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¿El inhibidor de enzimas conduce a una mayor tasa de rotación?


Actualmente estoy trabajando en un proyecto en el que tengo que lidiar con la inhibición enzimática. La enzima purificada muestra un buen recambio de sustrato. Sin embargo, cuando trato de inhibirlo con diferentes inhibidores descritos en la literatura, obtengo resultados bastante incómodos.

Ahora he probado 3 compuestos inhibidores diferentes. ¿Uno mostró buenos resultados (redujo la renovación del sustrato), mientras que los otros dos compuestos en cambio condujeron a una mayor renovación del sustrato?

Sé que suena ridículo, pero ¿alguien ha experimentado algo así antes? Las medidas de los compuestos "de trabajo" y "no de trabajo" se realizan en la misma placa. ¿Cómo puede ser que los inhibidores ampliamente descritos conduzcan a tales resultados?


Si bien es difícil saber qué está fallando en el laboratorio de otra persona, los efectos aparentemente paradójicos como estos son desafortunadamente comunes en el trabajo de laboratorio. Suponiendo que estos son inhibidores bien establecidos que realmente deberían estar funcionando, consideremos por qué podrían no estar en sus manos.

Los mecanismos de interacción molecular son lo suficientemente complejos como para que haya muchos casos en los que una sustancia que actúa como activador en una afección puede actuar como inhibidor en otra afección. Otra forma en que podría ver tal efecto es si su sistema purificado no es realmente tan bueno como cree y el problema está siendo parcialmente aliviado por uno de los inhibidores, por ejemplo, imperfectamente purificado y la adición del inhibidor neutraliza algunas de las imperfecciones.

Sin conocer los detalles de los compuestos con los que está trabajando, no es posible adivinar cuál de las posibilidades podría estar funcionando. Sin embargo, le sugiero que comience por:

  1. Comparar su tasa de rotación cuantitativa con la enzima purificada con la tasa predicha de la literatura para ver si su sistema de línea de base realmente está funcionando correctamente.
  2. Asegúrese de que su sistema también (no) procese el sustrato a la velocidad baja adecuada cuando la enzima esté ausente.
  3. Verificar las posibles diferencias entre su método y el método que está tratando de adaptar de la literatura, lo que podría dar pistas sobre las diferencias de condición que pueden estar afectando sus resultados.

¿Cómo estudiamos la inhibición competitiva? Normalmente se hace de la siguiente manera. Primero se realiza un conjunto de reacciones V vs. [S] sin inhibidor (20 o más tubos, con tampón y cantidades constantes de enzima, cantidades variables de sustrato, tiempos de reacción iguales). Se traza V frente a [S], así como 1 / V frente a 1 / [S], si se desea. A continuación, se realiza un segundo conjunto de reacciones de la misma manera que antes, excepto que se agrega una cantidad fija del inhibidor de metotrexato a cada tubo. A bajas concentraciones de sustrato, el inhibidor compite por la enzima de manera efectiva, pero a altas concentraciones de sustrato, el inhibidor tendrá un efecto mucho menor, ya que el sustrato lo supera, debido a su mayor concentración (recuerde que el inhibidor está en una concentración fija ). Gráficamente, los resultados de estos experimentos se muestran arriba. Tenga en cuenta que a concentraciones elevadas de sustrato, el inhibidor competitivo esencialmente no tiene ningún efecto, lo que hace que la Vmax de la enzima permanezca sin cambios. Para reiterar, esto se debe al hecho de que a altas concentraciones de sustrato, el inhibidor no compite bien. Sin embargo, a concentraciones de sustrato más bajas lo hace.

Tenga en cuenta que la KM aparente de la enzima para el sustrato aumenta (-1 / KM se acerca a cero - la línea roja anterior) cuando el inhibidor está presente, lo que ilustra la mejor competencia del inhibidor a concentraciones de sustrato más bajas. Puede que no sea obvio por qué llamamos al KM modificado el KM aparente de la enzima. La razón es que el inhibidor no cambia realmente la afinidad de la enzima por el sustrato de folato. Solo parece hacerlo. Esto se debe a la forma en que funciona la inhibición competitiva. Cuando el inhibidor competitivo se une a la enzima, queda efectivamente fuera de acción. Las enzimas inactivas NO tienen afinidad por el sustrato ni tampoco actividad. Podemos medir KM para una enzima inactiva.

Las moléculas de enzima que no están unidas por metotrexato pueden, de hecho, unir folato y son activas. El metotrexato no tiene ningún efecto sobre ellos y sus valores de KM no se modifican. Entonces, ¿por qué la KM parece más alta en presencia de un inhibidor competitivo? La razón es que el inhibidor competitivo reduce la cantidad de enzima activa a concentraciones más bajas de sustrato. Cuando se reduce la cantidad de enzima, se debe tener más sustrato para suministrar la cantidad reducida de enzima lo suficiente como para llegar a Vmax / 2.

Cabe señalar que en la inhibición competitiva, el porcentaje de
enzima inactiva cambia drásticamente en el rango de valores de [S]
usó. Para empezar, con valores bajos de [S], el mayor porcentaje de
se inhibe la enzima. En un [S] alto, no hay un porcentaje significativo de
se inhibe la enzima. Este no es siempre el caso, como veremos.
en inhibición no competitiva.


Reacciones enzimáticas: discusión y resultados

Tabla 1. Concentraciones de solución, volúmenes y observaciones para el Experimento 1: Observación de la reacción enzimática.

Tubo de ensayodH2Extracto de papaCatecolObservaciones
15 ml + 500μl—–500 μlLa solución se volvió de un color blanco lechoso a transparente. (Alto sustrato)
25 ml500 μl500 μlLa solución se volvió marrón amarillenta. (Alto sustrato)
35 ml + 500μl500 μl—–La solución es transparente, pero de color blanco turbio en la parte inferior. (Sustrato cero)

* La reacción química se observó con la introducción de catecol al extracto de papa (tubo 2).

Tabla 2. Concentraciones de solución, volúmenes y observaciones para el Experimento 2: El efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.

Tubo de ensayodH2Extracto de papaCatecolObservaciones
15 ml + 500μl500 μl500 μlLa solución se volvió clara, de color marrón amarillento. (Alto sustrato)
25 ml + 900μl500 μl100 μlSolución convertida en melocotón translúcido. (Bajo sustrato, diluido)

* El tiempo de reacción para el tubo 1 fue el más rápido debido a la alta concentración de sustrato y menor dH20 concentración.

Tabla 3. Concentraciones de solución, volúmenes y observaciones para el Experimento 3: El efecto de la concentración de enzima sobre la actividad de la enzima.

Tubo de ensayodH2Extracto de papaCatecolObservaciones
15 ml + 500μl500 μl500 μlLa solución cambió de verde azulado a marrón amarillento claro. (Alto sustrato)
25 ml + 900μl100 μl500 μlLigeramente más turbio que la solución transparente original, sin cambios reales de color. (Alto sustrato, diluido, bajo contenido de enzimas)

* Las concentraciones más bajas de Dh20 y las más altas de extracto de papa permitieron un tiempo de reacción más rápido

Cuadro 4. Concentraciones de solución, pH del tampón, volúmenes y observaciones para el Experimento 4: El efecto del pH sobre la actividad enzimática.

Tampón de pHVolumen de búferdH2Extracto de papaCatecolObservaciones
42ml3ml500 μl500 μlBlanco nublado
62ml3ml500 μl500 μlAmarillo oscuro
82ml3ml500 μl500 μLMarrón anaranjado
102ml3ml100 μl500 μlMelocotón translúcido

* La velocidad de reacción aumentó a medida que aumentaba el pH, siendo un pH de 6 el mejor tampón para la actividad de la catecol oxidasa. El aumento del pH por encima de 6 mostró una disminución en la velocidad de reacción.

Cuadro 5. Concentraciones, temperaturas, volúmenes y observaciones de la solución para el Experimento 5: El efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

Tubo de ensayodH2Extracto de papaCatecolObservaciones
1 (0 ° C)5ml500 μl500 μlMarrón amarillento muy claro
2 (15 ° C)5ml500 μl500 μlMelocotón amarillento
3 (37 ° C)5ml500 μl500 μlMelocotón naranja
4 (100 ° C)5ml500 μl500 μlDurazno muy ligero

* La velocidad de reacción más rápida se observó a 37 ° C. Cuanto más fría sea la temperatura (0 ° C - 15 ° C), más lenta será la velocidad de reacción. Se observó desnaturalización de la enzima a 100 ° C.

Cuadro 6. Concentraciones, volúmenes y observaciones de la solución para el Experimento 6: Efectos inhibidores: inhibición de la acción de la catecol oxidasa

Tubo de ensayodH2Extracto de papaPTUCatecolObservaciones
15ml + 1ml500 μl—–500 μlMelocotón amarillento (Control)
25ml + 500μL500 μl500 μl500 μlDurazno muy ligero
35ml500 μl500 μl500 μLNublado, blanco claro

* La reacción más rápida y pronunciada se observó en el tubo 1 (la solución sin feniltiourea)

Discusión del laboratorio de enzimas

Para el primer experimento, Observación de la reacción enzimática, se planteó la hipótesis de que la reacción enzimática solo ocurriría en el segundo tubo de ensayo debido al hecho de que era el único tubo que contenía tanto la enzima como el sustrato. Como se esperaba, la solución en el tubo 2 fue la única solución que mostró el pigmento amarillo-marrón característico de la producción de benzoquinona, que fue causado por el extracto de papa que convirtió su catecol en el nuevo producto.

En el experimento 2, El efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática, la hipótesis era que el tubo con la concentración de sustrato más alta mostraría una reacción química más rápida y pronunciada que el tubo con menos catecol.

La hipótesis fue apoyada por el hecho de que la mayor concentración de catecol en el tubo 1 permitió un resultado similar al del tubo 2 del experimento 1, la única diferencia es que los 5 ml adicionales de dH20 diluyó algo del color marrón amarillento observado en la primera reacción.

Si bien se observó una reacción química en el tubo 2 (experimento 2), fue mucho más lenta (con un pigmento de melocotón translúcido) debido a una menor concentración de catecol y una mayor dH20 concentración. Cuanto mayor sea la concentración de catecol, más benzoquinona se puede producir.

En el experimento 3, El efecto de la concentración enzimática sobre la actividad enzimática, se planteó la hipótesis de que cuanto mayor sea la concentración de enzima en la solución, más rápida y pronunciada será la reacción química.

Esta hipótesis pudo ser aceptada con base en la velocidad a la que reaccionó el tubo con mayor concentración de extracto de papa. El tubo 1 tenía 400 μL más de extracto de patata y 400 μL menos de dH20 que el tubo 2. Debido a que las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran el tiempo de reacción química, la solución en el tubo 1 cambió rápidamente de un pigmento verde azulado al color marrón amarillento asociado con la benzoquinona.

La menor concentración de extracto de papa y una mayor concentración de dH20 en el tubo 2 no mostraron cambios de color, aparte de la turbidez del propio extracto de papa.

En el experimento 4, El efecto del pH sobre la actividad enzimática, la hipótesis inicial era que cuanto más bajo era el nivel de pH del tampón añadido a la solución, más rápida sería la velocidad de reacción. Esta hipótesis no fue apoyada por los datos observados porque los niveles de acidez más altos en realidad desaceleraron la producción de benzoquinona, que fue lo opuesto a lo que se predijo.

La solución con un tampón de pH 4 permaneció blanca turbia, mientras que la solución con un tampón de pH 6 se volvió marrón amarillento. A medida que aumentaba el pH, aumentaba la tasa de producción de benzoquinona. Mientras que los tampones de pH más bajos demostraron ser demasiado ácidos, los tampones más neutros permitieron el mejor entorno para la actividad de la catecol oxidasa.

Los niveles de pH del tampón superiores a 6 también mostraron una reacción química más lenta y menos pronunciada, lo que ilustra la necesidad de neutralidad de la reacción enzimática.

La hipótesis del experimento 5, El efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática, era que una temperatura extremadamente baja ralentizaría la tasa de producción de benzoquinona, mientras que las temperaturas extremadamente altas provocarían la desnaturalización de las enzimas. Esta hipótesis fue apoyada por la velocidad a la que las soluciones a 0 ° C - 15 ° C reaccionaron lentamente y la velocidad a la que la solución a 37 ° C produjo rápidamente benzoquinona.

Después de cinco minutos a la temperatura designada para cada solución, las soluciones más frías apenas comenzaron a cambiar de color, mientras que las temperaturas más cálidas reaccionaron rápidamente, tanto que a 100 ° C, las enzimas se desnaturalizaron y la solución comenzó a palidecer en pigmento. Las temperaturas más frías ralentizaron el movimiento de las moléculas en las soluciones, mientras que las temperaturas más cálidas (sin incluir los 100 ° C) permitieron un mejor entorno para la actividad de la catecol oxidasa.

Para el experimento 6, Efectos inhibidores: inhibición de la acción de la catecol oxidasa, se planteó la hipótesis de que la adición de feniltiourea (PTU) evitaría que ocurriera la reacción enzimática. La hipótesis pudo aceptarse debido a que los tubos que contenían la PTU mostraban muy pocos cambios de pigmento.

El tubo 1 sirvió como control, que mostró la producción de benzoquinona (color marrón amarillento) y permitió la comparación entre las tres soluciones. Considerando que PTU es un inhibidor no competitivo, los tubos 2 y 3 contenían soluciones que impedían que la enzima catalizara la reacción, independientemente de si el sustrato estaba unido al sitio activo o no.

El único problema real con cualquiera de los 6 experimentos fue la hipótesis no respaldada del efecto del pH en el experimento de actividad enzimática. Debo haber vinculado la naturaleza conservante de la benzoquinona con la forma en que el jugo de limón ácido evita que las manzanas se pongan marrones, así que asumí que un pH bajo aumentaría la velocidad de reacción. En realidad, la acidez ralentiza la velocidad de reacción, que es por qué las manzanas no cambian de color.

En conclusión, estos experimentos han demostrado que la producción de benzoquinona solo puede ocurrir con la presencia tanto de una enzima como de un sustrato. Factores como la concentración de sustrato y enzima, el pH, la temperatura y la presencia de inhibidores no competitivos pueden afectar la reacción enzimática. Una alta concentración de sustrato permitirá una mayor producción de benzoquinona, mientras que una alta concentración de enzima acelerará la velocidad de reacción, y viceversa.

Para que la reacción enzimática se produzca rápidamente, debe realizarse en un entorno en el que el pH sea lo más cercano posible al neutro, con la velocidad de reacción disminuyendo tanto en soluciones muy ácidas como básicas. Lo mismo ocurre con la temperatura: las temperaturas extremadamente altas o extremadamente frías pueden disminuir las velocidades de reacción de las enzimas o hacer que las enzimas se desnaturalicen por completo.

La introducción de un inhibidor no competitivo (como la feniltiourea) le permite unirse al sitio alostérico de la enzima, lo que evita que se produzca la reacción (independientemente de la concentración de enzima o sustrato).


Resultados

Compilar funciones para el aprendizaje automático

Para construir modelos predictivos de ML de tasas de rotación catalítica de enzimas, compilamos un conjunto diverso de características que incluyen propiedades de red, propiedades estructurales de enzimas, información de mecanismos bioquímicos y condiciones de ensayo (Fig.1, detalles en Métodos y Tabla complementaria 2).

Aprendizaje automático de los números de rotación catalítica para la parametrización del modelo metabólico a escala del genoma (GEM). Se selecciona y asigna un conjunto de características de diversas clases para construir de forma independiente modelos de aprendizaje automático (ML) de ambos kgato in vitroF(X)) y kaplicación, máx. en vivo (gramo(X)). Los modelos ML inferidos se utilizan para predecir kgato in vitro o kaplicación, máx. a escala del genoma para parametrizar los GEM

Las propiedades de la red se extrajeron de una GEM de E. coli K-12 MG1655, IML1515 26: El flujo promedio en diversas condiciones de crecimiento se obtuvo con un método de muestreo de Monte Carlo y FBA 27 parsimonioso (ver Métodos). En el pasado, se descubrió que la propensión de un componente enzimático a participar en reacciones múltiples —la propiedad generalista— estaba asociada con tasas de renovación catalítica más bajas 28. Por lo tanto, cuantificamos la tendencia de una enzima a catalizar múltiples reacciones a partir de las reglas de reacción gen-proteína (GPR) de IML1515. Además, el número de sustratos enzimáticos se extrajo de la matriz estequiométrica de IML1515.

Planteamos la hipótesis de que las propiedades estructurales de las enzimas contienen información sobre las constantes de renovación catalítica. Con este fin, extrajimos las propiedades estructurales de las enzimas de las estructuras de las proteínas en el Protein Data Bank 29 y los modelos de homología de la tubería de modelado I-TASSER 30,31 (ver Métodos). El trastorno estructural global y el peso molecular se utilizaron como características del modelo ML. La ocurrencia relativa de clases de estructuras secundarias está altamente correlacionada con la fracción de desorden estructural, y decidimos no incluirlas en el modelo ML para evitar características colineales. Además, esperábamos que las propiedades de la estructura del sitio catalítico fueran particularmente informativas sobre el recambio enzimático y, por lo tanto, extrajimos la información del sitio catalítico del Atlas 32 del sitio catalítico. En particular, utilizamos la profundidad del sitio activo, la exposición al solvente del sitio activo, la hidrofobicidad del sitio activo, el número de residuos que contribuyen al sitio activo y la estructura secundaria del sitio activo como características del modelo (consulte la Tabla complementaria 1 para obtener más detalles).

Se incluyó más información sobre bioquímica enzimática en forma de números de CE, eficiencia termodinámica, constantes de Michaelis (Kmetros) y concentraciones de metabolitos (ver Métodos).

Para modelos ML de in vitro kgatos incluimos el pH del ensayo y la temperatura del ensayo como características del modelo para corregir estas condiciones de ensayo.

Como no existe una correlación convincente entre las propiedades de las propiedades estructurales del sustrato enzimático y las propiedades in vitro kgato se encontró anteriormente 15, decidimos no incluir las propiedades estructurales del sustrato como características.

Compilar datos de salida para el aprendizaje automático

Tradicionalmente, los números de recambio catalítico enzimático se miden en ensayos bioquímicos in vitro, una cantidad a la que nos referimos como kgato in vitro. Extrajimos información sobre kgato in vitro para E. coli de las bases de datos BRENDA 33, SABIO-RK 34 y Metacyc 35 (Figura complementaria 1). Estos valores extraídos se filtraron para evitar enzimas no naturales, sustratos no fisiológicos y redundancia en las bases de datos (consulte Métodos para obtener más detalles). Además de las mediciones in vitro, utilizamos estimaciones in vivo del recambio enzimático efectivo, kaplicación, máx., que se obtuvieron como la tasa máxima de rotación efectiva en diversas condiciones de crecimiento 14. El conjunto de datos final tiene 215 observaciones completas, es decir, todas las características y la salida están disponibles para kgato in vitro y 133 observaciones completas para kaplicación, máx. (Figura complementaria 2) como se analiza a continuación, este conjunto se puede ampliar mediante la imputación de características seleccionadas, lo que arroja 497 y 234 observaciones completas para kgato in vitro y kaplicación, máx., respectivamente.

Entrenamiento de modelos predictivos de números de rotación de enzimas

Utilizamos el conjunto de funciones compilado para entrenar por separado modelos de AA para kgato in vitro y kaplicación, máx. (Figura 1). Se entrenó un conjunto diverso de algoritmos de regresión utilizando una validación cruzada de cinco veces repetida (ver Métodos y Tabla complementaria 2). Encontramos que la elección del algoritmo tiene solo un pequeño efecto en el rendimiento del modelo, donde la media validada de forma cruzada R 2 entre predicciones y validación tiende a ser menor en técnicas de modelado lineal (regresión lineal, PLSR, red elástica) en comparación con los modelos más complejos (bosque aleatorio y red neuronal profunda) para el kgato modelos in vitro (Fig. 2). El rendimiento predictivo de los modelos es significativamente mayor para kaplicación, máx. que para kgato in vitro, mostrando promedio validado cruzado R 2 s de 0,76 y 0,31, respectivamente (Fig. 2, consulte la Figura complementaria 3 para los errores cuadráticos medios (RMSE)). La estimación del rendimiento del modelo a través de la validación cruzada puede estar sesgada positivamente porque los hiperparámetros se optimizan en el proceso, pero el uso de un conjunto de pruebas independientes confirma nuestros hallazgos (Fig. 2). Por tanto, esperamos modelos de kaplicación, máx. para ser más adecuado para predecir las tasas de renovación catalítica a escala del genoma.

Rendimiento del modelo de aprendizaje automático para kaplicación, máx. y kgato in vitro. Las líneas centrales muestran la mediana R 2 en cinco validaciones cruzadas cinco veces repetidas (25 validaciones), excepto en el caso de aprendizaje profundo, donde se muestra la mediana de una sola ronda de validación cruzada de cinco veces (cinco validaciones). Los límites de los recuadros representan el primer y tercer cuartil, los bigotes se extienden a valores que se encuentran dentro del rango intercuartílico 1.5x y los puntos restantes se muestran como valores atípicos (marcados con una x). Espectáculo de círculos R 2 para un conjunto de prueba que consta del 20% de las muestras disponibles que no se utilizaron para la optimización de hiperparámetros. Esto resultó en un conjunto de entrenamiento de 172 observaciones de kgato in vitro y 106 observaciones de kaplicación, máx.. Para el conjunto de prueba, se utilizaron 43 y 27 observaciones para kgato in vitro y kaplicación, máx., respectivamente. Consulte Métodos para obtener detalles sobre la optimización de hiperparámetros.

Los modelos exhiben similitud en la importancia de las características

Aunque los modelos ML de kaplicación, máx. logró una mayor precisión de predicción que las de kgato in vitro, ambos modelos pueden explicar una variación significativa en las tasas de rotación catalítica de nuestro conjunto de características. ¿Qué características contribuyen más a estas predicciones? Analizamos la importancia de las características en los modelos forestales aleatorios examinando el aumento promedio en el error cuadrático medio que resulta de permutar aleatoriamente un vector de características respectivo en 500 árboles de decisión entrenados (Fig. 3).

Destacan la importancia en los modelos forestales aleatorios para los números de rotación in vivo e in vitro. Se muestra la importancia relativa medida por la disminución promedio en el error cuadrático medio (MSE) fuera de la bolsa en los árboles que resulta de la permutación aleatoria de una característica dada (escalada por la desviación estándar). Las barras que faltan indican una importancia de permutación menor o igual a cero. La significación estadística de la importancia de la característica se evaluó mediante una prueba de permutación basada en 500 permutaciones de la variable de respuesta por modelo *pag-valor & lt 0.05, **pag-valor & lt 0.005. La correlación de rango de Spearman entre las estimaciones de importancia de los dos modelos es 0.47 (pag & lt 0.021, norte = 24, S = 1214, consulte Métodos), ignorando las características relacionadas con el ensayo que no se utilizan en el modelo para kaplicación, máx.

Encontramos que la importancia de las características está significativamente correlacionada entre los modelos para kgato in vitro e in vivo kaplicación, máx. (Correlación de rango de Spearman 0.46, pag & lt 0.025, norte = 24, S = 1214, consulte Métodos). El flujo in silico es la característica más importante tanto para in vitro kgato y en vivo kaplicación, máx., lo que confirma el papel significativo hipotético de la presión de selección evolutiva sobre el número de recambio enzimático 5,15,17. Confirmamos este importante papel del flujo mediante el uso de flujos basados ​​en datos experimentales del análisis de flujo metabólico (MFA) en lugar de flujos in silico, lo que lleva a desempeños de modelos muy similares (Figura complementaria 5, ver Métodos). Asimismo, la característica generalista es un factor importante en ambos modelos. Las características estructurales son de importancia constante en ambos modelos, con la profundidad del sitio activo, la accesibilidad a los solventes del sitio activo y la exposición del sitio activo que muestran contribuciones significativas en ambos modelos. Curiosamente, la enzima Kmetro es una característica muy importante en el kgato modelo in vitro, pero no produce ninguna ventaja predictiva en el modelo para kaplicación, máx.. Este efecto puede deberse al original kaplicación, máx. la estimación está sesgada con respecto a la saturación de la enzima.

Los modelos de aprendizaje automático mejoran las predicciones del proteoma

Un obstáculo importante en la utilización de GEM de inversión en proteínas es el requisito de miles de constantes de tasa de rotación de enzimas específicas de la dirección (más de 3000 en IML1515), mientras que los conjuntos de datos in vitro e in vivo se limitan a unos pocos cientos de estas mediciones (497 y 234, respectivamente, que cubren 412 y 234 reacciones, respectivamente, Figura complementaria 2).

La alta precisión de validación cruzada de los modelos ML para kaplicación, máx. (Fig.2) sugiere que estos modelos estadísticos podrían utilizarse para predecir la kaplicación, máx. de procesos metabólicos a escala genómica para mejorar la precisión predictiva de los GEM mecanicistas. Para lograr este objetivo, creamos un modelo de conjunto para kaplicación, máx. que combina predicciones en tres modelos de ML diversos: la red elástica lineal, el modelo de bosque aleatorio basado en árboles de decisiones y el modelo de red neuronal compleja (consulte Métodos y la Tabla complementaria 2 para obtener más detalles). Se espera que la red elástica lineal muestre una baja varianza a costa de un mayor sesgo, mientras que los dos algoritmos más complejos, el bosque aleatorio y la red neuronal, son más propensos a sobreajustarse en el conjunto de datos relativamente pequeño 36. Confirmamos este comportamiento calculando las curvas de aprendizaje (Figura 4 complementaria). El entrenamiento de modelos y las predicciones a escala del genoma están limitados por el número de observaciones de características disponibles para cada reacción, lo que sugiere que la imputación de observaciones de características faltantes puede conducir a modelos ML más precisos (Figura complementaria 2). Para cada uno de los tres algoritmos de ML, entrenamos cuatro versiones: una sin imputación, una con imputación del conjunto de entrenamiento, una con imputación de solo las características en las que se basan las predicciones y una en la que se imputan todas las observaciones (consulte Métodos para obtener detalles). ). En los casos en que las observaciones contenían valores faltantes que no se imputaron, se utilizó la mediana de todas las predicciones exitosas. La diversidad de estos modelos ML se refleja en la modesta correlación de sus predicciones (promedio R 2 entre predicciones es 0,27 para kaplicación, máx. y 0.08 para kgato in vitro), lo que sugiere que un enfoque de conjunto puede mejorar la precisión del modelo ML. Por lo tanto, usamos la predicción promedio de estos doce modelos como modelo de conjunto final. Datos experimentales sobre kaplicación, máx. y kgato Luego se extrapoló in vitro a la escala del genoma utilizando el modelo de conjunto respectivo.

Los números de renovación catalítica enzimática afectan fuertemente el costo proteómico de los flujos de reacción. Por tanto, se espera que el rendimiento predictivo de los GEM para la asignación cuantitativa de proteomas sea sensible al conjunto de tasas de rotación efectivas. Usamos dos marcos de modelado GEM diferentes, el modelado metabólico con cinética enzimática (MOMENT) 5 y un GEM de metabolismo y expresión génica (modelo ME) 8,9, para predecir datos cuantitativos de proteómica 37 y comparar el rendimiento predictivo en diferentes parametrizaciones a escala genómica. estrategias: conocidas in vitro kgato con valores perdidos simplemente reemplazados por la mediana de valores conocidos (mediana imputada), in vitro kgato extrapolado con el modelo de conjunto ML, mediana imputada kaplicación, máx., y kaplicación, máx. extrapolado con el kaplicación, máx. Modelo de conjunto ML (Fig. 4). Además, también incluimos una parametrización con un ajuste de seleccionados kef parámetros a los datos de proteómica que se realizó anteriormente para estudiar la regularidad de kefs 12. La principal diferencia entre el algoritmo MOMENT y el modelo ME radica en el hecho de que los modelos ME modelan explícitamente los detalles de la maquinaria de expresión génica y la síntesis de cofactores, lo que da como resultado una representación más realista de la estequiometría del complejo enzimático y la dilución del producto génico dependiente de la tasa de crecimiento. .

Rendimiento de vectores de números de renovación catalítica en la predicción de datos cuantitativos del proteoma. Se muestra el rendimiento para dos marcos de modelado metabólico a escala genómica diferentes, MOMENT y el modelo ME. Las predicciones del modelo se comparan con los datos cuantitativos de la proteómica en Schmidt et al. 37 a través de la raíz del error cuadrático medio (RMSE) para las fracciones del proteoma metabólico en la escala log10. Las comparaciones utilizan proteínas que se encuentran en los datos proteómicos y se expresan en las predicciones del modelo. Para permitir la comparación de diferentes estrategias de parametrización, la intersección de los conjuntos de proteínas comparables se utiliza en cada combinación de condición y modelo, lo que da como resultado el número de comparaciones. norte. El rendimiento de los dos marcos de modelado, MOMENT y ME, por lo tanto, no es comparable, ya que diferentes conjuntos de proteínas subyacen a los cálculos de error. Consulte Métodos y la Figura 8 complementaria para obtener más detalles.

Encontramos que la capacidad predictiva tanto de MOMENTO como del modelo ME es mayor para kaplicación, máx.conjuntos de parámetros basados ​​en kgato in vitro, donde el error de predicción es en promedio un 43% menor en MOMENTO y también un 43% menor en el modelo ME. El modelo ensemble ML mejora aún más el rendimiento predictivo de kaplicación, máx.basados ​​en GEM consistentemente en todas las condiciones de crecimiento y técnicas de modelado mecanicista, con una reducción promedio en la raíz del error cuadrático medio (RMSE) de 34% y 20% para MOMENT y el modelo ME, respectivamente (Fig. 4). Como se esperaba de los altos errores de validación cruzada para los modelos ML de kgato in vitro (Fig.2), la ganancia en el rendimiento que se origina en el modelo ML de conjunto para kgato in vitro es mucho menor que el de la kaplicación, máx. Modelo ML, con una reducción media de RMSE del 7% para los modelos MOMENT y del 1% para los modelos ME (Fig. 4).


¿El inhibidor de enzimas conduce a una mayor tasa de rotación? - biología

Esta página analiza el efecto de los inhibidores en las reacciones que involucran enzimas. Esta es la tercera y última página que habla de cómo funcionan las enzimas como catalizadores. Recuerde que esta serie de páginas está escrita para jóvenes de 16 a 18 años. química estudiantes. Si quieres algo más avanzado, estás buscando en el lugar equivocado.

Nota: Esta página asume que ya ha leído la página sobre cómo funcionan las proteínas como enzimas. Si ha venido directamente a esta página a través de un motor de búsqueda, debería volver atrás y leer esa página primero. De hecho, a menos que ya tenga un buen conocimiento de la estructura de las proteínas, es posible que tenga que remontarse aún más a una página sobre la estructura de las proteínas.

Inhibición competitiva y no competitiva

Inhibidores competitivos

Esta es la forma más sencilla y obvia de inhibición enzimática, y el nombre le dice exactamente lo que sucede.

El inhibidor tiene una forma similar al sustrato habitual de la enzima y compite con él por el sitio activo. Sin embargo, una vez que se adjunta al sitio activo, no le sucede nada. No reacciona, esencialmente, solo se interpone en el camino.

¿Recuerda la ecuación general para una enzima que reacciona con un sustrato?

La ecuación equivalente para un inhibidor competitivo se ve así:

El complejo no reacciona más para formar productos, pero su formación aún es reversible. Se rompe nuevamente para formar la enzima y la molécula inhibidora.

Eso significa que si aumenta la concentración del sustrato, el sustrato puede competir con el inhibidor, por lo que la reacción normal puede tener lugar a una velocidad razonable.

Un ejemplo simple de esto involucra a los iones malonato que inhiben la enzima succinato deshidrogenasa. Esta enzima cataliza la conversión de iones succinato en iones fumarato. Los nombres modernos son:

La conversión que realiza la succinato deshidrogenasa es:

La reacción es inhibida por iones malonato que tienen una forma muy similar a los iones succinato.

La forma similar permite que los iones de malonato se unan al sitio activo, pero la falta de CH2-CH2 enlace en el centro del ion detiene cualquier reacción adicional que tenga lugar.

Por lo tanto, los iones malonato bloquean el sitio activo, pero recuerde que esto es reversible. Los iones de malonato se desprenderán y liberarán la enzima nuevamente. Los iones de malonato compiten por el sitio, no lo están destruyendo.

Si los iones succinato tienen una mayor concentración que los iones malonato, por casualidad tendrán acceso al sitio con más frecuencia que los iones malonato. Eso significa que puede superar el efecto de un inhibidor competitivo aumentando la concentración del sustrato.

Nota: ¡Algunos bioquímicos son muy descuidados con el uso de nombres químicos! Si lee acerca de esta reacción en otros lugares, puede encontrar la reacción citada como conversión de ácido succínico en ácido fumárico. Algunas fuentes incluso parecen dar a entender que las palabras & quotsuccinato & quot y & quotsuccinic acid & quot significan lo mismo. ¡Eso es inaceptable desde el punto de vista químico!

Por lo que he podido descubrir, la versión correcta es la conversión de iones succinato a iones fumarato (como se indica arriba). A un pH celular típico de alrededor de 7, estas sustancias estarán presentes principalmente como sus iones, no como ácidos no ionizados. Y los artículos científicos de personas que trabajan en los mecanismos de esta conversión hablan sobre los iones, no sobre los ácidos.

Inhibidores no competitivos

Un inhibidor no competitivo no se adhiere al sitio activo, sino que se adhiere a otra parte de la enzima. Al adherirse a otro lugar, afecta la estructura de la enzima y, por lo tanto, la forma en que funciona la enzima. Because there isn't any competition involved between the inhibitor and the substrate, increasing the substrate concentration won't help.

If you look at various biochemistry sites on the web, you will find two explanations for this. We'll look at the simple, fairly obvious one in some detail in a minute. I want to have a brief word about the other one first.

"Pure" non-competitive inhibitors

This explanation says that the inhibitor doesn't affect the ability of the substrate to bond with the active site, but stops it reacting once it is there.

I found a couple of biochemistry sites which said that inhibitors working like this (which they describe as puro non-competitive inhibitors) are virtually unknown. As a non-biochemist, I don't know what the truth is about this - if you want to find out, you will probably have to do a biochemistry degree!

Other non-competitive inhibitors

The straightforward explanation (which would seem to apply to most enzymes) is that reaction with the inhibitor causes the shape of the active site to change. Remember that non-competitive inhibitors aren't attaching directly to the active site, but elsewhere on the enzyme.

The inhibitor attachs to a side group in the protein chain, and affects the way the protein folds into its tertiary structure. That in turn changes the shape of the active site. If the shape of the active site changes, then the substrate can't attach to it any more.

Some non-competitive inhibitors attach irreversibly to the enzyme, and therefore stop it working permanently. Others attach reversibly.

A relatively uncomplicated example of non-competitive inhibitors in a reasonably familiar situation is:

Heavy metal poisoning

You are probably aware that compounds containing heavy metals such as lead, mercury, copper or silver are poisonous. This is because ions of these metals are non-competitive inhibitors for several enzymes.

I'm going to take silver as a simple example.

Silver ions react with -SH groups in the side groups of cysteine residues in the protein chain:

There isn't enough electronegativity difference between silver and sulphur for a full ionic bond and so the bond can be considered as covalent.

If the cysteine residue is somewhere on the protein chain which affects the way it folds into its tertiary structure, then altering this group could have an effect on the shape of the active site, and so stop the enzyme from working.

The 2+ ions from, for example, mercury, copper or lead can behave similarly - also attaching themselves to the sulphur in place of the hydrogen.

Nota: I have come across a couple of references to the ability of heavy metal ions to break sulphur-sulphur bridges, which would have a major effect on the folding of the protein chain.

A student suggested this page, which has a note about mercury poisoning (see item 4 on the page). This suggests that mercury breaks sulphur-sulphur bridges by attaching to both of the sulphur atoms, distorting the bridge, and so the folding of the protein chains. I have no reason to suppose that this description is wrong, but I am a bit wary of relying on a single source.

The reason for choosing silver as my example rather than the more obvious mercury or lead is that it forms a 1+ ion. For 2+ ions, you would have to worry about what got attached to the metal as well as the sulphur - or whether it retained a single positive charge. All the biochemistry sources I've been able to find skip over this problem - as a chemistry teacher looking for chemical accuracy, I'm not prepared to do that!

Preguntas para poner a prueba su comprensión

Si esta es la primera serie de preguntas que ha hecho, lea la página de introducción antes de comenzar. Deberá usar el BOTÓN ATRÁS en su navegador para volver aquí después.


The choice of a competitive or non-competitive inhibitor as a drug

If the requirement is to increase the intracellular concentration of the substrate, then either a competitive or non-competitive inhibitor will serve, since both will inhibit the utilisation of substrate, so that it accumulates.

However, if the requirement is to decrease the intracellular concentration of the product, then the inhibitor must be non-competitive. As unused substrate accumulates, so it will compete with a competitive inhibitor, and the final result will be a more or less normal rate of formation of product, but with a larger pool of substrate. Increasing the concentration of substrate does not affect a non-competitive inhibitor.


Abstracto

The rate of product formation is an important measure of the speed of enzyme reactions. Classical studies of enzyme reactions have been conducted in dilute solutions and under conditions that justified the substrate abundance assumption. However, such assumption is well-known to break down in the context of cellular biochemistry. Instead, the concentration of available substrate can become rate limiting. Here we use the chemical master equation to obtain expressions for the instantaneous and time averaged rate of product formation without invoking the conventional substrate abundance assumption. The expressions are derived for a broad range of enzyme reaction mechanisms, including those that involve one or many enzyme molecules, require multiple substrates, and exhibit cooperativity and substrate inhibition. Novel results include: (i) the relationship between the average rate of product formation (calculated over the time it takes for the reaction to finish) and the substrate concentration, for a Michaelis–Menten (MM) reaction with one enzyme molecule, is approximately given by a logarithmically corrected MM form (ii) intrinsic noise decreases the sharpness of cooperative switches but enhances the filtering response of substrate inhibition (iii) the relationship between the initial average rate of product formation and the initial substrate concentration for a MM reaction with no reversible reaction and with any number of enzyme and substrate molecules is a sum of Michaelis–Menten equations.


The Significance of (K_M) and (V_)

The Michaelis-Menten model is used in a variety of biochemical situations other than enzyme-substrate interaction, including antigen-antibody binding, DNA-DNA hybridization, and protein-protein interaction. It can be used to characterize a generic biochemical reaction, in the same way that the Langmuir equation can be used to model generic adsorption of biomolecular species. When an empirical equation of this form is applied to microbial growth. The experimentally determined parameters values vary wildly between enzymes (Table (PageIndex<1>)):

Table (PageIndex<1>) : Enzyme Kinetic parameters
Enzima (K_m) (M) (k_) (1/s) (k_/K_m) (1/M.s)
Quimotripsina 1.5 × 10 &minus2 0.14 9.3
Pepsina 3.0 × 10 &minus4 0.50 1.7 × 10 3
Tyrosyl-tRNA synthetase 9.0 × 10 &minus4 7.6 8.4 × 10 3
Ribonuclease 7.9 × 10 &minus3 7.9 × 10 2 1.0 × 10 5
Carbonic anhydrase 2.6 × 10 &minus2 4.0 × 10 5 1.5 × 10 7
Fumarase 5.0 × 10 &minus6 8.0 × 10 2 1.6 × 10 8

While (K_m) is equal to the substrate concentration at which the enzyme converts substrates into products at half its maximal rate and hence is related to the affinity of the substrate for the enzyme. The catalytic rate (k_) is the rate of product formation when the enzyme is saturated with substrate and therefore reflects the enzyme's maximum rate. The rate of product formation is dependent on both how well the enzyme binds substrate and how fast the enzyme converts substrate into product once substrate is bound. For a kinetically perfect enzyme, every encounter between enzyme and substrate leads to product and hence the reaction velocity is only limited by the rate the enzyme encounters substrate in solution. From Equation ( ef), the catalytic efficiency of a protein can be evaluated.

This (k_/K_m) ratio is called the specificity constant measure of how efficiently an enzyme converts a substrate into product. It has a theoretical upper limit of 10 8 &ndash 10 10 /M.s enzymes working close to this, such as fumarase, are termed superefficient (Table (PageIndex<1>)).

Determining (V_m) and (K_m) from experimental data can be difficult and the most common way is to determine initial rates, (v_0), from experimental values of ([P]) or ([S]) as a function of time. Hyperbolic graphs of (v_0) vs. ([S]) can be fit or transformed as we explored with the different mathematical transformations of the hyperbolic binding equation to determine (K_d). These included:

  • nonlinear hyperbolic fit (e.g., Figure (PageIndex<1>))
  • double reciprocal plot (e.g., Lineweaver&ndashBurk plot discussed below
  • Eadie-Hofstee plot

Enzyme inhibitors are substances which alter the catalytic action of the enzyme and consequently slow down, or in some cases, stop catalysis. There are three common types of enzyme inhibition - competitive, non-competitive and substrate inhibition.

Most theories concerning inhibition mechanisms are based on the existence of the enzyme-substrate complex ES. As mentioned earlier, the existence of temporary ES structures has been verified in the laboratory.

Competitive inhibition occurs when the substrate and a substance resembling the substrate are both added to the enzyme. A theory called the "lock-key theory" of enzyme catalysts can be used to explain why inhibition occurs.

The lock and key theory utilizes the concept of an "active site." The concept holds that one particular portion of the enzyme surface has a strong affinity for the substrate. The substrate is held in such a way that its conversion to the reaction products is more favorable. If we consider the enzyme as the lock and the substrate the key (Figure 9) - the key is inserted in the lock, is turned, and the door is opened and the reaction proceeds. However, when an inhibitor which resembles the substrate is present, it will compete with the substrate for the position in the enzyme lock. When the inhibitor wins, it gains the lock position but is unable to open the lock. Hence, the observed reaction is slowed down because some of the available enzyme sites are occupied by the inhibitor. If a dissimilar substance which does not fit the site is present, the enzyme rejects it, accepts the substrate, and the reaction proceeds normally.

Non-competitive inhibitors are considered to be substances which when added to the enzyme alter the enzyme in a way that it cannot accept the substrate. Figura 10.

Substrate inhibition will sometimes occur when excessive amounts of substrate are present. Figure 11 shows the reaction velocity decreasing after the maximum velocity has been reached.

Additional amounts of substrate added to the reaction mixture after this point actually decrease the reaction rate. This is thought to be due to the fact that there are so many substrate molecules competing for the active sites on the enzyme surfaces that they block the sites (Figure 12) and prevent any other substrate molecules from occupying them.

This causes the reaction rate to drop since all of the enzyme present is not being used.


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Ciencias

Vol 371, Issue 6528
29 January 2021

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By A. R. Palla , M. Ravichandran , Y. X. Wang , L. Alexandrova , A. V. Yang , P. Kraft , C. A. Holbrook , C. M. Schürch , A. T. V. Ho , H. M. Blau

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