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Unidad 18: Tinción negativa - Biología

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Unidad 18: Tinción negativa

Biología estructural guiada por espectrometría de masas

La espectrometría de masas proporciona una determinación inequívoca de la estequiometría de subunidades.

Define la unión de lípidos u otras moléculas pequeñas.

Describe el cambio conformacional con reticulación química.

Permite el acoplamiento de componentes adicionales en mapas de densidad EM.

Con la convergencia de los avances en biología estructural, rompiendo específicamente las barreras de resolución en microscopía crioelectrónica y con los continuos desarrollos en cristalografía, están surgiendo nuevas interfaces con otros métodos biofísicos. Aquí consideramos cómo la espectrometría de masas puede informar estas técnicas al proporcionar una definición inequívoca de estequiometría de subunidades. Además, los desarrollos recientes que aumentan la resolución espectral de masas permiten que los detalles moleculares se atribuyan a la densidad no asignada dentro de mapas de alta resolución de la membrana y los complejos de proteínas solubles. Es importante destacar que también mostramos cómo los desarrollos en espectrometría de masas pueden definir condiciones de solución óptimas para guiar la determinación de la estructura aguas abajo, particularmente de biomoléculas desafiantes que se niegan a cristalizar.


1. Introducción

La microscopía electrónica de transmisión (EM) se puede utilizar para proporcionar información estructural sobre una variedad de muestras biológicas, desde células hasta macromoléculas. La resolución de la información que se puede adquirir mediante EM depende de las propiedades de la muestra, el método de preparación de la muestra utilizado, la especificación técnica del microscopio electrónico y los parámetros de imagen. La información 3D se puede obtener a partir de los datos EM 2D recopilados de diversas formas, incluido el análisis de partículas individuales [1], [2], la reconstrucción helicoidal [3], la tomografía electrónica (con o sin promediado de subtomogramas) [4], [5 ] y cristalografía 2D [6], [7]. Estos métodos de procesamiento de datos son adecuados para diferentes muestras, análisis de partículas individuales para complejos proteicos purificados & # x02018 homogéneos & # x02019 (como el ribosoma [8]), reconstrucción helicoidal para conjuntos de proteínas con simetría helicoidal (como microtúbulos [9]), tomografía para ensamblajes & # x02018únicos & # x02019 (como orgánulos y células [10]), y cristalografía 2D para proteínas, significativamente más pequeñas que 150 & # x000a0kDa que forman matrices 2D ordenadas (como bacteriorrodopsina [11]). El análisis de una sola partícula utiliza múltiples imágenes de proyección 2D sin procesar que contienen muchas & # x02018partículas individuales & # x02019 con diferentes orientaciones angulares. Las relaciones angulares entre cada vista de la muestra se pueden calcular en las imágenes para proporcionar información 3D. La tomografía electrónica y la cristalografía 2D obtienen diferentes vistas angulares inclinando la misma muestra muchas veces (normalmente inclinando la muestra entre & # x000b165 & # x000b0 y tomando una imagen cada 2 & # x000b0, produciendo 65 imágenes de la misma área). Se conoce la relación angular entre cada imagen, porque se define el incremento de inclinación, por lo que se puede utilizar para reconstruir información 3D. La generación de información estructural 3D a partir de micrografías 2D y patrones de difracción de electrones utilizando los métodos de procesamiento anteriores se ha revisado ampliamente en otros lugares [1], [2], [6], [7], [12].

Aquí, los pasos hacia la determinación de la estructura biológica por EM se discuten con un enfoque en la preparación de muestras y la obtención de imágenes de muestras para análisis de partículas individuales (flujo de trabajo de ejemplo que se muestra en la Fig.1) y tomografía electrónica, aunque muchos de los conceptos y consideraciones discutidos son transferibles.

Ejemplo de flujo de trabajo para la determinación de estructuras mediante EM de una sola partícula.


Proceso de tinción de Gram

El proceso de tinción de Gram incluye los siguientes pasos:

  1. Tome un portaobjetos limpio y seco y coloque una gota de agua destilada en el centro.
  2. Prepare un frotis bacteriano tomando un poco de inóculo del cultivo bacteriano con la ayuda del asa de inoculación.
  3. Luego, mezcle el inóculo con la gota de agua para preparar un frotis bacteriano fino girando el asa de inoculación en sentido horario y antihorario.
  4. Después de eso, el frotis bacteriano se fija con calor debajo de la lámpara de alcohol.
  5. Luego, inunde el frotis bacteriano con cristal violeta y déjelo reposar durante 1 minuto.
  6. Luego inunde la mancha con Yodo de Gram.
  7. Después de eso, agregue el agente decolorante, es decir 95% de etanol al frotis.
  8. Por último, agregue contratinción, es decir Safranina al frotis y déjelo reposar durante 1 minuto.
  9. Luego, lavar el portaobjetos con agua y seque el portaobjetos al aire.
  10. Al final, observar el portaobjetos de vidrio bajo el microscopio agregando inmersión en aceite a las células teñidas para diferenciar las células grampositivas y negativas.

Interpretación de los resultados de la tinción de Gram

  • Gram positivas: Si la célula bacteriana da un resultado positivo para la reacción de gram, se manchará Violeta.
  • Gram-negativos: Si la célula bacteriana da un resultado negativo para la reacción de Gram, se manchará Rosado.

Significado

La tinción de Gram es el paso principal para la identificación y clasificación de las bacterias en dos grupos, es decir, grampositivos y gramnegativos. Tiñe la pared celular bacteriana de manera diferente, dando color violeta a las bacterias grampositivas y color rosa a las bacterias negativas. Por lo tanto, agrega color a la pared celular de las bacterias, lo que aumenta la visibilidad bajo el microscopio óptico.

Además, la tinción de Gram también ayuda en el estudio de la morfología y arreglo de las bacterias. También nos ayuda a conocer la químico y propiedades físicas de las bacterias grampositivas y gramnegativas, según la diferencia de la pared celular.


Diferencia entre bacterias grampositivas y gramnegativas

Christian Gram, un médico danés en 1884, desarrolló una técnica de tinción para distinguir dos tipos de bacterias. Las dos categorías de bacterias basadas en la tinción de Gram son Gram positivas bacterias y Gram negativo bacterias. Las bacterias se tiñen primero con violeta cristal o violeta de genciana. Todas las células bacterianas se tiñerán de color azul o púrpura con una solución de violeta cristal. Luego, las células bacterianas se tratan con una solución de yodo (yodo de Lugol) y se lavan con alcohol (solución decolorante). Las bacterias que retienen el color azul o violeta del cristal violeta se denominan bacterias Gram positivas y las bacterias que pierden el color del cristal violeta después de lavarse con una solución decolorante se denominan bacterias Gram Negativas.

Las bacterias gramnegativas se tiñen posteriormente con safranina o fucsina para su observación al microscopio. Las bacterias gram negativas después de la tinción con safranina o fucsina aparecerán de color rojo o rosa. La tinción de Gram diferencia las bacterias por las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares al detectar las propiedades del peptidoglicano. El método de tinción de Gram es útil para diferenciar la mayoría de las especies bacterianas en dos categorías amplias. Aunque no todas las especies bacterianas se pueden diferenciar en base a la técnica de tinción de Gram, este método tiene una inmensa aplicación en el diagnóstico clínico y las investigaciones biológicas.

Similitudes entre bacterias Gram positivas y Gram negativas

Ø Ambas son células bacterianas

Ø Ambos grupos son procariotas

Ø Ambos carecen de orgánulos delimitados por membrana

Ø Ambos grupos tienen ADN circular covalentemente cerrado como material genético

Ø Ambos grupos contienen materiales genéticos extracromosómicos (plásmidos)

Bacterias Gram Positivas (azul) y Gram Negativas (Rosa) (fuente wikipedia)

Ø Ambos grupos poseen cápsula

Ø En ambos grupos, la pared celular está formada por peptidoglicano

Ø En ambos grupos, el citoplasma está rodeado por una bicapa lipídica con muchas proteínas que atraviesan la membrana.

Ø Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas suelen tener una capa superficial llamada capa S

Ø Ambos grupos de bacterias se someten a recombinación genética mediante transformación, transducción y conjugación.

Ø Ambos grupos se someten a fisión binaria como modo de reproducción asexual

Ø Ambos grupos contienen muchas especies flageladas y no flageladas

Ø Tanto las bacterias gram positivas como las gram negativas son inhibidas por antibióticos (su sensibilidad varía)

Ø Ambos grupos incluyen formas flageladas (móviles) y no flageladas (no móviles)

Más información & # 8230

Diferencia entre bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas


Los 3 mejores métodos de tinción | Botánica práctica

Para una observación más rápida de la morfología de las células bacterianas o de levadura, se aplica la técnica de tinción negativa y shynique.

1. Suspensión bacteriana / de levadura.

2. Portaobjetos, aguja de inoculación, pipetas, etc.

5. Solución de tinte de nigrosina (1% acuoso)

Se coloca una gota de suspensión bacteriana en un portaobjetos limpio y sin grasa. Luego alrededor de 1 ml. La suspensión se esparce con una aguja en el portaobjetos y se seca al aire. Finalmente, el frotis seco se fija con calor pasándolo a través de una llama. Luego se vierten unas gotas de solución de tinte de nigrosina sobre el frotis y se esparcen uni & tímidamente sobre el portaobjetos. Finalmente, el frotis con tinte se seca y se examina microscópicamente.

Las bacterias o células de levadura se ven como cuerpos brillantes sobre un fondo oscuro.

Método # 2. Tinción simple:

I. Por Ziehl & # 8217s Carbol Fuchsin:

Para facilitar la observación al microscopio, es necesario teñir las bacterias con tintes adecuados. Por lo general, se emplean tintes básicos para teñir bacterias.

(b) Portaobjetos, aguja, quemador, pipeta, microscopio, etc.

Transfiera una pequeña gota de una suspensión bacteriana al centro de un portaobjetos sin grasa y extiéndalo uniformemente sobre un área de aproximadamente 1 × 2 cm. Deje que el frotis se seque al aire y luego fíjelo pasando de 3 a 4 veces rápidamente sobre una llama.

Coloque el portaobjetos en el borde de un petridish y cubra el frotis con tinción de carbol fucsina. Deje que la mancha reaccione durante 2 minutos y luego lave el portaobjetos con agua corriente. Seque el portaobjetos (Fig. 4.2a.). Observe al microscopio utilizando un objetivo de inmersión en aceite.

Las células bacterianas se ven violáceas.

II. Por Crystal Violet:

1. Solución de colorante violeta cristal (0,5% ac.)

2. Portaobjetos, aguja, quemador, pipeta, microscopio, etc.

1. Tome 1 o 2 lazos de una suspensión bacteriana en un portaobjetos limpio. Haga un frotis fino en el portaobjetos y déjelo secar. Fije la película pasando el portaobjetos seco 3 o 4 veces rápidamente sobre una llama.

2. Cubra el portaobjetos con la mancha y déjelo actuar durante 1 minuto.

3. Retirar la mancha, lavar con agua y secar entre papeles secantes.

4. Examine el portaobjetos bajo un microscopio y evite los objetivos de alta y baja potencia.

Tenga en cuenta la forma de los organismos tal como se observa. Las células bacterianas adquieren una coloración violeta (Fig. 4.2b).

Método n. ° 3. Tinción diferencial:

I. Tinción de Gram:

Este método se utiliza para la clasificación de microorganismos mixtos de acuerdo con sus propiedades de tinción. Ciertas bacterias cuando se tratan con un tinte como cristal (o metil) violeta y luego con yodo, la mancha se vuelve & # 8220 fijo & # 8221 para que el tratamiento posterior con un agente decolorante, por ejemplo, alcohol o acetona & # 8211, no elimine el color. Sin embargo, algunos organismos se decoloran mediante este proceso.

Las especies que retienen el color se denominan & # 8220 Gramo positivo & # 8221 y los decolorados se denominan & # 8220 Gramo negativo & # 8221. Para hacer visibles los organismos decolorados y distinguirlos de los que retienen el color, se aplica luego un contraste o contratinción, generalmente la primera tinción es violeta y se puede diferenciar de la contratinción que es roja.

1. Primera tinción: (violeta cristal o violeta de metilo) & # 8211 5 g.

Disuelva 20 g. KI en 250 ml. agua y luego agregue 10 gm. I2 cuando se disuelva, complete hasta 1 lit.

4. Alcohol absoluto o acetona al 80%.

5. Pipetas, gotero, microscopio, papel secante, etc.

1. Haga un frotis (como se indicó en el expt. Anterior), seque y luego fije con calor.

2. Cubra el portaobjetos con una solución de violeta de cristal (o de metilo) y déjelo actuar durante unos 30 & # 8211 60 segundos.

3. Quite la mancha y, sosteniendo el portaobjetos en un ángulo hacia abajo, vierta la solución de yodo para eliminar el cristal violeta. Cubra el portaobjetos con una solución de yodo fresca y déjelo actuar durante unos 30 & # 8211 60 segundos.

4. Lavar la solución de yodo con alcohol absoluto hasta que cese el color de la preparación.

5. Lavar con agua. Enjuague con una pequeña cantidad de contratinción.

6. Aplique la contratinción durante 1 & # 8211 2 minutos.

7. Lavar con agua y secar entre papeles secantes.

8. Examinar al microscopio con un objetivo de inmersión en aceite.

Explicación de la tinción de Gram:

La explicación más plausible de este fenómeno está asociada con la estructura y composición de la pared celular bacteriana. Las diferencias en el grosor de las paredes celulares entre estos dos grupos de bacterias pueden ser importantes. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas son generalmente más delgadas que las de las bacterias gram positivas.

Las bacterias gramnegativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias gram positivas. La evidencia experimental sugiere que durante la tinción el tratamiento con alcohol extrae el lípido, lo que da como resultado un aumento de la porosidad o permeabilidad de la pared celular. De este modo, se puede extraer el complejo cristal violeta-yodo (CV & # 8211 I) y se decolora el organismo Gram-negativo.

Estas células adquieren posteriormente el color de la tinción de contador de safranina. Las paredes celulares de las bacterias Gram positivas, debido a su diferente composición (menor contenido de lípidos), se deshidratan durante el tratamiento con alcohol. El tamaño de los poros disminuye, la permeabilidad se reduce y el complejo CV-I no se puede extraer. Por lo tanto, estas células permanecen violetas violetas.

Otra explicación, algo similar, también se basa en las diferencias de permeabilidad entre los dos grupos de bacterias. En las bacterias Gram-positivas, el complejo CV & # 8211 I queda atrapado en la pared después del tratamiento con etanol, lo que presumiblemente causa una disminución en el diámetro de los poros en el peptidoglicano de la pared celular.

Las paredes de bacterias Gram-negativas y shyria tienen una cantidad mucho menor de peptidog y shylycan, que está menos reticulado que en las paredes de las bacterias Gram-positivas. Los poros en el peptidoglicano de bacterias gramnegativas y tímidas permanecen lo suficientemente grandes incluso después del tratamiento y secado con etanol para permitir la extracción del complejo CV & # 8211 I.

Aunque los organismos gramnegativos fracasan sistemáticamente en retener la tinción violeta cristal primaria, los organismos grampositivos a veces pueden mostrar variaciones a este respecto, es decir, una reacción de variable Gram. Por ejemplo, los cultivos antiguos de bacterias grampositivas pierden la capacidad de retener el violeta cristal y, por lo tanto, se tiñen con safranina.

II. Tinción de endosporas:

Las endosporas maduras de las bacterias no se tiñen fácilmente debido a la presencia de una capa impermeable entre el citoplasma de esporas y la capa de esporas.

Sin embargo, penetran manchas especiales y concentradas. Una de esas manchas es el verde malaquita.

(i) Solución saturada de verde de malaquita (verde de malaquita disuelto en agua destilada).

(ii) Safranina 0,25% ac. solución.

(iii) Suspensión de cultivo bacteriano de 72 horas.

Preparar el frotis bacteriano de la forma habitual y fijar pasando el portaobjetos 20 veces sobre una llama. Cubra el frotis con verde malaquita y déjelo reaccionar durante 10 minutos. Enjuague con agua del grifo durante 10 segundos. y luego teñir con safranina durante 1 minuto. Enjuague con agua, seque y examine bajo inmersión en aceite. Haz un boceto a mano alzada.

Método: II (Método Writz & # 8217s):

Tinción por Ziehl & # 8217s Carbol fucsina y Dorner & # 8217s Solución de nigrosina:

(a) Suspensión de cultivo bacteriano de 72 horas.

(b) Carbol fucsina de Ziehl & # 8217s (se disuelven 0,3 g de fucsina básica al 90% en 10 ml de etanol al 95% y luego se completa el volumen hasta 100 ml añadiendo agua).

(c) Solución de nigrosina de Dorner & # 8217s (se disuelven 10 g de nigyyyrosin en 100 ml de agua destilada y se hierve durante 30 minutos y luego se añaden 0,5 ml de formalina al 40% y se filtra a continuación).

(e) Tubo de ensayo, gradilla para tubos de ensayo.

Aproximadamente 1 ml. de suspensión bacteriana se toma en un tubo de ensayo y luego se agrega una cantidad igual de carbol fucsina. En un portaobjetos, un asa de la preparación teñida se mezcla con un asa de solución de nigrosina. La preparación se unta lo más finamente posible y se seca rápidamente. La porción fina de esta preparación de frotis se observa al microscopio utilizando objetivos de inmersión en aceite.

El fondo aparece negro grisáceo, las células incoloras y la endospora rojo brillante (Fig. 4.3).

III. Tinción de flagelos:

Algunos organismos eucariotas y procariotas pueden moverse activamente mediante un componente celular conocido como flagelo que es tan delgado que no entra dentro del poder de resolución de un microscopio de campo brillante. Como tal, requiere una tinción especial que lo haga visible.

(i) Cultivo inclinado de 18 horas de Bacillus aspiarius

(ii) Tubo de cultivo y agua destilada (esterilizada)

(iii) Portaobjetos limpio y sin grasa.

(a) Ácido tánico (solución acuosa al 10%) & # 8211 18 ml.

(b) Fucsina básica (0,5% en etanol) & # 8211 0,5 ml.

(c) HCl (concentrado) & # 8211 0,5 ml.

1. La inclinación se llena hasta la mitad con agua y se mantiene a temperatura ambiente durante aproximadamente 1/2 hora sin alteraciones.

2. Se coloca una gota de suspensión sobre el portaobjetos y se sujeta de forma inclinada para que la suspensión recorra la superficie del portaobjetos muy lentamente.

4. Se tiñe siguiendo el método de Bailey & # 8217s.

(i) Se filtra la solución & # 8216A & # 8217 y se deja que el filtrado permanezca en el portaobjetos durante 3 & # 8211 4 minutos.

(ii) Después de verter la solución & # 8216A & # 8217 del portaobjetos, se añade la solución & # 8216B & # 8217 y se deja reposar durante 7 min.

(iii) El frotis teñido se lava con agua destilada.

(iv) A continuación, el portaobjetos se llena con la solución & # 8216C & # 8217 y se deja reposar durante 1 minuto con calor suave.

5. El frotis se lava con agua y se seca al aire.

6. Se examina bajo el objetivo de inmersión en aceite.

Se observan flagelos de Peritrichonus (color rosado (oscuro)) adheridos a la superficie de los glóbulos rojos. También son visibles algunos flagelos rotos.

1. Se debe tener mucho cuidado de no alterar la suspensión bacteriana, que puede causar el desprendimiento de los flagelos.

2. Durante la tinción con la solución & # 8216C & # 8217, se debe tener cuidado de no hervir directamente sobre la llama.

IV. Tinción de cápsulas:

Algunas células bacterianas están rodeadas por una sustancia viscosa que forma una envoltura alrededor de la célula. Esta estructura se conoce como cápsula. Esta cápsula toma un tipo especial de mancha y revela su presencia.

1. Cultivo inclinado de Klebsiella de 24 horas.

2. Tubo de cultivo y agua destilada (esterilizada) para hacer la suspensión.

3. Deslizador limpio y sin grasa.

a) 1% ac. solución de rojo congo.

b) Mancha Maneval & # 8217s. (2 ml. De solución acuosa al 1% de fucsina ácida, 4 ml. De solución acuosa al 20% de cloruro férrico, 10 ml. De ácido acético glacial y 30 ml. De solución acuosa al 5% de fenol mezclados bien y filtrado).

1. Se prepara una suspensión acuosa de Klebsiella.

2. Se coloca una gota de rojo Congo en un portaobjetos limpio y sin grasa.

3. Se retira un bucle de suspensión bacteriana, se mezcla con rojo Congo y se extiende suavemente sobre el portaobjetos. Se deja secar al aire.

4. El frotis se inunda con tinte Maneval & # 8217s y se mantiene durante al menos 3 minutos.

5. El frotis teñido se lava con agua destilada y se seca al aire.

6. La preparación se examina bajo el objetivo de inmersión en aceite.

Las cápsulas se ven como zonas sin teñir, pero el fondo es de azul a negruzco y las células se tiñen de rojo a marrón rojizo según el grosor del frotis.

Se requieren las siguientes soluciones:

1. Solución acuosa de violeta cristal al 1%.

2. Solución acuosa de sulfato de cobre al 20%.

1. Se prepara un frotis fino y se seca al aire sin fijación.

2. Se aplica violeta cristal durante 2 minutos sin calentar.

3. Se lava con solución de sulfato de cobre.

4. Luego se seca, se seca al aire y se examina al microscopio.

Cápsula & # 8211 violeta pálido, célula bacteriana & # 8211 violeta oscuro.

V. Tinción ácido-rápido:

Este es un procedimiento de tinción único para identificar algunos grupos característicos de bacterias denominados & # 8220 Bacilo ácido rápido & # 8221, que son extremadamente patógenos para el hombre. Estas bacterias pertenecen al género & # 8211 & # 8220Mycobacterium & # 8221.

1. Tinción primaria & # 8211 Carbol fucsina (mezcla de fucsina básica y fenol diluido).

2. Contratinción & # 8211 Azul de metileno (1% acuoso)

3. Mezcla de ácido y alcohol (3% HCl o HNO3 en alcohol etílico al 95%)

4. Portaobjetos, aguja, pipeta, mechero, papel secante.

1. Se hace un frotis bacteriano en un portaobjetos sin grasa y luego se fija con calor de la forma habitual.

2. El frotis se inunda con el colorante primario y se mantiene durante 3 & # 8211 5 minutos (sin secar). El muerto se lava con agua.

3. Luego, el frotis se lava con una mezcla de ácido y alcohol y finalmente se contratiñe con azul de metileno durante 2 & # 8211 3 minutos.

Los organismos resistentes a los ácidos se tiñen de rojo intenso, mientras que otros organismos no resistentes a los ácidos se tiñen de azul.

VI. Tinción de organismos de la cuajada:

& # 8216Curd & # 8217 es un producto lácteo que se forma debido a la actividad microbiológica en la leche. La bacteria Lactobacillus produce ácido en la leche y luego hace que la leche se agria y finalmente la leche se convierte en cuajada. Además de la cuajada de Lactobacillus, también contiene la bacteria Streptococcus lactis y algunas levaduras.

2. Reactivos para tinción de Gram de organismos de cuajada (tinción violeta cristal, solución de yodo, tinción de safranina, solución de alcohol).

3. Portaobjetos, aguja, pipeta, vaso de precipitados, papel secante.

Se coloca un bucle lleno de cuajada en un portaobjetos limpio sin grasa y se diluye con 1 gota de agua esterilizada. Luego se prepara un frotis fino en el portaobjetos, se seca al aire y finalmente se fija con calor. El frotis se tiñe siguiendo el procedimiento habitual de tinción de Gram y se examina al microscopio utilizando un objetivo de inmersión en aceite. Se examina y registra el tamaño, la forma y el gramo de cada organismo.


Información de soporte

S1 Fig. Tres diferentes interfaces NTD M1 reveladas por cristalografía de rayos X previa.

Se muestran (A) interfaz de simetría C2, presente en la estructura PDB: 1AA7 [14], y (B) interfaces apiladas y (C) laterales presentes en la estructura PDB: 1EA3 [15]. Los residuos de lisina, que se utilizan a continuación en los análisis de reticulación, se muestran en rojo. Las ubicaciones hipotéticas de los CTD se muestran en verde. CTD, dominio C-terminal M1, proteína de matriz 1 NTD, dominio N-terminal PDB, banco de datos de proteínas

S2 Fig. Cryo-EM de oligómeros de proteína WT-M1.

(A) Micrografía crio-EM representativa de oligómeros WT-M1. (B) La transformada de Fourier de la imagen en (A) muestra líneas de capa. La primera línea de capa indica el paso helicoidal de 111 Å del oligómero WT-M1. (C) Los promedios de clase 2D que se centran en el centro de los segmentos helicoidales muestran una gran heterogeneidad de densidad adicional a cada lado de la capa exterior del filamento. crio-EM, microscopía crioelectrónica M1, proteína de matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de longitud completa.

S3 Fig. El ensamblaje M1 depende del tiempo, así como de la concentración de proteína y NaCl.

Micrografías electrónicas de tinción negativa (A) después de 2 hy (B) 24 h de incubación a las concentraciones indicadas de proteína en presencia de NaCl 2 M. (C) Micrografías electrónicas de tinción negativa después de incubaciones de 24 h de M1 10,8 μM ensambladas a las concentraciones de NaCl indicadas. Barra de escala = 5.000 Å. M1, proteína de matriz 1

S4 Fig. Reconstrucción helicoidal Cryo-EM de filamentos M1-V97K.

(A) Transformada de Fourier de una micrografía representativa que muestra el anillo de agua. (B) Indexación de línea de capa. (C) Promedios de clase 2D representativos. (D) Resolución local de la unidad asimétrica M1-V97K. (E) La curva FSC muestra una resolución de 3,4 Å utilizando el límite de 0,143. crio-EM, microscopía crioelectrónica FSC, correlación de capa de Fourier M1, proteína de matriz 1

S5 Fig. Los enlaces cruzados descubiertos se asignan bien a la estructura M1-V97K.

(A) Representación de cinta de una proteína M1-V97K en las mismas orientaciones que se muestran en la Fig. 5, mostrando los enlaces cruzados descubiertos aplicando el mismo esquema de color que en la Fig. 4. Los residuos de lisina se muestran como barras de naranja. (B) Igual que en (A), excepto que solo se muestran los enlaces cruzados verde y rojo para resaltar los enlaces cruzados formados por lisina K242 y K252, ubicados en el bucle flexible L12. M1, proteína de matriz 1

S6 Fig. La estructura crio-EM M1-V97K revela interacciones moleculares entre monómeros adyacentes.

(A) Un grupo de 6 unidades asimétricas con la cadena inferior identificada como N (rosa), N + 1 (rojo) y N + 2 (cian) y la cadena superior identificada como N + 22 (verde), N + 23 (amarillo) y N + 24 (azul). Los círculos punteados resaltan 3 grupos de interacciones intermoleculares. (B) Interacciones entre N CTD y N + 23 NTD en la interfaz entre cadenas. Cinco residuos T167-169, N170 y R174 de N participan en un bolsillo hidrofóbico que también contiene Q75 de N + 23. (C) Interacciones entre DTN de 2 unidades asimétricas adyacentes N + 23 y N + 24. Residuos L3, L4, T140 y F144 de N + 24 forman un bolsillo hidrofóbico con I51 de N + 23. (D) El lazo de conexión CL9 y la hélice α10 del CTD de N + 23 interactúan con N + 24 NTD a través de enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas. (E) Helices α11 y α12 del CTD de N + 23 interactúan con N + 24 a través de enlaces de hidrógeno, puentes salinos e interacciones hidrófobas. Las líneas discontinuas amarillas indican puentes de hidrógeno y puentes salinos. Las orientaciones se modifican para facilitar la visualización. CL, bucle de conexión crio-EM, microscopía crioelectrónica CTD, dominio C-terminal M1, proteína de matriz 1 NTD, dominio N-terminal.

S7 Fig. Mutaciones de WT-M1 mapeadas en la estructura M1-V97K.

Todos los residuos mutados en el fondo de WT-M1 se muestran como esferas en el contexto del oligómero M1-V97K. Los residuos mutados que dieron como resultado una oligomerización de una sola capa, no aparente o multicapa se muestran como esferas rojas, azules y naranjas, respectivamente. El residuo I51, en el que las mutaciones no dieron como resultado una oligomerización aparente o multicapa, se muestra en verde. M1, proteína de matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de longitud completa.

S8 Fig. Ángulos entre interfaces apiladas.

Comparación de la interfaz apilada entre 2 subunidades (gris) de la estructura cristalina de NTD M1 (PDB: 1EA3) [15] y las NTD de 2 subunidades M1, N + 23 (amarillo) y N + 24 (azul), de la estructura crio-EM de oligómeros M1-V97K. La falta de superposición de la subunidad amarilla y gris más a la izquierda revela la ligera alteración en la interfaz apilada entre la NTD y las estructuras M1 de longitud completa. crio-EM, microscopía crioelectrónica M1, proteína de matriz 1 NTD, dominio N-terminal PDB, banco de datos de proteínas

S9 Fig. Conservación de aminoácidos entre 3544 IAV M1.

Los aminoácidos se muestran con cada residuo coloreado por su puntuación de conservación, calculada utilizando el servidor ConSurf. M1, proteína de matriz 1

S10 Fig. Orientación y dimensiones de 1 subunidad monomérica dentro del filamento M1-V97K.

Se muestran 3 subunidades adyacentes dentro del tubo M1-V97K con la interfaz apilada entre los monómeros M1 indicada. Un cuadro resalta la longitud y el ancho de la subunidad amarilla. El NTD apunta hacia el exterior del tubo. M1, proteína de matriz 1 NTD, dominio N-terminal.

S11 Fig. Sensibilidad al pH de los oligómeros WT-M1 y V97K-M1.

(A) Micrografías electrónicas de tinción negativa de oligómeros WT-M1 (izquierda) y V97K-M1 (derecha) que se sedimentaron y resuspendieron en tampón a pH 7 o 5,5 como se indica. (B) Cuantificación de SDS-PAGE de sedimentos (P) y sobrenadantes (S) después de resuspender los oligómeros WT-M1 y M1-V97K en tampón a pH 7 o 5,5. M1, proteína de matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de longitud completa.

Tabla S1. Interfaces proteína-proteína y condiciones de cristalización de todas las estructuras de IAV NTD M1 depositadas en el AP en rcsb.org.

IAV, virus de la influenza A M1, proteína de matriz 1 NTD, dominio N-terminal PDB, banco de datos de proteínas

Tabla S2. Relacionado con la figura 3.

Mutaciones en la interfase apilada, lateral y del dímero C2.

Tabla S3. Relacionado con la figura 5.

Recopilación de datos Cryo-EM, procesamiento y estadísticas de refinamiento del modelo de los filamentos WT-M1 y M1-V97K M1. crio-EM, microscopía crioelectrónica M1, proteína de matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de longitud completa.

Película S1. Relacionado con la figura 6.

Interacciones de la subunidad M1 dentro del oligómero M1-V97K. M1, proteína de matriz 1

Datos S1. Relacionado con la figura 4.

Datos de MS sin procesar para M1 de oligómeros M1-V97K. MS, espectrometría de masas M1, proteína de matriz 1

Datos S2. Relacionado con la figura 4.

Datos de MS sin procesar para M1 de oligómeros WT-M1. MS, espectrometría de masas M1, proteína de matriz 1 WT-M1, PR8 M1 de longitud completa.

Datos S3. Relacionado con la figura 4.

Datos de MS sin procesar para M1 de viriones PR8 a pH 7. MS, espectrometría de masas M1, proteína de matriz 1 PR8, A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1)

Datos S4. Relacionado con la figura 4.

Datos de MS sin procesar para M1 de viriones PR8 a pH 5,5. MS, espectrometría de masas M1, proteína de matriz 1 PR8, A / Puerto Rico / 8/1934 (H1N1)

Datos S5. Relacionado con la figura 4.

Datos de MS sin procesar para M1 de viriones Udorn a pH 7. MS, espectrometría de masas M1, proteína de matriz 1 Udorn, A / Udorn / 1972 (H3N2) virus filamentoso

Datos S6. Relacionado con la figura 4.

Datos de MS sin procesar para M1 de viriones Udorn a pH 5,5. MS, espectrometría de masas M1, proteína de matriz 1 Udorn, A / Udorn / 1972 (H3N2) virus filamentoso

Imágenes Raw S1.


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