB (131-645aa) normalized by cell growth) indicated that both Absind and IPTG concentration had no statistical influence on this response, as all the effects resulted in pag & gt 0,05.

The data on soluble LigB (131-645aa) expression indicated that productivity was improved when 0.1 mM IPTG was used (lower inducer concentration) and when the highest absorbances were reached for induction at the final exponential growth phase, keeping the maximum specific growth rates (Absind 2.0). Induction at Absind 2.0 resulted in a higher level of expression of the recombinant protein (positive effect of this parameter on soluble LigB (131-645aa) expression yield and productivity). Comparing with the assay when Absind was 0.75 (early exponential phase) and IPTG was 1 mM, cell growth increased by almost 100% while soluble LigB (131-645aa) expression rose by around 50%, even though the process time was increased because induction was done at a higher absorbance at the exponential phase. The IPTG concentration was reduced to the lowest value because had a negative effect on cell growth, the final yield of soluble LigB (131-645aa) obtained, and the overall productivity of the process. The data therefore indicated that the best concentration of IPTG for expression was 0.1 mM.

The condition that produced the higher yield and productivity of soluble LigB (131-645aa) in E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE was confirmed in shaking flasks by inducing protein expression at the final exponential growth phase using the minimum inducer concentration. The expression results for the triplicate in shaking flasks at Absind 2.0 and 0.1 mM IPTG (equivalent to assay 3 presented in Table 2), 28°C, for 4 h induction in TB medium were: 1.5 ± 0.1 g (dry cell)/L (equivalent to 5.9 ± 0.4 measured by absorbance at 600 nm) for cell growth, yield of 272 ± 6 mg/L for LigB (131-645aa) expression, and 40.4 ± 0.9 (mg/L)/h for productivity.

Correlation between cellular growth and protein expression yield

In order to check whether the expression of soluble LigB (131-645aa) was proportional to cell growth, a linear correlation was performed using the experimental design results (Figure 5). The equation: mg/L = 181 (g dry cell)/L, with a linear correlation coefficient (R 2 ) of 0.9, was obtained, indicating that the soluble expressed LigB (131-645aa) was proportional to cell growth with a yield factor YP/X of 181 mg/g (dry cell). When it came to protein production in milligrams per liter of culture at Abs600nm of 1, the yield factor was 45.3 mg/L per absorbance measured at 600 nm, which indicates the same significance as the yield of product per unit of cell [25]. This finding indicates that the expression of soluble LigB (131-645aa) in the conditions tested in this work in terms of mg L −1 Abs −1 was similar in all the experiments, with an error of around 10%. That is, LigB (131-645aa) expression per cell in terms of mg L −1 Abs −1 obtained from the bands of the soluble fractions in the densitometry analysis was not statistically influenced by either of the variables (Absind and IPTG concentration), as already indicated before.

Correlation between soluble LigB (131-645aa) expression (mg/L) in E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE and cell growth measured at 600 nm (Abs 600nm). The linear correlation is mg/L = 181 (g dry cell)/L or mg/L = 45.3 Abs600nm, that is, (mg L -1 )/Abs600nm = 45.3 = YP/X.

Expression of LigB protein in microbioreactor and purification by IMAC

The condition for soluble LigB (131-645aa) expression at the end of exponential growth phase and 0.1 mM IPTG was also performed using Biopod microbioreactors. A cell growth curve was run in the Biopod microbioreactors at 37°C in TB medium without induction of E. coli BL21 (DE3) Star™/pAE/LigB (131-645aa) and the exponential phase was reached after 1 h, corresponding to an absorbance at 600 nm of 6. The exponential growth phase was verified until the absorbance of 12 and the final absorbance was around 18 after 6.5 h. This growth was due to high rate of aeration caused by the dispersion of air through microbubbles [18].

The maximum specific growth rate at 37°C (μmax de 0.69 h -1 ) was maintained until the bacteria reached absorbance 12. At this point, the cells were induced with 0.1 mM IPTG, as suggested by the experimental design performed in shaking flasks. The specific growth rate of the bacteria was found to be 0.3 h -1 after induction with IPTG at 28°C (25% improvement over the specific growth rate of 0.24 h -1 obtained in shaking flasks). Cell grew until 18.8 ± 1.2 (measured by absorbance at 600 nm) after 4 h induction. The results for densitometry of soluble protein bands showed a yield of 970 ± 174 mg/L and a final productivity of 157.4 ± 28.2 (mg/L)/h. The soluble fraction of the protein was around 77% of the total LigB (131-645aa) expressed in this condition. Cell growth, expression levels and productivities were greater than in shaking flasks due to more efficient aeration in the microbioreactor [18].

Protein purification was performed by IMAC and eluted with 300 mM imidazole, as shown in Figure 6. LigB (131-645aa) band evaluated by gel densitometry was equivalent to 25-27% of the total E. coli protein lysate obtained in microbioreactor (Figure 6). Purified LigB (131-645aa) was obtained in a final concentration of 260 mg/L medium culture with 91% homogeneity (10% error).

SDS-PAGE results from protein purification obtained with 300 mM imidazole elution by IMAC. The lysate fraction contains 25-27% LigB (131-645aa) and flow-through contains proteins without binding, leading to enrichment of the protein of interest in the last gel lane.


Mechanisms of microbial growth

Microbial growth refers to an increase in number of cells rather than an increase in cell size. Many microbes (including Escherichia coli, Salmonella enterica, y Listeria monocytogenes) are unicellular, meaning they are made of only one cell. The size of any unicellular microbe is limited by the capacity for the essential components of the cell to support its survival. For example, the integrity of the cell wall is impaired when cells become too large. The solution to growing despite limits on cell size is for cells to divide or produce new cells from the original cell. Therefore, the population grows although the size of the individual members of the population remains stable.

Most commonly, a single-cellular microbe divides into two identical new cells during one growth cycle (Figure 3a). The original cell, called the parent cell, makes a copy of its DNA and generates enough material to build the membrane, wall, and molecular machines for two cells. The parent cell slightly increases in size to accommodate these additional materials. Then, the parent cell begins to contract at the middle and a new piece of cell wall is assembled at the site of contraction. This process continues until the parent cell is split into two cells with complete cell walls. The resulting cells are called the daughter cells. Because both daughter cells are identical, cell division is also called replication. Replication in this manner leads to a rapid increase in the number of cells as each daughter cell begins the cycle again by acting as a parent cell. Cell division can look slightly different for microbes with different shapes (Figure 3b), but the key principles remain the same.

As long as the conditions are favorable, one cell produces two new cells in a continuous cycle. Every cycle doubles the number of cells in the population. This is known as exponential growth. Depending on the conditions, the division cycle of E. coli can be as short as 20 minutes. This rapid division leads to a rapid increase in the population size (Figure 3c). Eventually, the population is large enough to have an impact we can detect, such as formation of a physical structure. In a research lab, this might be a “colony,” a mound of bacteria on solid growth media. You might notice this as plaque on your teeth. It takes over a million bacteria to form a visible structure, but this can occur in only about eight hours when conditions are optimal for E. coli.

Figure 3: The population increases exponentially as cells divide. Microbes with different shapes divide similarly.

Some microbes produce new cells asymmetrically. In this situation, one parent cell produces a single daughter cell by a process called budding. During budding the parent cell develops a small protrusion known as the bud. The materials necessary to support a new cell are sent into the bud, which eventually splits from the parent cell to form a new daughter cell. The parent cell continues to make buds, but the budded daughter cells do not divide. Buds can remain connected in a chain or separate into individual cells (Figure 4). Saccharomyces cerevisiae, a yeast used to make bread, is a budding yeast.

There are also multicellular microbes, like algae and the fungi that form molds. For these microbes, multiple cells work together to keep the organism alive. Each cell might perform slightly different functions for the organism. When a parent cell divides, each daughter cell begins to perform specific functions based on its surroundings. The entire organism grows as new cells form and take on new functions. This is similar to the way larger organisms, like animals, grow.

Figure 4: Some cells use budding to produce daughter cells. A parent cell produces small protrusions called buds.


Procedimiento

Part 1: Preparing Strain 4-1 and 4-2 for transformation

  1. In advance of lab today, a small patch of each strain was grown for you on an LB agar petri dish. A video of this procedure is here.Strain 4-1 is a K-12 type of E. coli. Strain 4-2 is a B-type strain.
  2. Label 2 small eppendorf tubes either "4-1" or "4-2".
  3. Pipet 200 ul of CaCl2 solution into each eppendorf and then place the tubes on ice.
  4. Use a sterile wooden dowel to scrape up one entire patch of cells (NOT including the agar that they're growing on!) labeled "4-1," and then swirl the cells into its tube of cold CaCl2. A small bit of agar can get transferred without consequence to your experiment, but remember you're trying to move the cells to the CaCl2, not the media they're growing on. If you have a vortex, you can resuspend the cells by vortexing very briefly. If no vortex is available, gently flick and invert the eppendorf tube, then return it to your icebucket.
  5. Repeat, using a different sterile wooden dowel to scrape up the patch of cells labeled "4-2." Vortex briefly if possible. It's OK for some clumps of cells to remain in this solution.
  6. Keep these competent cells on ice while you prepare the DNA for transformation.

Part 2: Transforming Strains 4-1 and 4-2 with pPRL and pGRN

The cells you've prepared will be enough to complete a total of 6 transformations. You will transform the purple-color generator into each strain, and also the green-color generator into each strain. You will also use the last bit of competent cells as negative controls for the transformation.
A video of this procedure is here.

  1. Retrieve 2 aliquots of each plasmid for a total of 4 samples (2x pPRL, 2x pGRN). Each aliquot has 5 ul of DNA in it. The DNA is at a concentration of 0.04 ug/ul. You will need these values when you calculate the transformation efficiency at the end of this experiment.
  2. Label one of the pPRL tubes "4-1." Label the other pPRL tube "4-2." Be sure that the labels are readable. Place the tubes in the ice bucket.
  3. Label one of the pGRN tubes "4-1." Label the other pGRN tube "4-2." Be sure that the labels are readable. Place the tubes in the ice bucket.
  4. Flick the tube with the competent 4-1 strain and then pipet 75 ul of the bacteria into the tube labeled "pPRL, 4-1" and an additional 75 ul into the tube labeled "pGRN, 4-1." Flick to mix the tubes and return them to the ice. Save the remaining small volume of the 4-1 strain on ice.
  5. Flick the tube with the competent 4-2 strain and then pipet 75 ul into the tube labeled "pPRL, 4-2" and an additional 75 ul into the tube labeled "pGRN, 4-2." Flick to mix and store them, as well as the remaining volume of competent cells, on ice.
  6. Let the DNA and the cells sit on ice for 5 minutes. Use a timer to count down the time.
  7. While your DNA and cells are incubating, you can label the bottoms (not the tops) of the 6 petri dishes you'll need. The label should indicate the strain you've used ("4-1" or "4-2") and the DNA you've transformed them with ("pPRL," "pGRN," or "no DNA control")
  8. Heat shock all of your DNA/cell samples by placing the tubes at 42° for 90 seconds exactly (use a timer). This step helps drive the DNA into the cells and closes the porous bacterial membranes of the bacteria.
  9. At the end of the 90 seconds, move the tubes to a rack at room temperature.
  10. Add 0.5 ml of room temperature LB to the tubes. Close the caps, and invert the tubes to mix the contents.
  11. Using a sterilized spreader or sterile beads, spread 250 ul of the transformation mixes onto the surface of LB+ampicillin agar petri dishes. A video of the procedure is here.
  12. If desired the remaining volumes of transformation mixes can be plated on LB plates to show the effect of antibiotic selection on the outcome.
  13. Incubate the petri dishes with the agar side up at 37° overnight, not more than 24 hours.

Next day

In your lab notebook, you will need to construct a data table as shown below. These may be provided. Also be sure to share your data with the BioBuilder community here.