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La interferencia del ARN y el antiguo experimento de Petunias>


Tengo problemas para entender cómo funciona la interferencia de ARN.

Por lo que entendí, en términos simples, existe este dsRNA que se fragmenta en siRNA por la enzima llamada Dicer, y esos siRNA hacen que el complejo RISC sea activo, lo que conduce a la degradación de los mRNA que son complementarios a una de las hebras del original. dsRNA.

Dicho esto (que ni siquiera sé si es correcto), ¿cómo se relaciona esto con el experimento de las petunias? Por lo que entendí, los investigadores pusieron en las petunias una enzima que codificaba el pigmento y no hebras de dsRNA que luego habrían creado la inhibición ...

¿Qué me estoy perdiendo?

PD. No tengo conocimientos técnicos sobre tecnologías, así que discúlpeme en caso de que haya dicho cosas incorrectas.

Gracias de antemano a todos.


Introdujeron un gen extraño responsable del color de la hoja de la petunia, con la intención de regular al alza la expresión génica de este color, que era el púrpura. Sin embargo, lo que se observó fue intrigante. En lugar de una regulación al alza del color púrpura, las hojas eran todas blancas. Este hallazgo mostró que el sistema de ARNi en las plantas reconoció el gen extraño y lo degradó. No solo eso, sino que el sistema RNAi también identificó el equivalente endógeno del gen extraño y lo reguló negativamente pensando también que era extraño. Así es como descubrieron este milagroso hallazgo :)


La interferencia del ARN y el antiguo experimento de Petunias> - Biología

Inicio Esta página web fue creada como una tarea para el Taller de instalaciones de técnicas de investigación en Hunter College

Mi presentación se realizó en Powerpoint. Haga clic aquí para ver mi powerpoint sobre RNAi.


La interferencia de ARN es una técnica utilizada para reprimir la expresión de genes a nivel transcripcional. El ARN interfiere con el proceso de expresión génica y no interactúa con el ADN. Se ha observado ARNi en eucariotas. El ARNi se utiliza para identificar y estudiar la función de las proteínas. La identificación de las funciones de las proteínas puede conducir a la curación de enfermedades. RNAi es un represor temporal. También se conoce como silenciamiento de genes, eliminación de genes, en plantas se conoce como silenciamiento de genes postranscripcional y en hongos se conoce como silenciamiento.

La figura 1 muestra la diferencia entre la petunia de color violeta intenso y su resultado. Estas imágenes son cortesía de la Universidad de Arizona y OMG-info.

El ARNi fue el resultado de experimentos realizados por un científico de plantas de EE. UU. Y los Países Bajos en 1990 que quería producir plantas de petunia con colores mejorados. Para mejorar los colores, agregaron copias de un gen que codifica la enzima para la pigmentación de las flores en las petunias. El resultado que se muestra en la Figura 1 fue diferente de las predicciones, en lugar de tener flores de color púrpura oscuro, produjeron flores total o parcialmente blancas. Sin embargo, estos científicos no conocían el mecanismo.

La figura 2 muestra a Craig Mello y Andrew Fire, cortesía de Nature.

En 2006, Andrew Fire y Craig Mello compartieron un Premio Nobel por su trabajo sobre la interferencia de ARN. Inyectaron ARN bicatenario en C. Elegans y notaron un efecto de silenciamiento génico eficaz.

La Figura 3 es el mecanismo de interferencia de ARN. Esta figura es cortesía de Ambion.

El mecanismo de interferencia de ARN (ARNi) que se muestra en la Figura 3 es cuando el ARN bicatenario (DsRNA) se introduce en la célula y se escinde en ARN de interferencia pequeña (SiRNA) mediante un cortador que es una enzima. El SiRNA puede formar un complejo silenciador inductor de ARN (RISC) que media el desenrollamiento del SiRNA en el que solo mantiene el antisentido. Luego se une a un ARNm diana de una manera específica de secuencia. A continuación, el ARNm diana se escinde mediante un cortador que se encuentra en RISC y la célula lo destruye para evitar que se produzca la traducción, lo que silencia la expresión del gen del que se ha transcrito el ARNm.

El científico ha estado estudiando ARNi en organismos como Drosophila, C. Elegans, ratones,

Petunias, A. thaliana, pez cebra, hongos y esperan estudiarlo en humanos. Además, RNAi tiene

ha sido ampliamente utilizado en la investigación del cáncer, inmunología, biología celular y neurociencia.

La interferencia del ARN es importante porque ayuda a defenderse de las infecciones virales y mantiene los genes saltarines bajo control. La interferencia de ARN se puede utilizar en tecnología genética. Publicaciones recientes demuestran que el silenciamiento de genes en células humanas y animales de experimentación tiene éxito. Por ejemplo, se demostró que un gen que causa niveles altos de colesterol en sangre se silencia en animales con ARN silenciador. El ARN silenciador se puede utilizar como tratamiento para infecciones virales, enfermedades cardiovasculares, cáncer, trastornos endocrinos y varias otras afecciones.

Shapiro, David J, 12 de agosto de 2003. Aplicaciones de ARNi y Vigilin en el metabolismo del ARN.


Interferencia de ARN: una visión cercana (con diagrama)

Las células usan un cortador para cortar el ARN bicatenario y formar pequeños ARN o microARN interferentes.

Un dsRNA exógeno o pre-miRNA endógeno puede ser procesado por dicer e incorporado en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que se dirige a moléculas de ARN mensajero monocatenario y desencadena la incorporación de represión traduccional en el complejo de silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS) induce actividades de mantenimiento del genoma como la metilación de histonas y la reorganización de la cromatina.

La interferencia de ARN (también denominada & # 8220 interferencia mediada por ARN & # 8221, abreviada ARNi) es un mecanismo para la regulación guiada por ARN de la expresión génica en la que el ácido ribonucleico bicatenario inhibe la expresión de genes con secuencias de nucleótidos complementarias. Conservada en la mayoría de los organismos eucariotas, se cree que la vía del ARNi ha evolucionado como una forma de inmunidad innata contra los virus y también juega un papel importante en la regulación del desarrollo y el mantenimiento del genoma.

La vía del RNAi es iniciada por la enzima dicer, que escinde el RNA bicatenario (dsRNA) en fragmentos bicatenarios cortos de 20-25 pares de bases. Una de las dos hebras de cada fragmento, conocida como hebra guía, se incorpora luego al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) y pares de bases con secuencias complementarias.

El resultado bien estudiado de este evento de reconocimiento es una forma de silenciamiento génico postranscripcional. Esto ocurre cuando la base de la cadena guía se empareja con una molécula de ARN mensajero (ARNm) e induce la degradación del ARNm por argonauta, el componente catalítico del complejo RISC.

Los fragmentos cortos de ARN se conocen como ARN interferente pequeño (ARNip), cuando se derivan de fuentes exógenas y microARN (miARN), cuando se producen a partir de genes que codifican ARN en el propio genoma de la célula. La vía del ARNi se ha estudiado particularmente bien en ciertos organismos modelo, como el gusano nematodo Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y la planta con flores Arabidopsis thaliana.

El efecto selectivo y robusto del ARNi sobre la expresión génica lo convierte en una valiosa herramienta de investigación, tanto en cultivos celulares como en organismos vivos, el ARNbc sintético introducido en las células puede inducir la supresión de genes específicos de interés. El ARNi también se puede usar para pantallas a gran escala que apagan sistemáticamente cada gen en la célula, lo que puede ayudar a identificar los componentes necesarios para un proceso celular particular o un evento como la división celular. La explotación de la vía también es una herramienta prometedora en biotecnología y medicina.

Históricamente, la interferencia de ARN se conocía con otros nombres, incluido el silenciamiento de genes postranscripcional, el silenciamiento de transgén y la extinción. Solo después de que estos procesos aparentemente no relacionados se entendieron completamente, quedó claro que todos describían el fenómeno de ARNi.

El ARNi también se ha confundido con la supresión antisentido de la expresión génica, que no actúa catalíticamente para degradar el ARNm, sino que implica fragmentos de ARN monocatenarios que se unen físicamente al ARNm y bloquean la traducción. En 2006, Andrew Fire y Craig C. Mello compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su trabajo sobre la interferencia del ARN en el gusano nematodo C. elegans, que publicaron en 1998.

Mecanismos celulares:

RNAi es un proceso de silenciamiento de genes dependiente de RNA que está mediado por el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) y es iniciado por moléculas de RNA bicatenarias cortas en el citoplasma, donde interactúan con el componente catalítico de RISC argonaute. Cuando el dsRNA es exógeno, procedente de la infección por un virus con un genoma de RNA o de manipulaciones de laboratorio, el RNA se importa directamente al citoplasma y se escinde en fragmentos cortos por el cortador de enzimas.

El dsRNA de iniciación también puede ser endógeno, como en los pre-microRNAs expresados ​​a partir de genes codificantes de RNA en el genoma. Las transcripciones primarias de tales genes se procesan primero a la estructura característica de tallo-bucle del pre-miARN en el núcleo, y luego se exportan al citoplasma para ser escindidas por el cortador. Por tanto, las dos vías para el dsRNA exógeno y endógeno convergen en el complejo RISC, que media los efectos de silenciamiento génico.

Escisión de dsRNA:

El dsRNA exógeno inicia el RNAi activando el dicer de la proteína ribonucleasa, que se une y escinde los RNA bicatenarios (dsRNA) para producir fragmentos bicatenarios de 20-25 pares de bases con unas pocas bases sobresalientes desaparecidas en cada extremo. Los estudios bioinformáticos sobre los genomas de múltiples organismos sugieren que esta longitud maximiza la especificidad del gen diana y minimiza los efectos no específicos.

Estos fragmentos cortos de doble hebra se denominan ARN de interferencia pequeños (ARNip). Estos ARNip se separan luego en cadenas simples y se integran en un complejo RISC activo. Después de la integración en el RISC, los ARNip se emparejan con su ARNm diana e inducen la escisión del ARNm, evitando así que se utilice como plantilla de traducción.

El dsRNA exógeno es detectado y unido por una proteína efectora conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila que estimula la actividad de dicer. Esta proteína solo se une a ARNds largos, pero se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud. Estas proteínas de unión a ARN facilitan la transferencia de ARNip escindidos al complejo RISC.

Esta ruta de iniciación puede ser amplificada por la célula a través de la síntesis de una población de ARNip & # 8216 secundarios & # 8217 usando los ARNip iniciadores o & # 8216 primarios & # 8217 producidos por el dicer como plantillas. Estos ARNip son estructuralmente distintos de los ARNip producidos por dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP).

MicroARN:

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes codificados genómicamente que ayudan a regular la expresión génica, particularmente durante el desarrollo. El fenómeno de la interferencia de ARN, ampliamente definido, incluye los efectos de silenciamiento génico inducidos endógenamente de los miARN, así como el silenciamiento desencadenado por dsARN extraño.

Los miRNA maduros son estructuralmente similares a los siRNA producidos a partir de dsRNA exógeno, pero los miRNA primero deben sufrir una extensa modificación postranscripcional. Un miARN se expresa a partir de un gen codificante de ARN mucho más largo como una transcripción primaria conocida como pri-miARN, que se procesa en el núcleo celular a una estructura de bucle de tallo de 70 nucleótidos llamada pre-miARN por el complejo microprocesador.

Este complejo consta de una enzima RNasa III llamada Drosha y una proteína de unión a dsRNA Pasha. La porción de dsRNA de este pre-miRNA se une y escinde por dicer para producir la molécula de miRNA madura que puede integrarse en el complejo RISC, por lo tanto, miRNA y siRNA comparten la misma maquinaria celular aguas abajo de su procesamiento inicial.

Los siRNA derivados de precursores de dsRNA largos difieren de los miRNA en que los miRNA, especialmente los de animales, normalmente tienen un apareamiento de bases incompleto con una diana e inhiben la traducción de muchos mRNA diferentes con secuencias similares. Por el contrario, los ARNip típicamente se emparejan perfectamente e inducen la escisión del ARNm solo en una única diana específica. En Drosophila y C. elegans, miRNA y siRNA son procesados ​​por distintas proteínas argonauta y enzimas dicer.

Activación y catálisis RISC:

Los componentes catalíticamente activos del complejo RISC son endonucleasas llamadas proteínas argonauta, que escinden la hebra de ARNm diana complementaria a su ARNip unido. Como los fragmentos producidos por el dicer son de doble hebra, cada uno de ellos podría, en teoría, producir un ARNip funcional.

Sin embargo, solo una de las dos hebras, que se conoce como hebra guía, se une a la proteína argonauta y dirige el silenciamiento génico. La otra hebra anti-guía o hebra pasajera se degrada durante la activación de RISC. Aunque en un principio se creyó que una helicasa dependiente de ATP separaba estas dos cadenas, el proceso es en realidad independiente de ATP y lo realizan directamente los componentes proteicos de RISC.

La hebra seleccionada como guía tiende a ser la que tiene un extremo 5 & # 8242 más estable, pero la selección de la hebra no se ve afectada por la dirección en la que el dicer escinde el dsRNA antes de la incorporación de RISC. En cambio, la proteína R2D2 puede servir como factor de diferenciación al unirse al extremo 5 & # 8242 menos estable de la hebra pasajera.

La base estructural para la unión de ARN a la proteína argonauta se examinó mediante cristalografía de rayos X del dominio de unión de una proteína argonauta unida a ARN. Aquí, el extremo 5 & # 8242 fosforilado de la hebra de ARN entra en un bolsillo superficial básico conservado y hace contactos a través de un catión divalente como el magnesio y por apilamiento aromático entre el nucleótido 5 & # 8242 en el ARNip y un residuo de tirosina conservado. Se cree que este sitio forma un sitio de nucleación para la unión del ARNip a su ARNm diana.

No se comprende cómo el complejo RISC activado localiza ARNm complementarios dentro de la célula. Aunque se ha propuesto que el proceso de escisión está ligado a la traducción, la traducción del ARNm diana no es esencial para la degradación mediada por ARNi. De hecho, el ARNi puede ser más eficaz contra dianas de ARNm que no se traducen.

Las proteínas argonauta, los componentes catalíticos de RISC, se localizan en regiones específicas del citoplasma llamadas cuerpos P (también cuerpos citoplasmáticos o cuerpos GW), que son regiones con altas tasas de descomposición del ARNm, la actividad del miARN también se agrupa en los cuerpos P. La alteración de los cuerpos P en las células disminuye la eficiencia de la interferencia del ARN, lo que sugiere que son el sitio de un paso crítico en el proceso de iARN.

Variación entre organismos:

Los organismos varían en su capacidad para absorber dsRNA extraño y utilizarlo en la vía del RNAi. Los efectos de la interferencia del ARN pueden ser tanto sistémicos como hereditarios en plantas y C. elegans, aunque no en Drosophila o mamíferos. En las plantas, se cree que el ARNi se propaga mediante la transferencia de ARNip entre células a través de plasmodesmos.

Una amplia distinción general entre plantas y animales radica en la orientación de miARN producidos endógenamente en las plantas, los miARN suelen ser perfecta o casi perfectamente complementarios a sus genes diana e inducen la escisión directa del ARNm por RISC, mientras que los miARN de animales tienden a ser más divergentes en secuencia e induce la represión traslacional. Este efecto de traducción puede producirse inhibiendo las interacciones de los factores de iniciación de la traducción con el ARN mensajero y la cola de poliadenina # 8217s.

Algunos protozoos eucariotas como Leishmania major y Trypanosoma cruzi carecen por completo de la vía del ARNi. La mayoría o todos los componentes también faltan en algunos hongos, sobre todo en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae. Ciertos ascomicetos y basidiomicetos también carecen de vías de interferencia de ARN.Esta observación indica que las proteínas necesarias para el silenciamiento del ARN se han perdido independientemente de muchos linajes de hongos, posiblemente debido a la evolución de una nueva vía con función similar, o a la falta de ventaja selectiva en ciertos linajes. nichos.

Funciones biológicas:

Inmunidad:

La interferencia del ARN es una parte vital de la respuesta inmune a virus y otro material genético extraño, especialmente en plantas donde también puede prevenir la autopropagación por transposones. Plantas como Arabidopsis thaliana expresan múltiples homólogos de dicer que están especializados para reaccionar de manera diferente cuando la planta se expone a diferentes tipos de virus.

Incluso antes de que se comprendiera por completo la vía del ARNi, se sabía que el silenciamiento génico inducido en las plantas podría extenderse por toda la planta con un efecto sistémico y podría transferirse del stock a las plantas de vástago mediante injertos. Desde entonces, este fenómeno ha sido reconocido como una característica del sistema inmunológico innato de la planta y permite que toda la planta responda a un virus después de un encuentro localizado inicial.

En respuesta, muchos virus vegetales han desarrollado elaborados mecanismos que suprimen la respuesta del ARNi en las células vegetales. Estos incluyen proteínas virales que se unen a fragmentos cortos de ARN bicatenario con extremos que sobresalen de una sola cadena, como los producidos por la acción del dicer. Algunos genomas de plantas también expresan ARNip endógenos en respuesta a la infección por tipos específicos de bacterias. Estos efectos pueden ser parte de una respuesta generalizada a los patógenos que regula a la baja cualquier proceso metabólico en el huésped que ayude al proceso de infección.

Aunque los animales generalmente expresan menos variantes de la enzima dicer que las plantas, también se ha demostrado que el ARNi en algunos animales produce una respuesta antiviral. Tanto en la Drosophila juvenil como en la adulta, la interferencia del ARN es importante en la inmunidad innata antiviral y es activa contra patógenos como el virus Drosophila X.

Un papel similar en la inmunidad puede operar en C. elegans, ya que las proteínas argonauta se regulan positivamente en respuesta a los virus, y los gusanos que sobreexpresan componentes de la vía del ARNi son resistentes a la infección viral. El papel de la interferencia del ARN en la inmunidad innata de los mamíferos es poco conocido y hay relativamente pocos datos disponibles.

Sin embargo, la existencia de virus que codifican genes capaces de suprimir la respuesta de ARNi en células de mamíferos puede ser una evidencia a favor de una respuesta inmune de mamíferos dependiente de ARNi. Sin embargo, esta hipótesis de inmunidad mediada por ARNi en mamíferos ha sido cuestionada por estar poco fundamentada. También existen funciones alternativas para el ARNi en virus de mamíferos, como los miARN expresados ​​por el virus del herpes que pueden actuar como desencadenantes de la organización de la heterocromatina para mediar la latencia viral.

Mantenimiento del genoma:

Los componentes de la vía de interferencia del ARN se utilizan en muchos eucariotas para el mantenimiento de la organización y estructura de sus genomas. La modificación de histonas y la inducción asociada de la formación de heterocromatina sirven para regular a la baja los genes pre-transcripcionalmente. Este proceso se conoce como silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS) y se lleva a cabo mediante un complejo de proteínas llamado complejo RITS.

En la levadura de fisión, este complejo contiene argonauta, una proteína de dominio cromático Chp1 y una proteína llamada Tarea de función desconocida. Como consecuencia, la inducción y propagación de regiones heterocromáticas requiere las proteínas argonauta y RdRP. De hecho, la deleción de estos genes en la levadura de fisión S. pombe interrumpe la metilación de histonas y la formación de centrómeros, provocando anafase lenta o estancada durante la división celular. En algunos casos, se ha observado que procesos similares asociados con la modificación de histonas regulan positivamente la transcripción de genes.

El mecanismo por el cual el complejo RITS induce la formación y organización de heterocromatina no se comprende bien y la mayoría de los estudios se han centrado en la región de tipo de apareamiento en la levadura de fisión, que puede no ser representativa de las actividades en otras regiones u organismos genómicos.

En el mantenimiento de las regiones de heterocromatina existentes, RITS forma un complejo con ARNip complementarios a los genes locales y se une de manera estable a las histonas metiladas locales, actuando co-transcripcionalmente para degradar cualquier transcripción de pre-ARNm naciente que sea iniciada por la ARN polimerasa.

La formación de dicha región de heterocromatina, aunque no su mantenimiento, es dependiente de dicer, presumiblemente porque se requiere dicer para generar el complemento inicial de ARNip que se dirigen a transcripciones posteriores. Se ha sugerido que el mantenimiento de la heterocromatina funciona como un bucle de retroalimentación que se autorrefuerza, ya que los nuevos ARNip se forman a partir de las transcripciones nacientes ocasionales por RdRP para su incorporación en los complejos RITS locales.

La relevancia de las observaciones de los centrómeros y regiones de apareamiento de levaduras de fisión para los mamíferos no está clara, ya que el mantenimiento de la heterocromatina en las células de los mamíferos puede ser independiente de los componentes de la vía del ARNi.

MiARN y regulación genética:

Los miARN expresados ​​endógenamente, incluidos los miARN intrónicos e intergénicos, son más importantes en la represión de la traducción y en la regulación del desarrollo, especialmente el momento de la morfogénesis y el mantenimiento de tipos de células indiferenciadas o incompletamente diferenciadas, como las células madre.

El papel del miARN expresado endógenamente en la regulación negativa de la expresión génica se describió por primera vez en C. elegans en 1993. En las plantas, esta función se descubrió cuando se demostró que el & # 8220JAW microARN & # 8221 de Arabidopsis estaba involucrado en la regulación de varios genes que controlan forma de la planta.

En las plantas, la mayoría de los genes regulados por miARN son factores de transcripción, por lo que la actividad de miARN es particularmente amplia y regula redes de genes enteras durante el desarrollo modulando la expresión de genes reguladores clave, incluidos factores de transcripción y proteínas de caja F. En muchos organismos, incluidos los humanos, los miARN también se han relacionado con la formación de tumores y la desregulación del ciclo celular. Aquí, los miARN pueden funcionar como oncogenes y supresores de tumores.

Diafonía con edición de ARN:

El tipo de edición de ARN que es más frecuente en eucariotas superiores convierte los nucleótidos de adenosina en inosina en ARNdc a través de la enzima adenosina desaminasa (ADAR). Se propuso originalmente en 2000 que las vías de edición de ARNi y ARN A → I podrían competir por un sustrato común de ARNbc. De hecho, algunos pre-miARN se someten a edición de ARN A → I, y este mecanismo puede regular el procesamiento y la expresión de miARN maduros.

Además, al menos un ADAR de mamífero puede secuestrar ARNip de los componentes de la ruta del ARNi. El apoyo adicional para este modelo proviene de estudios sobre cepas de C. elegans nulas para ADAR que indican que la edición de ARN A → 1 puede contrarrestar el silenciamiento de ARNi de genes y transgenes endógenos.

Sistemas procarióticos relacionados:

La expresión génica en procariotas está influenciada por un sistema basado en ARN similar en algunos aspectos al ARNi. Aquí, los genes que codifican el ARN controlan la abundancia o la traducción del ARNm produciendo un ARN complementario que se une a un ARNm por apareamiento de bases. Sin embargo, estos ARN reguladores generalmente no se consideran análogos a los miARN porque la enzima dicer no está involucrada. Se ha sugerido que los sistemas CRISPR en procariotas son análogos a los sistemas de interferencia de ARN eucariotas, aunque ninguno de los componentes proteicos es ortólogo.

Evolución:

Según el análisis filogenético basado en la parsimonia, el ancestro común más reciente de todos los eucariotas probablemente ya poseía una vía de interferencia de ARN temprana; se cree que la ausencia de la vía en ciertos eucariotas es una característica derivada. El sistema de ARNi ancestral probablemente contenía al menos una proteína tipo dicer, una argonauta, una proteína PIWI y una ARN polimerasa dependiente de ARN que también puede haber desempeñado otras funciones celulares.

Un estudio de genómica comparativa a gran escala también indica que el grupo de la corona eucariota ya poseía estos componentes, que luego pueden haber tenido asociaciones funcionales más estrechas con sistemas de degradación de ARN generalizados como el exosoma. Este estudio también sugiere que la familia de proteínas argonauta de unión a ARN, que se comparte entre los eucariotas, la mayoría de las arqueas y al menos algunas bacterias (como Aquifex aeolicus), es homóloga y evolucionó originalmente a partir de componentes del sistema de inicio de la traducción.

En general, se acepta que la función ancestral del sistema ARNi ha sido la defensa inmune contra elementos genéticos exógenos como los transposones y los genomas virales. Es posible que las funciones relacionadas, como la modificación de histonas, ya hayan estado presentes en el antepasado de los eucariotas modernos, aunque se cree que otras funciones, como la regulación del desarrollo por miARN, evolucionaron más tarde.

Los genes de interferencia de ARN, como componentes del sistema inmunológico innato antivírico en muchos eucariotas, están involucrados en una carrera armamentística evolutiva con genes virales. Algunos virus han desarrollado mecanismos para suprimir la respuesta del ARNi en sus células huésped, un efecto que se ha observado particularmente en los virus de las plantas. Los estudios de las tasas evolutivas en Drosophila han demostrado que los genes en la vía del ARNi están sujetos a una fuerte selección direccional y se encuentran entre los genes de evolución más rápida en el genoma de Drosophila.

Derribo de genes:

Un gusano nematodo adulto de tipo salvaje Caenorhabditis elegans, cultivado bajo la supresión de ARNi de un receptor de hormonas nucleares implicado en la regulación de la desaturasa. Estos gusanos tienen un metabolismo anormal de los ácidos grasos, pero son viables y fértiles. La vía de interferencia del ARN a menudo se explota en biología experimental para estudiar la función de genes en cultivos celulares e in vivo en organismos modelo.

El ARN bicatenario se sintetiza con una secuencia complementaria a un gen de interés y se introduce en una célula u organismo, donde se reconoce como material genético exógeno y activa la vía del ARNi. Usando este mecanismo, los investigadores pueden causar una disminución drástica en la expresión de un gen objetivo.

El estudio de los efectos de esta disminución puede mostrar el papel fisiológico del producto génico. Dado que el ARNi puede no abolir totalmente la expresión del gen, esta técnica a veces se denomina & # 8220knockdown & # 8221, para distinguirla de los procedimientos & # 8220knockout & # 8221 en los que la expresión de un gen se elimina por completo.

Se han dirigido grandes esfuerzos en biología computacional hacia el diseño de reactivos de ARNdc exitosos que maximizan la eliminación de genes pero minimizan los efectos & # 8220 fuera del objetivo & # 8221. Los efectos fuera del objetivo surgen cuando un ARN introducido tiene una secuencia de bases que puede emparejarse y, por lo tanto, reducir la expresión de múltiples genes a la vez. Estos problemas ocurren con mayor frecuencia cuando el dsRNA contiene secuencias repetitivas.

Se ha estimado a partir del estudio de los genomas de H. sapiens, C. elegans y S. pombe que aproximadamente el 10% de los posibles ARNip tendrán efectos sustanciales fuera del objetivo. Se han desarrollado una multitud de herramientas de software que implementan algoritmos para el diseño de ARNip generales, específicos de mamíferos y específicos de virus que se comprueban automáticamente para detectar una posible reactividad cruzada.

Dependiendo del organismo y del sistema experimental, el ARN exógeno puede ser una cadena larga diseñada para ser escindida por un cortador, o ARN cortos diseñados para servir como sustratos de ARNip. En la mayoría de las células de mamíferos, se utilizan ARN más cortos porque las moléculas largas de ARN de doble hebra inducen la respuesta al interferón de los mamíferos, una forma de inmunidad innata que reacciona de forma inespecífica al material genético extraño.

Los ovocitos de ratón y las células de los primeros embriones de ratón carecen de esta reacción al dsRNA exógeno y, por lo tanto, son un sistema modelo común para estudiar los efectos de eliminación de genes en mamíferos. También se han desarrollado técnicas de laboratorio especializadas para mejorar la utilidad del ARNi en sistemas de mamíferos evitando la introducción directa de ARNip, por ejemplo, mediante transfección estable con un plásmido que codifica la secuencia apropiada a partir de la cual se pueden transcribir ARNsi, o mediante un vector lentiviral más elaborado. sistemas que permiten la activación o desactivación inducible de la transcripción, conocidos como ARNi condicional.

Genómica funcional:

La mayoría de las aplicaciones genómicas funcionales de ARNi en animales han utilizado C. elegans y D. melanogaster, ya que estos son los organismos modelo comunes en los que el ARNi es más eficaz. C. elegans es particularmente útil para la investigación de ARNi por dos razones: en primer lugar, los efectos del silenciamiento génico son generalmente hereditarios y, en segundo lugar, porque la entrega del dsRNA es extremadamente simple. A través de un mecanismo cuyos detalles no se comprenden bien, las bacterias como E. coli que transportan el ARNdc deseado pueden ser alimentadas a los gusanos y transferirán su carga útil de ARN al gusano a través del tracto intestinal.

Este "suministro por alimentación" es tan eficaz para inducir el silenciamiento génico como los métodos de suministro más costosos y lentos, como remojar los gusanos en una solución de dsRNA e inyectar dsRNA en las gónadas. Aunque el suministro es más difícil en la mayoría de los otros organismos, también se están realizando esfuerzos para realizar aplicaciones de cribado genómico a gran escala en cultivos celulares con células de mamíferos.

Los enfoques para el diseño de bibliotecas de ARNi de todo el genoma pueden requerir más sofisticación que el diseño de un solo ARNip para un conjunto definido de condiciones experimentales. Las redes neuronales artificiales se utilizan con frecuencia para diseñar bibliotecas de ARNip y predecir su probable eficiencia en la eliminación de genes.

El cribado genómico masivo se considera un método prometedor para la anotación del genoma y ha desencadenado el desarrollo de métodos de cribado de alto rendimiento basados ​​en microarrays. Sin embargo, se ha cuestionado la utilidad de estas pantallas y la capacidad de las técnicas desarrolladas en organismos modelo para generalizar incluso a especies estrechamente relacionadas, por ejemplo, desde C. elegans hasta nematodos parásitos relacionados.

La genómica funcional que utiliza RNAi es una técnica particularmente atractiva para el mapeo genómico y la anotación en plantas porque muchas plantas son poliploides, lo que presenta desafíos sustanciales para los métodos de ingeniería genética más tradicionales. Por ejemplo, el ARNi se ha utilizado con éxito para estudios de genómica funcional en el trigo hexaploide Triticum aestivum, así como en los sistemas de modelos de plantas más comunes Arabidopsis thaliana y Zea mays.

Historia y descubrimiento:

El descubrimiento de RNAi fue precedido primero por observaciones de inhibición transcripcional por RNA antisentido expresado en plantas transgénicas y más directamente por informes de resultados inesperados en experimentos realizados por científicos de plantas en los Estados Unidos y los Países Bajos a principios de la década de 1990.

En un intento por alterar los colores de las flores en las petunias, los investigadores introdujeron copias adicionales de un gen que codifica la calcona sintasa, una enzima clave para la pigmentación de las flores en las plantas de petunia de color de flor normalmente rosa o violeta. Se esperaba que el gen sobreexpresado produjera flores más oscuras, pero en cambio produjo flores menos pigmentadas, total o parcialmente blancas, lo que indica que la actividad de la chalcona sintasa se había reducido sustancialmente, de hecho, tanto los genes endógenos como los transgenes estaban regulados negativamente en el blanco. flores.

Poco después, se observó un evento relacionado denominado sofocación en el hongo Neurospora crassa, aunque no se reconoció de inmediato como relacionado. Una mayor investigación del fenómeno en plantas indicó que la regulación negativa se debió a la inhibición postranscripcional de la expresión génica a través de una mayor tasa de degradación del ARNm. Este fenómeno se denominó cosupresión de la expresión génica, pero el mecanismo molecular seguía siendo desconocido.

No mucho después, los virólogos de plantas que trabajaban para mejorar la resistencia de las plantas a las enfermedades virales observaron un fenómeno similar inesperado. While it was known that plants expressing virus-specific proteins showed enhanced tolerance or resistance to viral infection, it was not expected that plants carrying only short, non-coding regions of viral RNA sequences would show similar levels of protection.

Researchers believed that viral RNA produced by transgenes could also inhibit viral replication. The reverse experiment, in which short sequences of plant genes were introduced into viruses, showed that the targeted gene was suppressed in an infected plant. This phenomenon was labelled “virus-induced gene silencing” (VIGS), and the set of such phenomena were collectively called post-transcriptional gene silencing.

After these initial observations in plants, many laboratories around the world searched for the occurrence of this phenomenon in other organisms. Craig C. Mello and Andrew Fire’s 1998 Nature paper reported a potent gene silencing effect after injecting double stranded RNA into C. elegans. In investigating the regulation of muscle protein production, they observed that neither mRNA nor antisense RNA injections had an effect on protein production, but double-stranded RNA success­fully silenced the targeted gene.

As a result of this work, they coined the term RNAi. Fire and Mello’s discovery was particularly notable because it represented the first identification of the causa­tive agent of a previously inexplicable phenomenon. Fire and Mello were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2006 for their work.


Press release

This year’s Nobel Laureates have discovered a fundamental mechanism for controlling the flow of genetic information. Our genome operates by sending instructions for the manufacture of proteins from DNA in the nucleus of the cell to the protein synthesizing machinery in the cytoplasm. These instructions are conveyed by messenger RNA (mRNA). In 1998, the American scientists Andrew Fire and Craig Mello published their discovery of a mechanism that can degrade mRNA from a specific gene. This mechanism, RNA interference, is activated when RNA molecules occur as double-stranded pairs in the cell. Double-stranded RNA activates biochemical machinery which degrades those mRNA molecules that carry a genetic code identical to that of the double-stranded RNA. When such mRNA molecules disappear, the corresponding gene is silenced and no protein of the encoded type is made.

RNA interference occurs in plants, animals, and humans. It is of great importance for the regulation of gene expression, participates in defense against viral infections, and keeps jumping genes under control. RNA interference is already being widely used in basic science as a method to study the function of genes and it may lead to novel therapies in the future.

The flow of information in the cell: from DNA via mRNA to protein

The genetic code in DNA determines how proteins are built. The instructions contained in the DNA are copied to mRNA and subsequently used to synthesize proteins (Fig 1). This flow of genetic information from DNA via mRNA to protein has been termed the central dogma of molecular biology by the British Nobel Laureate Francis Crick. Proteins are involved in all processes of life, for instance as enzymes digesting our food, receptors receiving signals in the brain, and as antibodies defending us against bacteria.

Our genome consists of approximately 30,000 genes. However, only a fraction of them are used in each cell. Which genes are expressed (es decir. govern the synthesis of new proteins) is controlled by the machinery that copies DNA to mRNA in a process called transcription. It, in turn, can be modulated by various factors. The fundamental principles for the regulation of gene expression were identified more than 40 years ago by the French Nobel Laureates François Jacob and Jacques Monod. Today, we know that similar principles operate throughout evolution, from bacteria to humans. They also form the basis for gene technology, in which a DNA sequence is introduced into a cell to produce new protein.

Around 1990, molecular biologists obtained a number of unexpected results that were difficult to explain. The most striking effects were observed by plant biologists who were trying to increase the colour intensity of the petals in petunias by introducing a gene inducing the formation of red pigment in the flowers. But instead of intensifying the colour, this treatment led to a complete loss of colour and the petals turned white! The mechanism causing these effects remained enigmatic until Fire and Mello made the discovery for which they receive this year’s Nobel Prize.

The discovery of RNA interference

Andrew Fire and Craig Mello were investigating how gene expression is regulated in the nematode worm Caenorhabditis elegans (Figura 2). Injecting mRNA molecules encoding a muscle protein led to no changes in the behaviour of the worms. The genetic code in mRNA is described as being the ‘sense’ sequence, and injecting ‘antisense’ RNA, which can pair with the mRNA, also had no effect. But when Fire and Mello injected sense and antisense RNA together, they observed that the worms displayed peculiar, twitching movements. Similar movements were seen in worms that completely lacked a functioning gene for the muscle protein. What had happened?

When sense and antisense RNA molecules meet, they bind to each other and form double-stranded RNA. Could it be that such a double-stranded RNA molecule silences the gene carrying the same code as this particular RNA? Fire and Mello tested this hypothesis by injecting double-stranded RNA molecules containing the genetic codes for several other worm proteins. In every experiment, injection of double-stranded RNA carrying a genetic code led to silencing of the gene containing that particular code. The protein encoded by that gene was no longer formed.

After a series of simple but elegant experiments, Fire and Mello deduced that double-stranded RNA can silence genes, that this RNA interference is specific for the gene whose code matches that of the injected RNA molecule, and that RNA interference can spread between cells and even be inherited. It was enough to inject tiny amounts of double-stranded RNA to achieve an effect, and Fire and Mello therefore proposed that RNA interference (now commonly abbreviated to RNAi) is a catalytic process.

Fire and Mello published their findings in the journal Naturaleza on February 19, 1998. Their discovery clarified many confusing and contradictory experimental observations and revealed a natural mechanism for controlling the flow of genetic information. This heralded the start of a new research field.

The RNA interference machinery is unraveled

The components of the RNAi machinery were identified during the following years (Fig 3). Double-stranded RNA binds to a protein complex, Dicer, which cleaves it into fragments. Another protein complex, RISC, binds these fragments. One of the RNA strands is eliminated but the other remains bound to the RISC complex and serves as a probe to detect mRNA molecules. When an mRNA molecule can pair with the RNA fragment on RISC, it is bound to the RISC complex, cleaved and degraded. The gene served by this particular mRNA has been silenced.

RNA interference – a defense against viruses and jumping genes

RNA interference is important in the defense against viruses, particularly in lower organisms. Many viruses have a genetic code that contains double-stranded RNA. When such a virus infects a cell, it injects its RNA molecule, which immediately binds to Dicer (Fig 4A). The RISC complex is activated, viral RNA is degraded, and the cell survives the infection. In addition to this defense, higher organisms such as man have developed an efficient immune defense involving antibodies, killer cells, and interferons.

Jumping genes, also known as transposons, are DNA sequences that can move around in the genome. They are present in all organisms and can cause damage if they end up in the wrong place. Many transposons operate by copying their DNA to RNA, which is then reverse-transcribed back to DNA and inserted at another site in the genome. Part of this RNA molecule is often double-stranded and can be targeted by RNA interference. In this way, RNA interference protects the genome against transposons.

RNA interference regulates gene expression

RNA interference is used to regulate gene expression in the cells of humans as well as worms (Fig 4B). Hundreds of genes in our genome encode small RNA molecules called microRNAs. They contain pieces of the code of other genes. Such a microRNA molecule can form a double-stranded structure and activate the RNA interference machinery to block protein synthesis. The expression of that particular gene is silenced. We now understand that genetic regulation by microRNAs plays an important role in the development of the organism and the control of cellular functions.

New opportunities in biomedical research, gene technology and health care

RNA interference opens up exciting possibilities for use in gene technology. Double-stranded RNA molecules have been designed to activate the silencing of specific genes in humans, animals or plants (Fig 4C). Such silencing RNA molecules are introduced into the cell and activate the RNA interference machinery to break down mRNA with an identical code.

This method has already become an important research tool in biology and biomedicine. In the future, it is hoped that it will be used in many disciplines including clinical medicine and agriculture. Several recent publications show successful gene silencing in human cells and experimental animals. For instance, a gene causing high blood cholesterol levels was recently shown to be silenced by treating animals with silencing RNA. Plans are underway to develop silencing RNA as a treatment for virus infections, cardiovascular diseases, cancer, endocrine disorders and several other conditions.

Referencia:
Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998 391:806-811.

Andrew Z. Fire, born 1959, US citizen, PhD in Biology 1983, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. Professor of Pathology and Genetics, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA.

Craig C. Mello, born 1960, US citizen, PhD in Biology 1990, Harvard University, Boston, MA, USA. Professor of Molecular Medicine and Howard Hughes Medical Institute Investigator, Program in Molecular Medicine, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, USA.

To cite this section
MLA style: Press release. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach AB 2021. Wed. 23 Jun 2021. <https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2006/press-release/>

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Nobel Prizes 2020

Twelve laureates were awarded a Nobel Prize in 2020, for achievements that have conferred the greatest benefit to humankind.

Their work and discoveries range from the formation of black holes and genetic scissors to efforts to combat hunger and develop new auction formats.


RNA Interference: Turning Genes Off at Will Part I

In my previous article, I introduced the model organism C. elegans. In this article, I am introducing an experiment that lets students turn off genes in C. elegans using RNAi.

The discovery of RNAi

In 1990, while working for the biotech firm DNA Plant Technology Inc., Rich Jorgensen and Carolyn Napoli tried to make petunias more purple than normal. Engineering petunias was meant to show potential investors that the firm had the technology to manipulate commercially important flowers. To do so, the scientists introduced extra copies of the gene encoding an enzyme called chalcone synthase (CHS) into petunia cells. This enzyme is part of the biosynthetic pathway that makes anthocyanins, the purple pigments in plants. They predicted that increasing the number of CHS genes would increase CHS protein levels, leading to the production of very purple flowers.

Instead, introducing the CHS gene had the opposite effect: rather than being darker, many of the modified flowers were white or had white variegations. How could this happen? When Jorgensen and Napoli looked in more detail, they found that the levels of CHS messenger RNA (mRNA) in white flowers were 50 times lower than in unaltered plants. Somehow the introduced gene (the transgene) lowered expression of both the transgene and the endogenous petunia gene. Jorgensen’s petunias were just 1 example of this phenomenon unexpected silencing (reduced gene expression) also happened when scientists did similar experiments in animals, other plants, and fungi.

How silencing occurred was a mystery for almost 10 years. One popular model suggested that silencing was caused by anti-sense RNA—single-stranded RNA that is the reverse complement of mRNA. The idea was that anti-sense RNA would base pair to the message and inhibit protein production. In 1998, Andrew Fire and Craig Mello discovered that injecting C. elegans with double-stranded RNA (dsRNA) with a sequence corresponding to a gene would silence that gene.

In fact, dsRNA was more than 100 times more effective at inhibiting gene function than anti-sense RNA. When scientists checked other examples of silencing, including Rich Jorgensen’s petunias, they found that dsRNA complementary to the silenced gene was produced in each case, showing that this response occurs in multiple organisms. Fire and Mello were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine in 2006 for discovering RNA interference—the term they coined to describe gene silencing by dsRNA.

RNAi is routinely used to silence genes and study their function. Its power comes from the ability to quickly target genes in a sequence-specific way. Also, RNAi promises to give rise to a new family of RNA-based drugs, with treatments being developed for cancers, neurodegenerative diseases like Alzheimer’s, and viral infections like HIV and hepatitis. Likewise, RNAi is being explored as a way to engineer new crops. Examples of genetically engineered crops using RNAi technology include tobacco with reduced nicotine levels soybeans with better oil quality and papaya, plum, and squash with viral resistance.

Inducing RNAi by feeding

Amazingly, feeding the roundworm C. elegans bacteria expressing dsRNA identical to a worm gene of choice can silence that gene. The experiment is very simple to set up. First, 3 strains of bacteria are grown: control bacteria and 2 strains designed to “silence” 2 different genes. These strains have been engineered to express dsRNA complementary to each targeted gene. Next, wild-type worms are fed each bacterial strain. The control bacteria have no effect. However, when worms eat bacteria expressing dsRNA, it is taken up by the worms and recognized by the RNAi machinery, turning off the targeted gene. Finally, once progeny from the worms grow up, students can observe the phenotypes with a dissecting microscope, compare the control worms to the RNAi-treated worms, and hypothesize about the function of the silenced genes.

To learn more about the genes in question, students explore them in the C. elegans WormBase database. Once they have identified the sequence for the genes, they are guided in using the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) bioinformatics Web site to identify human homologs of these genes.

This experiment provides a great educational opportunity: you can have your students turn off genes and see the results just days later. It is a vivid demonstration of the relationship between genes, their function, and phenotypes using Nobel Prize-winning technology.

Author’s note: The RNAi experiment discussed can be done with your students using Carolina’s Inducing RNAi by Feeding Kit. Carolina also offers the Culturing and Observing C. elegans Kit containing naturally occurring C. elegans mutants with the same phenotype created using RNAi in the Inducing RNAi by Feeding Kit.

“RNA Interference: Turning Genes Off at Will, Part II” will appear in a future issue of Carolina Tips®. Don’t miss it!�.


The paper
P. Liao et al., “Cuticle thickness affects dynamics of volatile emission from petunia flowers,” Nat Chem Biol, doi:10.1038/s41589-020-00670-w, 2020.

M any flowers emit sweet scents to lure pollinators. Those fragrant molecules can, however, cause damage if they begin to collect in the flowers’ cells.

To escape into the air, a petunia’s scent molecules, called volatile organic compounds (VOCs), have to travel through their cells’ cytoplasm, cross an inner membrane and then the cell wall, and finally move through a waxy cuticle. Scientists long thought that diffusion drove the release of the molecules, but in 2015, computer simulations revealed that VOCs can’t diffuse out of flower cells quickly enough to prevent internal damage to the plant.

In follow-up experiments to find out how the fragrance molecules might escape the plants, Purdue University biochemist Natalia Dudareva and colleagues found that when the flowers opened and became pungent, levels of a protein called PhABCG1 spiked. Dialing down PhABCG1 expression cut the emissions of the VOCs, which started to back up in the flower petal cells, causing the plant cell membranes to deteriorate. PhABCG1 was actively transporting the scent compounds across the membrane, Dudareva and colleagues concluded in 2017.

Tracking the location of VOCs in wild-type petunias’ flower cells, Dudareva’s team noticed that most of them accumulated in the cuticle. This waxy layer that coats the outside of plant cells serves as a sink for roughly 50 percent of a cell’s VOCs, the experiment showed. When the researchers used RNA interference to reduce levels of PhABCG12, a wax transport protein, the thickness of the petunia flower cuticle layer dropped, and then VOC emissions, VOC production, and VOC pooling in the cuticle dropped as well. When the researchers repeated the experiment using a chemical to thin the flower’s cuticle, they got the same result.

“The idea that when you reduce the cuticle, you actually get less emission—that’s totally bizarre,” says Jonathan Gershenzon, a biochemist at Max Planck Institute for Chemical Ecology who was not involved in the study.

Dudareva agrees. As she and her colleagues analyzed their data, it became clear that if the cuticle is too thin, VOCs build up within the plant cells, causing damage. Sensing trouble, the cells somehow dial back VOC production. Taken together, the results reveal that the cuticle plays an integral role in regulating petunia’s sweet scent, the authors write.

Even with that explanation, the results are flummoxing, Gershenzon says. If researchers find a similar phenomenon in other plants, it could give researchers a way to alter volatile emission, and the messages plants send, just by manipulating cuticle thickness, he notes. In addition, the finding raises questions about the signaling going on between the cuticle and the pathways that control VOC accumulation and production. “We know a lot about metabolism and regulation for so many things,” Gershenzon notes, “but for flower volatiles like this, people haven’t thought about how that works.”


Defeating Disease and Communism (2)

On 4/23/20 former President Donald J. Trump reportedly linked God’s Creation of sunlight and humidity to the energy-dependent weakening of coronaviruses via RNA–RNA interaction between host and virus, but see Experts say there’s no medical basis for Trump’s suggestion that sunlight, disinfectants may treat coronavirus 4/24/20

Jonathan Reiner, professor of medicine at The George Washington University Hospital, said there’s no medical basis for Trump’s statements about sunlight.

Reiner’s stupid claim can be placed into the context of “…a computational model that examines one of the first major biological innovations-the origin of heredity in simple protocells.” See: “The origin of heredity in protocells 12/5/17

Here we develop a computational model that examines one of the first major biological innovations-the origin of heredity in simple protocells.

Our novel conceptualization sets out conditions under which protocell heredity and competition could arise, and points to where crucial experimental work is required.This article is part of the themed issue ‘Process and pattern in innovations from cells to societies’.

See for comparison to their computational model: Peptide synthesis at the origin of life 11/13/20

Darwin presciently included peptide synthesis in the context of his “conditions of life.” Serious scientists know that fixation of amino acid substitutions differentiates all cell types in all tissues of all individual of all species. Everything happens in the context of what is known about biochemistry, which requires the energy-dependent Creation of a massive assembly of proteins and RNA, called ribosomes.

Computational biologists failed to start with the building of a primordial ribosome under the conditions of a lifeless planet. Their ridiculous assumptions led them to miss the fact that microorganisms use biological nonribosomal peptide synthesis for the production of peptide-based natural products.

The production of peptide-based natural products links Darwin’s “conditions of life” from the light-activated Creation of pH-dependent nonribosomal peptide synthetases to the reactions that are required to Create ribosomes.

In that context, RNA interference links the Creation of ribosomes to the pungency of the fragrance and to the richness of color in purple petunias.

…when the flowers opened and became pungent, levels of a protein called PhABCG1 spiked.

They linked RNA interference to the pungency via reduced levels of PhABCG12.

RNA interference was linked to the color of purple petunias for a general audience in 2012.

The technical aspects were published in our section on molecular epigenetics in From Fertilization to Adult Sexual Behavior (1996)

Olfaction, however, is unique among sensory systems in its relative structural conservation throughout mammalian evolution, and it is unknown whether human primary olfactory cortex was subject to the same rerouting.

If you accept the claims about evolved mammals from Communists in China and government subsidized researchers in Chicago, you may miss the message in Why odors trigger powerful memories 3/8/21

The study compares connections between primary sensory areas—including visual, auditory, touch and smell—and the hippocampus. It found olfaction has the strongest connectivity.

The connectivity was established via links from Peptide Synthesis at the Origin of Life 11/13/20 to God’s Creation of the sense of smell in bacteria and Visualizing a protonated RNA state that modulates microRNA-21 maturation 10/26/20

For links from God’s Creation of the sense of smell in bacteria to biophysically constrained viral latency across kingdoms and disease prevention via plant growth, see also: Combating Cancer with Natural Products: What Would Non-Coding RNAs Bring?

This review summarizes the scientific progress made regarding the anti-tumor mechanisms elicited by various active ingredients of Chinese medicine in regulating non-coding RNAs, to provide a theoretical foundation for treating tumors using traditional Chinese medicine.

cancer development and progression are closely associated with various non-coding RNAs, including long non-coding RNAs and microRNAs, which regulate gene expression….

…increasing attention has been paid to developing new cancer treatment modalities using traditional Chinese medicines, which exert regulatory effects on multiple components, targets, and pathways. Several active ingredients in Chinese medicine, including ginsenoside, baicalin, and matrine have been found to regulate ncRNA expression levels, thus, exerting anti-tumor effects.

The links from God’s Creation of sunlight and humidity to oxygen-dependent plant growth and biophysically constrained viral latency should not be placed back into theories by atheists from China or anyone else who failed to link God’s Creation of energy-as-information to biophysically constrained viral latency via what is known to intelligent serious scientists.


Plucking RNAi from the Gene-Silencing Nettle

Only five short years after the launch of GEN magazine—1986 to be precise—in the early heydays of genetic engineering, molecular geneticist Richard Jorgensen, Ph.D., was working for a then small biotech company called Advanced Genetic Sciences, which later became DNA Plant Technology Corp. In what Dr. Jorgensen and his colleagues hoped would have been a tantalizing display of their control and understanding of plant genetics, the researchers attempted to create an extremely dark purple petunia, to garner the attention and financial backing of some venture capitalist groups.

Dr. Jorgenson knew which gene controlled purple pigment in the flower, and he was aware that petunias are very amenable to DNA transfection. The researchers logically surmised that additional copies of the purple gene should make petunias that were shades darker. However, to the investigators’ surprise and dismay, after they added an extra version of the purple gene to a petunia, the plant did not produce dark purple flowers—instead it bore stark white flowers devoid of pigment.

After Dr. Jorgenson and his colleagues verified that the gene they had placed into petunias was correct, these scientists—along with a horde of molecular biologists—spent the next several years trying to figure out what went wrong. During this time, they had little idea they were doing work that would prove to be so significant. It not only won Nobel Prizes for two scientists, but it also led to a discovery that would spark a molecular revolution.

Simple, But Elegant

In the early 1990s, researchers Andrew Fire, Ph.D., and Craig Mello, Ph.D., were investigating gene-expression mechanisms in the classical genetic animal model Caenorhabditis elegans. They found that separate injections of either sense or antisense messenger RNA (mRNA) that encoded for various muscle proteins produced no phenotypic or behavioral changes. However, when the researchers injected sense and antisense mRNA together, the worms responded with a unique and characteristic twitching effect. Interestingly, these erratic movements were similarly found in worms that lacked a functional gene for a muscle protein that corresponded to one of the experimental mRNAs.

After some years investigating this phenomenon, Drs. Fire and Mello surmised that in their original experiments, injecting single-stranded sense or antisense mRNA led these molecules to pair up with their “mirror image” counterparts in the cell, resulting in no observable changes. However, through a series of elegant experiments, the researchers, and their colleagues found that the addition of double-stranded RNA (dsRNA) had the capacity to silence the endogenous genes that matched the sequence of the injected RNA. In every experiment, injection of dsRNA carrying a homologous genetic sequence led to the silencing of that gene and subsequent reduction in the accompanying protein levels.

Curiously, the research team found that the induced RNA interference—or RNAi as it is now called—was capable not only of spreading from cell to cell within an organism but of passing to the organism’s offspring. Moreover, RNAi genetic silencing required only minuscule amounts of dsRNA to achieve the desired effect—which led Drs. Fire and Mello to propose that RNAi was a catalytic process. The researchers published their findings in Nature on February 19, 1998, clarifying contradictory results seen previously—in Dr. Jorgenson’s petunias, for example—and starting the race to uncover the molecular mechanisms that regulated RNAi within the cell.

New Opportunities Emerge

The years following the initial RNAi publication saw a massive influx of research describing RNAi mechanics with new terms being introduced into the biological lexicon such as Dicer, RISC, and Argonaute to explain the RNA-dependent gene silencing process. At the same time, many investigators had fixed their gaze toward clinical applications of this new gene-silencing technique. The potential for this method to treat and possibly even cure diseases as diverse as blindness and cancer was viewed, at that time, to be limitless.

The continued study of RNAi allowed researchers to discover that dsRNA sequences approximately 70 nucleotides in length, called short-hairpin RNAs (shRNAs), may be cleaved by the Dicer enzyme into smaller molecules. These molecules, which are 21 nucleotides long, are functional. They are dubbed small interfering RNAs or siRNAs. The antisense strand of siRNA then merges with RISC (RNA-induced silencing complex) to guide it to the siRNA-complementary mRNA molecule, signaling mRNA’s demise by cellular machinery. Researchers found that this molecular pathway and many of its components were highly conserved across mammalian species, a finding that encouraged RNAi research to move rapidly across species and gear up for the eventual jump into human trials.

In the early years of the new millennium (ca. 2002), a few enterprising biotechnology companies decided to go “all in” with RNAi, believing firmly in the science’s potential for significant impact on disease. One such company was Ribozyme Pharmaceuticals. The company, which changed its name in 2003 to Sirna Therapeutics to reflect its renewed commitment toward gene-silencing technology, was later bought by Merck & Co. in 2006. In the company’s Sirna days, it developed an RNAi therapy against age-related macular degeneration (AMD). The therapy was put into clinical trials, but Phase II results were less than spectacular, causing the trials to be shut down toward the end of 2008.

The Sirna outcome is one of the dozens of examples of RNAi-based companies that were (and still are) looking to make their mark on history. While the AMD clinical trial failed, early clinical successes using refined versions of RNAi technology have increased over the past several years. Moreover, an even greater understanding of the basic molecular biology behind RNA-induced gene silencing has led to technological improvements as a laboratory tool and clinical therapeutic. However, despite gains made, the perception of RNAi as a clinically useful tool have yet to be realized and may suffer an even more critical blow with the genome-editing tool CRISPR setting the molecular biology field ablaze with excitement over the last several years.

Time will tell what the future holds for RNAi in the clinical arena, but its impact on the biological sciences has been nothing short of remarkable. Opening new avenues of research in the areas of gene silencing and regulation has led to entirely new business endeavors being created to address the needs of RNAi researchers and those seeking to utilize the technique therapeutically. All told, it's not difficult to see why Drs. Fire and Mello were awarded the 2006 Nobel Prize in Medicine for their seminal research. Who would have thought the petunia could have so much impact on modern science?


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RNAi silencing of Apolipoprotein B

Researchers have used RNA interference (RNAi) to block the production of Apolipoprotein B (ApoB), which is involved in the metabolism of cholesterol.

When tiny fat droplets (liposomes) containing synthetic RNA molecules were injected into monkeys’ bloodstreams they interfered with ApoB synthesis, leading to a 75% reduction in the level of the protein. This resulted in a similar reduction in levels of the two types of cholesterol, high- and low-density lipoprotein, both of which are synthesized from ApoB.

The effects of the injection were apparent within 24 hours and lasted at least 11 days. In comparison, the commonly prescribed cholesterol-lowering drugs called statins reduce low-density lipoprotein levels by between 30-40% and have to be taken on a daily basis.

“We have shown that an injection of our drug into the bloodstream of primates can result in a profound and durable silencing of a disease-causing gene…[which] represents a major step forward in the development of therepeutics based on RNA interference,” said John Maraganore, chief executive of Alnylam Pharmaceuticals of Cambridge, Massachusetts, one of the companies involved in the research.

Researchers at Alnylam now hope to carry out clinical trials in humans within two years. They are also developing inhalation sprays as another method of administering RNAi-based drugs.

RNAi was accidently discovered over 10 years ago and was hailed as a method that would revolutionize biomedicine,with many speculating on its use in therapies for a wide variety of genetic conditions.

Geneticists were trying to give petunias a deeper purple colouring by adding to them a pigment-producing gene. To their surprise, many of the resulting transgenic plants were variegated or white, and they called the phenomenon ‘co-suppression’, as neither the introduced transgene nor the original pigment gene functioned properly.

At first the phenomenon was thought to be specific to petunias, but it has since been observed in many other plant species, in the nematode worm Caenhorhabditis elegans and the fruit fly Drosophila melanogaster. RNAi is also known to take place in humans.

The molecular machinery and mechanisms of RNA have not yet been fully characterised. Double-stranded RNA molecules are found by an enzyme called Dicer, which cuts them into small fragments and seperates the two strands. The resulting single-stranded RNA molecules – called small interfering RNAs (siRNAs) – are then used by another group of enzymes, the RNAases, to target RNA molecules with a complementary sequence, which they then destroy by cutting at a specific site. The molecules targeted by RNAases are sometimes transcripts of messenger RNA, or copies of the DNA sequence which have been shuttled out of the nucleus to be translated into chains of amino acids that fold up to form protein molecules. By destroying messenger RNAs in this way, RNAi can reduce the activity of a gene, or silence it altogether.

RNAi has been used in gene knockout experiments, in which a specific gene is switched off in order to determine its normal function. Because gene silencing is not always complete, the method is also used in gene knockdown experiments, where the activity of a gene is reduced.

Many viruses produce double-stranded RNA when replicating inside cells and RNAi may have evolved to protect cells from viral infection. RNAi and similar RNA-mediated gene silencing mechanisms are also involved in gene regulation in most cells and play an essential role in development.

Effective treatments for hypercholesterolemia are desperately needed, and RNAi therepeutics for the condition would be both very welcome and extremely lucrative – a high cholesterol level is a major contributing factor to heart disease, the most common cause of death in the Western world.


CONCLUDING REMARKS

In the past few years the RNAi pathway has become the predominant means of assessing loss of gene function in most organisms. The ease with which genes can be silenced via the RNAi pathway has led to the generation and screening of genome-wide siRNA libraries in many organisms (53–59). The remarkable utility of RNAi in modulating gene expression has resulted in an explosion of interest in deciphering the molecular mechanisms that control this pathway and imaginative ideas of ways to apply it to research and clinically. The pace of progress has been staggering, yet many mysteries remain to be solved as we search for ways to silence the genes in this world of small RNAs with enormous effects.


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