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¿Con qué frecuencia se puede reutilizar la tinción de Coomassie?

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Yo suelo calentar a hervir en el microondas y teñir durante 12 minutos. ¿Con qué frecuencia puedo reutilizar este búfer?


Dado que hay una gran cantidad de metanol en la tinción de Coomassie, es probable que una cantidad significativa se evapore cada vez que la cocine en el microondas. Por lo tanto, probablemente sería una buena idea no reutilizarlo porque (1) está perdiendo metanol y (2) la concentración de todo lo demás se pierde.

¿Por qué hierves la mancha? Solo vierto el mío a temperatura ambiente directamente sobre el gel y funciona bien.


¿Con qué frecuencia se puede reutilizar la tinción de Coomassie? - biología

CURVAS ESTÁNDAR DE PROTEÍNA

Como saben, la electroforesis en gel es una poderosa herramienta para separar y visualizar macromoléculas biológicas. Ha realizado electroforesis en gel de agarosa para separar fragmentos de ADN en Biología 151 y, muy probablemente, también en otros laboratorios. Los siguientes dos laboratorios utilizaremos un tipo de electroforesis llamado SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS) que se usa para separar mezclas de proteínas.

En SDS-PAGE, un detergente, el dodecilsulfato de sodio (SDS), recubre proteínas solubles y polipéptidos con una carga negativa que se encuentra en la molécula. Las proteínas recubiertas de SDS pueden luego migrar hacia el electrodo positivo, pero a diferentes velocidades dependiendo de sus tamaños relativos. Cuando las proteínas se calientan y se recubren con SDS, pierden su estructura tridimensional, lo que facilita la migración a través de la matriz del gel. Los polipéptidos más grandes están recubiertos con más moléculas de SDS, por lo que la relación entre el peso molecular de una proteína y su carga es aproximadamente la misma para todas las proteínas. Esto significa que el tamaño (peso molecular) se convierte en el determinante de la movilidad a través del gel.

Como sabe, muchas proteínas grandes multiméricas están formadas por subunidades de proteínas más pequeñas. Estos polipéptidos se mantienen unidos por una serie de enlaces, incluidos los enlaces entre átomos de azufre en los aminoácidos que contienen. Se utilizan calor y SDS para romper estos puentes disulfuro y liberar las unidades polipeptídicas separadas.

Como resultado, una proteína nativa funcional puede dar lugar a varios polipéptidos más pequeños que pueden aparecer como bandas distintas en un gel. La miosina, por ejemplo, es un complejo de 2 cadenas de proteínas pesadas y 4 cadenas ligeras. Las cadenas ligeras son de dos tamaños diferentes, por lo que una muestra de miosina purificada formará 3 bandas separadas cuando se trate adecuadamente antes de la electroforesis.

Los procedimientos de SDS-PAGE utilizan geles de SDS-PAGE que se procesan en cámaras de electroforesis verticales. En estos sistemas, el gel de poliacrilamida se coloca en una cámara llena de tampón entre dos electrodos. Las muestras de proteínas tratadas se colocan en pozos en la parte superior del gel y los electrodos se conectan a una fuente de alimentación que genera un gradiente de voltaje a través del gel. Las proteínas recubiertas con SDS cargadas negativamente pueden luego migrar hacia abajo a través del gel hacia el electrodo positivo.

El tamaño de la proteína se mide en dalton, una medida del peso molecular. Un dalton se define como la masa de un átomo de hidrógeno, que es 1,66 x 10 × 24 gramos. La mayoría de las proteínas tienen masas del orden de miles de daltons, por lo que el término kilodalton (kD) se usa a menudo para describir el peso molecular de la proteína. Dado que el peso promedio de un aminoácido es 110 daltons, el número de aminoácidos en una proteína puede aproximarse a partir de su peso molecular.

Las proteínas de sus muestras no son visibles mientras el gel está en funcionamiento, a menos que estén teñidas previamente con tintes unidos covalentemente. Por lo tanto, durante una ejecución de electroforesis típica, debería poder ver la separación de los estándares de proteínas preteñidos, pero no el movimiento de las proteínas desconocidas en estudio.

Como en cualquier procedimiento de electroforesis, si la corriente eléctrica se deja encendida durante demasiado tiempo, las proteínas se escurrirán del gel en la parte inferior. Para evitar esto, se mezcla un tinte de rastreo azul con las muestras de proteína de los embriones. Este tinte azul está cargado negativamente y también es atraído hacia el electrodo positivo. Dado que las moléculas de tinte son más pequeñas que las proteínas esperadas en la mayoría de las muestras, se mueven más rápidamente a través del gel.

Generalmente existe una relación lineal entre el log (base 10) del peso molecular de una proteína y la distancia que el fragmento de proteína migra en el gel. Tenga en cuenta que esta relación lineal es solo entre el logaritmo del peso molecular y la distancia. Debido a esta relación lineal, podemos generar una ecuación para la línea recta que describe el logaritmo del peso molecular y la distancia recorrida.

Este tipo de curvas se denominan curvas estándar y se pueden utilizar para identificar el peso molecular de proteínas desconocidas. Por supuesto, para poder hacer esto, necesita conocer el peso molecular de las proteínas, por lo que compramos estándares de proteínas como los de Bio-Rad a continuación.

Tabla de posibles patrones de proteínas previamente teñidos

El procedimiento para el laboratorio de hoy será bastante sencillo. Realizará electroforesis cuantitativa SDS-PAGE de estándares de proteínas y generará una curva estándar con barras de error. El punto clave es desarrollar su técnica para que tenga poca variación en sus resultados.

1. Su instructor le demostrará cómo ensamblar las unidades de gel verticales e instalar los geles SDS-PAGE prefabricados. Tenga cuidado de no apretar demasiado las abrazaderas de gel

2. Agregue tampón de electroforesis y asegúrese de que no haya fugas en el sistema. Repare las fugas si es necesario.

3. Cargue tantas muestras de estándares de 10 ul como tenga disponibles. Esto dependerá del costo de los estándares y de la cantidad disponible.

4. Ejecute los geles durante unos 45 minutos o hasta que las bandas que se muevan más rápido lleguen a los extremos del gel.

5. Retire el gel de las placas sandwich. Colóquelo sobre una mesa de luz y lea directamente la distancia recorrida. Mide desde el fondo del pozo hasta el frente de la banda. Si tiene patrones sin teñir, deberá teñirlos. Se proporcionará el procedimiento de tinción si es necesario, hay un par de tinciones de proteínas generales estándar que se pueden usar dependiendo de la combinación de estándares que tengamos.

6. Se le proporcionarán los pesos moleculares de los estándares. Utilice estos pesos para generar una curva estándar con barras de error (consulte el procedimiento de laboratorio anterior). Incluya una ecuación para la línea de regresión. Recuerde tomar la base logarítmica 10 de los pesos moleculares al hacer su curva estándar.

Los materiales que se enumeran a continuación son necesarios para realizar el experimento de hoy. Se utilizan para la manipulación de muestras y para la preparación y análisis de los geles SDS-PAGE.

- Probetas graduadas y agua destilada de vidrio

- 50 ul / grupo de estándares proteicos

- Guantes, reglas de plástico transparente, soporte para tubos de ensayo para tubos de ensayo calientes

- Soportes de tubos para los tubos de 0,5 ml

- pipetas, eppendopf y 10 ml, bandejas de tinción de plástico (6 & quot X 6 & quot)

- bloques calientes configurados a 95 ° C para calentar muestras

1. Centro de Formación Avanzada en Biología Celular y Molecular. Parte del material para el laboratorio de hoy provino de un taller al que asistí sobre "Técnicas de separación", Dr. Frank Castora, Director de la Universidad Católica, Washington DC.

2. Davis, L.D., Dibner, M.D. y Battey, J.F. 1986. Métodos básicos en biología molecular. Elsevier, Nueva York. págs. 58-75.

3. Gasque, C.E. 1989. Un manual de experiencias de laboratorio en biología celular. WC. Editores Brown, Dubuque, Iowa.

4. Bergman, A. 1990. Investigaciones de laboratorio en biología celular y molecular. Tercera edicion. John Wiley and Sons, Nueva York.

5. Hames, B.D. y Rickwood, D. 1988. Electroforesis en gel de proteínas, un enfoque práctico. IRL Press, Washington DC.

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DE UNA MEZCLA DE PROTEÍNAS DESCONOCIDAS

Entonces, según el laboratorio de la semana pasada, todos están familiarizados con SDS-PAGE y cómo hacer una curva estándar. Su tarea esta semana es diseñar y realizar un experimento para determinar el peso molecular de una mezcla de proteínas desconocidas. Su grupo deberá leer este laboratorio y reunirse con el instructor antes de este laboratorio para presentar su diseño experimental. Durante estas reuniones previas al laboratorio, normalmente le haré preguntas al grupo como:

1. ¿Qué está tratando de hacer en este laboratorio en palabras simples?

2. ¿Cuál es su hipótesis y su hipótesis nula?

3. ¿Cuál es su matriz de diseño experimental? Querré verlo escrito.

4. ¿Cómo va a analizar / cuantificar sus datos? Querré que seas específico.

Para este primer laboratorio de experimentos, iba a darles a los grupos de estudiantes una mezcla de sangre completa y les haría caracterizar las proteínas plasmáticas presentes, pero realmente necesita concentrar un poco las proteínas de la sangre para obtener buenos resultados. En cambio, le proporcionaré los mismos materiales que tenía la semana pasada más 50 ul de una mezcla desconocida de proteínas. Una vez más, su trabajo consiste en diseñar y realizar un experimento para determinar el peso molecular de estas proteínas.

Como la mezcla de proteínas desconocidas no está teñida, deberá visualizarlas mediante el procedimiento de tinción de Coomassie. Los colorantes de Coomassie se unen a las proteínas a través de interacciones iónicas entre los grupos de ácido sulfónico del colorante y los grupos de amina de proteínas positivos, así como a través de atracciones de Van der Waals. Hay una serie de protocolos de tinción que implican variaciones en el tema de la tinción y luego decolorar el gel. Aquí hay uno que funciona bastante bien:

1. Sumerja el gel en la solución de tinción.

2. Microondas durante 30 segundos, no lo he probado antes, pero se supone que lo acelerará.

3. Coloque el gel en una plataforma giratoria y agite lentamente hasta que las bandas se hagan visibles. Tarda aproximadamente media hora (se utiliza microondas para acelerar el proceso de tinción).

4. Vacíe la solución de tinción y guárdela para uso futuro.

5. Enjuague el gel varias veces con agua pura.

7. Sumerja el gel en la solución decolorante.

8. Microondas durante 30 segundos, nuevamente, no lo he probado antes, pero tiene sentido que acelere el procedimiento.

9. Doble y coloque varias hojas de Kimwipes en la esquina del recipiente (el papel tiene proteínas y se adhiere a la mancha, acelerando el proceso de decoloración).

10. Vuelva a colocar el gel sobre una plataforma giratoria y agítelo hasta que se vean las bandas. Esto tarda aproximadamente media hora. Alternativamente, puede dejarlo durante la noche.

11. Destain más reemplazando la toalla de papel, si es necesario. La idea de decolorar es que el coommassie mancha todo, gel y bandas. Tienes que quitar la mayor parte de la mancha del gel para poder ver las bandas.

II. MATERIALES Se le proporcionarán los siguientes materiales:

- solución de tinción azul de Coommasie, que puede prepararse en un kit o prepararse con la mezcla siguiente

- 50 ul / grupo de mezcla de proteínas desconocidas

- 50 ul / grupo de estándares proteicos

- Probetas graduadas y agua destilada de vidrio

- Guantes, reglas de plástico transparente, soporte para tubos de ensayo para tubos de ensayo calientes

- Soportes de tubos para los tubos de 0,5 ml

- pipetas, eppendopf y 10 ml, bandejas de tinción de plástico (6 & quot X 6 & quot)

- bloques calientes configurados a 95 ° C para calentar muestras

Solución colorante 1 litro:

100 ml de ácido acético glacial

2,5 g de azul brillante de Coomassie R-250

Filtre la solución a través del filtro Whatman No. 1 para eliminar las impurezas.

Solución decolorante 1 litro:

50 ml de ácido acético glacial

2. Centro de Formación Avanzada en Biología Celular y Molecular. Parte del material para el laboratorio de hoy provino de un taller al que asistí sobre "Técnicas de separación", Dr. Frank Castora, Director de la Universidad Católica, Washington DC.

3. Davis, L.D., Dibner, M.D. y Battey, J.F. 1986. Métodos básicos en biología molecular. Elsevier, Nueva York. págs. 58-75.

4. Gasque, C.E. 1989. Un manual de experiencias de laboratorio en biología celular. WC. Editores Brown, Dubuque, Iowa.

5. Bergman, A. 1990. Investigaciones de laboratorio en biología celular y molecular. Tercera edicion. John Wiley and Sons, Nueva York.

6. Hames, B.D. y Rickwood, D. 1988. Electroforesis en gel de proteínas, un enfoque práctico. IRL Press, Washington DC.

NOTAS PARA EL PRIMER LABORATORIO EXPERIMENTAL

Cuando diseñe su experimento, tenga en cuenta lo siguiente. Su experimento debe completarse, analizarse y debe completarse un informe oral y escrito en el laboratorio de la semana siguiente. El laboratorio número 4 consistirá en la presentación oral de los resultados de tu experimento a la clase. La presentación oral de su grupo debe tener el formato de:

Introducción: antecedentes de lo que hizo, por qué decidió hacerlo, qué esperaba lograr, esto puede incluir una declaración que describa su hipótesis nula

Métodos: esto debe incluir el diseño del experimento y cómo realizó físicamente su trabajo.

Resultados: esto debe incluir una presentación de sus resultados y una discusión de su importancia, debe incluir gráficos (transparencias) cuando sea apropiado y el análisis estadístico que utilizó para dar cierto grado de confianza en sus resultados.

Debe planificar su presentación en unos 15-20 minutos. Eso permitirá unos 10 minutos para la discusión. Todos los miembros deben participar en la discusión y redacción del experimento. El grupo puede trabajar en conjunto para redactar un informe común de su experimento. Su calificación en el componente de laboratorio del curso estará determinada por los siguientes factores:

2. Calidad de su presentación oral (consulte la rúbrica)

3. Calidad de la redacción de su laboratorio

Los informes escritos deben estar mecanografiados y utilizar la gramática adecuada. Tus informes escritos no puede ser simplemente una copia impresa de su presentación de Powerpoint. Deben incluir cualquier gráfico o análisis estadístico que haya utilizado. Consulte el primer laboratorio para obtener un formato más completo de los informes del laboratorio. Cuando su grupo entregue su informe escrito, debe estar firmado por todos los miembros del grupo. Junto a sus firmas debe tener un porcentaje (0 - 100%). Este número representa la cantidad de tiempo que cada miembro dedicó a la redacción del experimento y la preparación del informe oral.

La suma de estos porcentajes debe sumar el 100%. Idealmente, cada miembro debería realizar la misma cantidad de trabajo. Por ejemplo, si hay tres personas en el grupo, cada estudiante idealmente pondría el 33,3% del trabajo en el análisis de los datos y redacción del experimento y preparación del informe oral. Consulte el primer folleto de laboratorio para conocer el formato que se utilizará para los informes escritos.


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Manchas de proteína total

Las tinciones de proteínas totales permiten la visualización del patrón de proteínas en el gel. La siguiente tabla compara las ventajas y desventajas de varias técnicas de tinción de proteínas totales.

Manchas de Coomassie
El colorante de proteína aniónica más popular, Coomassie Brilliant Blue, tiñe casi todas las proteínas con una buena linealidad cuantitativa a una sensibilidad media. Hay dos variantes de Coomassie Brilliant Blue: R-250 (R para rojizo), que ofrece tiempos de tinción más cortos, y G-250 (G para verdoso), que está disponible en formulaciones más sensibles y respetuosas con el medio ambiente (Simpson 2010, Neuhoff et al. 1988). Los tintes de Coomassie también son los tintes favoritos para la espectrometría de masas y la identificación de proteínas. Bio-Safe Coomassie Stain es una formulación no peligrosa de Coomassie Blue G-250 que solo requiere agua para enjuagar y decolorar. Ofrece una sensibilidad mejor que las formulaciones convencionales de Coomassie R-250 y equivalente a Coomassie Blue G-250, pero con un protocolo de tinción más simple y rápido.

Manchas de plata
Las manchas de plata ofrecen la mayor sensibilidad, pero con un rango dinámico lineal bajo (Merril et al. 1981, Rabilloud et al. 1994). A menudo, estos protocolos requieren mucho tiempo, son complejos y no ofrecen una reproducibilidad suficiente para el análisis cuantitativo. Además, su compatibilidad con la espectrometría de masas con fines de identificación de proteínas es menor en comparación con las tinciones de Coomassie y los tintes fluorescentes (Yan et al. 2000). La tinción de plata ofrece una sensibilidad que supera la de Coomassie y es equivalente a la mayoría de las tinciones fluorescentes.

Manchas fluorescentes
Estas tinciones cumplen casi todos los requisitos para una tinción de proteína ideal al ofrecer alta sensibilidad, un amplio rango dinámico lineal de más de cuatro órdenes de magnitud, un protocolo simple y robusto y compatibilidad con espectrometría de masas. Sin embargo, en comparación con las técnicas de tinción de Coomassie o de plata, los tintes fluorescentes son más caros y requieren una cámara CCD (dispositivo de carga acoplada) o un escáner de fluorescencia para obtener imágenes en gel. Por estas razones, las tinciones fluorescentes se utilizan a menudo en aplicaciones proteómicas y en geles 2-D, donde se realiza la cuantificación relativa de proteínas en mezclas complejas en varios órdenes de abundancia y se determina la identidad de proteínas mediante digestión proteolítica en gel y espectrometría de masas. Los ejemplos incluyen Flamingo & trade y Oriole & trade Fluorescent Gel Stains.


Contenido

Edición de SDS-PAGE

SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio, describe una colección de técnicas relacionadas para separar proteínas de acuerdo con su movilidad electroforética (una función del peso molecular de una cadena polipeptídica) mientras se encuentran en el estado desnaturalizado (desplegado). En la mayoría de las proteínas, la unión de SDS a la cadena polipeptídica imparte una distribución uniforme de carga por unidad de masa, lo que da como resultado un fraccionamiento por tamaño aproximado durante la electroforesis.

El SDS es un agente detergente fuerte que se usa para desnaturalizar las proteínas nativas en polipéptidos individuales desplegados. Cuando una mezcla de proteínas se calienta a 100 ° C en presencia de SDS, el detergente envuelve la estructura polipeptídica. En este proceso, las cargas intrínsecas de los polipéptidos se vuelven insignificantes en comparación con las cargas negativas aportadas por SDS. Por tanto, los polipéptidos después del tratamiento se convierten en estructuras en forma de varilla que poseen una densidad de carga uniforme, que es la misma carga negativa neta por unidad de longitud. Las movilidades electroforéticas de estas proteínas serán una función lineal de los logaritmos de sus pesos moleculares.

Los geles nativos, también conocidos como geles no desnaturalizantes, analizan proteínas que todavía están en su estado plegado. Por lo tanto, la movilidad electroforética depende no solo de la relación carga-masa, sino también de la forma física y el tamaño de la proteína.

PÁGINA nativa azul Editar

BN-PAGE es una técnica de PAGE nativa, donde el colorante Coomassie Brilliant Blue proporciona las cargas necesarias a los complejos de proteínas para la separación electroforética. [1] [2] La desventaja de Coomassie es que, al unirse a las proteínas, puede actuar como un detergente provocando la disociación de los complejos. Otro inconveniente es la posible extinción de la quimioluminiscencia (por ejemplo, en ensayos de actividad o detección de transferencia Western posteriores) o la fluorescencia de proteínas con grupos prostéticos (por ejemplo, hemo o clorofila) o marcadas con tintes fluorescentes.

Borrar edición de PÁGINA nativa

CN-PAGE (comúnmente conocido como Native PAGE) separa proteínas ácidas solubles en agua y de membrana en un gel de gradiente de poliacrilamida. No utiliza colorante cargado, por lo que la movilidad electroforética de las proteínas en CN-PAGE (en contraste con la técnica de cambio de carga BN-PAGE) está relacionada con la carga intrínseca de las proteínas. [3] La distancia de migración depende de la carga de la proteína, su tamaño y el tamaño de los poros del gel. En muchos casos, este método tiene una resolución más baja que BN-PAGE, pero CN-PAGE ofrece ventajas siempre que el tinte de Coomassie interfiera con otras técnicas analíticas, por ejemplo, se ha descrito como una técnica de separación a microescala muy eficiente para análisis FRET. [4] Además, CN-PAGE es más suave que BN-PAGE, por lo que puede retener conjuntos supramoleculares lábiles de complejos de proteínas de membrana que se disocian en las condiciones de BN-PAGE.

PÁGINA nativa cuantitativa Editar

Los complejos de proteínas plegadas de interés se separan de forma limpia y predecible debido a las propiedades específicas del gel de poliacrilamida. Las proteínas separadas se eluyen continuamente en un eluyente fisiológico y se transportan a un recolector de fracciones. En cuatro a cinco fracciones de PAGE, cada uno de los cofactores metálicos se puede identificar y cuantificar absolutamente mediante ICP-MS de alta resolución. Las estructuras respectivas de las metaloproteínas aisladas se pueden determinar mediante espectroscopía de RMN en solución. [5]

La mayoría de las separaciones de proteínas se realizan utilizando un sistema tampón "discontinuo" (o DISC) que mejora significativamente la nitidez de las bandas dentro del gel. Durante la electroforesis en un sistema de gel discontinuo, se forma un gradiente de iones en la etapa inicial de la electroforesis que hace que todas las proteínas se enfoquen en una sola banda nítida. La formación del gradiente de iones se logra eligiendo un valor de pH en el que los iones del tampón se cargan solo moderadamente en comparación con las proteínas recubiertas con SDS. Estas condiciones proporcionan un entorno en el que las reacciones de Kohlrausch determinan la conductividad molar. Como resultado, las proteínas recubiertas de SDS se concentran varias veces en una zona delgada del orden de 19 μm en unos pocos minutos. En esta etapa, todas las proteínas migran a la misma velocidad de migración por isotacoforesis. Esto ocurre en una región del gel que tiene poros más grandes para que la matriz del gel no retarde la migración durante el evento de enfoque o "apilamiento". [6] [7] La ​​separación de las proteínas por tamaño se logra en la región inferior de "resolución" del gel. El gel de resolución normalmente tiene un tamaño de poro mucho más pequeño, lo que conduce a un efecto de tamizado que ahora determina la movilidad electroforética de las proteínas. Al mismo tiempo, la parte de separación del gel también tiene un valor de pH en el que los iones tampón en promedio tienen una carga mayor, lo que hace que "superen" las proteínas cubiertas con SDS y eliminen el gradiente iónico y, por lo tanto, el efecto de apilamiento.

Un sistema tampón discontinuo muy extendido es el sistema de tris-glicina o "Laemmli" que se apila a un pH de 6,8 y se resuelve a un pH de

8.3-9.0. Un inconveniente de este sistema es que estos valores de pH pueden promover la formación de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína en las proteínas porque el pKa de la cisteína varía de 8 a 9 y porque el agente reductor presente en el tampón de carga no co-migra con las proteínas. Los avances recientes en la tecnología de amortiguación alivian este problema resolviendo las proteínas a un pH muy por debajo del pKa de la cisteína (p. Ej., Bis-tris, pH 6,5) e incluyen agentes reductores (p. Ej., Bisulfito de sodio) que se mueven hacia el gel antes que las proteínas para mantener un ambiente reductor. Un beneficio adicional de usar tampones con valores de pH más bajos es que el gel de acrilamida es más estable a valores de pH más bajos, por lo que los geles se pueden almacenar durante largos períodos de tiempo antes de su uso. [8] [9]

Electroforesis en gel de gradiente SDS de proteínas Editar

A medida que se aplica voltaje, los aniones (y las moléculas de muestra cargadas negativamente) migran hacia el electrodo positivo (ánodo) en la cámara inferior, el ion principal es Cl - (alta movilidad y alta concentración). El glicinato es el ión de arrastre (baja movilidad y baja concentración). concentración). Las partículas de proteína SDS no migran libremente en el límite entre el Cl - del tampón de gel y el Gly - del tampón del cátodo. Friedrich Kohlrausch descubrió que la ley de Ohm también se aplica a los electrolitos disueltos. Debido a la caída de voltaje entre los tampones de Cl y glicina, las proteínas se comprimen (apilan) en capas delgadas de un micrómetro. [10] El límite se mueve a través de un gradiente de poros y la pila de proteínas se dispersa gradualmente debido a un aumento de la resistencia a la fricción de la matriz de gel. El apilamiento y desapilamiento ocurre continuamente en el gel de gradiente, para cada proteína en una posición diferente. Para un desapilamiento completo de proteínas, la concentración de gel de poliacrilamida debe exceder el 16% T. El sistema de dos geles de "Laemmli" es un gel de gradiente simple. La discontinuidad del pH de los tampones no tiene importancia para la calidad de la separación y no se necesita un "gel de apilamiento" con un pH diferente.

La mancha de proteína más popular es Coomassie Brilliant Blue. Es un colorante aniónico, que se une de manera no específica a las proteínas. Las proteínas del gel se fijan con ácido acético y se tiñen simultáneamente. El exceso de tinte incorporado al gel puede eliminarse decolorando con la misma solución sin tinte. Las proteínas se detectan como bandas azules sobre un fondo claro.

Cuando se necesita un método más sensible que la tinción de Coomassie, se suele utilizar la tinción con plata. La tinción con plata es un procedimiento sensible para detectar trazas de proteínas en geles, pero también puede visualizar ácidos nucleicos o polisacáridos.

Los métodos de visualización sin utilizar un tinte como Coomassie y plata están disponibles en el mercado. Por ejemplo, Bio-Rad Laboratories comercializa geles "sin manchas" para electroforesis en gel SDS-PAGE. Alternativamente, se pueden usar tintes fluorescentes reversibles de Azure Biosystems como AzureRed o Azure TotalStain Q.

Del mismo modo que en la electroforesis en gel de ácido nucleico, tinte de seguimiento se utiliza a menudo. Los colorantes aniónicos de movilidad electroforética conocida se incluyen normalmente en el tampón de muestra. Un tinte de rastreo muy común es el azul de bromofenol. Este tinte está coloreado a pH alcalino y neutro y es una pequeña molécula cargada negativamente que se mueve hacia el ánodo. Al ser una molécula de gran movilidad, se adelanta a la mayoría de las proteínas.


3.1: Electroforesis en gel

  • Contribuido por Michael Blaber
  • Profesor (Ciencias Biomédicas) en Florida State University

La electroforesis en gel se utiliza para caracterizar una de las propiedades más básicas, la masa molecular, tanto de los polinucleótidos como de los polipéptidos. La electroforesis en gel también se puede utilizar para determinar: (1) la pureza de estas muestras, (2) heterogeneidad / extensión de degradación, y (3) subunidad composición.

El material de electroforesis en gel más común para moléculas de ADN es agarosa y acrilamida.

Geles de agarosa de ADN

La tasa de migración electroforética del ADN a través de geles de agarosa depende de cuatro parámetros principales:

1. El tamaño molecular del ADN. Las moléculas de ADN dúplex lineal viajan a través de geles de agarosa a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular.

Ejemplo: Compare la masa molecular con la tasa de migración esperada:

1 / log (Molec. Masa)
es decir, relativo Sr.

Figura 3.1.1:Tasa de migración relativa con masa molecular

2. El concentración de agarosa. Existe una relación lineal inversa entre el logaritmo de la movilidad electroforética y la concentración de gel.

inv log (1 / Gel%) (es decir, Mr relativo)

Figura 3.1.2:Tasa de migración relativa con concentración de gel

3. La conformación del ADN.

  • ADN circular cerradopara mi) - típicamente superenrollado
  • circular melladaformulario-II)
  • ADN linealformulario-III)

Estas diferentes formas de mismo ADN migran a diferentes velocidades a través de un gel de agarosa. Casi siempre el forma lineal (formulario-III) migra en el el más lento tasa de las tres formas y el ADN superenrollado (forma-I) generalmente migra el lo más rápido.

4. La aplicada Voltaje.

Rango de separación de ADN lineal (en kilobases)

Finalmente, el ADN es un molécula ácida, migra hacia el afirmativamente electrodo cargadocátodo).

Figura 3.1.3:Configuración de electroforesis en gel

Geles de acrilamida de ADN

Los geles de acrilamida son útiles para la separación de pequeños fragmentos de ADN típicamente oligonucleótidos & lt100 pares de bases. Estos geles suelen ser de un baja concentración de acrilamida (& lt = 6%) y contienen el no iónico agente desnaturalizante Urea (6 M). El agente desnaturalizante previene la formación de estructuras secundarias en oligonucleótidos y permite una determinación relativamente precisa de la masa molecular.

Electroforesis en gel para proteínas

La electroforesis en gel de proteínas utiliza casi exclusivamente poliacrilamida. La solución de acrilamida generalmente contiene dos componentes: acrilamida y bis acrilamida. Un valor típico para la relación acrilamida: bis es 19: 1. La bis acrilamida es esencialmente una reticulación componente del polímero de acrilamida. los total La concentración de acrilamida en el gel afecta la migración de proteínas a través de la matriz (como ocurre con la concentración de agarosa).

Los geles de proteínas se suelen realizar bajo condiciones desnaturalizantes en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Las proteínas se desnaturalizan mediante calor en presencia de SDS. El SDS se une, a través de interacciones hidrofóbicas, a las proteínas en una cantidad aproximadamente proporcional al tamaño de la proteína. Debido a la naturaleza cargada de la molécula de SDS, las proteínas tienen relación de carga constante a masa y migran a través del gel a una velocidad proporcional a su masa molecular.Las proteínas migran hacia el ánodo.

Rango de separación de polipéptidos (en kilodaltons)

Dado que el tratamiento con SDS disociará los complejos de proteínas no covalentes, pueden presentar una gran cantidad de lmás de lo esperado masa molecular en electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS PÁGINA). Los geles Protein PAGE generalmente se polimerizan entre dos placas de vidrio y se ejecutan en dirección vertical.


VINCULACIÓN ANTICUERPO

  • Anticuerpo primario: Después del bloqueo, la membrana se incuba en una solución que contiene el anticuerpo primario. El anticuerpo primario reconoce y se une al epítopo o la secuencia de aminoácidos específica de la proteína de interés.
  • Anticuerpo secundario: Después de lavar para eliminar el anticuerpo primario no unido, se agrega el anticuerpo secundario. El anticuerpo secundario reconoce al anticuerpo primario. Los anticuerpos secundarios utilizados para la transferencia Western se conjugan típicamente con una enzima; las enzimas más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina (AP).

Nota: Algunos anticuerpos primarios se conjugan directamente con HRP, lo que elimina la necesidad de los pasos de incubación de anticuerpos secundarios. En este caso, es posible proceder a la detección después de la incubación del anticuerpo primario y los enjuagues posteriores. Si se desea eliminar el paso del anticuerpo secundario, Novus ofrece anticuerpos primarios conjugados con HRP y kits de marcado de anticuerpos Lightning-Link, que se pueden usar para conjugar un anticuerpo primario no marcado con HRP u otros conjugados deseados.


Contenido

SDS-PAGE es un método de electroforesis que permite la separación de proteínas por masa. El medio (también denominado "matriz") es un gel discontinuo a base de poliacrilamida. El gel de poliacrilamida se intercala típicamente entre dos placas de vidrio en una placa de gel. Aunque los geles de tubo (en cilindros de vidrio) se usaron históricamente, rápidamente se volvieron obsoletos con la invención de los geles en placa más convenientes. [3] Además, se utiliza SDS (dodecil sulfato de sodio). Aproximadamente 1,4 gramos de SDS se unen a un gramo de proteína, [4] [5] [6] correspondientes a una molécula de SDS por dos aminoácidos. El SDS actúa como tensioactivo, enmascarando la carga intrínseca de las proteínas y confiriéndoles proporciones de carga a masa muy similares. Las cargas intrínsecas de las proteínas son insignificantes en comparación con la carga de SDS, y las cargas positivas también se reducen en gran medida en el rango de pH básico de un gel de separación. Tras la aplicación de un campo eléctrico constante, la proteína migra hacia el ánodo, cada uno con una velocidad diferente, dependiendo de su masa. Este sencillo procedimiento permite una separación precisa de proteínas por masa.

El SDS tiende a formar micelas esféricas en soluciones acuosas por encima de una cierta concentración llamada concentración micelar crítica (CMC). Por encima de la concentración micelar crítica de 7 a 10 milimolar en soluciones, el SDS se produce simultáneamente como moléculas individuales (monómero) y como micelas, por debajo de la CMC SDS aparece solo como monómeros en soluciones acuosas. En la concentración micelar crítica, una micela consta de aproximadamente 62 moléculas de SDS. [7] Sin embargo, solo los monómeros de SDS se unen a proteínas a través de interacciones hidrofóbicas, mientras que las micelas de SDS son aniónicas en el exterior y no adsorben ninguna proteína. [4] El SDS es de naturaleza anfipática, lo que le permite desplegar secciones polares y no polares de la estructura de la proteína. [8] In SDS concentrations above 0.1 millimolar, the unfolding of proteins begins, [4] and above 1 mM, most proteins are denatured. [4] Due to the strong denaturing effect of SDS and the subsequent dissociation of protein complexes, quaternary structures can generally not be determined with SDS. Exceptions are proteins that are stabilised by covalent cross-linking e.g. -S-S- linkages and the SDS-resistant protein complexes, which are stable even in the presence of SDS (the latter, however, only at room temperature). To denature the SDS-resistant complexes a high activation energy is required, which is achieved by heating. SDS resistance is based on a metastability of the protein fold. Although the native, fully folded, SDS-resistant protein does not have sufficient stability in the presence of SDS, the chemical equilibrium of denaturation at room temperature occurs slowly. Stable protein complexes are characterised not only by SDS resistance but also by stability against proteases and an increased biological half-life. [9]

Alternatively, polyacrylamide gel electrophoresis can also be performed with the cationic surfactants CTAB in a CTAB-PAGE, [10] [11] [12] or 16-BAC in a BAC-PAGE. [13]

The SDS-PAGE method is composed of gel preparation, sample preparation, electrophoresis, protein staining or western blotting and analysis of the generated banding pattern.

Gel production Edit

When using different buffers in the gel (discontinuous gel electrophoresis), the gels are made up to one day prior to electrophoresis, so that the diffusion does not lead to a mixing of the buffers. The gel is produced by radical polymerisation in a mold consisting of two sealed glass plates with spacers between the glass plates. In a typical mini-gel setting, the spacers have a thickness of 0.75 mm or 1.5 mm, which determines the loading capacity of the gel. For pouring the gel solution, the plates are usually clamped in a stand which temporarily seals the otherwise open underside of the glass plates with the two spacers. For the gel solution, acrylamide is mixed as gel-former (usually 4% V/V in the stacking gel and 10-12 % in the separating gel), methylenebisacrylamide as a cross-linker, stacking or separating gel buffer, water and SDS. By adding the catalyst TEMED and the radical initiator ammonium persulfate (APS) the polymerisation is started. The solution is then poured between the glass plates without creating bubbles. Depending on the amount of catalyst and radical starter and depending on the temperature, the polymerisation lasts between a quarter of an hour and several hours. The lower gel (separating gel) is poured first and covered with a few drops of a barely water-soluble alcohol (usually buffer-saturated butanol or isopropanol), which eliminates bubbles from the meniscus and protects the gel solution of the radical scavenger oxygen. After the polymerisation of the separating gel, the alcohol is discarded and the residual alcohol is removed with filter paper. After addition of APS and TEMED to the stacking gel solution, it is poured on top of the solid separation gel. Afterwards, a suitable sample comb is inserted between the glass plates without creating bubbles. The sample comb is carefully pulled out after polymerisation, leaving pockets for the sample application. For later use of proteins for protein sequencing, the gels are often prepared the day before electrophoresis to reduce reactions of unpolymerised acrylamide with cysteines in proteins.

By using a gradient mixer, gradient gels with a gradient of acrylamide (usually from 4 to 12%) can be cast, which have a larger separation range of the molecular masses. [14] Commercial gel systems (so-called pre-cast gels) usually use the buffer substance Bis-tris methane with a pH value between 6.4 and 7.2 both in the stacking gel and in the separating gel. [15] [16] These gels are delivered cast and ready-to-use. Since they use only one buffer (continuous gel electrophoresis) and have a nearly neutral pH, they can be stored for several weeks. The more neutral pH slows the hydrolysis and thus the decomposition of the polyacrylamide. Furthermore, there are fewer acrylamide-modified cysteines in the proteins. [15] Due to the constant pH in collecting and separating gel there is no stacking effect. Proteins in BisTris gels can not be stained with ruthenium complexes. [17] This gel system has a comparatively large separation range, which can be varied by using MES or MOPS in the running buffer. [15]

Sample preparation Edit

During sample preparation, the sample buffer, and thus SDS, is added in excess to the proteins, and the sample is then heated to 95 °C for five minutes, or alternatively 70 °C for ten minutes. Heating disrupts the secondary and tertiary structures of the protein by disrupting hydrogen bonds and stretching the molecules. Optionally, disulfide bridges can be cleaved by reduction. For this purpose, reducing thiols such as β-mercaptoethanol (β-ME, 5% by volume), dithiothreitol (DTT, 10 millimolar) or dithioerythritol (DTE, 10 millimolar) are added to the sample buffer. After cooling to room temperature, each sample is pipetted into its own well in the gel, which was previously immersed in electrophoresis buffer in the electrophoresis apparatus.

In addition to the samples, a molecular-weight size marker is usually loaded onto the gel. This consists of proteins of known sizes and thereby allows the estimation (with an error of ± 10%) of the sizes of the proteins in the actual samples, which migrate in parallel in different tracks of the gel. [18] The size marker is often pipetted into the first or last pocket of a gel.

Electrophoresis Edit

For separation, the denatured samples are loaded onto a gel of polyacrylamide, which is placed in an electrophoresis buffer with suitable electrolytes. Thereafter, a voltage (usually around 100 V, 10-20 V per cm gel length) is applied, which causes a migration of negatively charged molecules through the gel in the direction of the positively charged anode. The gel acts like a sieve. Small proteins migrate relatively easily through the mesh of the gel, while larger proteins are more likely to be retained and thereby migrate more slowly through the gel, thereby allowing proteins to be separated by molecular size. The electrophoresis lasts between half an hour to several hours depending on the voltage and length of gel used.

The fastest-migrating proteins (with a molecular weight of less than 5 kDa) form the buffer front together with the anionic components of the electrophoresis buffer, which also migrate through the gel. The area of the buffer front is made visible by adding the comparatively small, anionic dye bromophenol blue to the sample buffer. Due to the relatively small molecule size of bromophenol blue, it migrates faster than proteins. By optical control of the migrating colored band, the electrophoresis can be stopped before the dye and also the samples have completely migrated through the gel and leave it.

The most commonly used method is the discontinuous SDS-PAGE. In this method, the proteins migrate first into a collecting gel with neutral pH, in which they are concentrated and then they migrate into a separating gel with basic pH, in which the actual separation takes place. Stacking and separating gels differ by different pore size (4-6 % T and 10-20 % T), ionic strength and pH values (pH 6.8 or pH 8.8). The electrolyte most frequently used is an SDS-containing Tris-glycine-chloride buffer system. At neutral pH, glycine predominantly forms the zwitterionic form, at high pH the glycines lose positive charges and become predominantly anionic. In the collection gel, the smaller, negatively charged chloride ions migrate in front of the proteins (as leading ions) and the slightly larger, negatively and partially positively charged glycinate ions migrate behind the proteins (as initial trailing ions), whereas in the comparatively basic separating gel both ions migrate in front of the proteins. The pH gradient between the stacking and separation gel buffers leads to a stacking effect at the border of the stacking gel to the separation gel, since the glycinate partially loses its slowing positive charges as the pH increases and then, as the former trailing ion, overtakes the proteins and becomes a leading ion, which causes the bands of the different proteins (visible after a staining) to become narrower and sharper - the stacking effect. For the separation of smaller proteins and peptides, the TRIS-Tricine buffer system of Schägger and von Jagow is used due to the higher spread of the proteins in the range of 0.5 to 50 kDa. [19]

Gel staining Edit

At the end of the electrophoretic separation, all proteins are sorted by size and can then be analyzed by other methods, e. gramo. protein staining such as Coomassie staining (most common and easy to use), [20] [21] silver staining (highest sensitivity), [22] [23] [24] [25] [26] [27] stains all staining, Amido black 10B staining, [21] Fast green FCF staining, [21] fluorescent stains such as epicocconone stain [28] and SYPRO orange stain, [29] and immunological detection such as the Western Blot. [30] [31] The fluorescent dyes have a comparatively higher linearity between protein quantity and color intensity of about three orders of magnitude above the detection limit, i. mi. the amount of protein can be estimated by color intensity. When using the fluorescent protein dye trichloroethanol, a subsequent protein staining is omitted if it was added to the gel solution and the gel was irradiated with UV light after electrophoresis. [32] [33]

In Coomassie Staining, Gel is Fixed in a 50% ethanol 10% glacial acetic acid solution for 1 hr. Then the solution is changed for fresh one and after 1 to 12 hrs Gel is changed to a Staining solution (50% methanol, 10% Glacial acetic Acid, 0.1% Coomassie Brilliant Blue) followed by destaining changing several times a destaining solution of 40% methanol, 10% glacial acetic acid.

Análisis Editar

Protein staining in the gel creates a documentable banding pattern of the various proteins. Glycoproteins have differential levels of glycosylations and adsorb SDS more unevenly at the glycosylations, resulting in broader and blurred bands. [34] Membrane proteins, because of their transmembrane domain, are often composed of the more hydrophobic amino acids, have lower solubility in aqueous solutions, tend to bind lipids, and tend to precipitate in aqueous solutions due to hydrophobic effects when sufficient amounts of detergent are not present. This precipitation manifests itself for membrane proteins in a SDS-PAGE in "tailing" above the band of the transmembrane protein. In this case, more SDS can be used (by using more or more concentrated sample buffer) and the amount of protein in the sample application can be reduced. An overloading of the gel with a soluble protein creates a semicircular band of this protein (e. g. in the marker lane of the image at 66 kDa), allowing other proteins with similar molecular weights to be covered. A low contrast (as in the marker lane of the image) between bands within a lane indicates either the presence of many proteins (low purity) or, if using purified proteins and a low contrast occurs only below one band, it indicates a proteolytic degradation of the protein, which first causes degradation bands, and after further degradation produces a homogeneous color ("smear") below a band. [35] The documentation of the banding pattern is usually done by photographing or scanning. For a subsequent recovery of the molecules in individual bands, a gel extraction can be performed.

Archiving Edit

After protein staining and documentation of the banding pattern, the polyacrylamide gel can be dried for archival storage. Proteins can be extracted from it at a later date. The gel is either placed in a drying frame (with or without the use of heat) or in a vacuum dryer. The drying frame consists of two parts, one of which serves as a base for a wet cellophane film to which the gel and a one percent glycerol solution are added. Then a second wet cellophane film is applied bubble-free, the second frame part is put on top and the frame is sealed with clips. The removal of the air bubbles avoids a fragmentation of the gel during drying. The water evaporates through the cellophane film. In contrast to the drying frame, a vacuum dryer generates a vacuum and heats the gel to about 50 °C.

For a more accurate determination of the molecular weight, the relative migration distances of the individual protein bands are measured in the separating gel. [36] [37] The measurements are usually performed in triplicate for increased accuracy. The relative mobility (called Rf value or Rm value) is the quotient of the distance of the band of the protein and the distance of the buffer front. The distances of the bands and the buffer front are each measured from the beginning of the separation gel. The distance of the buffer front roughly corresponds to the distance of the bromophenol blue contained in the sample buffer. The relative distances of the proteins of the size marker are plotted semi-logarithmically against their known molecular weights. By comparison with the linear part of the generated graph or by a regression analysis, the molecular weight of an unknown protein can be determined by its relative mobility. Bands of proteins with glycosylations can be blurred. [34] Proteins with many basic amino acids (e. g. histones) [38] can lead to an overestimation of the molecular weight or even not migrate into the gel at all, because they move slower in the electrophoresis due to the positive charges or even to the opposite direction. Accordingly, many acidic amino acids can lead to accelerated migration of a protein and an underestimation of its molecular mass. [39]

The SDS-PAGE in combination with a protein stain is widely used in biochemistry for the quick and exact separation and subsequent analysis of proteins. It has comparatively low instrument and reagent costs and is an easy-to-use method. Because of its low scalability, it is mostly used for analytical purposes and less for preparative purposes, especially when larger amounts of a protein are to be isolated.

Additionally, SDS-PAGE is used in combination with the western blot for the determination of the presence of a specific protein in a mixture of proteins - or for the analysis of post-translational modifications. Post-translational modifications of proteins can lead to a different relative mobility (i.e. a band shift) or to a change in the binding of a detection antibody used in the western blot (i.e. a band disappears or appears).

In mass spectrometry of proteins, SDS-PAGE is a widely used method for sample preparation prior to spectrometry, mostly using in-gel digestion. In regards to determining the molecular mass of a protein, the SDS-PAGE is a bit more exact than an analytical ultracentrifugation, but less exact than a mass spectrometry or - ignoring post-translational modifications - a calculation of the protein molecular mass from the DNA sequence.

In medical diagnostics, SDS-PAGE is used as part of the HIV test and to evaluate proteinuria. In the HIV test, HIV proteins are separated by SDS-PAGE and subsequently detected by Western Blot with HIV-specific antibodies of the patient, if they are present in his blood serum. SDS-PAGE for proteinuria evaluates the levels of various serum proteins in the urine, e.g. Albumin, Alpha-2-macroglobulin and IgG.

SDS-PAGE is the most widely used method for gel electrophoretic separation of proteins. Two-dimensional gel electrophoresis sequentially combines isoelectric focusing or BAC-PAGE with a SDS-PAGE. Native PAGE is used if native protein folding is to be maintained. For separation of membrane proteins, BAC-PAGE or CTAB-PAGE may be used as an alternative to SDS-PAGE. For electrophoretic separation of larger protein complexes, agarose gel electrophoresis can be used, e.g. the SDD-AGE. Some enzymes can be detected via their enzyme activity by zymography.

While being one of the more precise and low-cost protein separation and analysis methods, the SDS-PAGE denatures proteins. Where non-denaturing conditions are necessary, proteins are separated by a native PAGE or different chromatographic methods with subsequent photometric quantification, for example affinity chromatography (or even tandem affinity purification), size exclusion chromatography, ion exchange chromatography. [40] Proteins can also be separated by size in a tangential flow filtration [41] or an ultrafiltration. [42] Single proteins can be isolated from a mixture by affinity chromatography or by a pull-down assay. Some historically early and cost effective but crude separation methods usually based upon a series of extractions and precipitations using kosmotropic molecules, for example the ammonium sulfate precipitation and the polyethyleneglycol precipitation.

In 1948, Arne Tiselius was awarded the Nobel Prize in Chemistry for the discovery of the principle of electrophoresis as the migration of charged and dissolved atoms or molecules in an electric field. [43] The use of a solid matrix (initially paper discs) in a zone electrophoresis improved the separation. The discontinuous electrophoresis of 1964 by L. Ornstein and B. J. Davis made it possible to improve the separation by the stacking effect. [44] The use of cross-linked polyacrylamide hydrogels, in contrast to the previously used paper discs or starch gels, provided a higher stability of the gel and no microbial decomposition. The denaturing effect of SDS in continuous polyacrylamide gels and the consequent improvement in resolution was first described in 1965 by David F. Summers in the working group of James E. Darnell to separate poliovirus proteins. [45] The current variant of the SDS-PAGE was described in 1970 by Ulrich K. Laemmli and initially used to characterise the proteins in the head of bacteriophage T4. [1] This Laemmli paper is widely cited for the invention of modern SDS-PAGE, but the technique was actually invented by Jake Maizel, who was doing a sabbatical in the MRC laboratory when Laemmli joined the lab as a postdoctoral fellow. Maizel shared his prior technology with Laemmli and together they made further improvements. Laemmli and Maizel had planned to follow up with a Methods paper but this never materialized. Maizel recounts the history of development of SDS-PAGE in brief commentary. [46]


Cell staining techniques and preparation depend on the type of stain and analysis used. One or more of the following procedures may be required to prepare a sample:

  • Permeabilization - treatment of cells, generally with a mild surfactant, which dissolves cell membranes in order to allow larger dye molecules to enter inside the cell.
  • Fijación - serves to "fix" or preserve cell or tissue morphology through the preparation process. This process may involve several steps, but most fixation procedures involve adding a chemical fixative that creates chemical bonds between proteins to increase their rigidity. Common fixatives include formaldehyde, ethanol, methanol, and/or picric acid.
  • Mounting - involves attaching samples to a glass microscope slide for observation and analysis. Cells may either be grown directly to the slide or loose cells can be applied to a slide using a sterile technique. Thin sections (slices) of material such as tissue may also be applied to a microscope slide for observation.
  • Staining - application of stain to a sample to color cells, tissues, components, or metabolic processes. This process may involve immersing the sample (before or after fixation or mounting) in a dye solution and then rinsing and observing the sample under a microscope. Some dyes require the use of a mordant, which is a chemical compound that reacts with the stain to form an insoluble, colored precipitate. The mordanted stain will remain on/in the sample when excess dye solution is washed away.

Non-specific or unexpected bands

Unsuitable blocking buffer for experiment

The blocker you use may affect background bands. If you encounter high background or unexpected bands, try a different blocker. For tips on how to choose an appropriate blocker, get the Western Blot Blocker Optimization for Near-Infrared Detection protocol.

Antibody cross-reactivity in a two-color Western blot

In two-color Western blots, antibody cross-reactivity is always a possibility. To avoid cross-reactivity:

  • Detect the two secondary antibodies on two separate blots first. See what each channel looks like individually before you detect the two secondary antibodies together on the same blot, to help you know what bands to expect and where to expect them.
  • Use secondary antibodies from the same host species to avoid potential cross-reactivity.
  • Avoid using mouse and rat primary antibodies together if possible. Because the species are so closely related, anti-mouse will react with rat IgG to some extent, and anti-rat with mouse IgG. Sheep and goat antibodies will also cross-react.
  • Use only highly cross-adsorbed secondary antibodies, like the IRDye Secondary Antibodies.
  • Use less secondary antibody to minimize cross-reactivity – a good starting dilution is 1:20,000. Dilute between 1:10,000 – 1:40,000 for optimal performance.

Too much antibody

  • Use the supplier’s lowest recommended amount of antibody.
  • Reduce antibody incubation time to 1 hour at room temperature.
  • Dilute antibodies in the same blocking solution that you used to block the blot.
  • Include Tween 20 at 0.2%.
  • For PVDF membranes, add or increase SDS in diluted secondary antibodies.

Signal bleed from one channel to the other

Check your fluorescent dye. Fluorophores like Alexa Fluor ® 750 may appear in both channels (700 nm and 800 nm) and are not recommended for use with Odyssey Imaging Systems.

If signal in one channel is very strong (near or at saturation), it may cause signal in one channel to bleed to the other channel. Minimize this by using a lower scan intensity setting in the channel that had strong signal. If you have an Odyssey CLx Imaging System, try the AutoScan mode.

Reduce signal by reducing the amount of protein loaded or the amount of antibody. A dilution series of each will also help you save on sample and antibody.


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