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¿Por qué se considera la lisis de eritrocitos de oveja como la vía clásica de activación del complemento y la del conejo como alternativa?


Cualquier sugerencia es altamente apreciada.


La lisis de eritrocitos de oveja que menciona en realidad involucra sensibilizado eritrocitos, es decir, eritrocitos ya recubiertos con anticuerpos. Los complejos antígeno-anticuerpo son bien conocidos por su activación de la ruta clásica del complemento.

De hecho, los eritrocitos de conejo recubiertos de anticuerpos también activan la vía clásica del complemento.$^1$. Por tanto, los eritrocitos de oveja no son especiales en este sentido.

La diferencia se produce cuando solo incubamos eritrocitos, desprovistos de anticuerpos sensibilizantes, con suero que contiene factores del complemento. En esta situación, los eritrocitos del conejo, pero no los de la oveja, se lisan por activación alternativa del complemento. ¿Por qué hay tanta diferencia?

Fearon y Austen$^2$ mostró que esto se debe a un efecto protector de la membrana de eritrocitos de conejo sobre C3b. Normalmente, C3b es inhibido por el factor I y el factor H en suero. Este efecto se pierde con los eritrocitos de conejo (pero no de oveja), lo que explica la diferencia en la lisis mediada por el complemento.


Artículos de revistas citados:

  1. Dijk HV, Rademaker PM, Willers JMN. Estimación de la ruta clásica de la actividad del complemento de ratón mediante el uso de eritrocitos de conejo sensibilizados. Revista de métodos inmunológicos. 22 de diciembre de 1980; 39 (3): 257-268. https://doi.org/10.1016/0022-1759(80)90060-5
  2. Fearon DT, Austen KF. Activación de la vía alternativa del complemento con eritrocitos de conejo por elusión de la acción reguladora de las proteínas de control endógenas. Revista de Medicina Experimental. 1 de julio de 1997; 146 (1): 22-33. https://doi.org/10.1084/jem.146.1.22

El sistema del complemento es una respuesta inmune innata que tiene tres vías, como se muestra en la imagen a continuación.

La descomposición de los glóbulos rojos evalúa la capacidad funcional del sistema del complemento. Este experimento se titula: "Actividad del complemento total", "CH50" o "CH100". ¿Es esto a lo que te refieres?

Hemólisis de oveja Los glóbulos rojos se producen a través de la vía clásica del complemento.

Más información: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360204/


Fronteras en inmunología

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Introducción

El sistema del complemento es una cascada proteolítica de autopropagación de proteínas y funciona dentro del marco de la inmunidad innata. Para responder a múltiples patrones de peligro, el complemento puede iniciarse por tres vías principales: clásica, lectina y alternativa. Los dos primeros se activan tras la detección de estructuras no propias o del yo alterado por moléculas sensoras capaces de reconocer varios patrones moleculares (complejo C1, lectina de unión a manosa (MBL) y ficolinas), mientras que el último se mantiene activo constantemente a un nivel bajo. y se propaga sólo debido a la falta de inhibición por parte de los propios reguladores del cuerpo [1], [2]. Todas las vías convergen a nivel de la molécula C3, donde los eventos posteriores pueden amplificarse mediante un mecanismo de retroalimentación positiva respaldado por convertasas del complemento: la convertasa C3 de la vía clásica / lectina (C4b2a) o la vía alternativa C3 convertasa (C3bBb) [3] . Estas convertasas escinden aún más C3 a C3b y C3a, de las cuales C3b se une a superficies cercanas, proporcionando una plataforma de ensamblaje de convertasa novedosa, o convertasas C3 preensambladas, cambiándolas a convertasas C5 (C4b2aC3b o C3bBbC3b, respectivamente) [4]. La convertasa C5 escinde las moléculas C5 en C5a y C5b y esta última inicia la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC, C5b678polyC9) y su inserción en una membrana diana. La lisis osmótica debido a la deposición de MAC junto con la liberación de anafilatoxinas C3a y C5a, así como la opsonización por C3b, son los mecanismos efectores del complemento que aseguran la protección contra patógenos invasores, la eliminación de complejos inmunes, las células moribundas e incluso la orquestación de respuestas inmunes innatas [1], [ 2]. Sin embargo, el complemento también puede dañar los propios tejidos cuando no se controla adecuadamente. La obvia necesidad de mantener el sistema estrechamente equilibrado se refleja en el hecho de que, además de 23 proteínas reconocidas hasta ahora como implicadas en el inicio y propagación de la cascada del complemento, hasta la fecha se ha identificado casi el mismo número de inhibidores del complemento [1 ]. Cualquier alteración de este delicado equilibrio [5] puede resultar en una mayor susceptibilidad a infecciones [6], [7], [8], [9] o enfermedades autoinmunes [10], [11], [12], [13], [14], [15] debido a la deficiencia del complemento. Además, la activación del complemento excesiva o equivocada está implicada en la mayoría de las enfermedades inflamatorias crónicas y agudas. Además, muchas bacterias y virus han desarrollado estrategias para evadir el sistema del complemento, como capturar inhibidores del huésped o expresar sus propios inhibidores eficientes, o secretar proteasas que agotan el complemento (revisado en [16]). La mayoría de los inhibidores del complemento humanos y microbianos descritos se dirigen al complemento en la etapa de convertasas. Los inhibidores de la fase líquida más abundantes presentes en el suero en concentraciones de varios cientos de microgramos por mililitro, como el factor H (FH) [17] o la proteína C4b-bidning (C4BP) [18], se caracterizan por una actividad de aceleración de la descomposición de la convertasa, una capacidad para acelerar desensamblaje de convertasa, así como actividad de cofactor, ya que actúan como cofactores que apoyan la escisión por el factor I (FI) de los componentes del complemento activados C3b y / o C4b necesarios para la formación de convertasa. Además, todas las células humanas expresan al menos un inhibidor unido a la membrana que muestra actividad de aceleración de la descomposición (CD35 / CR1, CD55 / DAF) o actividad de cofactor (CD35 / CR1, CD46 / MCP) [1]. Los estudios funcionales de inhibidores del complemento supuestos y reconocidos y la disección de su influencia en la formación y el desmontaje de convertasa son cruciales para evaluar su importancia general en toda la cascada del complemento.

Históricamente, los ensayos que determinan la actividad de aceleración de la descomposición se realizaron en eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos (vía clásica) o eritrocitos de conejo (vía alternativa) en tampones veronales permisivos para las vías individuales [19], [20], [21]. El tampón DGVB ++ que contiene iones de magnesio y calcio necesarios para la interacción C2-C4 [22] y la formación del complejo C1q [23], respectivamente, permite la activación de las vías clásica y de la lectina, así como la vía alternativa (en concentraciones séricas suficientemente altas) . Sólo la vía alternativa puede proceder en el tampón Mg 2+ -EGTA, que contiene iones de magnesio y un agente quelante de calcio [24]. En un ensayo típico, la convertasa C3 clásica se construye paso a paso en eritrocitos usando C1, C4 y C2 purificados y se denomina EAC142 (E significa eritrocitos de oveja y A para anticuerpo sensibilizador de amboceptor). La incubación adicional con C3 purificado da como resultado la formación de convertasa C5 clásica (EAC1423). La misma plataforma se puede utilizar para construir convertases alternativas funcionales. En tal caso, C4 y C2 se disocian del complejo mediante incubación en un tampón que contiene EDTA 10 mM seguido de la adición de factor D, factor B (FB) y propidina [19]. Los estudios de la convertasa alternativa también se realizaron utilizando métodos de microplaca, donde C3b purificado (o dímeros C3b para convertasa alternativa C5) se recubrieron en la superficie y seguidos de incubación con FB y D en presencia de iones de níquel. La convertasa restante se cuantificó luego mediante la detección de FB unido [19]. Otro método utilizado con éxito para determinar el modo de inhibición del complemento de la convertasa del complemento alternativo empleó técnicas de resonancia de plasmón de superficie [25].

Aquí proponemos un método novedoso basado en ensayos hemolíticos y sueros empobrecidos en C3 o C5. Dichos sueros, a los que se les ha eliminado C3 o C5 mediante cromatografía de afinidad, apoyan el desarrollo de la cascada del complemento hasta el nivel de convertasa deseado. Elimina la necesidad de la formación costosa, gradual y lenta de complejos enzimáticos a partir de componentes purificados. Además, el uso de suero completo limita el riesgo de inactivación de proteínas durante el procedimiento y proporciona condiciones mucho más fisiológicas que las que requieren la inmovilización de proteínas en una superficie artificial o iones de metales pesados. La construcción de convertasas del complemento en los eritrocitos permite una lectura fácil del ensayo mediante la cuantificación espectrofotométrica de la hemoglobina liberada. Los principios del método se muestran y explican en la Fig.1.

Las convertasas del complemento clásicas se ensamblan en eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos y se incuban con suero empobrecido en C3 o C5. La falta de un componente particular permite que la cascada del complemento proceda solo a la etapa de convertasa C3 clásica (C4b2a) o convertasa C5 clásica (C4b2a3Cb). La baja concentración sérica y la sensibilización con anticuerpos permiten la vía clásica del complemento. La formación de convertasas alternativas C3 (C3bBb) y C5 (C3bBbC3b) se realiza en eritrocitos de conejo tras el tratamiento con una concentración moderada de suero empobrecido en C5 en tampón Mg-EGTA (que secuestra calcio pero no magnesio). La adición de suero de cobaya (como fuente del componente del complemento faltante así como de los componentes MAC) diluido en EGTA inicia la lisis solo a partir de complejos convertasa preformados ya que la quelación de cationes divalentes previene la formación de convertasa de novo inhibida. Por tanto, la cantidad de hemoglobina liberada es proporcional al número inicial de convertasas activas formadas en los eritrocitos.


Introducción

Espiroquetas pertenecientes a la Borrelia burgdorferi sensu lato complejos son el agente causante de la borreliosis de Lyme e incluyen B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, y B. afzelii. B. burgdorferi sensu stricto (denominado B. burgdorferi en adelante) causa 300.000 casos de enfermedad de Lyme en los Estados Unidos cada año [1], mientras que B. garinii y B. afzelii son el agente etiológico más común de la enfermedad de Lyme en Europa y Asia [2]. B. burgdorferi sensu lato son los principales agentes infecciosos transmitidos por artrópodos en el hemisferio norte y son capaces de diseminación hematógena mediante la cual se coloniza una amplia gama de tejidos del huésped remoto. Para sobrevivir y persistir en huéspedes inmunocompetentes, las espiroquetas asociadas a Lyme deben evadir las defensas inmunitarias del huésped, incluida la cascada proteolítica evolutivamente antigua de la inmunidad innata conocida como sistema del complemento.

El complemento es un grupo de casi tres docenas de proteínas que se combinan para coordinar un conjunto estrictamente controlado de reacciones proteolíticas dirigidas a las superficies de las células diana [3, 4]. La activación del complemento se inicia mediante proteínas solubles de reconocimiento de patrones que son capaces de discernir superficies moleculares extrañas. El modo específico de reconocimiento define las tres vías convencionales del complemento conocidas como vía clásica, vía de lectina y vía alternativa. Por ejemplo, la ruta clásica se activa tras la unión de la proteína del complemento C1q a los anticuerpos unidos al antígeno (es decir, complejos inmunes). Asimismo, la vía de la lectina se activa tras la unión de lectina o ficolinas de unión a manosa a estructuras de carbohidratos extrañas, mientras que la vía alternativa se activa constitutivamente a niveles bajos mediante un mecanismo denominado "tick-over" [3,4]. Independientemente del evento de iniciación molecular, las tres vías proceden de la activación de una serie de serina proteasas especializadas que convergen en la molécula central del complemento, C3. C3 se escinde por complejos enzimáticos llamados C3 convertasas que dan como resultado la amplificación del complemento en la superficie diana, la activación de la vía terminal del complemento y la inducción de funciones efectoras posteriores. La activación del complemento da como resultado en última instancia la opsonización de las superficies objetivo, el reclutamiento de fagocitos profesionales y la lisis directa de las membranas susceptibles [3, 4].

Las células hospedadoras expresan varias proteínas que funcionan para regular el complemento y, por lo tanto, están típicamente protegidas de la orientación no intencionada por la cascada. En contraste, los patógenos que trafican en fluidos donde el complemento está presente en altas concentraciones necesariamente han desarrollado mecanismos para evadir la detección y activación del complemento. Por ejemplo, muchos patógenos humanos secretan proteínas asociadas a la membrana que se unen a los reguladores endógenos del complemento del huésped [5]. En este sentido, una diana bacteriana prominente es el regulador negativo dominante de la vía alternativa, el factor H. De hecho, B. burgdorferi sensu lato Se sabe que las propias especies codifican hasta cinco proteínas distintas (CspA, CspZ, ErpP, ErpC y ErpA; tenga en cuenta que las tres últimas también se denominan proteínas Erps relacionadas con OspE) que se unen y reclutan el factor H en la superficie bacteriana, por lo que secuestrando sus actividades protectoras complementarias [6-13]. Además de las proteínas de unión al factor H, se conocen distintas proteínas borreliales que bloquean específicamente la formación del complejo de ataque a la membrana [14-16], reclutan plasminógeno del hospedador y degradan los componentes del complemento [17-20], o se unen directamente a otros componentes del complemento. [21,22]. En total casi una docena B. burgdorferi sensu lato Ahora se han identificado proteínas que exhiben actividades inhibidoras específicas del complemento [23].

Dentro del pequeño arsenal de inhibidores del complemento borrelial, la lipoproteína expresada en superficie B. burgdorferi BBK32 sigue siendo el único inhibidor específico de la vía clásica identificado y caracterizado [22]. La vía clásica está controlada por la acción del primer componente del complemento, C1, que es un complejo de múltiples proteínas compuesto por C1q unido a un heterotetrámero de dos serina proteasas, C1r y C1s (S1 Higo). Por tanto, C1 funciona como molécula de reconocimiento de patrones y como zimógeno iniciador de la vía clásica. El complejo C1 circula en la sangre en forma inactiva hasta que C1q es reclutado hacia la superficie mediante el reconocimiento de receptores como los complejos inmunes. La unión de C1q promueve la activación autocatalítica de la proteasa C1r dentro del complejo C1 que luego escinde los C1 para formar C1 completamente activado. En este paso, la enzima C1s escinde los componentes del complemento C2 y C4, y la vía clásica se cruza con la vía de la lectina en la formación de las convertasas C3 de la vía clásica / lectina (C4b2a). Las convertasas C3 luego convierten el complemento C3 en sus formas activadas, que a su vez impulsan reacciones posteriores de la cascada. Anteriormente hemos demostrado que el dominio globular C-terminal de B. burgdorferi BBK32 (denominado BBK32-C) bloquea la activación de la vía clásica uniéndose con alta afinidad a la serina proteasa C1r iniciadora y previniendo sus actividades de escisión autocatalítica y C1s dentro del complejo C1 [22] (S1 Higo).

En este estudio investigamos la actividad de los ortólogos BBK32 codificados por la prevalencia B. burgdorferi sensu lato especies B. garinii y B. afzelii para comprender mejor la base estructural y mecanicista de la inhibición de C1r mediada por BBK32. Aquí informamos la primera estructura cristalina del dominio anti-complemento de BBK32 que revela un nuevo pliegue de haz helicoidal. Una estrategia de mutagénesis quimérica proporcionó información adicional sobre la reducción in vitro actividades de B. garinii Ortólogo BBK32 BGD19 relativo al B. afzelii Ortólogo BBK32 BAD16 y B. burgdorferi BBK32 en sí. A continuación, se utilizaron estudios bioquímicos para mapear el sitio de unión de BBK32 en C1r humano y demostraron que el dominio de serina proteasa (SP) era necesario para la formación del complejo BBK32 / C1r. Los resultados de este estudio mejoran significativamente nuestra comprensión de las propiedades únicas de inhibición de la vía clásica de BBK32 y sugieren que la actividad de evasión del complemento mediada por BBK32 se comparte entre las principales especies de espiroquetas asociadas a la enfermedad de Lyme.


RESULTADOS

El plasminógeno unido a PGK se activa a plasmina y escinde C3b

La enzima glicolítica neumocócica PGK se une al plasminógeno y su activador tPA (31). Sin embargo, no está claro si PGK también puede reclutar plasminógeno del suero humano. Para evaluar esto, se incubaron placas de microvaloración recubiertas con PGK con varias diluciones de suero humano y se detectó la unión del plasminógeno con Abs específicos. Se obtuvo un aumento dependiente de la dosis en la unión de plasminógeno proporcional a la concentración sérica (Fig.1 A).

El plasminógeno unido a PGK es funcionalmente activo. A, se recubrieron placas de microvaloración con PGK (5 & # x003 bcg / ml) y se añadieron cantidades crecientes de suero. El plasminógeno unido se detectó usando un Ab policlonal específico. Se utilizó gelatina como control negativo. Los datos se presentan como la media y la S.D. de tres experimentos independientes realizados por duplicado. La significación estadística se calculó mediante ANOVA de dos factores. ***, pag & # x0003c 0,001. B, El plasminógeno unido a PGK escinde la proteína del complemento C3b. Se incubaron placas de microtitulación recubiertas con PGK (5 & # x003bcg / pocillo) con tPA o uPA (10 unidades / pocillo) seguido de la adición de plasminógeno (5 & # x003bcg / pocillo) y 125 I-C3b. Después de la incubación durante 1,5 ha 37 ° C, se tomaron muestras y luego se separaron por SDS-PAGE. El control positivo (+ve Ctrl) contenía Factor H mezclado con Factor I, C3b marcado con 125 I, mientras que en el control negativo (& # x02212ve Ctrl) Factor I fue omitido. Un flecha marca los productos de escisión de C3b. Se muestran datos representativos de tres experimentos independientes.

Se sabe que el plasminógeno interactúa con la proteína del complemento C3 y, tras la activación a plasmina, inactiva el complemento al nivel de C3 (32). Para determinar si el plasminógeno unido a PGK también puede afectar al complemento, se incubó tPA o uPa unido a PGK inmovilizada con plasminógeno y C3b marcado con 125I. Después de la incubación, las muestras se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron los productos de escisión de C3b. El patrón de señal de proteína resultante reveló la escisión de C3b por plasminógeno activado (plasmina) (Fig.1 B). Es importante destacar que no se observó escisión de C3b tras la incubación con los activadores solos o en presencia de BSA (Fig.1 B), lo que sugiere que el plasminógeno unido a PGK se convirtió en plasmina proteolíticamente activa, que a su vez escindió C3b.

PGK inhibe la actividad hemolítica del suero humano

Debido a que la PGK también es una proteína secretada, preguntamos si tiene algún papel adicional en la modulación del ataque del complemento. Para investigar si la PGK neumocócica inhibe la actividad de las vías clásica y alternativa del complemento, se realizaron ensayos hemolíticos.Se mezcló suero humano con diversas concentraciones de PGK recombinante y posteriormente se incubó con eritrocitos. Los resultados demuestran una inhibición dosis-dependiente significativa de la lisis de eritrocitos a través de la vía clásica (Fig.2 A), mientras que PGK tuvo solo un efecto insignificante sobre la lisis mediada por la vía alternativa incluso a las concentraciones más altas (Fig.2 B).

PGK inhibe la actividad hemolítica del suero humano. Para medir el efecto inhibidor de PGK en la vía clásica, los eritrocitos recubiertos de amboceptor se sometieron al ataque del complemento de NHS en presencia de cantidades crecientes de PGK neumocócica en tampón DGVB 2+ (A). Se utilizó BSA como control negativo. El grado de lisis se estimó midiendo la liberación de hemoglobina. Para estudiar la inhibición de la vía alternativa, se incubaron eritrocitos de conejo con NHS con concentraciones crecientes de PGK neumocócica en tampón Mg 2+ EGTA (B). Se utilizaron FH y BSA como controles positivos y negativos, respectivamente. La lisis celular se midió como en A. La absorbancia obtenida sin inhibidor se ajustó al 100%. Los gráficos muestran la media & # x000b1 S.D. de tres experimentos independientes realizados por duplicado. La significación estadística de las diferencias se calculó mediante un análisis de varianza de dos vías y una prueba posterior de Bonferroni. ***, pag & # x0003c 0,001.

Para corroborar los resultados anteriores y demostrar que PGK de hecho inhibe la cascada del complemento, se recubrieron placas de microvaloración con ligandos activadores del complemento, IgG agregada (vía clásica), manano (vía de la lectina) y zimosano (vía alternativa). Posteriormente, se añadió NHS preincubado con PGK. La deposición de MAC (C5b9) se midió con Abs monoclonal reconociendo específicamente un neoepítopo presente en el C9 polimérico de C5b9-MAC. El pretratamiento del suero con PGK inhibió significativamente la deposición de MAC de una manera dependiente de la dosis a través de las tres vías (Fig.3, A & # x02013C). Tomados en conjunto, nuestros datos indicaron que PGK inhibe específicamente la cascada del complemento.

PGK inhibe pero no activa las vías del complemento. Se preincubó PGK con NHS en tampón EGTA GVB 2+ o Mg 2+ y se añadió a placas de microvaloración recubiertas con IgG humana agregada (A), manano (B) y zimosán (C). C4BP (A y B) y FH (C) se utilizaron como controles positivos, mientras que BSA se utilizó como control negativo. La deposición de MAC (C5b-9) se midió usando Ab monoclonal aE11. La cantidad de componentes de MAC depositados en ausencia de inhibidor se estableció en 100%. Los datos representan la media & # x000b1 S.D. de tres experimentos independientes realizados por duplicado. La significación estadística de las diferencias se calculó mediante el análisis de varianza de dos factores y la prueba posterior de Bonferroni. ***, pag & # x0003c 0,001. D, para el análisis de la activación de la vía clásica, las placas se recubrieron con PGK, con IgG humana agregada como control positivo o BSA como control negativo. Las placas se incubaron con las concentraciones indicadas de NHS en tampón GVB 2+. La deposición de C3b se detectó con Abs específicos. mi, para el análisis de la activación de la ruta alternativa, se añadió NHS diluido en tampón EGTA Mg 2+ a placas recubiertas con zimosán y se midió la deposición de C3b. Los medios & # x000b1 S.D. Se presentan tres experimentos independientes realizados por duplicado.

PGK no activa el complemento

Como PGK inhibe significativamente el complemento, preguntamos si la inhibición observada se debe a la capacidad de PGK para activar y, en consecuencia, consumir complemento, como se ha demostrado recientemente para la endopeptidasa O neumocócica (33). Para ello, se incubaron con NHS placas de microvaloración recubiertas con PGK, con agentes activadores del complemento para las tres vías como controles positivos y BSA como control negativo, seguido de la detección del componente del complemento depositado C3b con Abs específicos. PGK no indujo ningún depósito de C3b a través de la vía clásica y la vía alternativa (Fig.3, D y mi). Para la investigación de la ruta de la lectina, se utilizó suero humano empobrecido en C1q. De manera similar a los resultados obtenidos para las otras dos vías, PGK provocó una deposición insignificante de C3b (datos no mostrados). Tomados en conjunto, nuestros datos indican que PGK no activa ninguna de las vías del complemento.

PGK une componentes MAC e inhibe su formación

Los resultados anteriores mostraron que aunque PGK no activa el complemento, su presencia en suero inhibió significativamente la deposición de MAC a través de las tres vías (Fig. 3). Para corroborar los datos, probamos la capacidad de PGK para bloquear la formación de MAC utilizando componentes de MAC purificados. El seguimiento de la lisis de eritrocitos se realizó como lectura. Se preincubó PGK con C7, C8 y C9 purificados y luego se añadió a eritrocitos de oveja sensibilizados con amboceptor y tratados con C5b6. La presencia de PGK inhibió significativamente la lisis de eritrocitos de una manera dependiente de la dosis (Fig.4 A). La PGK a 80 & # x003bcg / ml inhibió la lisis de los eritrocitos en casi un 90%, mientras que la BSA incluida como control negativo no lo hizo (Fig.4 A). Los datos confirman además el papel inhibidor de PGK en la formación de MAC.

PGK se une a los componentes de MAC e inhibe su formación. A, PGK inhibe la hemólisis de los eritrocitos usando componentes del complemento terminal purificado. Se preincubó PGK (0 & # x0201380 & # x003bcg / ml) con C7, C8 y C9 y se añadió a eritrocitos de oveja recubiertos con C5b-6. Después de la incubación, se midió la lisis celular y la lisis en ausencia de inhibidor se ajustó al 100%. B, PGK se une a los componentes terminales del complemento C5, C7 y C9. Se recubrieron placas de microtitulación con PGK (5 & # x003 bcg / ml) y se añadieron cantidades crecientes de C5, C6, C7, C8 y C9. La unión se detectó usando Abs policlonales específicos. Para A y B, BSA se utilizó como control negativo. La media de & # x000b1 S.D. de tres experimentos independientes realizados por duplicado. La significación estadística se calculó mediante ANOVA de dos factores. ns, insignificante ***, pag & # x0003c 0,001. C, PGK se une simultáneamente a C5, C7 y C9. Se inmovilizó PGK en placas de microvaloración y se añadió una mezcla de C5, C7 y C9 (2,5 & # x003 bcg / ml cada uno). C5, C7 y C9 unidos se detectaron por separado usando Abs específicos que no reaccionaban de forma cruzada con otras proteínas. Los datos presentados son de tres experimentos duplicados independientes & # x000b1 S.D. Se utilizó ANOVA unidireccional para calcular la significación estadística entre la unión en ausencia y la presencia de proteínas. D, PGK inhibe la formación de MAC a nivel de C5. Se añadió PGK preincubado con C5 (0,5 & # x003bcg / ml) y C6 (0,75 & # x003bcg / ml) a eritrocitos de oveja incubados con suero empobrecido en C5 al 1%. Después de la incubación, los eritrocitos se lavaron y se incubaron adicionalmente con C7, C8 y C9. El grado de lisis se estimó midiendo la liberación de hemoglobina. Los valores medios & # x000b1 S.D. de tres experimentos separados se muestran. *, pag & # x0003c 0.05l **, pag & # x0003c 0.01 ***, pag & # x0003c 0,001.

Para comprender el mecanismo de inhibición de MAC, estudiamos la capacidad de PGK para interactuar con componentes de MAC purificados. Las placas de microtitulación recubiertas con PGK se incubaron por separado con C5, C6, C7, C8 y C9 purificados, y la unión se detectó usando Abs específicos. Se utilizó BSA como control negativo. Los resultados indicaron una unión dependiente de la dosis de C5, C7 y C9 a PGK, mientras que no se detectó interacción entre PGK y C6 o C8 (Fig.4 B).

Para abordar la cuestión de si C5, C7 y C9 se unen simultáneamente a PGK o si los sitios de unión para estas proteínas son independientes entre sí, se agregaron concentraciones de las proteínas de 2,5 & # x003bcg / ml en varias combinaciones como se indica en la Fig.4. C. Los resultados indican que C5 y C7 tenían sitios de unión parcialmente superpuestos en PGK. Por el contrario, C9 no compitió con ninguno de estos por la unión de PGK. Tomados en conjunto, los datos demuestran que PGK se une simultáneamente a C5, C7 y C9 para inhibir la formación de MAC funcionalmente activa (Fig.4 C).

Para verificar el efecto de la interacción PGK-C5 sobre la formación de MAC, se estudió la actividad hemolítica. Para ello, se añadió PGK preincubado con C5 y C6 a eritrocitos de oveja sensibilizados con Ab que se habían tratado con suero empobrecido en C5. Después de la incubación, se añadieron las proteínas C7, C8 y C9 purificadas y se evaluó la lisis de los eritrocitos. Se observó una inhibición de la lisis de eritrocitos dependiente de la dosis en presencia de PGK (Fig.4 D). Tomados en conjunto, los datos indicaron claramente que PGK afecta el proceso de formación del MAC funcional en virtud de su interacción con C5.

PGK interactúa con C7 e inhibe la formación de MAC

La interacción PGK-C7 se caracterizó analizando la unión de C7 a PGK inmovilizada. Se incubaron placas de microtitulación recubiertas con PGK recombinante con concentraciones crecientes de C7 y se detectó la unión usando Abs específicos. Se utilizó BSA como control negativo. Se determinó una unión dependiente de la dosis de C7 a PGK inmovilizada (KD = 125 & # x000b1 13 n m) (Figura 5 A). De manera similar, en una configuración inversa, se midió la unión dependiente de la dosis de PGK a C7 inmovilizado (Fig.5 B).

C7 se une a PGK. Las placas de microtitulación se recubrieron con PGK (5 & # x003bcg / ml) (A) o C7 (5 & # x003bcg / ml) (B) y se añadieron cantidades crecientes de C7 o PGK. La unión se detectó usando Abs policlonales específicos. Se utilizó BSA como control negativo. La significación estadística se calculó mediante ANOVA de dos factores y el postest de Bonferroni. Las placas de microtitulación se recubrieron con PGK y el efecto de diferentes concentraciones de NaCl (C) o heparina (D) tras la unión de C7 (2,5 & # x003bcg / ml) a PGK se analizó. La cantidad de C7 unido en ausencia de NaCl o heparina se fijó en 100%. Se usaron Abs policlonales específicos para detectar C7 unido. Se realizaron ANOVA de una vía y la prueba posterior de Dunnett para calcular las diferencias estadísticas en comparación con la unión a 150 m m de NaCl o sin heparina. MI, PGK no afecta la unión de C7 a C5b-6. Se añadió proteína de complemento C7 preincubada sin o con PGK o BSA a C5b-6 inmovilizado, y la unión se detectó usando Abs policlonales específicos. F, PGK inhibe la formación de MAC a nivel de C7. Se añadió PGK (50 & # x003bcg / ml) preincubado con C7 a eritrocitos de oveja recubiertos con C5b-6. Se utilizó BSA como control negativo. Después del lavado, los eritrocitos se incubaron con una mezcla de C8 y C9 y se midió la hemólisis. Los datos presentados son de tres experimentos duplicados independientes & # x000b1 S.D. Se utilizó ANOVA de una vía para calcular la significación estadística. ns, insignificante **, pag & # x0003c 0.01 ***, pag & # x0003c 0,001.

Para determinar si la interacción entre C7 y PGK es de carácter hidrófobo o iónico, se llevó a cabo el ensayo de unión antes mencionado en presencia de concentraciones variables de NaCl. La unión de C7 a PGK disminuyó sustancialmente con el aumento de las concentraciones de NaCl (Fig.5 C). A 800 m m de NaCl, la unión de C7 a PGK se redujo en un 60% en comparación con la unión a la concentración fisiológica de 150 m m de NaCl (Fig.5 C). Debido a que C7 se une a la heparina, se determinó el efecto de la heparina en la interacción PGK-C7 (34). Se observó una modulación dependiente de la dosis de la unión de C7 a PGK en presencia de heparina. La cantidad de 400 & # x003bcg / ml de heparina redujo la unión en un 45% (Fig.5 D).

Para diseccionar el efecto de la interacción PGK-C7 sobre la formación de MAC con más detalle, analizamos si PGK inhibe la unión de C7 al complejo C5b6. Se preincubó PGK con C7 y, posteriormente, se añadió la mezcla a C5b6 inmovilizado. Los datos resultantes indicaron que C7 se unió a C5b6, y C7 formó un complejo con PGK unido con la misma intensidad (Fig.5 mi). Por tanto, la interacción PGK-C7 no bloquea la unión de C7 al complejo C5b6, pero no se puede excluir un efecto sobre su inserción en la membrana. Para verificar esta hipótesis, se analizó la actividad hemolítica. Se preincubó PGK con C7 y luego se añadió a eritrocitos de oveja tratados con C5b6. A esto le siguió la incubación con C8 y C9 y se determinó el grado de lisis. PGK (50 & # x003bcg / ml) redujo significativamente la lisis de eritrocitos en & # x0223c80% en comparación con la lisis en ausencia de PGK (Fig.5 F). En conjunto, la interacción PGK-C7 inhibe la formación de MAC al afectar la inserción de C7 en la membrana diana.

PGK enlaza C9

Para evaluar la interacción PGK-C9, se incubaron placas de microvaloración recubiertas con PGK con concentraciones crecientes de C9 humano purificado seguido de detección usando Abs específicos. Se observó una unión dependiente de la dosis de C9 a PGK inmovilizada (KD = 37 & # x000b1 3 n m) (Figura 6 A). Además, la unión de PGK neumocócica a C9 inmovilizado también se detectó en configuraciones inversas (Fig.6 B). En ensayos adicionales se investigó el efecto del NaCl y la heparina sobre la interacción PGK-C9. Similar a PGK-C7, la unión de C9 a PGK se vio afectada en presencia de concentraciones crecientes de NaCl y heparina, respectivamente (Fig.6, C y D). A 800 m m de NaCl, la unión de C9 a PGK se redujo en un 45% en comparación con 150 m m de NaCl (Fig.6 C). De manera similar, la presencia de 800 & # x003bcg / ml de heparina redujo la unión hasta en un 55% (Fig.6 D). En conjunto, la PGK es una proteína de unión a C9 y la fuerza iónica influye en la interacción.

PGK se une a C9. Cantidades crecientes de C9 (A) o PGK (B) se añadieron a placas de microvaloración después de recubrir con PGK o C9 (5 & # x003bcg / ml), respectivamente. La unión se detectó usando Abs policlonales específicos. Se utilizó BSA como control negativo. La significación estadística se calculó mediante ANOVA de dos factores y el postest de Bonferroni. Las placas de microtitulación se recubrieron con PGK y el efecto de diferentes concentraciones de NaCl (C) o heparina (D) tras la unión de C9 (2,5 & # x003bcg / ml) a PGK se analizó. La cantidad de C9 unido en ausencia de NaCl o heparina se fijó al 100%. Abs policlonal específico detectado C9 unido. Se realizaron ANOVA de una vía y la prueba posterior de Dunnett para calcular las diferencias estadísticas en comparación con la unión a 150 m m de NaCl o sin heparina. Unión de C9 y plasminógeno a PGK. Se inmovilizó PGK en placas de microvaloración. Una cantidad constante de C9 (2 & # x003bcg / ml) junto con cantidades crecientes de plasminógeno (mi) o una cantidad constante de plasminógeno (2 & # x003bcg / ml) con cantidades crecientes de C9 (F) fue añadido. El C9 unido y el plasminógeno se detectaron usando Abs específicos. Los datos presentados son de tres experimentos duplicados independientes & # x000b1 S.D. La significancia estadística se calculó usando ANOVA de una vía y posprueba de Dunnett. ***, pag & # x0003c 0,001.

Debido a que PGK también se une al plasminógeno, preguntamos si C9 y el plasminógeno se unen simultáneamente a PGK y si los sitios de unión para estas dos proteínas en PGK son independientes entre sí. Para ello, se añadió una concentración constante de C9 (2 & # x003bcg / ml) junto con concentraciones crecientes de plasminógeno o una concentración constante de plasminógeno (2 & # x003bcg / ml) en presencia de una cantidad creciente de C9 a PGK inmovilizada. El C9 unido y el plasminógeno se detectaron usando Abs específicos. La unión de C9 a PGK no se vio afectada por la presencia de plasminógeno (Fig.6 mi). De manera similar, la presencia de concentraciones crecientes de C9 no influyó en la unión del plasminógeno a la PGK inmovilizada (Fig.6 F). En conjunto, las dos proteínas no compiten entre sí para unirse a PGK, lo que indica que C9 y el plasminógeno pueden unirse simultáneamente y a sitios de unión no superpuestos en PGK.

PGK inhibe la polimerización de C9 y la formación de MAC

Debido al hecho de que PGK interactúa con C9, investigamos los efectos sobre la autopolimerización de C9 o su interacción con C5b8. Para examinar si PGK inhibe la polimerización de C9, se incubó 0.5 & # x003bc m C9 con cantidades crecientes de PGK (0 & # x020135 & # x003bc m) durante la noche a 37 & # x000b0C, y las muestras se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras seguidas. por Western Blot con Abs anti-C9. Se usó BSA (5 & # x003bc m) como control negativo. El patrón resultante indica que PGK inhibió la polimerización de C9 de una manera dependiente de la concentración (Fig.7 A). Las intensidades de las bandas para C9 polimerizado se determinaron por densitometría (Fig.7 B).

PGK inhibe la polimerización de C9. A, PGK inhibe la polimerización de C9. Se mezcló C9 con diferentes cantidades de PGK (0 & # x020135 & # x003bc m) o BSA (5 & # x003bc m) como control negativo. Las muestras se separaron mediante un gradiente de SDS-PAGE al 2,5% y se transfirieron a una membrana de PVDF, y se detectó C9 usando Abs específicos mediante análisis de transferencia Western. B, las intensidades de las bandas para C9 polimerizado (de A) se determinaron por densitometría y se presentan como el valor medio de tres experimentos independientes & # x000b1 S.D. Se realizó un ANOVA de una vía para probar diferencias significativas entre la polimerización de C9 en ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de PGK. C, la capacidad de PGK para inhibir la incorporación de C9 en el MAC se estudió sometiendo eritrocitos de oveja sensibilizados a suero humano empobrecido en C9 después de agregar PGK preincubado con C9. La extensión de la hemólisis se determinó midiendo la absorbancia de la hemoglobina liberada a 405 nm. Se utilizó BSA como control negativo. La señal obtenida en ausencia de inhibidor se fijó al 100%, y los gráficos muestran la media de & # x000b1 S.D. de tres experimentos individuales. La significación estadística de las diferencias se calculó con un ANOVA de dos vías y una prueba posterior de Bonferroni. ns, insignificante *, pag & # x0003c 0,05 ***, pag & # x0003c 0,001.

Para evaluar adicionalmente la importancia de la inhibición de la polimerización de C9 sobre la atenuación de la formación de MAC funcional, los eritrocitos de oveja sensibilizados con Ab se sometieron al ataque del complemento de suero empobrecido en C9 para inducir la formación de C5b8 en su superficie. Se preincubó C9 con cantidades crecientes de PGK y luego se añadió a las células. La lisis se evaluó midiendo la liberación de hemoglobina. Se utilizó BSA como control negativo. PGK inhibió la lisis de eritrocitos de una manera dependiente de la dosis (Fig.7 C), lo que indica que la interacción PGK-C9 afecta la formación de MAC.

PGK limita el depósito de MAC en neumococos, que es independiente del serotipo

El polisacárido capsular es un factor de virulencia esencial de los neumococos y hasta la fecha se han descrito polisacáridos capsulares serológicamente distintos (35, 36). Se sabe que los polisacáridos capsulares hacen que los neumococos sean resistentes a la opsonofagocitosis mediada por el complemento e interfieren con la interacción neumocócica con las células del huésped y las proteínas (37). Para demostrar la relevancia funcional de la PGK neumocócica, investigamos el grado de deposición de MAC en la superficie neumocócica después de la incubación con diversas concentraciones séricas. El análisis de citometría de flujo demostró el depósito de MAC dependiente de la dosis en la superficie neumocócica a través de la vía de activación del complemento clásica y alternativa, proporcional a la concentración sérica (Fig.8, A y B). Para estudiar si el polisacárido capsular también afectaría el grado de deposición de MAC, una colección de 12 aislados clínicos de S. pneumoniae (Tabla 1) pertenecientes a 12 serotipos diferentes se analizó el nivel de deposición de MAC después del tratamiento con suero humano. Los análisis de citometría de flujo demostraron la deposición de MAC con un grado variable en todos los aislados clínicos probados mediada a través de la vía de activación del complemento clásica y alternativa (Tabla 1). Además, las cepas altamente encapsuladas como las cepas del serotipo 3 eran relativamente resistentes a la deposición de MAC, mientras que la NCTC10319 tipo 35A tenía una señal relativamente fuerte para la deposición de MAC. Por tanto, los datos sugieren que la deposición de MAC es un mecanismo general que está influenciado por la extensión de la cápsula.

Detección de depósito de MAC (C5b-9) en S. pneumoniae utilizando citometría de flujo. Los neumococos NCTC10319 se incubaron con una concentración creciente de NHS en tampón GVB 2+ para la vía clásica (A) o tampón EGTA Mg 2+ para la vía alternativa (B) y se incubó durante 1 ha 37 ° C. La deposición de MAC (C5b-9) se detectó usando el mAb aE11 Ab que reconoce un neoepítopo presente en C9 polimérico pero ausente en C9 monomérico. Los datos de GMFI de al menos tres experimentos independientes se muestran (media & # x000b1 S.D.) como una medida de la deposición de MAC de la ruta clásica y alternativa. Recuadro, se muestra un histograma de citometría de flujo representativo para la deposición de MAC a través de las dos vías. Significación estadística para la deposición de MAC en comparación con el fondo de bacterias (Bac.) se calculó utilizando ANOVA de una vía. PGK restringe la deposición de MAC en la superficie neumocócica. La deposición de MAC (C5b-9) a través del clásico (C y D) o vía alternativa (mi y F) sobre la superficie neumocócica (NCTC10319) de 0,2 y 2% de NHS, respectivamente, se midió en ausencia o presencia de proteína PGK añadida exógena. Se utilizó BSA como control negativo. El MAC depositado se analizó mediante citometría de flujo usando mAb aE11. Se muestra un histograma de citometría de flujo representativo de tres experimentos independientes (C y mi) y valores de GMFI (D y F) de tres experimentos independientes realizados por duplicado. La significación estadística se calculó mediante ANOVA de una vía. ns, insignificante *, pag & # x0003c 0,05 ***, pag & # x0003c 0,001.

Para verificar el papel de PGK en la inhibición de la deposición de MAC, se realizaron experimentos de bloqueo. El depósito de MAC a través de la vía clásica de activación del complemento en neumococos se midió mediante citometría de flujo en presencia de PGK. Los análisis de citometría de flujo indicaron una inhibición competitiva dependiente de la dosis de MAC en neumococos por PGK (Fig.8, C y D). Por el contrario, BSA no mostró ningún efecto inhibidor. Se observó una inhibición similar en la deposición de MAC a través de la vía alternativa de activación del complemento (Fig.8, mi y F). En resumen, nuestros datos identifican por primera vez a la PGK como un nuevo inhibidor del complemento de las especies Gram-positivas. S. pneumoniae que inhibe la formación de MAC funcional. PGK interactúa específicamente con los componentes terminales del complemento C5, C7 y C9, modulando así el ataque del complemento (Fig. 9).

Modelo esquemático de inhibición del complemento neumocócica mediada por PGK. PGK inhibe las tres vías al interactuar con las proteínas C5, C7 y C9 e interferir con la polimerización de C9.


Resultados

Generación y caracterización de MoAbs anti-properdina humana 3A3E1, 6E11A4, 1G6D2 y 6E9E6

Se seleccionaron los cuatro clones de propidina antihumana basándose en su capacidad para reconocer fuertemente la propidina cuando se evaluaron en un ELISA directo y estos anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de proteína G y se determinó que eran del isotipo IgG1 kappa (datos no mostrados). Los MoAb antiapropiadina purificados reconocen solo la propidina no reducida, según lo evaluado por inmuno western blot (Figura 1A), y reconocen la apropiadadina humana, de babuino, de conejo y canina, pero no la apropiada de ratón, rata, felino o hurón (datos no mostrados ). Además, para determinar si los MoAb reconocen distintos epítopos, se llevaron a cabo ELISA de competición en los que se biotiniló cada anticuerpo anti-propidina y se mezcló con cada uno de los otros clones de anticuerpos anti-propidina sin marcar, seguido de incubación con placas de ELISA recubiertas de propidina, y Se midió la unión del anticuerpo biotinilado a la propidina. 6E9E6 y 1G6D2 no compitieron entre sí por unirse a la propidina (Figuras S1A, B) y, por lo tanto, reconocieron distintos epítopos en la propidina, mientras que 3A3E1 y 6E11A4 sí compitieron por la unión a la propidina en el ELISA competitivo (Figuras S1C, D), lo que indica que reconocer los mismos epítopos o superpuestos. Debido a que la oligomerización de la apropiadadina está asociada con la función de la apropiadadina [revisada en (14, 16)], buscamos determinar si los anticuerpos podían distinguir entre dímeros (P2), trímeros (P3) y tetrámeros (P4) de propidina utilizando oligómeros de propidina purificados en ELISA directos. La Figura 1B indica que los MoAb reconocen los diferentes oligómeros de la propia dina en la misma medida y no pueden distinguir entre ellos.

Figura 1. Generación y caracterización de MoAbs anti-owndin (3A3E1, 6E11A4, 1G6D2, 6E9E6). (A) Los MoAbs antiapropiadina reconocen la apropiadadina no reducida (P) pero no la apropiadadina reducida (P). Se detectaron 10 ng de propidina no reducida o no reducida no fraccionada con MoAbs 3A3E1, 6E11A4, 1G6D2 o 6E9E6 anti-propidina, o control de isotipo IgG1 de ratón purificado a 1 & # x003BCg / ml mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se muestra la unión de los anticuerpos a la apropiadadina no reducida (línea 1 y # x020135, 11) o reducida (línea 6 y # x0201310). El carril 11 es un control positivo que contiene 10 ng de propidina purificada detectada por 1 & # x003BCg / ml de 1G6D2 anti-propidina MoAb en condiciones no reducidas. La flecha indica el tamaño del monómero de la dina apropiada (& # x0007E50 kDa). (B) Los MoAbs antiapropiadina reconocen todas las formas de propidina [P2, PAG3, PAG4, o owndin (P) no fraccionado] en un ELISA directo. La unión se detectó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods. & # X0201D Los resultados se muestran como media y SD de triplicados. (C) 3A3E1 y 6E11A4 inhiben la hemólisis mediada por AP de los eritrocitos de conejo (ER). miR se incubaron con NHS en presencia de uno de los MoAb anti-propidina indicados. La actividad hemolítica se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y se expresó como un porcentaje relativo (%) de hemólisis. Los resultados de la izquierda se muestran como media y desviación estándar de observaciones duplicadas. Los resultados a la derecha se muestran como media y SD de observaciones duplicadas para 6E9E6 y observaciones únicas para los controles 3A3E1 y 1G6D2. (D) 3A3E1 y 6E11A4 inhiben la capacidad de la propidina para unirse a ESC3b. Cada control de isotipo o anti-P & # x000231 (1G6D2, 6E9E6, 3A3E1, 6E11A4 o anti-P & # x000231) se incubó con owndin (P) y ESC3b. La unión de owndin a ESC3b se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods. & # X0201D & # x0201C No P & # x0201D fue un control negativo donde no se añadió propinadina, y & # x0201C sólo P & # x0201D fue un control positivo donde no se añadió anticuerpo de inhibición. El gráfico es representativo de tres experimentos independientes y se muestra como media y SD de duplicados. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples de Dunnett & # x00027s con & # x0201CNo P & # x0201D pag & # x0003C 0,0001 in & # x0201COsólo P, & # x0201D & # x0201CIsotype control & # x0002BP, & # x0201D & # x0201C1G6D2 & # x0002BP, & # x0201D & # x0201C6E9E6 & # x0201C6E9E6 & # x0201C6E9E6D & #.

Los MoAbs anti-Properdin inhiben la estabilización mediada por Properdin de la convertasa C3bBb del AP al inhibir la unión de Properdin a C3b

Para determinar si los anticuerpos inhiben la capacidad de la propidina para estabilizar las convertasas C3bBb, se realizó un ensayo de hemólisis AP utilizando eritrocitos de conejo. Los anticuerpos antipropidina 6E11A4 o 3A3E1 inhibieron la hemólisis de eritrocitos de conejo de una manera dependiente de la dosis, mientras que 1G6D2 y 6E9E6 no inhibieron la lisis celular, incluso cuando se ensayaron a 16 & # x003BCg / ml (Figura 1C). Se utilizó anti-P & # x000231 comercial como control positivo para la inhibición. La mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50) fue de 0,5 & # x003BCg / ml para 6E11A4, fue de 0,6 & # x003BCg / ml para anti-P & # x000231 y fue de 0,7 & # x003BCg / ml para 3A3E1. Dado que la propidina necesita unirse a C3b para estabilizar la convertasa, la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión de la propidina a C3b se probó mediante citometría de flujo. La Figura 1D muestra que 3A3E1 y 6E11A4 alteraron por completo la unión de la propidina a los eritrocitos recubiertos de C3b (ESC3b), mientras que 1G6D2 y 6E9E6 no lo hicieron.

Determinación del papel de la properdina en la promoción de la lisis de los glóbulos rojos de HPN mediada por el complemento in vitro

La inhibición de Properdin previene la lisis mediada por el complemento de eritrocitos humanos & # x0201CPNH-like & # x0201D (EH) y lo hace de forma más eficaz que otros inhibidores del complemento

Utilizando los MoAbs anti-propidina inhibidores caracterizados, exploramos el papel de la propidina en la promoción de la lisis mediada por el complemento de los glóbulos rojos con defectos de regulación del complemento, como los glóbulos rojos en pacientes con HPN. Primero usamos EH donde CD59 se ha bloqueado usando un anticuerpo anti-CD59 inhibidor (células & # x0201CPNH-like & # x0201D) y se agregó rH19-20 como una forma de aumentar la lisis inducida por suero detectable general al eliminar la protección del factor H, lo que obvia la necesidad acidificar el suero con el fin de lograr el mismo resultado, como hemos descrito anteriormente (24). Usando este ensayo, evaluamos el efecto de bloquear la propidina con MoAbs anti-propidina en comparación con el bloqueo de otros componentes del complemento, incluido (a) el anti-Factor B, que inhibe la formación de AP convertasa al inhibir la unión del Factor B a C3b (b) Cp20, que se une a C3 e interfiere con la escisión de C3 y, por tanto, previene la formación de convertasa y (c) eculizumab y OmCI, que inhiben la escisión de C5 y, por tanto, la formación de C5a y MAC. Cada inhibidor se agregó en concentraciones crecientes al ensayo, y el IC90 para cada inhibidor se determinó (Figuras 2A y # x02013F). La figura 2G muestra el IC combinado90 valores para los diferentes inhibidores. Los antiapropiadina MoAbs 6E11A4 y 3A3E1 dieron un IC90 de 51 y 53 nM, respectivamente. El IC90 obtenido para el anti-factor B fue de 890 nM, aproximadamente 17 veces más alto que el IC90 para los MoAbs anti-owndin. Cp20 dio un IC90 valor de & # x0007E6,058 nM, que era & # x0007E117 veces más alto que el MoAbs anti-owndin (no mostrado). Sin IC90 Se pudo obtener un valor para eculizumab y OmCI, incluso cuando se probaron a 667 y 5400 nM, respectivamente. Para tener en cuenta las variaciones en las concentraciones plasmáticas de cada proteína del complemento diana, se calcularon las proporciones diana / inhibidor para cada inhibidor dividiendo las concentraciones plasmáticas nM de la diana por el IC promedio90 valores, como se describe en & # x0201CMateriales y métodos & # x0201D. La proporción de MoAbs anti-propidina fue de 5,2 & # x020135,4 (para la propidina monomérica no mostrada) o 1,7 y # x020131,8 (para la forma trímera de la propidina, P3, la forma predominante en plasma), para el anti-Factor B fue 2.4 y para Cp20 fue 1.1 (Figura 2H). Esto indica que la inhibición de la propidina, si se considera como un trímero, tenía una relación objetivo / inhibidor similar a la de los otros inhibidores probados. No se pudo determinar la proporción de eculizumab y OmCI debido a su falta de CI90 valores. En general, los datos muestran que la propina es esencial para promover la lisis de glóbulos rojos & # x0201CPNH & # x0201D y, según la IC90 valores y proporciones objetivo / inhibidor, el bloqueo de la propidina con MoAbs anti-propidina fue al menos tan eficaz como el bloqueo de otros componentes del complemento, es decir, el factor B, C3, en la inhibición de la lisis de E mediada por APH que carecen de protección de la superficie de las células CD59, aunque son más eficaces que la inhibición de C5 (Figura 2).

Figura 2. Eficacia de la inhibición de la propidina en comparación con otros inhibidores del complemento para prevenir la lisis de glóbulos rojos & # x0201CPNH-like & # x0201D. (A & # x02013F) Determinación de IC90 valores de los inhibidores del complemento para inhibir la lisis mediada por el complemento de eritrocitos humanos & # x0201CPNH-like & # x0201D (EH) y los datos se muestran como media y desviación estándar de observaciones duplicadas. miH se mezclaron con los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: 40% NHS, 5 mM MgEGTA o 10 mM EDTA, 11,4 & # x003BCM rH19-20, 1 & # x003BCg / ml anti-CD59 y uno de los inhibidores del complemento 6E11A4 (A), 3A3E1 (B), anti-factor B (C), Cp20 (D), eculizumab (MI)y OmCI (F) a las concentraciones indicadas en los gráficos. El% relativo de hemólisis e IC90 de cada inhibidor se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y la línea de puntos es donde la inhibición alcanza el 90%. IC90 valores obtenidos en (A & # x02013F) fueron graficados en (GRAMO) y combinado de dos experimentos independientes con duplicados para cada inhibidor, que se muestran como media y SD. IC90 valores en (GRAMO) se dividieron por la concentración plasmática (nM) de cada inhibidor para evaluar la relación objetivo / inhibidor en (H). Properdin se consideró como un trímero para el cálculo y los resultados de eculizumab y OmCI no se incluyeron porque no90 se pueden determinar los valores. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.01, & # x0002Apag & # x0003C 0.05, pag & # x0003E 0,05 ns.

La inhibición de la properdina inhibe la lisis de los glóbulos rojos derivados de pacientes con HPN al proteger las células de HPN de tipo II y III de la lisis

Con muestras de glóbulos rojos de pacientes con HPN que están bajo tratamiento con eculizumab, determinamos a continuación qué tipos de células de HPN están protegidas de la lisis mediada por el complemento cuando se inhibe la propidina. Anteriormente hemos demostrado que las células de HPN de tipo II y III se vuelven altamente susceptibles a la lisis mediada por el complemento cuando se elimina la protección del factor H mediante la adición de rH19-20 al suero (24), que es similar a lo que ocurre en el suero que ha sido acidificado. a pH 6,4 (67, 68). La Figura 3A muestra la distribución de CD59 & # x0002B de los glóbulos rojos de dos pacientes cuando se exponen al suero en ausencia de actividad del complemento (control de EDTA). Cuando los glóbulos rojos se tratan con NHS en presencia de MgEGTA y rH19-20, las células de HPN de tipo II y III se lisan, dejando intactos los glóbulos rojos normales, como se esperaba (Figuras 3B & # x02013D, histogramas sombreados de gris claro). Las figuras 3B, D (líneas negras frente a histogramas sombreados en gris claro) muestran que, a diferencia de eculizumab, que previno parcialmente la lisis de los eritrocitos de HPN mediada por rH19-20 (figura 3D), la inhibición de la propidina a través de MoAb 6E11A4 protegió por completo los eritrocitos de HPN de la AP. - lisis mediada, restaurando así la población de eritrocitos de HPN de tipo II y III a una distribución similar a la del grupo EDTA (Figuras 3A, B). El antipropidina no inhibidor MoAb 6E9E6 no evitó que los glóbulos rojos de HPN de tipo II y III de la lisis mediada por AP (Figura 3C). Además, el MoAb antiapropiadina 6E11A4 previene la deposición del fragmento C3 en los glóbulos rojos de HPN que carecen de protección CD55 / CD59, mientras que eculizumab y 6E9E6 no pueden (Figura 3E). Esto indica que el bloqueo de la función de estabilización de la apropiadadina protegió a los eritrocitos de HPN de tipo II y III de la activación del complemento y la lisis cuando se elimina la protección del factor H y fue más eficaz que eculizumab.

figura 3. La inhibición de la propidina protege a las células de HPN de tipo II y III de la opsonización y lisis del complemento. Los glóbulos rojos de dos pacientes con HPN en tratamiento con eculizumab y un paciente con HPN sin tratamiento con eculizumab se mezclaron con los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: (A) 40% NHS & # x0002B 10 mM EDTA & # x0002B 20 & # x003BCM rH19-20 (histogramas sombreados en gris oscuro original de control de distribución de población de RBC de PNH), o (B & # x02013D) NHS & # x0002B 5 mM MgEGTA & # x0002B 20 & # x003BCM rH19-20, en ausencia (histogramas gris claro) o presencia (línea negra) de uno de los inhibidores del complemento [(B) MoAb 6E11A4 inhibidor de antiapropiadina (53 nM), (C) MoAb 6E9E6 no inhibidor (53 nM), o (D) eculizumab (667 nM)], o (MI) Suero empobrecido en C8 al 40% (C8-dpl) & # x0002B Mg-EGTA 5 mM en presencia o ausencia de 1 & # x003BCM rH19-20, 53 nM 6E11A4, 53 nM 6E9E6 o 667 nM eculizumab. Se utilizó EDTA 10 mM como control negativo. El análisis de los fragmentos CD59 y C3 de las células restantes no lisadas se evaluó como se describe en & # x0201CMateriales y métodos & # x0201D. (A & # x02013D). Los gráficos son representativos de dos experimentos independientes con observaciones duplicadas. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s. Solo se muestran estadísticas relevantes en (MI) & # x0002A & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.0001, & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0,005, & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.01, & # x0002Apag & # x0003C 0.05, pag & # x0003E 0,05 ns.

La inhibición de la properdina inhibe la lisis de los glóbulos rojos de los pacientes con HPN más eficazmente que otros inhibidores del complemento

La protección de PNH RBC obtenida por el bloqueo de la propidina se comparó con la de inhibir otros componentes del complemento (enumerados en la Figura 2). Los glóbulos rojos derivados de cuatro pacientes con HPN que están bajo tratamiento con eculizumab tuvieron 35 & # x0201365% de hemólisis basal en presencia de 40% de NHS y MgEGTA (datos no mostrados), probablemente debido al alto porcentaje (& # x0003E70%) de tipos II y III RBC entre la población total de RBC (Figura S2). Las Figuras 4A y # x02013F muestran los datos del paciente con HPN # x000231 como representativos del cribado de todos los inhibidores del complemento en su capacidad para proteger los glóbulos rojos del paciente con HPN de la lisis mediada por el complemento.El bloqueo de la propidina, el factor B o el C3 protegió completamente los glóbulos rojos de HPN que provienen de pacientes que están bajo tratamiento con eculizumab de la hemólisis mediada por el complemento (Figuras 4A & # x02013D). El IC90 Los valores de MoAbs anti-propidina 6E11A4 y 3A3E1 en estos cuatro pacientes oscilaron entre 38 & # x0201348 nM y 36 & # x0201350 nM, respectivamente, que fueron al menos 18 veces, 81 veces más bajos que los del anti-Factor B (con IC90 688 & # x02013920 nM) y Cp20 (con IC90 3,650 & # x020135,150 nM), respectivamente (Figura 4G). Las proporciones de objetivo / inhibidor para los MoAbs antiapropiadina 6E11A4 y 3A3E1 fueron 5.5 & # x020137.7 (para el monómero no mostrado) o 1.8 & # x020132.6 (para P3, la forma principal en plasma), para el anti-Factor B fue 2.3 & # x020133.1, y para Cp20 fue 1.3 & # x020131.8 (Figura 4H). Esto indica que la inhibición de la propidina, si se considera como un trímero, tenía una relación objetivo / inhibidor similar a la de los otros inhibidores probados. Sin embargo, eculizumab y OmCI, los dos inhibidores de C5, no inhibieron completamente la lisis de glóbulos rojos del paciente con HPN y alcanzaron una meseta de hemólisis de fondo por encima del 50% (Figuras 4E, F). El IC90 para eculizumab y OmCI en los cuatro glóbulos rojos de los pacientes estaba por encima de 667 nM (por encima de 13 veces más que el IC de MoAbs anti-propidina90) y 2700 nM (más de 54 veces más alto que el IC de MoAbs anti-propidina90), respectivamente (Figura 4G), lo que indica que el bloqueo de C5 era ineficaz para proteger estos RBC de PNH. Los glóbulos rojos de HPN de pacientes que no fueron tratados con eculizumab también se usaron para probar si el bloqueo de la apropiadadina protegería estas células. En lugar de usar suero acidificado, se usó rH19-20 en el ensayo, como se describió anteriormente (24), para aumentar la sensibilidad requerida para evaluar la hemólisis mediada por el complemento. El bloqueo de la propidina inhibe la lisis en más del 50% en todos los pacientes no tratados, y la CI90 se pudo determinar en el paciente A (Figuras 5A y # x02013D), mientras que eculizumab tuvo un efecto protector marginal (Figuras 5E y # x02013H). La ineficacia de eculizumab para proteger estas células es intrínseca a la inhibición de C5 ya que se observa un efecto similar usando otro inhibidor de C5, OmCI (datos no mostrados). Dado que eculizumab, el tratamiento actual para la HPN, resultó en una inhibición incompleta de la lisis de los eritrocitos de la HPN (Figuras 4E, 5E y # x02013H), a continuación exploramos las consecuencias del uso de la combinación de MoAbs anti-propidina y eculizumab en nuestro in vitro modelo (Figura 6). Antiapropiadina MoAb 6E11A4 solo, en el IC50 dosis (Figura 4A), redujo la hemólisis en & # x0007E50% y eculizumab solo, a la concentración máxima de meseta (Figura 4E 667 nM), redujo la hemólisis en & # x0007E40% (Figura 6), como se esperaba. La combinación de antiapropiadina MoAb y eculizumab redujo significativamente la hemólisis residual causada por eculizumab al 10%, y el efecto de inhibición fue aditivo (Figura 6).

Figura 4. Eficacia de la inhibición de la propidina en comparación con otros inhibidores del complemento para prevenir la lisis de los eritrocitos de HPN. (A & # x02013F) Determinación de IC90 valores de los inhibidores del complemento para inhibir la lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento de pacientes con HPN. Los resultados del paciente con HPN & # x000231 se muestran como un representante de los datos de cuatro pacientes con HPN en tratamiento con eculizumab, cuyos glóbulos rojos se mezclaron con los siguientes reactivos en las concentraciones finales indicadas: 40% NHS, 5 mM MgEGTA o 10 mM EDTA, y uno de los inhibidores del complemento 6E11A4 (A), 3A3E1 (B), anti-factor B (C), Cp20 (D), eculizumab (MI)y OmCI (F) a las concentraciones indicadas en los gráficos. El% relativo de hemólisis se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y la línea de puntos es donde la inhibición alcanza el 90%. El IC90 valores para cuatro pacientes con HPN, obtenidos como en (A & # x02013F), fueron graficados en (GRAMO). Los datos de OmCI eran de dos pacientes (& # x000231 y & # x000232) debido a suministros limitados. Los resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes con duplicados y se muestran como media y DE. IC90 valores en (GRAMO) se dividieron por la concentración plasmática (nM) de cada inhibidor para evaluar la relación objetivo / inhibidor en (H). Properdin se consideró como un trímero para el cálculo y los resultados de eculizumab y OmCI no se incluyeron porque no90 se pueden determinar los valores. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s & # x0002A & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.0001, & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0,001, & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.01, & # x0002Apag & # x0003C 0.05, pag & # x0003E 0,05 ns.

Figura 5. El bloqueo de la propidina inhibe la lisis mediada por el complemento de los eritrocitos de HPN que no se han sometido a tratamiento con eculizumab. (A & # x02013H) Determinación de IC90 valores de los inhibidores del complemento para inhibir la lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento de pacientes con HPN (A & # x02013D). Los eritrocitos de HPN se mezclaron con los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: 17 & # x003BCM rH19-20, 40% NHS, MgEGTA 5 mM o EDTA 10 mM, y uno de los inhibidores del complemento 6E11A4 (A & # x02013D), eculizumab (E & # x02013H) a las concentraciones indicadas en los gráficos. El% relativo de hemólisis se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y la línea de puntos es donde la inhibición alcanza el 90%. Los resultados son representativos de los valores medios de dos experimentos independientes con duplicados y se muestran como media y DE.

Figura 6. La combinación de eculizumab y antiapropiadina MoAb 6E11A4 supera la hemólisis residual de la inhibición de C5. Los eritrocitos de HPN se mezclaron con los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: 40% NHS, 5 mM MgEGTA o 10 mM EDTA, en presencia de 667 nM eculizumab, o 20 nM (IC50 dosis como se muestra en la Figura 4A) 6E11A4, o la combinación de eculizumab 667 nM y 6E11A4 20 nM. La actividad hemolítica se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y se expresó como un% de hemólisis con respecto a & # x0201CNHS. & # X0201D Los resultados se combinan de tres experimentos independientes (con duplicados) y se muestran como media y SD. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s & # x0002A & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0,0001, pag & # x0003E 0,05 ns.

Determinación del papel de la properdina en la promoción del daño de los glóbulos rojos y las células endoteliales mediado por el complemento en el SUHa in vitro

La inhibición de la properdina previene la lisis de los eritrocitos de oveja (ES) Bajo una condición & # x0201CaHUS-Like & # x0201D

La AHUS es otra enfermedad de desregulación del complemento que se caracteriza por hemólisis, que tradicionalmente se explica por la hemólisis mecánica como resultado del paso de los glóbulos rojos a través de la microvasculatura estrecha debido a la formación de microtrombos, y por la lisis mediada por el complemento debido a la falta de regulación del complemento en los glóbulos rojos [revisado en (69)]. Debido a que las mutaciones en los dominios 19 y 20 del factor H están altamente asociadas con aHUS (7), usamos la proteína recombinante rH19-20 que inhibe competitivamente la protección de la superficie celular mediada por el factor H en ES, que normalmente son resistentes a la AP, lo que da lugar a la lisis de los eritrocitos. La incapacidad del factor H para unirse a la superficie de los glóbulos rojos (para protegerla) imita lo que sucede cuando los pacientes con SHUa tienen mutaciones en el extremo C-terminal del factor H (56).

Utilizando el in vitro En el ensayo, se probó la capacidad de inhibir la propidina para reducir la actividad de la AP (mediada por la falta de protección del factor H) y se comparó con la inhibición de otros componentes del complemento (inhibidores enumerados en la Figura 2). Cada inhibidor del complemento se añadió en concentraciones crecientes a la ES células en presencia de NHS y rH19-20, y el IC90 para cada inhibidor se determinó (Figuras 7A y # x02013F). Los datos de la Figura 7G indican que los MoAbs antiapropiadina 6E11A4 y 3A3E1 dieron IC90 valores entre 34 y 45 nM, y el bloqueo de la propidina usando MoAbs anti-propidina tenía un IC 3 & # x0201386 veces más bajo90 valores para inhibir la lisis mediada por AP de eritrocitos & # x0201CaHUS-like & # x0201D que los otros inhibidores del complemento probados (IC90: Factor B = eculizumab 416 nM = OmCI 107 nM = Cp20 252 nM = 3174 nM). Las proporciones objetivo / inhibidor para los MoAbs anti-propidina fueron 7,4 (para la propidina monomérica no mostrada) o 2,5 (para P3, la forma predominante en plasma), para el anti-Factor B fue 5.2, para Cp20 fue 2.4, para eculizumab fue 3.9 y para OmCI fue 1.7 (Figura 7H), lo que indica que inhibir los trímeros de propidina fue tan efectivo como bloquear C5 y menos efectivo que bloquear el Factor B.

Figura 7. Eficiencia de la inhibición de la propidina en comparación con otros inhibidores del complemento en la prevención de la lisis de los eritrocitos de oveja (ES) bajo una condición & # x0201CaHUS-like & # x0201D. (A & # x02013F) Determinación de IC90 valores de los inhibidores del complemento en la prevención de la lisis de eritrocitos de oveja & # x0201CaHUS-like & # x0201D (ES), y los datos se muestran como media y DE de observaciones duplicadas. miS se mezclaron con los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: 40% NHS, 1,7 & # x003BCM rH19-20, MgEGTA 5 mM o EDTA 10 mM, y uno de los inhibidores del complemento 6E11A4 (A), 3A3E1 (B), anti-factor B (C), Cp20 (D), eculizumab (MI)y OmCI (F) a las concentraciones indicadas en los gráficos. El% relativo de hemólisis e IC90 de cada inhibidor se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y la línea de puntos es donde la inhibición alcanza el 90%. El IC90 valores obtenidos como en (A & # x02013F) fueron graficados en (GRAMO) y se combinan de más de tres experimentos independientes con duplicados para cada inhibidor y se muestran como media y SD. IC90 valores en (GRAMO) se dividieron por la concentración plasmática (nM) de cada inhibidor para evaluar la relación objetivo / inhibidor en (H). Properdin se consideró como un trímero para el cálculo. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s & # x0002A & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.0001, & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0,005, & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.01, pag & # x0003E 0,05 ns.

La inhibición de la properdina reduce la activación del complemento en las células endoteliales expuestas al hemo

La lesión endotelial es otra característica típica de los pacientes con SHUa. El desarrollo de SHUa podría ser provocado por una agresión de las células endoteliales y promovido por una regulación anormal del complemento. En condiciones normales, la hemoglobina y el hemo que se liberan durante la hemólisis son eliminados por la haptoglobina y la hemopexina, respectivamente. Sin embargo, el hemo libre de células se puede encontrar en altas concentraciones en diversos trastornos que se caracterizan por una hemólisis excesiva (70, 71) y pueden activar la PA del complemento en la superficie de las células endoteliales, promoviendo la deposición de C3b y la formación de MAC, así como inducir Generación de C3a y C5a en la fase fluida de la sangre (66). Estos productos de activación del complemento tienen el potencial de promover un estado protrombótico [revisado en (72, 73)]. Un in vitro El ensayo endotelial (66) se adaptó a nuestro estudio para evaluar si la propidina modula la activación del complemento inducida por el hemo en las células endoteliales primarias humanas, mediante la medición de los depósitos de productos de activación de C3. La Figura 8A muestra que el hemo indujo una deposición de C3b de 5 a 15 veces mayor en HUVEC, frente a NHS solo, y la activación fue inhibida en un 60% por el inhibidor de C3 Cp20. La inhibición de la actividad del complemento por Cp20 fue completa según se determinó en comparación con un control de EDTA 20 mM, donde la inhibición también fue del 60% (Figura 8B). El suero empobrecido en factor B, que carece de actividad AP, redujo la deposición del fragmento C3 a un nivel similar al del uso de Cp20 (Figura 8A), mientras que la adición de factor B al suero empobrecido en factor B restauró la deposición del fragmento C3 inducida por el hemo a un nivel similar. nivel como NHS (Figura 8A), lo que indica que la activación del complemento inducida por hemo es dependiente de AP, como se describió anteriormente por otros (66).

Figura 8. La inhibición de la propidina protege a las células endoteliales de la activación del complemento inducida por el hemo. (A, B) La activación del complemento en las células endoteliales tratadas con hemo depende de la vía alternativa. Las HUVEC se estimularon con medio M199 o hemina 100 & # x003BCM, se lavaron e incubaron con NHS o suero empobrecido en factor B (FB-dpl) (15% final), en presencia o ausencia de Cp20 (50 & # x003BCM) o EDTA (20 mM). Se usó factor B (FB) 54 nM para restaurar la actividad del suero empobrecido en factor B. (C) El MoAb anti-propidina protege a las HUVEC tratadas con hemo de la deposición del fragmento C3. Las HUVEC se estimularon con 100 & # x003BCM hemin (o M199), NHS (33% final) y uno de los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: Cp20 (50 & # x003BCM), péptido de control de compstatina (& # x0201CCp20 Control, & # x0201CCp20) # x0201D 50 & # x003BCM), MoAb antiapropiadina 6E11A4 (80 nM), control de isotipo IgG1 (80 nM), eculizumab (53 nM u 80 nM) o SALO (5 & # x003BCM). (A & # x02013C) La deposición de C3 (GMFI) se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y & # x0201CFold diferencia & # x0201D se calculó dividiendo GMFI de cada grupo por GMFI del grupo NHS solo. (A) es una combinación de cuatro experimentos independientes (cada uno con duplicados), (ANTES DE CRISTO) son representativos de cuatro y dos experimentos independientes, respectivamente, con duplicados. Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s. & # x0002A & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.0001, & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0,001, & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.01, & # x0002Apag & # x0003C 0.05, pag & # x0003E 0,05 ns. El análisis estadístico entre el grupo NHS & # x0002Bheme y cada grupo inhibidor se muestra en (C).

El bloqueo de la propidina usando anti-propidina MoAb 6E11A4 inhibió significativamente la deposición del fragmento C3 en las HUVEC tratadas con hemo en un 40% y eculizumab no redujo la deposición del fragmento C3 (Figura 8C) en comparación con el grupo NHS & # x0002Bheme solo. Además, SALO, un inhibidor de la vía clásica (61), no inhibió la deposición del fragmento C3 en las HUVEC tratadas con NHS & # x0002Bheme (Figura 8C), lo que indica que la vía clásica no contribuye a la activación del complemento en las células endoteliales expuestas al hemo, lo que confirma Datos de la Figura 8A. En conjunto, los datos indican que la inhibición de la función de la propidina redujo significativamente la activación del complemento inducida por hemo en las células endoteliales.

Estandarización de un ensayo de deposición de C3b similar al aHUS en células endoteliales humanas utilizando mutantes de hemo y rH19-20 aHUS

Las mutaciones relacionadas con AHUS en el extremo C-terminal del factor H afectan su función de superficie celular y causan eventos patológicos en glóbulos rojos (57), plaquetas (18), neutrófilos (18) y células endoteliales (74 & # x0201376). Por tanto, buscamos establecer una condición de & # x0201CaHUS-like & # x0201D en células endoteliales donde la protección del Factor H está deteriorada y el hemo está presente. Para ello, evaluamos cómo las mutaciones relacionadas con el aHUS en el dominio 19-20 del factor H afectan la activación del complemento en las células endoteliales cuando se exponen solo al NHS, en comparación con el rH19-20 de tipo salvaje. La exposición de las células endoteliales a rH19-20 de tipo salvaje aumentó la deposición del fragmento C3 de 7 a 11 veces en comparación con NHS solo (Figuras 9A y # x02013C). Se probaron cuatro construcciones de rH19-20 que contenían mutaciones. Estas mutaciones tienen una capacidad altamente alterada (R1215Q y W1183L), intermediamente alterada (L1189R) o mínimamente alterada (T1184R) para competir con el factor H e inducir la activación del complemento en las superficies de plaquetas, neutrófilos y células endoteliales, en comparación con el tipo salvaje rH19-20 (18, 57, 76). R1215Q y W1183L perdieron completamente su capacidad para competir con el factor H, lo que no provocó un aumento en la deposición del fragmento C3 en comparación con el NHS solo (Figura 9A). L1189R se vio afectada en un 40% en su capacidad para inducir la deposición de C3 en comparación con rH19-20 de tipo salvaje (Figura 9B). T1184R no se vio afectada en su capacidad para inducir la activación del complemento (Figura 9C) y aumentó la deposición de C3 en 2 veces en comparación con el rH19-20 de tipo salvaje, de acuerdo con nuestra observación anterior sobre las plaquetas (18). Debido a que la hemólisis excesiva es una de las características distintivas del SHUa, a continuación agregamos hemo, además del tipo salvaje o mutantes NHS y rH19-20, como una forma de establecer un SHUa similar in vitro ensayo. Las Figuras 9D y # x02013F muestran que la exposición del hemo solo a las células endoteliales aumentó 6 & # x0201311 veces la activación del complemento en comparación con el NHS, como se observa en la Figura 8. La adición de rH19-20 mejoró significativamente la activación del complemento inducida por el hemo en 2 & # x020133 veces (Figuras 9D y # x02013F). La Figura 9D muestra que las mutaciones altamente deterioradas (R1215Q y W1183L) tenían una tendencia de deterioro similar en comparación con la de ausencia de hemo (Figura 9A). El mutante L1189R ya no se alteraba de forma intermedia, ya que inducía el mismo nivel de deposición de C3 en comparación con el rH19-20 de tipo salvaje, en presencia de hemo (Figura 9E). El mutante T1184R mínimamente alterado indujo 2 veces más deposición de C3 frente al rH19-20 de tipo salvaje en presencia de hemo (Figura 9F), comparable al observado en ausencia de hemo (Figura 9C). En conjunto, la Figura 9 muestra que la falta de protección de la superficie celular del factor H condujo a la activación del complemento en las células endoteliales y la preexposición al hemo exacerbó significativamente la activación del complemento cuando las células endoteliales no están protegidas por el factor H. Además, este depósito de C3b similar al aHUS El ensayo pudo detectar diferencias entre el nivel de deterioro entre los mutantes rH19-20 probados, similar a lo que hemos observado anteriormente para glóbulos rojos, neutrófilos y plaquetas (18, 57).

Figura 9. Los mutantes RH19-20 tienen varios efectos en relación con el rH19-20 de tipo salvaje al afectar la activación del complemento en las células endoteliales en presencia o ausencia de hemo. (A & # x02013F) Las HUVEC se estimularon con hemina M199 o 100 & # x003BCM, se lavaron e incubaron con NHS (33% final) con o sin rH19-20 (10 & # x003BCM) o mutantes relacionados con el aHUS (R1215Q, W1183L, L1189R o T1184R, 10 & # x003BCM) # x003BCM). La deposición de C3 (GMFI) se determinó como se describe en & # x0201CMateriales y métodos. & # X0201D Los resultados representativos se muestran como & # x0201C Diferencia de pliegues & # x0201D y se representan gráficamente como la media y la DE de los duplicados. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s & # x0002A & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.0001, & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0,001, & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.01, & # x0002Apag & # x0003C 0.05, pag & # x0003E 0,05 ns.

La inhibición de la properdina reduce la activación del complemento en las células endoteliales expuestas al hemo que carecen de la protección del factor H

Finalmente, nuestro objetivo fue determinar si la propidina contribuye a la activación del complemento inducida por hemo en las células endoteliales que carecen de la protección del factor H (como modelo para el SHUa).La Figura 10 (lado izquierdo) muestra que el hemo indujo una deposición de fragmentos C3 de 7 veces, en comparación con NHS solo. El MoAb y Cp20 anti-propidina inhibieron la deposición de C3 inducida por hemo en un 30 y 60%, respectivamente, de acuerdo con la Figura 8C. La incubación de HUVEC con rH19-20 aumentó la deposición de fragmentos C3 en 12 veces en comparación con NHS solo (Figura 10, centro) y el bloqueo de la propidina, en este caso, eliminó por completo la deposición de fragmentos C3 mediada por rH19-20 (Figura 10, centro ). El bloqueo de C3 (Cp20) también dio como resultado la inhibición completa de la deposición de C3 (Figura 10, centro). El aumento de los depósitos de C3 mediado por hemo o rH19-20 se incrementó aún más en más de 4 veces cuando las HUVEC se trataron tanto con hemo como con rH19-20 (Figura 10, lado derecho), y este aumento se atenuó significativamente en un & # x0007E75% por bloqueando la escisión de la apropiadadina o C3 (Figura 10, lado derecho).

Figura 10. La inhibición de la propidina reduce la activación del complemento en las células endoteliales expuestas al hemo que carecen de la protección del factor H. Las HUVEC se estimularon con hemina M199 o 100 & # x003BCM, se lavaron e incubaron con NHS (33% final) en presencia o ausencia de los siguientes reactivos a las concentraciones finales indicadas: rH19-20 (10 & # x003BCM), Cp20 (50 & # x003BCM), Cp20 (50 & # x003BCM) # x003BCM), antiapropiadina MoAb 6E11A4 (53 nM) o control de isotipo IgG1 (53 nM). La deposición de C3 (GMFI) se determinó como se describe en & # x0201CMaterials and Methods & # x0201D y los resultados representativos se representan gráficamente como la media y la DE de los duplicados para cada grupo en relación con & # x0201CNHS solo & # x0201D (valor asignado de 1 línea discontinua) y se muestran como & # x0201C Doble diferencia. & # x0201D Los datos se analizaron mediante ANOVA bidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey & # x00027s & # x0002A & # x0002A & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.0001, & # x0002A & # x0002Apag & # x0003C 0.01, & # x0002Apag & # x0003C 0.05, pag & # x0003E 0,05 ns.


Sistema complementario en inmunidad adaptativa: regulación de células B e inmunidad humoral

Las funciones antes mencionadas del sistema del complemento, oposonización, lisis y generación de la respuesta inflamatoria a través de mediadores solubles, son paradigmáticas y representan un componente bien caracterizado de una defensa innata del huésped. Se ha vuelto cada vez más apreciado que las funciones del complemento en la defensa del huésped se extienden más allá de las respuestas inmunes innatas. El hallazgo de que los linfocitos B se unían a C3 planteó la pregunta, ya en la década de 1970, de si el sistema del complemento estaba implicado en las respuestas inmunitarias adaptativas 84. El trabajo posterior demostró que el agotamiento de C3 alteraba las respuestas inmunitarias humorales y proporcionó evidencia directa de que las respuestas adaptativas eficientes dependían de un sistema del complemento intacto en algunos casos 85. Estudios posteriores en animales con deficiencias naturales del complemento implicaron a la vía clásica como un mecanismo crucial para la retención y captura eficaz de antígenos en tejidos linfoides (p. Ej., Folículos esplénicos), lo que sugiere que una función principal del sistema del complemento era localizar antígenos extraños en sitios inmunes importantes. para las respuestas de los linfocitos 86, 87, 88.

El brazo humoral de la respuesta inmune adaptativa tiene la tarea de proteger los espacios extracelulares mediante la generación de células B efectoras y de memoria, y anticuerpos producidos por las células B, lo que lleva a la neutralización y opsonización del patógeno y proporciona memoria inmunológica contra la reinfección. La potencia de esta respuesta proviene de una interacción compleja de mecanismos inmunes, dependiendo de la fuerza de los estímulos antigénicos y la presencia de asistencia de las células T colaboradoras, entre muchos otros factores 2. Los efectores del complemento están comprometidos con la inmunidad humoral en múltiples etapas de la diferenciación de las células B y pueden influir en la biología de las células B en varios niveles 89, 90. Como se mencionó anteriormente, el complemento mejora la inmunidad de las células B principalmente a través de CR, CR1 (CD35) y CR2 (CD21), expresados ​​en linfocitos B y células dendríticas foliculares (FDC), y uniéndose a las opsoninas del complemento en un esfuerzo concertado con el fagocítico. sistema 75, 90, 91. CR2 forma un complejo receptor con la proteína de señalización CD19 y la proteína tetraspan CD81 para formar el complejo correceptor de células B (CD21-CD19-CD81), que soporta una señal mejorada a través del receptor de células B (BCR, por ejemplo, inmunoglobulina de superficie) cuando encuentra antígeno recubierto con opsoninas del complemento (p. ej., C3d), ​​lo que resulta en la reducción del umbral de activación de células B en varios órdenes de magnitud 92, 93. Por tanto, el complemento puede verse como un "adyuvante natural" y como un instructor de la respuesta inmune humoral 94.

La consecuencia funcional de esta modulación de la señalización de las células B se puede observar en múltiples entornos. Las células B expresan primero el correceptor CD21-CD19-CD81 a medida que migran desde la médula ósea hacia la periferia, generalmente conocida como la etapa de transición que tiene implicaciones importantes en la eliminación de las células B autorreactivas y en la selección positiva de las células B1. 95. Las células B1, que son las principales fuentes de anticuerpos naturales con repertorios muy sesgados hacia antígenos conservados (p. Ej., Antígenos nucleares), son una población de células B de larga duración y fisiológicamente distinta 2. El complemento parece funcionar en la selección y el mantenimiento de las células B1, ya que los ratones deficientes en CR2 tienen un repertorio alterado de anticuerpos naturales, que se puede observar por una marcada reducción de la lesión después de la isquemia / reperfusión a pesar de los niveles normales de IgM 96, 97. Estos ratones también tienen un número reducido de células B1a y muestran una producción de anticuerpos generalizada alterada 98.

Además de modular la actividad B1 y la producción de anticuerpos naturales, el entrecruzamiento del complejo correceptor CD21-CD19-CD81 con BCR también mejora la inmunidad de las células B en las etapas posteriores de la diferenciación de las células B. El acoplamiento de C3d al antígeno de baja afinidad, que (si se desacopla) causaría la muerte de las células B, da como resultado no solo la supervivencia, sino también la activación de las células B y la producción de anticuerpos, lo que sugiere un papel del complemento en la 'instrucción' de las células B vírgenes. en la periferia 99. De manera similar, la activación de las células B periféricas y foliculares maduras por el antígeno opsonizado por complemento conduce a su migración al límite de células T linfoides: células B, donde las células T auxiliares proporcionan coestimulación a través de CD40, lo que lleva a la activación y expansión de las células B. Posteriormente, las células B activadas inician la formación de centros germinales (GC), donde las CR en las células B mejoran la señalización de BCR, lo que lleva a una diferenciación efectiva en células B plasmáticas y de memoria 89, 90. Esto está respaldado por la observación de que las células B específicas de antígeno que carecen de CR1 / CR2 no sobreviven dentro de un GC cuando se ponen en competencia con las células B WT, lo que insinúa que la señalización del correceptor es vital para la selección clonal de células B y en ausencia de este complemento. cososeñalización asistida, las células B no compiten y sufren la muerte celular 100. Las CDF son fundamentales para este proceso, ya que son células estromales especializadas que secretan el quimioatrayente de linfocitos B, ayudan a organizar los GC y proporcionan un medio eficaz para atrapar y retener el antígeno dentro de los folículos de las células B y mostrarlos a las células B vírgenes y GC 101 . Las FDC expresan niveles relativamente altos de CR1 y CR2 y retienen eficazmente los complejos inmunes recubiertos de C3 dentro de los folículos linfoides, lo que promueve la selección de antígenos de las células B GC de alta afinidad 92. Además, las células B post-GC requieren un complemento en las FDC para un mantenimiento eficiente de las células B de memoria a largo plazo, la maduración de la afinidad y las respuestas de recuerdo eficaces 102.

Además de los CR, CR1 y CR2, alguna evidencia sugiere un papel de las anafilatoxinas en la modulación de la biología de las células B. Se ha informado que las células B expresan C3aR y ambos ligandos, C3a y C3adesArg, se ha demostrado que regulan negativamente la respuesta inmunitaria policlonal, además de limitar la secreción de TNF-α e IL-6 103, 104. Por el contrario, se ha informado que C5a desempeña un papel en el tráfico y la migración de varias poblaciones de células B, incluidas las células GC B y la memoria amigdalina y las células B naїve 105, 106, 107.

Las funciones del complemento en la inmunidad humoral pueden ilustrarse mediante la caracterización de ratones que presentan deficiencias tanto en los componentes del complemento como en las RC 90. Los estudios han demostrado la importancia de una vía clásica del complemento intacta (C1q, C3 o C4) en la respuesta humoral a los antígenos tanto dependientes del timo como independientes del timo 108. En muchos casos, los ratones deficientes en CR1 / 2 (un solo gen Cr1 / 2 codifica ambas proteínas en ratones) exhiben un deterioro similar, lo que sugiere que las respuestas pro-humorales están mediadas por estos receptores 89. Por ejemplo, los ratones deficientes en CR1 / 2 y C3 exhibieron niveles de IgM (e IgG) marcadamente reducidos, falla en el cambio de isotipo a IgG y disminución de la captación de antígeno en respuesta a los antígenos de polisacáridos de tipo II independientes de T 109, 110. Se establecieron resultados similares para antígenos dependientes de T, como la hemocianina de lapa californiana y el bacteriófago ΦX174, así como para patógenos virales y bacterianos, como el virus del herpes simple, el virus del Nilo occidental y steotococos neumonia 98, 111, 112, 113, 114. Estos y otros estudios destacan el papel fundamental que desempeña el complemento en la generación de una sólida respuesta de anticuerpos en varios niveles de la biología de las células B.


Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

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Palabras clave: complemento, lisis, complejo de ataque de membrana, virus Zika, proteína de la envoltura, vía terminal del complemento.

Cita: Malekshahi Z, Schiela B, Bernklau S, Banki Z, W & # xfcrzner R y Stoiber H (2020) Interference of the Zika Virus E-Protein with the Membrane Attack Complex of the Complement System. Parte delantera. Immunol. 11: 569549. doi: 10.3389 / fimmu.2020.569549

Recibido: 11 de junio de 2020 Aceptado: 05 de octubre de 2020
Publicado: 28 de octubre de 2020.

Zvi Fishelson, Universidad de Tel Aviv, Israel

Kenneth Reid, Universidad de Oxford, Reino Unido
Horea Rus, Universidad de Maryland, Baltimore, Estados Unidos

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¿Por qué se considera la lisis de eritrocitos de oveja como la vía clásica de activación del complemento y la del conejo como alternativa? - biología

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UN ESTUDIO COMPARATIVO DE LA VÍA ALTERNATIVA DE MAMÍFEROS Y REPTILIANOS DE MATANZA MEDIADA POR COMPLEMENTOS DE LA ENFERMEDAD DE LYME SPIROCHETE (BORRELIA BURGDORFERI)

May M. Kuo, 1 Robert S. Lane, 1 Patricia C. Giclas 1, *

1 Departamento de Ciencias, Políticas y Gestión Ambientales, División de Biología de Insectos, Universidad o

* * Centro Nacional de Investigación y Medicina Judía, Laboratorio de Complemento, Denver, Colorado 80206.

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La actividad bactericida potencial de la vía alternativa del complemento de sueros de mamíferos y reptiles para Borrelia burgdorferi sensu stricto (s.s.) se evaluó in vitro. Se observó muerte mediada por el complemento cuando se inocularon espiroquetas cultivadas en sueros del lagarto de la cerca occidental (Sceloporus occidentalis) y del lagarto cocodrilo del sur (Elgaria multicarinata), pero no cuando se inocularon en suero de ratón ciervo (Peromyscus maniculatus) o de humanos. Las espiroquetas seguían vivas después de 4 h en suero de lagarto que se había precalentado a 56 ° C durante 30 min para inactivar el complemento. Además, cuando el suero de lagarto fue quelado con ácido etilendiaminotetraacético 10 mM para bloquear toda la activación del complemento, se detuvo la actividad borrelicida. Cuando el suero de lagarto fue quelado con etilenglicol-bis (β-aminoetil éter) -N, N, N ', N'-tetraacético 10 mM más MgCl 4 mM2 para bloquear solo la activación de la vía clásica del complemento, & gt85% de las espiroquetas se inmovilizaron en 1 h. Diferencias en B. burgdorferi s.s. no se observó mortalidad cuando los quelantes con o sin MgCl2 se añadieron al suero de ratones ciervos o de seres humanos. Las proteínas que comprenden la vía alternativa del complemento son responsables de la actividad borrelicida observada en la sangre de S. occidentalis y E. multicarinata.

May M. Kuo, Robert S. Lane y Patricia C. Giclas "UN ESTUDIO COMPARATIVO DE LA VÍA ALTERNATIVA DE MAMÍFEROS Y REPTILIANOS DE MATANZA MEDIADA POR COMPLEMENTOS DE LA ENFERMEDAD DE LYME SPIROCHETE (BORRELIA BURGDORFERI), "Journal of Parasitology 86 (6), 1223-1228, (1 de diciembre de 2000). Https://doi.org/10.1645/0022-3395(2000)086[1223:ACSOMA]2.0.CO2

Recibido: 1 de noviembre de 1999 Aceptado: 1 de abril de 2000 Publicado: 1 de diciembre de 2000


Información de soporte

S1 Fig. La interacción de BBK32 con C1r depende del calcio.

Como se observó para el complejo C1, la interacción de C1r con (A) BBK32-FL de longitud completa o (B) BBK32-C depende en gran medida del calcio según se juzga por SPR.

S2 Fig. Infeccioso B. burgdorferi y el isogénico bbk32 el mutante se une a C1 a niveles elevados.

Cepa ML23 / pBBE22luc y el bbk32 derivado mutante JS315 / pBBE22luc se incubaron con C1 inmovilizado para evaluar la unión. No se observaron diferencias significativas en la unión para ambas cepas probadas. Cada punto de datos representa espiroquetas contadas dentro de un campo independiente según se puntuó mediante microscopía de campo oscuro (n = 30 por cepa). La barra horizontal representa el valor medio. La significancia estadística se evaluó mediante el uso de un t prueba. ns no significativo.


Ver el vídeo: CytoQuest CR CTC Enrichment - RBC Lysis (Enero 2022).