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¿La microbiota intestinal es sustancialmente diferente dentro de un divertículo del colon?


De la página de Wikipedia para el apéndice vermiforme:

Esta propuesta se basa en una nueva comprensión de cómo el sistema inmunológico apoya el crecimiento de bacterias intestinales beneficiosas, en combinación con muchas características bien conocidas del apéndice, incluida su arquitectura, su ubicación justo debajo del flujo normal unidireccional de alimentos y gérmenes en el intestino grueso y su asociación con grandes cantidades de tejido inmunitario. La investigación ... mostró que las personas sin apéndice tenían cuatro veces más probabilidades de tener una recurrencia de Clostridium difficile.

Esta cita parece implicar que el apéndice puede actuar como caldo de cultivo para cierta flora intestinal que es un poco menos común (como C. difficile) y no tan ubicuo como E. coli o Enterobacter sp. El apéndice podría verse como un lugar ideal para este crecimiento de poblaciones microbianas en el intestino.

Dado que, en una primera aproximación, anatómicamente, el apéndice y un divertículo común del colon son afloramientos del intestino grueso: en qué medida un divertículo también podría soportar una flora menos común o más diversa, y qué tan probable es esto. debido a una diferencia en el ambiente extracelular (pH, concentración de iones) y ¿qué tan probable es simplemente debido a la forma?


El apéndice es un tipo de divertículo verdadero del colon, aunque es uno que está presente en todas las personas (a menos que un cirujano lo haya extraído). Hay bacterias en el intestino desde la boca hasta el ano, y la cantidad y los tipos de bacterias cambian a lo largo del tracto intestinal. Una revisión reciente de J. Ridlon publicada en el Journal of Lipid Research (2006) está disponible en línea y ha documentado estas observaciones de varios investigadores. En ese documento se describe que las especies bacterianas cambian, así como la abundancia relativa de bacterias que aumenta a lo largo del tracto intestinal. La Figura 1 de ese documento que es de acceso abierto disponible en el enlace de arriba se encuentra a continuación.

Creo que es interesante que la página wiki que está citando indique que las personas sin un apéndice tenían más probabilidades de desarrollar un recurrente C. diff infección. Se podría interpretar que, como lo hicieron en ese sitio, de alguna manera el apéndice está repoblando el colon y haciendo que el individuo sea más resistente a una infección repetida o "recurrente". Sin embargo, no conozco ningún estudio que haya probado directamente esa hipótesis.

En términos de si la flora intestinal, también conocida como "microbiota intestinal", es significativamente diferente en el apéndice, es posible, pero no creo que nadie lo haya identificado todavía. Uno de los problemas con esto sería que no eliminamos los apéndices de forma rutinaria a menos que estén infectados / inflamados, lo que intrínsecamente alteraría el microbioma localmente.

Entonces, ¿es posible que el microbioma sea significativamente diferente en el propio apéndice en comparación con el ciego a solo unos centímetros de distancia? La respuesta sería: potencialmente, pero nadie ha podido abordar esa pregunta hasta la fecha.


La palabra microbiota representa un conjunto de microorganismos que reside en un ambiente previamente establecido.

Los seres humanos tenemos grupos de bacterias en diferentes partes del cuerpo, como en la superficie o capas profundas de la piel (microbiota cutánea), la boca (microbiota oral), la vagina (microbiota vaginal), etc.

Microbiota intestinal (antes llamada flora intestinal) es el nombre que se le da hoy a la población de microbios que vive en nuestro intestino.

Contiene decenas de billones de microorganismos, incluidas al menos 1000 especies diferentes de bacterias conocidas con más de 3 millones de genes (150 veces más que los genes humanos). La microbiota puede, en total, pesar hasta 2 kg.

Un tercio de nuestra microbiota intestinal es común para la mayoría de las personas, mientras que dos tercios son específicos de cada uno de nosotros. En otras palabras, la microbiota de su intestino es como una tarjeta de identidad individual.

Existen varios suplementos que, cuando se toman según lo sugerido, pueden mejorar y restaurar el revestimiento intestinal. Total Restore de Gundry MD y 1MD Complete Probiotics Platinum son posiblemente los dos productos destacados.


Abstracto

Los datos preclínicos y clínicos producen una creciente evidencia de que la microbiota está fuertemente asociada con la carcinogénesis colorrectal. La disbiosis puede cambiar el curso de la carcinogénesis, ya que las acciones microbianas parecen afectar las alteraciones genéticas y epigenéticas que conducen a la displasia, la expansión clonal y la transformación maligna. La iniciación y promoción del cáncer colorrectal puede resultar de acciones bacterianas directas, metabolitos bacterianos y vías inflamatorias. Los aspectos más nuevos de la microbiota y el cáncer colorrectal incluyen la detección de quórum, la formación de biopelículas, las caras y los efectos / contraefectos de la microbiota y los probióticos en la quimioterapia. En el futuro, apuntar a la microbiota probablemente será un arma poderosa en la batalla contra el CCR, ya que la microbiología intestinal, la genómica y la metabolómica prometen descubrir vínculos importantes entre la microbiota y la salud intestinal.

Palabras clave: microbiota, disbiosis, mecanismos de defensa de las mucosas, inflamación, carcinogénesis, cáncer colorrectal.


Introducción

El envejecimiento es un proceso multifactorial que conduce a una disminución de la función de la mayoría de los órganos y tejidos [1, 2]. Las Perspectivas de población mundial de las Naciones Unidas de 2019 indicaron una tendencia mundial hacia el envejecimiento de la población [3]. A medida que las personas envejecen, sufren problemas de aprendizaje y de memoria. Estas deficiencias tienen un impacto negativo en su calidad de vida y funciones diarias. El deterioro cognitivo que inicialmente es lento y progresivo puede verse exacerbado por diversos factores y eventos de riesgo [4, 5]. Por lo tanto, es importante explorar los mecanismos del deterioro cognitivo relacionado con la edad y descubrir tratamientos potenciales para prevenir o retrasar el deterioro cognitivo en sus primeras etapas.

La microbiota intestinal se refiere a billones de bacterias simbióticas que coexisten en el tracto gastrointestinal, que es un componente esencial para mantener la salud del huésped. Los phyla bacterianos más poblados son Bacteriodetes y Firmicutes, que constituye más del 90% de la microbiota intestinal [[6], [7], [8]]. En individuos sanos, la microbiota intestinal es relativamente estable para formar mutualismo huésped-bacteria. Un análisis detallado indica que la microbiota intestinal regula el desarrollo y la función del cerebro a través de las tres rutas (es decir., vías inmunes, neuroendocrinas y vagales), y que las alteraciones de la comunidad microbiana pueden contribuir a las enfermedades neuropsiquiátricas. Las conexiones entre la microbiota intestinal, el intestino y el cerebro se conocen como eje microbiota-intestino-cerebro [[9], [10], [11], [12]]. Fröhlich y col. [13] informó que el tratamiento intragástrico a corto plazo de ratones adultos con una mezcla de antibióticos interrumpió la comunidad bacteriana en el colon y deterioró la memoria de reconocimiento de nuevos objetos. Gareau y col. [14] informó que los ratones libres de gérmenes (GF) presentaban déficits de memoria no espacial en ausencia de microbiota intestinal. La integridad del eje microbiota-intestino-cerebro de hecho juega un papel importante en la función cognitiva. Sin embargo, los estudios han demostrado que la microbiota intestinal de los adultos mayores es sustancialmente diferente a la de los adultos más jóvenes. La alteración de la comunidad de la microbiota intestinal (disbiosis) ocurre durante el envejecimiento normal (es decir., una reducción de la diversidad y una pérdida de taxones beneficiosos), por lo que la microbiota intestinal de los adultos mayores representa un fenotipo proinflamatorio en la mayoría de los casos [[15], [16], [17]]. Li y col. [18] realizaron un trasplante de microbiota fecal de ratas ancianas a ratas jóvenes, la composición de la microbiota intestinal de las ratas receptoras jóvenes estaba más cerca de las ratas ancianas. La función sináptica de las ratas receptoras jóvenes se dañó con el aumento de la neuroinflamación y se observaron deterioros cognitivos conductuales significativos. Por lo tanto, vale la pena explorar la asociación entre la microbiota intestinal y la función cognitiva durante el proceso de envejecimiento normal, las condiciones fisiológicas y patológicas y los mecanismos potenciales.

La entrada de neurotoxinas derivadas de la microbiota intestinal en la circulación sistémica puede ser un precursor del inicio de la neuroinflamación, estableciendo vías patogénicas de comunicación entre los sistemas inmunitarios innato sistémico y central [14, 19, 20, 21]. El sistema inmunológico innato protege al cuerpo contra microbios infecciosos mediante el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), que sirven para detectar patógenos mediante receptores de reconocimiento de patrones (PRR). El lipopolisacárido (LPS) es un componente de la pared celular de las bacterias Gram negativas y un potente estimulante inflamatorio. La permeabilidad intestinal al LPS bacteriano parece ser un desencadenante importante de la inflamación sistémica de bajo grado, la neuroinflamación y los déficits cognitivos [22,23]. A través de la interacción con el receptor tipo Toll 4 (TLR4) en las células mononucleares, el LPS derivado de la microbiota puede ser un desencadenante importante en el desarrollo de la inflamación [24]. La expresión amplia de TLR4 se ha encontrado en el cerebro humano, especialmente en microglia y neuronas, que pueden activar la vía TLR4 / proteína diferencial mieloide-88 (MyD88) / factor nuclear κB (NF-κB) después de unirse a LPS [25] . La activación de la vía TLR4 / MyD88 / NF-κB es clave para el desarrollo de muchas enfermedades. NF-κB es una molécula de señalización descendente fundamental en la vía TLR4 / MyD88. MyD88, una molécula adaptadora para la familia del receptor Toll-interleucina-1 (TIR), puede activar el factor de transcripción NF-κB para inducir la producción de citocinas inflamatorias. Nuestros estudios anteriores mostraron que la vía TLR4 / MyD88 / NF-κB juega un papel importante en la neuroinflamación [26, 27]. La neuroinflamación puede provocar deterioro cognitivo [25,28,29]. Dado que el envejecimiento deteriora el rendimiento cognitivo, planteamos la hipótesis de que este efecto se debe a la disbiosis intestinal, alteraciones en la comunicación microbiota-intestino-cerebro. vía inflamación crónica de bajo grado y neuroinflamación en el cerebro. Todo este proceso puede estar relacionado con la vía de señalización LPS-TLR4. Con este fin, comparamos la función cognitiva, la composición microbiana y las condiciones fisiológicas y patológicas del eje intestino-cerebro en ratones machos C57BL / 6 de 2 meses (2 m) y 15 meses (15 m) de edad. Las diferencias que se encontraron entre ratones de 2 my 15 m se asociaron con la activación inducida por LPS de la vía de señalización TLR4 / MyD88 / NF-κB.


Observaciones finales

Nuestro estudio explica los resultados dispares con respecto a la necesidad de T-bet para la inducción de inflamación intestinal mediada por células T CD4 + y destaca que la composición de la microbiota intestinal puede determinar las vías moleculares que conducen a la inflamación crónica. Estos hallazgos no solo sugieren que la fisiopatología de la EII humana puede ser altamente individual y dependiente de la microbiota, sino que también enfatizan nuevamente la importancia de estandarizar la microbiota en experimentos con animales.


Materiales y métodos

Se adquirieron ratones BALB / cy Rag1 - / - de Charles River Laboratories, Sulzfeld, Alemania. Se criaron ratones ΔdblGATA-1 [16] en condiciones específicas libres de patógenos en la instalación de cría DRFZ en el Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlín. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por la oficina reguladora “Landesamt für Gesundheit und Soziales” en Berlín, Alemania (número de permiso G0045 / 17).

Covivienda y trasplante de microbiota

Para los experimentos de covivienda, las hembras BALB / cy ΔdblGATA-1 se mantuvieron en la misma jaula en una proporción de 1: 1 durante 3 semanas. Para el agotamiento de la microbiota intestinal nativa, los ratones BALB / c se trataron con ampicilina (1 mg / ml ad libitum) a través del agua de bebida y con alimentación por sonda adicional dos veces al día. de neomicina 5 mg / ml, metronidazol 10 mg / ml y vancomicina 5 mg / ml (todos adquiridos de Sigma, Darmstadt) durante 14 días. Veinticuatro horas después de la última administración de antibióticos, la microbiota fecal correspondiente se transfirió mediante sonda durante tres días consecutivos. Para esto, se recolectaron sedimentos fecales frescos de ratones BALB / c (IgA alta) o ΔdblGATA-1 (IgA baja) y se resuspendieron en PBS (un sedimento en 1 ml). Después de la filtración a través de un filtro de células de 30 μm (Partec, Görlitz), se transfirieron 200 μL de la suspensión mediante alimentación por sonda. Los ratones se analizaron 3 semanas después de la última administración de microbiota.

Determinación de los niveles de IgA soluble

Las heces frescas se recogieron, se pesaron y se resuspendieron en PBS (1 mg de heces en 10 μL de PBS). Los niveles de IgA fecal en los sobrenadantes así como en los sueros sanguíneos se determinaron mediante ELISA (anticuerpos ELISA adquiridos de Southern Biotech a través de BIOZOL Diagnostica, Eching).

Inmunofluorescencia de secciones de tejido de PP

Los PP de ratones BALB / cy ΔdblGATA-1 no cohospedados y cohospedados se extrajeron de los intestinos, se lavaron en PBS helado y se embebieron en O.C.T. compuesto (Sakura Finetek Alpen aan den Rijn, NL) y congelado. El tejido congelado se cortó en secciones de 7 μm, que se fijaron en acetona al 100% (Carl Roth Karlsruhe) durante 20 min. Para la tinción por inmunofluorescencia, las secciones se bloquearon con anticuerpo anti-FcγR (clon 2.4G2 DRFZ), seguido de la tinción con IgA-FITC anti-ratón de cabra (Southern Biotech vía BIOZOL Diagnostica, Eching) e IgG1-PE anti-ratón. (RMG1-1 Biolegend Fell). Las imágenes adquiridas mediante un microscopio de barrido láser LSM 710 (Carl Zeiss) y el software ZEN2011.

Aislamiento celular

Para el aislamiento de las células siLP, se retiraron los PP y se abrieron longitudinalmente los intestinos delgados y se lavaron en PBS frío. Después de cortarlos en trozos cortos, los intestinos se incubaron dos veces en medio RPMI 1640 que contenía EDTA 25 mM, FCS al 10%, penicilina 100 U / mL y estreptomicina 100 μg / mL (P / S) durante 15 min a 37 ° C seguido de agitando para eliminar el epitelio. Las piezas intestinales se lavaron en PBS, se homogeneizaron con bisturí y se digirieron dos veces con RPMI 1640 que contenía FCS al 10%, P / S, 1 mg / ml de colagenasa D (Roche, Mannheim), 0,1 mg / ml de DNasa I y 1 mg. / mL Dispase II (Sigma, Darmstadt) durante 20 min a 37 ° C en un agitador a 200 rpm. Las suspensiones de células se pasaron a través de una aguja de calibre 18 y se filtraron a través de un filtro de células de 70 µm (BD Biosciences, Heidelberg). Después de lavar con medio RPMI1640 (FCS al 10%, P / S), las células se purificaron con una solución de Percoll al 30% (GE Healthcare, Hamburgo) en medio RPMI 1640 (FCS al 10%, P / S). A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en medio RPMI 1640 (FCS al 10%, P / S). Para aislar las células de PP, se extrajo tejido del intestino delgado, se hizo pasar por un filtro de células de 70 μm (BD Biosciences, Heidelberg) y se resuspendió en medio RPMI 1640, FCS al 10%, P / S.

Citometría de flujo

El análisis de citometría de flujo se realizó de acuerdo con las pautas publicadas anteriormente. [42] La tinción intracelular y de la superficie se realizó con los siguientes anticuerpos: CXCR5-Bio (L138D7), PD-1-APC (29F.1A12, BioLegend, Fell), B220-PacBlue (RA3.6B2), CD3-Bio (145-2C11), CD4-PB (GK1.5), todos purificados y conjugados en DRFZ, CD45-FITC (30-F11, eBioscience, Frankfurt, PNA-Bio (Vector Laboratories) , y de cabra anti-ratón IgA-DyLight 650 (BIOZOL Diagnostica, Eching y BIOMOL GmbH, Hamburgo). La tinción intracelular de IgG1-FITC (RMG1-1, BioLegend) se realizó utilizando el kit de tinción FoxP3 (eBioscience). Las células teñidas se adquirieron con un BD Canto II y los datos se analizaron con el software FlowJo V10. Las células Tfh se clasificaron mediante citometría de flujo con un clasificador de células BD Aria como células CD3 + CD4 + CXCR5 hi PD-1 hi.

Análisis de expresión genética

El ARN total se extrajo usando el reactivo de lisis QIAzol (Qiagen, Hilden). La transcripción inversa en el ADNc se realizó con el kit Sensiscript RT (Qiagen). La expresión de Tgfb1 y Il4 relativo a Actb se midió mediante PCR en tiempo real (95 ° C 30 s 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 s 45 ciclos) con StepOnePlus (Applied Biosystems) utilizando Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix de Thermo Scientific y los siguientes cebadores : Tgfb1 (Fw: 5´-CACAGCTCACGGCACCGGAGA-3´ Rv: 5´-GCTGTACTGTGTGTCCAGGCTCC-3´) Actb (Fw: 5´-CTCCTGAGCGCAAGTACTCTGTG-3´ Rv: 5´-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3´).

Análisis de ADN bacteriano fecal

El ADN bacteriano se aisló de los sedimentos fecales murinos congelados usando el kit ZR Fecal DNA MiniPrep (Zymo Research, Freiburg) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La cantidad relativa de phyla bacteriano específico se cuantificó usando una PCR en tiempo real (95 ° C 30 s 55 ° C 30 s, 72 ° C 30 s 55 ciclos) y cebadores específicos de phylum dirigidos al gen 16S rRNA [43]. La cantidad total de Eubacterias [44] se utilizó como referencia interna. El análisis de secuenciación profunda fue realizado por LGC Genomics, Berlín, Alemania, utilizando Illumina MiSeq V3 Chemistry (lectura de 300 pb en pares) y amplicón Bacteria 16S (341F-785R). La preparación de plantillas de rDNA 16S, la construcción de bibliotecas de Illumina, así como el procesamiento de lecturas, se produjo como se describió anteriormente [21]. Las lecturas combinadas se clasificaron usando "classifier.jar" del Ribosomal Database Project [45] con un límite de confianza del 50% y se aglomeraron a nivel de género usando RDPUtils [Quensen J. RDPutils: R Utilities for Processing RDPTool Output. R versión del paquete 1.2]. Las frecuencias de los géneros bacterianos se estimaron utilizando la producción ajustada por el número de copias y los recuentos bacterianos totales. Los mapas de calor representan géneros bacterianos clasificados de forma confidencial, con frecuencias superiores al 0,01% en BALB / cy inferiores en ratones ΔdblGATA-1 no agrupados. La estimación de la diversidad alfa y beta se realizó sin eliminar taxones no clasificados y sin volver a muestrear muestras a tamaños iguales por los paquetes “vegan” (Oksanen, J. et al. Vegan: Community Ecology Package) y “phyloseq” [46]. Tanto el índice de Shannon como el de Simpson se calcularon utilizando la función "estimación_ riqueza". El escalado multidimensional no métrico se realizó mediante la función "ordenada" en la configuración de los parámetros predeterminados utilizando la distancia de Bray-Curtis. Los datos de la secuencia sin procesar se depositaron en la base de datos GEO con el número de acceso PRJNA607006.

Preparación de filtrados de microbiota

Se recogieron heces frescas de ratones BALB / c y se resuspendieron en PBS helado. Posteriormente, la suspensión fecal se filtró a través de un filtro de células de 70 μm (Corning), 30 μm (Partec, Görlitz), 5 μm (Merck vía Sigma, Darmstadt) y filtros de jeringa bacteriana de 0,45 μm (Sarstedt, Nümbrecht). Después de la centrifugación, el sedimento se añadió a la suspensión de microbiota de ratones ΔdblGATA1. Se administraron doscientos microlitros del producto final por ratón mediante sonda.

Co-cultivo de esplenocitos con filtrados fecales

Se aislaron esplenocitos totales de ratones BALB / c, se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 105 células pro pocillo) recubiertas previamente con anticuerpos CD3 (3 μg / μL) y CD28 (3 μg / μL) y se cultivaron conjuntamente con 0,45 μm. filtrados de ratones BALB / co ΔdblGATA-1. Cuarenta y ocho horas después, las células se reactivaron con PMA (50 ng / mL) e ionomicina (5 μg / mL) durante 2 h, se lavaron y se resuspendieron en QIAzol Lysis Reagent para extracción de ARN.

Hibridación fluorescente in situ

Se incluyeron biopsias de tejido intestinal de ratón en el compuesto Tissue-Tek® O.C.T. ™. Se colocaron secciones de cuatro micrómetros de espesor en portaobjetos SuperFrost plus, se fijaron con solución de Carnoy en hielo durante 20 min y se dejaron secar. La hibridación se realizó en tampón de hibridación (NaCl 900 mM, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), formamida 6,7 ​​mM, SDS 346,7 mM, sonda de ADN 2 ng / μl) a 50 ° C durante 90 min. Los portaobjetos se aclararon con agua desionizada, se lavaron con tampón de lavado (NaCl 900 mM, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), SDS 346,7 mM) durante 5 min a 50 ° C y se aclararon de nuevo con agua desionizada. Después de secar, las secciones se tiñeron con una solución de DAPI (3,6 μM de DAPI, 900 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl) a temperatura ambiente durante 5 min y se enjuagaron con agua desionizada. La hibridación se realizó en la estación de hibridación a-Hyb (Miltenyi Biotec). Las secciones secas se montaron y examinaron mediante microscopía de fluorescencia (Keyence Biorevo BZ-9000). Se utilizó la siguiente sonda conjugada con AlexaFluor 647: AnaeroF1: 5’-ATGTAAAGTTCTTTTATCAG-3 ’.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 5.04. Las pruebas correspondientes se indican en las leyendas de las figuras.


Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del grupo del Prof. Rescigno por el inestimable apoyo científico, al IEO Animal Facility por la excelente cría de animales, al National Institute of Health Tetramer Facility por proporcionar h / mCD1d: PBS57 Tetramers y a Erika Mileti por su asistencia técnica. Agradecemos al Dr. Falcone, al Dr. Casorati y al Dr. Dellabona por la lectura crítica del manuscrito y al Prof. De Libero y al Dr. Mori por las discusiones científicas a lo largo del desarrollo del proyecto. Este trabajo fue posible gracias a las subvenciones de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (Start-Up 14378 to F Facciotti), el Ministerio de Salud de Italia (GR-2016-02361741) y la Fondazione IRCCS Policlinico Maggiore Milano (Premio de Investigación 5X1000 a F Caprioli) .

Contribuciones de autor

C Burrello: conservación de datos, análisis formal e investigación.

G Pellegrino: conservación e investigación de datos.

MR Giuffre: conservación e investigación de datos.

G Lovati: conservación e investigación de datos.

I Magagna: conservación e investigación de datos.

A Bertocchi: conservación e investigación de datos.

FM Cribiù: curación de datos, investigación y metodología.

F Boggio: investigación y metodología.

E Trombetta: conservación e investigación de datos.

A Di Sabatino: investigación y metodología.

M Vecchi: recursos y metodología.

M Rescigno: recursos y metodología.

F Caprioli: recursos, adquisición de fondos, investigación, metodología, administración del proyecto y redacción: revisión y edición.

F Facciotti: conceptualización, supervisión, adquisición de fondos, administración del proyecto y redacción: borrador original, revisión y edición.


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Resultados

La concentración de hierro luminal afecta la composición de la microbiota en el colon

La mayor parte del hierro suministrado a través de los suplementos de hierro en los seres humanos permanece sin absorber después de la ingestión y permanece localizado en la luz intestinal, donde puede afectar directamente la composición de la microbiota. Para obtener más información sobre cómo la concentración luminal de hierro afecta la microbiota intestinal, alimentamos ratones C57Bl / 6 con dietas personalizadas que contenían variaciones de 10 veces en el contenido de hierro, más precisamente 5 mg / kg (deficiencia de hierro), 50 mg / kg (hierro suficiente ) y 500 mg / kg (suplementado con hierro). Como se muestra en la Figura 1A, estas dietas dieron como resultado un aumento de aproximadamente 10 veces en el hierro luminal. Por lo tanto, en ratones, como en humanos, la mayor parte del exceso de hierro se retiene en el espacio luminal, lo que permite una modulación exitosa de los niveles de hierro luminal a través de manipulaciones dietéticas.

Cambios en la composición microbiana intestinal impulsados ​​por los niveles luminales de hierro. A, Niveles luminales de hierro en ratones que fueron alimentados con dietas que contenían 5, 50 o 500 mg de sulfato ferroso / kg de pienso. B – E, Análisis de los cambios de la microbiota fecal impulsados ​​por los niveles luminales de hierro evaluados por (B) Análisis de coordenadas principales (C) Diversidad α (D) Nivel de filo y (E) Composición microbiana a nivel de especie. Análisis de variación: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001. norte. s., no significativo. En (A), (B) y (E) cada punto de datos indica un solo mouse, norte = 10 ratones por grupo.

Cambios en la composición microbiana intestinal impulsados ​​por los niveles luminales de hierro. A, Niveles luminales de hierro en ratones que fueron alimentados con dietas que contenían 5, 50 o 500 mg de sulfato ferroso / kg de pienso. B – E, Análisis de los cambios de la microbiota fecal impulsados ​​por los niveles luminales de hierro evaluados por (B) Análisis de coordenadas principales (C) Diversidad α (D) Nivel de filo y (E) Composición microbiana a nivel de especie. Análisis de variación: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001. norte. s., no significativo. En (A), (B) y (E) cada punto de datos indica un solo mouse, norte = 10 ratones por grupo.

A continuación, investigamos el efecto de las concentraciones luminales variables de hierro sobre la composición de la microbiota en el colon. Analizamos el ADN extraído de muestras fecales mediante la secuenciación de próxima generación de amplicones del gen de ARN ribosómico (ARNr) 16S en la plataforma Illumina. Como se muestra en la Figura 1B, el análisis coordinado principal de la abundancia relativa de grupos bacterianos de las transcripciones de ARNr 16S reveló cambios en las comunidades bacterianas entre los ratones que fueron alimentados con la dieta deficiente en hierro y la dieta suplementada con hierro, ambos mostrando una superposición parcial con el hierro. dieta suficiente (Adonis: PAG = 0,008). Sin embargo, el análisis de diversidad alfa (número de OTU e índice de Shannon), que se muestra en la Figura 1C, indicó que la diversidad de la microbiota intestinal no se ve afectada significativamente por los niveles luminales de hierro. El análisis del gen de ARNr 16S reveló que el aumento de los niveles de hierro luminal desencadenó aumentos significativos de la abundancia relativa de los filos bacterianos. Firmicutes (25% deficiente de hierro versus 30% de hierro suplementado PAG & lt 0.05), mientras que Bacteroidetes y Proteobacterias permaneció prácticamente inalterado (Fig. 1D).

Dentro del filo Firmicutes, 4 especies bacterianas aumentaron con las concentraciones luminales de hierro (Fig. 1E), es decir, miembros de las órdenes Clostridiales (desclasificado Clostridiales y Oscillospira sp.) y Lactobacilales (Enterococcus sp. y sin clasificar Enterococcaceae). Por el contrario, 4 especies, pertenecientes a diferentes órdenes, disminuyeron: orden Clostridiales (desclasificado Christensenellaceae), pedido Lactobacilales (Lactococcus sp. y sin clasificar Lactobacillales), y el orden SHA-98 (desclasificado SHA-98). Cambios en no clasificados (Mogibacteriaceae) De la orden Clostridiales aumentó de 5 a 50 mg de hierro / kg de pienso, pero disminuyó de 50 a 500 mg de hierro / kg de pienso, lo que sugiere que estos cambios específicos pueden no estar relacionados con los niveles luminales de hierro. Dentro del filo TM7, pedido CW040, encontramos una disminución de no clasificados F 16 con mayores concentraciones de hierro. Finalmente, en el phylum Bacteroidetes, pedido Bacteroidales, se encontraron cambios en 4 especies: Parabacteroides distasonis, Parabacteroides gordonii, Bacteroides cacceaey sin clasificar Rikenellaceae.

Estos resultados muestran que las variaciones en los niveles luminales de hierro dan como resultado una mezcla de abundancias en lugar de un reemplazo significativo de miembros de la comunidad como causa de los cambios observados en la comunidad. Los turnos eran más frecuentes para los miembros de la Firmicutes que para el Bacteroidetes o TM7.

Las formulaciones de hierro afectan de manera diferencial la composición de la microbiota del colon

A continuación, preguntamos si el efecto del hierro sobre la composición de la microbiota puede diferir según las formulaciones de hierro utilizadas para complementar la dieta. En las últimas décadas, se han introducido varios compuestos de hierro como fortificantes alimentarios para la prevención de la deficiencia de hierro en humanos, seleccionados en base a 2 condiciones fundamentales: (1) “el compuesto no debe cambiar las propiedades organolépticas del vehículo alimenticio” y ( 2) “debe tener una alta biodisponibilidad cuando se consume como producto final”. 44 Seleccionamos 3 compuestos de hierro disponibles comercialmente de biodisponibilidad comprobada y química compleja distinta que se encuentran entre los más utilizados como fortificantes de hierro y suplementos de hierro terapéuticos: FS, FBG y FEDTA. 44, 45 Como se muestra en la Figura 2A, los ratones que fueron alimentados con diferentes formulaciones de hierro con la misma concentración de hierro (es decir, 50 mg de hierro / kg de pienso) tenían cantidades similares de hierro luminal, por lo que se excluye la posibilidad de que se produzcan cambios en la microbiota intestinal la composición, podrían ser atribuibles a cambios en la concentración luminal de hierro. Sin embargo, a pesar de los niveles luminales de hierro similares, la gráfica de análisis de coordenadas principal muestra que los distintos compuestos de hierro dieron como resultado un agrupamiento de comunidades de microbiota significativamente diferente (Adonis: PAG = 0,03 Fig. 2B). El número de OTU y el índice de Shannon (Fig. 2C) indicaron que la diversidad de la microbiota intestinal no se vio afectada significativamente por los distintos compuestos de hierro utilizados en las dietas.

Cambios en la composición microbiana intestinal impulsados ​​por distintas formulaciones de hierro. A, Niveles luminales de hierro en ratones que fueron alimentados con dietas que contenían 50 mg de hierro / kg agregado como sulfato ferroso (FS), bisglicinato ferroso (FBG) o ácido etilendiaminotetraacético férrico (FEDTA). B – E, Análisis de los cambios de la microbiota fecal impulsados ​​por los niveles luminales de hierro evaluados por (B) Análisis de coordenadas principales (C) Diversidad α (D) Nivel de filo y (E) Composición microbiana a nivel de especie. Análisis de variación: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001. norte. s., no significativo. En (A), (B) y (E) cada punto de datos indica un solo mouse, norte = 5-8 ratones por grupo.

Cambios en la composición microbiana intestinal impulsados ​​por distintas formulaciones de hierro. A, Niveles luminales de hierro en ratones que fueron alimentados con dietas que contenían 50 mg de hierro / kg agregado como sulfato ferroso (FS), bisglicinato ferroso (FBG) o ácido etilendiaminotetraacético férrico (FEDTA). B – E, Análisis de los cambios de la microbiota fecal impulsados ​​por los niveles luminales de hierro evaluados por (B) Análisis de coordenadas principales (C) Diversidad α (D) Nivel de filo y (E) Composición microbiana a nivel de especie. Análisis de variación: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001. norte. s., no significativo. En (A), (B) y (E) cada punto de datos indica un solo mouse, norte = 5-8 ratones por grupo.

Si bien a nivel de filo, no se observaron diferencias significativas (Fig. 2D) a nivel de especie (Fig. 2E), encontramos que tanto FBG como FEDTA, en comparación con FS, aumentaron los niveles de Parabacteroides sp. (filo Bacteroidetes). En comparación con FS, la abundancia de 2 especies disminuyó en respuesta a FBG, a saber, la Firmicutes desclasificado Clostridiaceae y Dehalobacterium sp. De la orden Clostridiales. A su vez, FEDTA aumentó la abundancia de 6 especies: una del filo Proteobacterias (Bilophila sp.), 3 Firmicutes (de la orden BacilosStaphylococcus sciuri y sin clasificar Lactobacillales y de la orden ErysipelotrichiAlobáculo sp.), y uno del filo Actinobacterias (Corynebacterium stationis). Por el contrario, la abundancia de 3 Firmicutes: Lactococcus sp. De la orden Lactobacillales, al igual que Coprococcus sp. y Roseburia sp. De la orden Clostridiales disminuyó significativamente en ratones que fueron alimentados con la dieta FEDTA (Fig. 2E).

Basado en niveles iguales de hierro luminal, estos datos demuestran que el tipo de compuesto de hierro altera significativamente la composición de la microbiota del colon. Sin embargo, los cambios identificados en las comunidades de la microbiota intestinal impulsados ​​por distintas formulaciones de hierro son sustancialmente diferentes de los cambios causados ​​por variaciones en los niveles luminales de hierro.

Los niveles de hierro luminal y las distintas formulaciones de hierro inducen cambios en la composición funcional prevista de las comunidades de microbiota fecal

A continuación, para evaluar si los cambios mediados por el hierro en la abundancia de taxones bacterianos se acompañaron de cambios funcionales, utilizamos el análisis PICRUSt 46 aplicado a los datos de secuenciación del gen 16S rRNA. Los resultados de PICRUSt se analizaron luego utilizando el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal para identificar las funciones microbianas que eran significativamente diferentes entre los grupos. Como se muestra en la Figura 3A, se observaron un total de 9 funciones bacterianas abundantes diferencialmente (α = 0.05, puntaje LDA & gt2.5) entre ratones que fueron alimentados con la dieta deficiente en hierro (5 mg FS / kg pienso) y ratones que fueron alimentados la dieta suplementada con hierro (500 mg FS / kg de pienso). La dieta suplementada con hierro elevó el número de genes implicados en el transporte de membrana (transportadores) y la transcripción (factores de transcripción), mientras que disminuyó el número de genes relacionados con el metabolismo energético (vías de fijación de carbono, fosforilación oxidativa y metabolismo energético), metabolismo de carbohidratos. (ciclo del citrato), acompañantes (plegado, clasificación y degradación) y metabolismo de cofactores y vitaminas.

Cambios funcionales metagenómicos inferidos desencadenados por dosis y formulaciones de hierro. A – C, cambios funcionales metagenómicos previstos medidos por análisis discriminativo lineal (LDA) tamaño del efecto de las vías de KEGG en ratones que fueron alimentados con dietas que contenían: (A) 5 (azul claro) y 500 (azul oscuro) mg de hierro / kg en la forma de sulfato ferroso (FS — azul) (B) Bisglicinato ferroso (FBG — verde) y (C) Ácido etilendiaminotetraacético férrico (FEDTA — rojo). Las dietas FBG y FEDTA tenían 50 mg de hierro / kg de pienso. D, Basic features of gene regulation by the iron-regulated bacterial transcription factor ferric uptake regulator (Fur) and functions known to be regulated by Fur. Background colors are used to group related KEGG pathways which overlap with those shown in (A–C). Apo-Fur devoid of iron can directly bind iron (Fe), originating Holo-Fur. Both may bind the Fur binding site (BS) present on the promoter of target genes and activate or inhibit the recruitment of RNA polymerase (Rp) to the Rp BS, thereby regulating the expression of the target gene. Arrows indicate activation and blunted lines represent inhibition.

Inferred metagenomic functional shifts triggered by iron doses and formulations. A–C, Predicted metagenomic functional shifts as measured by Linear discriminative analysis (LDA) effect size of KEGG pathways in mice that were fed diets containing: (A) 5 (light blue) and 500 (dark blue) mg of iron/kg in the form of ferrous sulfate (FS—blue) (B) Ferrous bisglycinate (FBG—green) and (C) Ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA—red). FBG and FEDTA diets had 50 mg iron/kg chow. D, Basic features of gene regulation by the iron-regulated bacterial transcription factor ferric uptake regulator (Fur) and functions known to be regulated by Fur. Background colors are used to group related KEGG pathways which overlap with those shown in (A–C). Apo-Fur devoid of iron can directly bind iron (Fe), originating Holo-Fur. Both may bind the Fur binding site (BS) present on the promoter of target genes and activate or inhibit the recruitment of RNA polymerase (Rp) to the Rp BS, thereby regulating the expression of the target gene. Arrows indicate activation and blunted lines represent inhibition.

Regarding the effect of iron formulations, analysis of the metagenomes using PICRUSt showed that 5 metabolic pathways were modulated by FBG and 12 by FEDTA when compared with FS. Both compounds led to an increase in genes associated with cellular processes and signaling and a decrease in genes implicated in cell motility ( Fig. 3B, C). There was also an increase in genes that are associated with general functions or poorly characterized genes ( Fig. 3B, C). Overall, the affected metabolic pathways were similar for FBG and FEDTA diets and may therefore represent an effect of the FS diet itself.

Taken together, these data suggest that bacterial community shifts induced by luminal iron concentration reflect both abundance changes and functional changes because, in addition to significant changes in the abundance of particular bacterial taxa, we also found significant modulation of several KEGG pathways. However, distinct iron formulations seem to impact similar inferred metabolic pathways.

Dietary Iron Compounds Differently Impact the Severity of DSS-induced Colitis

Because IBD has been associated with gut dysbiosis, and oral iron supplementation may further affect disease activity, we next investigated the effects of iron supplementation on chemically induced colitis using the 3 different iron compounds, i.e., FS, FBG, and FEDTA. To this end, colitis was induced by adding DSS to the drinking water of mice that were fed the iron-sufficient diet with 50 mg iron/kg chow as ferrous sulfate (FS50), or the iron-supplemented diet with 500 mg iron/kg chow as ferrous sulfate (FS500), ferrous bisglycinate (FBG500), or ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA500). As shown in Figure 4A, mice that were fed the diet supplemented with FBG500 had the best survival rates (100%), whereas survival in mice that were fed FEDTA500 was substantially lower (64%). Intermediate survival rates were registered in mice that were fed the FS-supplemented diet (FS50—71% and FS500—88%). Accordingly, body weight ( Fig. 4B) was also substantially lower in mice receiving FEDTA500 (19% body loss) and FS50 (20% body loss), with FBG500 causing the least body lost (9% body loss), followed by FS500 (13% body loss). In addition, mucosal cell infiltration assessed in colonic samples, indicating heightened inflammation, was significantly higher in FEDTA500 and FS50 fed mice compared with FS500 or FBG500 ( Fig. 4C). Finally, mice that were fed the FEDTA500 supplemented diet developed splenomegaly, which was not observed in the other mouse groups ( Fig. 4D). These data indicate that, overall, FEDTA500 had the most negative impact on colitis, whereas FBG500 seems to exert a protective effect. The interpretation that FEDTA aggravated the colitis is further substantiated by the finding that mice in the FEDTA500 group that did not survive acute colitis had significantly shortened colon length compared with the surviving mice, indicating that mice died from the DSS-induced colitis as opposed to potential toxic effects ( Fig. 4E).

Dietary iron doses and formulations affect the severity of DSS-induced colitis. A, Survival. B, Body weight. C, Inflammation score. D, Spleen weight in mice that were fed diets containing 50 mg of iron/kg as ferrous sulfate (FS—light blue), 500 mg of iron/kg FS (dark blue), ferrous bisglycinate (FBG—green), and ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA—red). Filled symbols in (D) represent surviving mice and empty symbols represent nonsurviving mice. E, Colon size of surviving (filled symbols) and nonsurviving (empty symbols) mice that were fed the diet supplemented with 500 mg of FEDTA/kg chow. In (D) and (E), each data point indicates a single mouse, norte = 12 to 24 mice per group, and the horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F–G, Rescue of mice that were fed 500 mg of the FEDTA/kg chow diet by streptomycin (Strp) treatment. F, Survival. G, Body weight. Analysis of variance: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG < 0.001 †PAG < 0.05 ††PAG < 0.01 (compared with 50 and 500 mg of iron/kg chow in the form of FS). ¥¥PAG < 0.01 ¥¥¥PAG < 0.001 (compared with FEDTA and FEDTA-Strp).

Dietary iron doses and formulations affect the severity of DSS-induced colitis. A, Survival. B, Body weight. C, Inflammation score. D, Spleen weight in mice that were fed diets containing 50 mg of iron/kg as ferrous sulfate (FS—light blue), 500 mg of iron/kg FS (dark blue), ferrous bisglycinate (FBG—green), and ferric ethylenediaminetetraacetic acid (FEDTA—red). Filled symbols in (D) represent surviving mice and empty symbols represent nonsurviving mice. E, Colon size of surviving (filled symbols) and nonsurviving (empty symbols) mice that were fed the diet supplemented with 500 mg of FEDTA/kg chow. In (D) and (E), each data point indicates a single mouse, norte = 12 to 24 mice per group, and the horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F–G, Rescue of mice that were fed 500 mg of the FEDTA/kg chow diet by streptomycin (Strp) treatment. F, Survival. G, Body weight. Analysis of variance: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG < 0.001 †PAG < 0.05 ††PAG < 0.01 (compared with 50 and 500 mg of iron/kg chow in the form of FS). ¥¥PAG < 0.01 ¥¥¥PAG < 0.001 (compared with FEDTA and FEDTA-Strp).

To further establish a link between the worsening of colitis and gut microbiota in mice receiving the FEDTA-supplemented diet, we cotreated mice with streptomycin, a broad-spectrum antibiotic that targets both gram-positive and gram-negative bacteria. This antibiotic, but not vancomycin, neomycin, or penicillin, has been shown by others to reduce colitis in mice treated with DSS, 37 presumably by killing specific bacterial species that contribute to DSS-induced colitis. Therefore, we treated mice that received the FEDTA-supplemented diet with the antibiotic streptomycin during the DSS treatment. As shown in Figure 4F, streptomycin treatment was able to rescue the mice by increasing survival rates to 100%, compared with a 64% survival rate in mice that did not receive antibiotic treatment. Likewise, body weight losses were significantly attenuated in mice receiving streptomycin with both FS- and FEDTA-supplemented diets ( Fig. 4G). These results reinforce the notion that FEDTA affects the outcomes of colitis through microbiota changes as opposed to unspecific toxic effects, in which case mice would have not been rescued by the antibiotic treatment.

Altogether, results from Figure 4 indicate that FEDTA presence in the diet may negatively affect the severity of DSS-induced colitis in mice, most likely through modulation of the microbiota. In contrast, FBG500 and FS500 had a protective effect compared with FS50, suggesting that iron supplementation may actually have a protective role in colitis.

The Probiotic E. coli Nissle 1917 Requires Iron to Protect Mice from Colitis

The probiotic bacteria EcN has been shown to outcompete pathogenic bacteria such as Salmonela by limiting iron availability and thus limiting their growth. 47 Hence, we next examined the potential use of EcN in combination with iron supplementation in decreasing intestinal inflammation.

To this end, mice were kept on the iron-sufficient diet (FS50) or iron-supplemented diet (FS500) and received 10 9 CFUs of EcN or saline twice, before and at the beginning of the DSS treatment. As shown in Figure 5A, survival rates were lowest when mice were fed the iron-sufficient diet (FS50—80%) compared with mice that were fed any of the other diets with or without EcN treatment (100% survival rate). Overall, mice receiving a combination of iron-supplemented diet (FS500) and EcN were the most protected from colitis, as judged by changes in body weight ( Fig. 5B), colon size ( Fig. 5C), inflammation score ( Fig. 5D), and mRNA levels of the inflammatory marker Lcn2 ( Fig. 5E). Again, iron supplementation did not result in aggravation of colitis, recapitulating the results from the previous experiments. The most surprising result was the absence of any protective effect in mice receiving EcN when mice were fed the iron-sufficient as opposed to the iron-supplemented diet. To investigate if this was related to the ability of EcN to grow in an iron sufficient versus iron rich environment, we quantified EcN DNA levels in fecal samples. As shown in Figure 5F, this was not the case, as the quantity of amplified EcN DNA was similar in feces samples collected from both mice that were fed the FS50 and FS500 diets.

The beneficial effect of the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) in DSS-induced colitis depends on the levels of luminal iron. All mice received DSS in drinking water while fed diets supplemented with 50 mg (light blue) and 500 mg (dark blue) of FS/kg chow-supplemented diet and were gavaged with PBS (controls—light and dark blue) and EcN (light and dark green). A, Survival. B, Body weight. C, Colon size. D, Inflammation score. E, Colon lipocalin 2 (Lcn2) mRNA levels. The horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F, Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) DNA levels. Analysis of variance: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001. ¥PAG < 0.05 (500 mg iron/kg chow + EcN compared with 50 mg of iron/kg chow + PBS). norte. s., not significant. In (C) and (E), each data point indicates a single mouse, norte = 8 to 10 mice per group.

The beneficial effect of the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) in DSS-induced colitis depends on the levels of luminal iron. All mice received DSS in drinking water while fed diets supplemented with 50 mg (light blue) and 500 mg (dark blue) of FS/kg chow-supplemented diet and were gavaged with PBS (controls—light and dark blue) and EcN (light and dark green). A, Survival. B, Body weight. C, Colon size. D, Inflammation score. E, Colon lipocalin 2 (Lcn2) mRNA levels. The horizontal dashed line indicates values measured in control, DSS-untreated mice. F, Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) DNA levels. Analysis of variance: *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001. ¥PAG < 0.05 (500 mg iron/kg chow + EcN compared with 50 mg of iron/kg chow + PBS). norte. s., not significant. In (C) and (E), each data point indicates a single mouse, norte = 8 to 10 mice per group.

These data suggest that the protective effect of EcN in colitis depends on the levels of luminal iron, as EcN provided to mice that were fed the FS50 diet seemed to have no significant effect on protecting mice from DSS-induced colitis, contrasting with the clearly protective effect achieved using the FS500 dieta.


Información del autor

Tzu-Wei Yang, Wei-Hsiang Lee and Chien-Ning Huang contributed equally.

Afiliaciones

Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Internal Medicine, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Tzu-Wei Yang, Ming-Chang Tsai, Chi-Chih Wang, Hsuan-Yi Chen & Chun-Che Lin

School of Medicine, Chung Shan Medical University, Taichung, 402, Taiwan

Tzu-Wei Yang, Ming-Chang Tsai, Chi-Chih Wang, Hsuan-Yi Chen, Chi-Chou Huang, Kwo-Chang Ueng, Chien-Ning Huang & Chun-Che Lin

Institute and Department of Biological Science and Technology, College of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, Hsinchu, 300, Taiwan

Tzu-Wei Yang, Wei-Hsiang Lee, Wei-Chih Huang, Ting-Hsuan Sun, Tzu-Ling Yang, Hsin-Tzu Huang, Chih-Hung Chou, Shinn-Ying Ho, Wen-Liang Chen, Hsien-Da Huang & Yuh-Jyh Jong

Institute of Bioinformatics and Systems Biology, College of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, Hsinchu, 300, Taiwan

Wei-Hsiang Lee, Siang-Jyun Tu, Wei-Chih Huang, Hui-Mei Chen, Yu-Pao Chou, Chih-Hung Chou, Ya-Rong Huang, Yi-Run Sun, Chao Liang, Feng-Mao Lin, Shinn-Ying Ho & Hsien-Da Huang

Department of Medical Research, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Wei-Hsiang Lee, Wei-Chih Huang, Shun-Fa Yang & Kwo-Chang Ueng

Institute of Medicine, Chung Shan Medical University, Taichung, 402, Taiwan

Ming-Chang Tsai, Chi-Chih Wang, Bei-Hao Shiu & Shun-Fa Yang

Division of Colon and Rectum, Department of Surgery, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Chi-Chou Huang & Bei-Hao Shiu

Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Internal Medicine, Chung Shan Medical University Hospital, Taichung, 402, Taiwan

Graduate Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, 807, Taiwan

Departments of Pediatrics and Laboratory Medicine, Kaohsiung Medical University Hospital, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, 807, Taiwan

Institute of Molecular Medicine and Bioengineering, College of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, Hsinchu, 300, Taiwan

Warshel Institute For Computational Biology, The Chinese University of Hong Kong, Shenzhen, 518172, Longgang District, Shenzhen, China

School of Life and Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Shenzhen, 518172, Longgang District, Shenzhen, China

School of Sciences and Engineering, The Chinese University of Hong Kong, Shenzhen, 518172, Longgang District, Shenzhen, China