Información

3.3F: Microscopía electrónica - Biología


Objetivos de aprendizaje

  • Describir la técnica empleada para la microscopía electrónica, distinguiendo entre diferentes tipos.

La microscopía electrónica utiliza un haz de electrones como fuente de energía. Un haz de electrones tiene una longitud de onda excepcionalmente corta y puede golpear la mayoría de los objetos en su camino, aumentando la resolución de la imagen final capturada. El haz de electrones está diseñado para viajar en el vacío para limitar la interferencia de las moléculas de aire. Los imanes se utilizan para enfocar los electrones en el objeto visto.

Hay dos tipos de microscopios electrónicos. La forma más tradicional es el microscopio electrónico de transmisión (TEM). Para utilizar este instrumento, se colocan rebanadas ultrafinas de microorganismos o virus en una rejilla de alambre y luego se tiñen con oro o paladio antes de verlas, para crear contraste. Las partes densamente recubiertas de la muestra desvían el haz de electrones y aparecen en la imagen las áreas oscuras y claras. TEM puede proyectar imágenes en una resolución mucho más alta, hasta el nivel atómico de objetos más delgados.

La segunda y más actual forma es el microscopio electrónico de barrido (SEM). Permite la visualización de microorganismos en tres dimensiones ya que los electrones se reflejan al pasar sobre la muestra. Se emplea la misma tinción con oro o paladio.

La microscopía electrónica tiene múltiples aplicaciones. Es ideal para:

  • explorar los mecanismos moleculares de la enfermedad in vivo;
  • visualizar la arquitectura tridimensional de tejidos y células;
  • determinar la conformación de estructuras y complejos proteicos flexibles;
  • observar virus individuales y complejos macromoleculares en su contexto biológico natural.

La preparación de la muestra puede ser fundamental para generar una imagen exitosa porque la elección de los reactivos y los métodos utilizados para procesar una muestra depende en gran medida de la naturaleza de la muestra y del análisis requerido.

Puntos clave

  • Se usa un haz de electrones, en lugar de luz, con un microscopio electrónico.
  • Los microscopios electrónicos tienen un aumento mayor porque las longitudes de onda de los electrones son mucho más pequeñas que las de la luz visible (0,005 nm frente a 500 nm respectivamente, cien mil veces más pequeñas).
  • Hay dos tipos de microscopios electrónicos, de barrido y de transmisión.
  • Los mejores microscopios de luz compuestos pueden aumentar 2000x, los microscopios electrónicos pueden aumentar hasta 100,000x.

Términos clave

  • rayo de electrones: una corriente de electrones observada en tubos de vacío.

Ciencia de los Materiales

El campo interdisciplinario de ciencia de los Materiales, también comúnmente llamado Ciencia e Ingeniería de los Materiales, cubre el diseño y descubrimiento de nuevos materiales, particularmente sólidos. Los orígenes intelectuales de la ciencia de los materiales se remontan a la Ilustración, cuando los investigadores comenzaron a utilizar el pensamiento analítico de la química, la física y la ingeniería para comprender las observaciones fenomenológicas antiguas en la metalurgia y la mineralogía. [1] [2] La ciencia de los materiales todavía incorpora elementos de la física, la química y la ingeniería. Como tal, el campo fue considerado durante mucho tiempo por las instituciones académicas como un subcampo de estos campos relacionados. A partir de la década de 1940, la ciencia de los materiales comenzó a ser más ampliamente reconocida como un campo específico y distinto de la ciencia y la ingeniería, y las principales universidades técnicas de todo el mundo crearon escuelas dedicadas a su estudio.

Los científicos de materiales enfatizan la comprensión, cómo la historia de un material (Procesando) influye en su estructura y, por tanto, en las propiedades y el rendimiento del material. La comprensión de las relaciones procesamiento-estructura-propiedades se denomina paradigma de materiales. Este paradigma se utiliza para avanzar en la comprensión en una variedad de áreas de investigación, incluidas la nanotecnología, los biomateriales y la metalurgia.

La ciencia de los materiales también es una parte importante de la ingeniería forense y el análisis de fallas: la investigación de materiales, productos, estructuras o componentes que fallan o no funcionan según lo previsto, causan lesiones personales o daños a la propiedad. Tales investigaciones son clave para comprender, por ejemplo, las causas de varios accidentes e incidentes de aviación.


Microscopio electrónico y de luz correlativa integrado por SECOM

La plataforma SECOM es una solución integrada única para microscopía correlativa de luz y electrónica que le permite realizar microscopía correlativa extremadamente rápido con la más alta calidad óptica y precisión de superposición. La combinación del poder de etiquetado de las imágenes de fluorescencia y la información estructural de alta resolución de la microscopía electrónica hace que la microscopía correlativa sea la herramienta perfecta para estudiar la compleja relación entre forma y función en biología.

El SECOM es el único producto hasta la fecha que integra microscopía electrónica de barrido y de fluorescencia en un solo dispositivo al equipar un microscopio electrónico de barrido (SEM) con un microscopio de fluorescencia invertido. La plataforma se puede instalar en un SEM reemplazando la puerta de la cámara del SEM. Este reemplazo admite una platina motorizada y el objetivo y la trayectoria de la luz para el microscopio óptico.

Gracias a su diseño integrado, el cambio de la fluorescencia a la imagen electrónica es perfecto e instantáneo. Y con el procedimiento de alineación automatizado, está obteniendo imágenes directamente de la ubicación correcta con alta resolución. La plataforma SECOM viene con un paquete de software intuitivo que está diseñado para adquirir fácilmente ambos tipos de información. El paquete de software también puede controlar la etapa SECOM y la configuración del microscopio electrónico.

La plataforma SECOM se puede integrar fácilmente en el flujo de trabajo existente y actúa como un microscopio óptico de gama alta totalmente equipado, sin comprometer el rendimiento óptico o electrónico.


Resultados

Diseño e implementación de FerriTagging

FerriTagging implica la creación de una partícula de ferritina (FerriTag) que se puede unir de forma inducible a una proteína de interés utilizando el sistema de heterodimerización FKBP-rapamicina-FRB (Fig. 1a). Para hacer esto, FerriTag se coexpresa con la proteína de interés que se fusiona con FKBP-GFP. FerriTag es FTL sin etiquetar y FRB-mCherry-FTH1 transfectado en una proporción de 4: 1. Cuando se añade rapamicina, induce la heterodimerización de los dominios FKBP y FRB dando como resultado que la proteína diana se convierta en FerriTagged (Fig. 1a).

Diseño e implementación de FerriTagging. a Diagrama esquemático de la cadena ligera de clatrina FerriTagging. Expresión simultánea de cadena ligera de clatrina marcada con FerriTag y GFP-FKBP. La adición de rapamicina induce la heterodimerización de los dominios FKBP y FRB dando como resultado el FerriTagging de clatrina en una vesícula recubierta de clatrina. B Imágenes fijas de imágenes de células vivas de la cadena ligera de clatrina FerriTagging. Se añadió rapamicina (200 nM) en el punto de tiempo cero, como indica la barra naranja. Se puede observar inmediatamente el etiquetado específico y rápido de clatrina por FerriTag. Tiempo, min: seg, barra de escala, 10 μm. Los zoom muestran una expansión de × 4. Ver película complementaria 1. C Fluorescencia de FerriTag (mCherry) en puntos positivos para GFP-FKBP-LCa en función del tiempo. El trazo rojo y el sombreado indican la media ± s.e.m. para 5 celdas. Se aplicó rapamicina como indica la barra naranja. D Imágenes típicas de la captación de transferrina (Tf-647, azul) en células HeLa que expresan FerriTag (rojo) y GFP-FKBP-LCa (verde). Se aplica rapamicina (200 nM) o control como se indica mediante barras de color naranja claro y oscuro, respectivamente. Se muestra el control negativo de sacarosa hipertónica para bloquear CME (violeta). Barra de escala, 10 μm. mi Gráfico de puntos de dispersión de la absorción de transferrina. Los puntos representan mediciones de células individuales, de dos experimentos independientes, las barras muestran la media ± DE

Nuestro intento inicial de utilizar ferritina como etiqueta implicó la fusión directa de FTH1 a una proteína de interés, similar a un sistema bacteriano descrito anteriormente [9]. Las células de mamífero que expresan mCherry-FTH1 fusionadas a la secuencia de direccionamiento mitocondrial de Tom70p se cultivaron en condiciones ricas en hierro y luego se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia (véase la nota complementaria 1). Estaba claro que esta fusión directa dio como resultado la agregación y la ubicación incorrecta de las mitocondrias, muy probablemente debido a la naturaleza multivalente de la molécula de ferritina. Esta observación nos llevó a diseñar una nueva etiqueta de ferritina que podría formar una partícula de ferritina de forma independiente y luego agregarse de manera inducible a una proteína de interés para evitar tales problemas de agregación. La dilución de las subunidades FTH1 etiquetadas con FRB-mCherry con subunidades FTL no etiquetadas también es un paso importante porque se observó agregación cuando FRB-mCherry-FTH1 se expresó solo. El resultado de esta versión etiquetada diluida de ferritina no fue agregación ni mala localización antes o después de la adición de rapamicina (ver Fig. 1 complementaria).

Nuestra primera proteína objetivo para FerriTagging fue la clatrina. Se obtuvieron imágenes de células HeLa que expresan FerriTag y cadena ligera de clatrina a (LCa) marcadas con GFP y FKBP mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 1b). Estos experimentos muestran que, después de la adición de rapamicina (200 nM), el FerriTagging de estructuras recubiertas de clatrina ocurre en segundos (Fig. 1c). Se puede ver que la señal difusa de FerriTag decora específicamente las estructuras recubiertas de clatrina en toda la celda, con un etiquetado completo después de 30 s (Fig. 1b y película complementaria 1). También probamos si FerriTagging de clatrina inhibía su función endocítica. Para hacer esto, medimos la captación de transferrina en células donde la clatrina había sido FerriTagged y las comparamos con células de control sin tratamiento con rapamicina (Fig. 1d, e). No encontramos ninguna diferencia en la captación de transferrina, lo que sugiere que FerriTagging en una escala de tiempo corta (12 min) no interfiere en gran medida con la función de la clatrina. La inhibición de CME se pudo detectar fácilmente mediante el tratamiento previo de las células con sacarosa hipertónica (0,45 M). Con este enfoque funcionando, a continuación queríamos observar FerriTagging por EM.

Visualización de proteínas FerriTagged mediante microscopía electrónica

Para evaluar si FerriTagging funciona o no a nivel EM, utilizamos microscopía electrónica de luz correlativa (CLEM). Nuestro protocolo EM se optimizó para que pudiéramos distinguir fácilmente FerriTag del fondo y aún poder ver la ultraestructura celular (Fig. 2a). Inicialmente FerriTagged dos proteínas diferentes en ubicaciones dispares: 1) monoamino oxidasa (MAO), una proteína de la membrana mitocondrial externa, y 2) cadena ligera de clatrina a (LCa), parte del clatrin triskelion (Fig. 2b). Después de la adición de rapamicina, FerriTag se confirmó mediante microscopía de fluorescencia para marcar específicamente cada proteína de interés rápidamente. Después de la fijación y el procesamiento, se obtuvieron imágenes mediante EM de secciones de resina ultrafinas tomadas de la misma celda. En cada caso, las partículas densas en electrones de aproximadamente 7 nm de diámetro pudieron distinguirse fácilmente del fondo, y la ultraestructura de la célula fue visible. Pudimos localizar partículas específicamente en la vecindad de las mitocondrias (en el caso de MAO) o fosas y vesículas recubiertas de clatrina (en el caso de LCa) donde se localiza cada proteína de interés (Fig. 2b).

Visualización de proteínas FerriTagged mediante microscopía óptica y electrónica. a Descripción general de los pasos de preparación de muestras para correlacionar la microscopía óptica (LM) con la microscopía electrónica (EM) mediante FerriTag. B Micrografías de luz y electrónicas de células HeLa que coexpresan FerriTag con FKBP-GFP-Myc-MAO (MAO) o GFP-FKBP-LCa (LCa). Las imágenes del localizador (izquierda) garantizan que se pueda seguir la misma celda a lo largo del flujo de trabajo. Imágenes de células vivas de FerriTagging (centro), las células se trataron con rapamicina (200 nM) como indica la barra naranja llena. El último fotograma se muestra antes de que la celda se arreglara y procesara para CLEM como se describe en a. Las imágenes TEM (derecha) de secciones tomadas de la misma célula muestran partículas de FerriTag que marcan específicamente la proteína de interés etiquetada con GFP-FKBP en cada experimento CLEM. Se muestran dos partículas por micrografía expandidas a la derecha. Barra de escala de microscopía óptica de 10 μm y zoom × 12. Barra de escala de micrografía electrónica de 50 nm y zoom × 7,25. C Micrografías de electrones de células que expresan FerriTag y GFP-FKBP-LCa, control (naranja claro) o tratadas con rapamicina (naranja oscuro). Se indica la ubicación de las partículas visibles, ninguna en control, cuatro en las tratadas con rapamicina (círculos amarillos). Se registró la incidencia de partículas en las regiones citoplásmicas (azul) o en las regiones proximales a la membrana recubierta (rosa). Las regiones proximales a la membrana se definen como una zona de 50 nm en el lado citoplásmico de la membrana. Esta región se subdivide en áreas recubiertas y áreas donde no se ve una capa obvia. Las micrografías de ejemplo no tienen regiones proximales a la membrana sin revestir. Barra de escala, 100 nm. Derecha, diagrama de puntos de dispersión para mostrar la densidad de partículas en volúmenes citoplásmicos (cito, azul), de membrana (mem, gris) o recubiertos (capa, rosa), comparando el control (norteExp = 3) y células tratadas con rapamicina (norteExp = 4). Los volúmenes se calculan multiplicando el área por el grosor de la sección (consulte Análisis de imágenes en Métodos)

Dado que el protocolo FerriTagging CLEM implica la preincubación de células en medios complementados con hierro y el tratamiento posterior con rapamicina, exploramos si estos pasos perturbaban la biología celular normal (nota complementaria 2). Brevemente, encontramos condiciones para la preincubación de hierro en células HeLa que no eran tóxicas y no afectaban a la ultraestructura (Fig. 2 complementaria). El tratamiento con carga de hierro y rapamicina no afectó la localización de una serie de marcadores celulares que representan el citoesqueleto de actina, los lisosomas, las mitocondrias, las caveolas, el retículo endoplásmico, las estructuras recubiertas de clatrina, los microtúbulos, los filamentos intermedios, los núcleos y los complejos de adhesión (Fig. 3 complementaria). ). La incubación de células con rapamicina para FerriTagging suele ser breve y no es suficiente para inducir la autofagia (Fig. 4a complementaria). Se puede usar un mutante T2098L de FerriTag con el Rapalog AP21967 si se requiere FerriTagging prolongado y / o la autofagia es una preocupación (Fig. 4b complementaria).

En los experimentos de Ferritagging, las partículas observadas por EM probablemente corresponden a FerriTag por cuatro razones. Primero, el tamaño y la forma de las partículas fue consistente con la ferritina y se observó el marcaje en los lugares esperados (Fig. 3a). En segundo lugar, no se observó ningún marcaje en las fosas recubiertas de clatrina (CCP) en las células cuando la MAO se etiquetó con ferri, y las mitocondrias no se marcaron en las células cuando se etiquetó con ferri con clatrina (Fig. 3b). En tercer lugar, no se observaron partículas junto al orgánulo apropiado en las células donde no se había añadido rapamicina (Fig. 3c). En cuarto lugar, las partículas eran menos densas o estaban ausentes cuando se realizó FerriTagging en células sin carga de hierro (Fig. 3d). A partir de estos experimentos, llegamos a la conclusión de que FerriTag funciona para etiquetar específicamente proteínas de interés a nivel ultraestructural.

Identidad de las partículas de FerriTag y especificidad de FerriTagging. Micrografías electrónicas de experimentos en los que FKBP-GFP-MAO o GFP-FKBP-LCa fueron FerriTagged. La adición de rapamicina o la preincubación de hierro se realizó o no según lo indicado. Demostración de micrografías de electrones a controles positivos: etiquetado de mitocondrias en células donde MAO había sido FerriTagged (izquierda) y etiquetado de CCS en células donde clatrina fue FerriTagged (derecha), B controles internos: sin etiquetado de CCS en células donde MAO había sido FerriTagged (izquierda) y sin etiquetado de mitocondrias en células donde la clatrina fue FerriTagged, C controles negativos: sin etiquetado en los lugares esperados en ausencia de rapamicina, y D las partículas eran menos densas o parecían estar ausentes en los lugares esperados cuando se añadió rapamicina, pero no se llevó a cabo una precarga de hierro. Barras de escala, 100 nm

Eficiencia de FerriTagging por microscopía electrónica

¿Cuáles son las concentraciones de fondo de FerriTag y qué densidades se ven en el orgánulo objetivo después de FerriTagging? Para responder a estas preguntas, las partículas de FerriTag en imágenes TEM de células que expresan GFP-FKBP-LCa y FerriTag fueron contadas por un experimentador ciego a las condiciones (control versus tratado con rapamicina, ver Análisis de imágenes en Métodos). Se registró la ubicación de estas partículas en las regiones citoplasmáticas o próximas a la membrana y se calcularon las densidades de partículas en cada región. Se pudieron distinguir las áreas recubiertas de la región próxima a la membrana y también se determinaron las densidades en estas áreas.

En la condición de control, la densidad de partículas citoplásmicas frente a la membrana recubierta-proximal fue de 34,6 frente a 0 partículas por μm 3 (Fig. 2c). En las muestras FerriTagged, las densidades fueron 72,5 frente a 1308,6 partículas por μm 3, un enriquecimiento de 18 veces (Fig. 2c). La densidad de las partículas en las zonas proximales de la membrana recubiertas en las muestras FerriTagged fue significativamente mayor que todas las demás densidades medidas (pag & lt 0.0022), todos los cuales eran similares entre sí (pag & gt 0.29, ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Tukey).

Usamos un método estereológico para probar si la intensidad de etiquetado relativa (RLI) era diferente a la tasa esperada de puntos regulares superpuestos en cada imagen 13. Estos puntos se probaron para determinar su coincidencia con el citoplasma o la región proximal de la membrana recubierta. Los recuentos y estadísticas resumidos de siete experimentos CLEM individuales se muestran en la Tabla 1. El RLI en la región proximal de la membrana recubierta para las células tratadas con rapamicina varió de 2,6 a 4,3 veces los valores esperados, lo que indica enriquecimiento. El RLI citoplasmático en muestras tratadas con rapamicina fue de 0,2 a 0,6 del esperado, lo que sugiere un agotamiento a medida que las partículas se trasladan a las regiones de la membrana. A modo de comparación, en los controles, el RLI citoplásmico fue de 1,0 a 1,2 de los valores esperados. En muestras FerriTagged, se encontraron partículas a tasas más altas de lo esperado en regiones proximales a la membrana sin una capa de clatrina obvia. Dada la especificidad del etiquetado, es probable que estas partículas representen clatrina FerriTagged que se encuentra en proceso de montaje / desmontaje. Este trabajo indica que cualquier FerriTag asociado con una estructura subcelular particular representa un etiquetado real, y que FerriTag no unido no interfiere con la detección del etiquetado FerriTag genuino.

Determinación de la resolución de etiquetado de FerriTag

La resolución del etiquetado se refiere a la precisión con la que la posición detectada de la partícula corresponde a la ubicación de la proteína etiquetada 2. La distancia máxima posible que la partícula de FerriTag podría estar de la proteína etiquetada es teóricamente 22 nm (Fig. 4a). Sin embargo, FerriTag puede adoptar una conformación o pose más compacta, lo que resulta en longitudes observadas más cortas. Para determinar la resolución del etiquetado directamente, FerriTagged la proteína transmembrana CD8α y muestras procesadas para EM (Fig. 4b). Se midió la distancia perpendicular desde el centro de la partícula FerriTag a la membrana plasmática (mediana = 9,5 nm, norte = 458 partículas, Fig. 4c). Para interpretar la forma de esta distribución, llevamos a cabo simulaciones por computadora que modelaron la detección de partículas en secciones EM (ver nota complementaria 3). Estas simulaciones indican que FerriTag puede existir en varios estados de longitud de 7 a 18 nm. La distribución tiene una amplia dispersión (FWHM ≈ 10 nm), lo que significa que, en promedio, la partícula se detectará a 10 ± 5 nm de distancia de la proteína objetivo. Esta resolución supera la del etiquetado inmunoold tradicional que tiene una resolución de etiquetado de 18 nm en preinclusión o 21 nm en la sección 2. Este conjunto de datos también nos permitió determinar directamente la relación señal / ruido (SNR) para FerriTagging (8,7 ± 0,1, media ± s.e.m., Fig. 4d, consulte la nota complementaria 4). La alta SNR es alentadora para futuros enfoques computacionales para seleccionar automáticamente partículas y cuantificar imágenes de células FerriTagged.

La resolución de etiquetado de FerriTagging es de aproximadamente 10 nm. a Diagrama esquemático para mostrar la configuración experimental para medir la resolución de etiquetado de FerriTag. El FerriTagging de CD8-GFP-FKBP se muestra en relación con la membrana plasmática. Los dominios proteicos se organizan colinealmente, dando una longitud máxima total de 22 nm desde el borde de la membrana plasmática hasta el centro de la partícula de ferritina. B FerriTagging CD8-GFP-FKBP. Imágenes de localizador (izquierda), imágenes de células vivas de FerriTagging (centro) e imágenes TEM (derecha). Las células se trataron con rapamicina (200 nM) como indica la barra naranja llena. Barra de escala de microscopía óptica de 10 μm y zoom × 12. Barra de escala de micrografía electrónica de 50 nm y zoom × 7,25. C Histograma de observaciones experimentales (rojo) con una función de densidad de valores simulados superpuestos (gris). La línea punteada indica la mediana del conjunto de datos experimentales, 9,8 nm (nortepartícula = 458). D Histograma de la relación señal-ruido medida a partir de este conjunto de datos (nortepartícula = 389)

Mapeo a nanoescala de HIP1R usando FerriTagging

Habiendo desarrollado FerriTagging, a continuación queríamos llevar a cabo un mapeo contextual a nanoescala de una proteína de interés para responder a una pregunta biológica celular. Relacionado con la proteína 1 que interactúa con la huntingtina (HIP1R), el homólogo humano de la levadura Sla2p, puede unirse a las membranas, la cadena ligera de clatrina y la actina. Existe en dos conformaciones: extendida y retorcida y se han propuesto varios modelos para explicar cómo HIP1R vincula la maquinaria de la clatrina con el citoesqueleto de actina 14,15,16,17,18,19. Para probar estos modelos, determinamos la distribución a nanoescala de HIP1R en los PCC utilizando FerriTagging. Las células HeLa que expresan HIP1R-GFP-FKBP y FerriTag se procesaron a través de nuestro flujo de trabajo CLEM y se adquirieron imágenes TEM de HIP1R FerriTagged en CCP (Fig. 5a). Recolectamos imágenes de PCC y segmentamos el perfil de la membrana plasmática y la posición de las partículas de FerriTag en cada una (Fig. 5b, ver Análisis de imágenes en Métodos). Usando promedios espaciales, trazamos la distribución de todas las partículas simétricamente alrededor de un perfil de pozo idealizado para visualización (Fig. 5c). Estos datos revelaron que la distribución de HIP1R es homogénea en toda la corona del PCC. Además, al definir los bordes del CCP podríamos mapear FerriTagged HIP1R distal al CCP, es decir, en áreas adyacentes de membrana plasmática sin recubrimiento. Aquí, HIP1R se marcó con una densidad más baja en relación con la del propio CCP (Fig. 5c, d). Curiosamente, la distancia de las partículas a la membrana plasmática fue mayor para FerriTagged HIP1R en el hoyo frente a las regiones distales, una diferencia de 10 nm en promedio (Fig. 5e). FerriTagging está en el extremo C-terminal de HIP1R y cualquier diferencia en la distancia a la membrana probablemente se traduzca en cambios en la conformación de la molécula (Fig. 5f). Estos datos sugieren que HIP1R está en una forma extendida en el CCP pero cuando está distal al hoyo, HIP1R está en una conformación retorcida (Fig. 5f).

Mapeo a nanoescala de HIP1R en la vecindad de fosas recubiertas de clatrina. a FerriTagging HIP1R-GFP-FKBP. Imágenes de localizador (izquierda), imágenes de células vivas de FerriTagging (centro) e imágenes TEM (derecha). Las células se trataron con rapamicina (200 nM) como indica la barra naranja llena. Barra de escala de microscopía óptica de 10 μm y zoom × 12. Barra de escala de micrografía electrónica de 50 nm y zoom × 7,25. B Perfiles de membrana segmentados manualmente (negro — hoyo, gris — distal) y partículas FerriTag (rojo) de micrografías electrónicas HIP1R FerriTag. En la esquina inferior derecha se muestra una superposición alineada de todos los perfiles. C Representación espacialmente promediada de HIP1R unido a un CCP idealizado (100 nm de diámetro) determinado por la posición de las partículas de FerriTag en micrografías TEM. Las ubicaciones de FerriTag están marcadas con cruces, codificadas por colores según la distancia a la membrana plasmática. Las partículas que estaban más cerca de la membrana en el hoyo o en las regiones distales se presentan por separado. Tenga en cuenta que la distribución se presenta simétricamente, es decir, cada partícula aparece dos veces. D, mi Gráficos de puntos de dispersión de la frecuencia de FerriTagged-HIP1R (D) y la proximidad de FerriTagged-HIP1R a la membrana plasmática (mi). Se grafican las partículas en la fosa o en las regiones distales. Las barras muestran la media ± DE, pag-los valores son de Student t-prueba con la corrección de Welch. F Diagrama esquemático de HIP1R, una molécula en forma de barra con dominios de interacción para membrana, clatrina y actina 14. Modelo para explicar nuestros datos: HIP1R está en una conformación extendida cuando interactúa con la membrana, clatrina y actina, y está en una conformación más corta / retorcida cuando no está unido a clatrina.


Conocimientos sobre microscopio electrónico de barrido

2. Teoría del engaño del microscopio electrónico de barrido
En 1980, Margherita Guarducci, una destacada epigrafista, publicó un libro en el que afirmaba que la inscripción había sido falsificada por Francesco Martinetti, un marchante de arte, y Helbig, que se sabía que habían colaborado en negocios turbios. Su presentación en 1887, afirmó, fue de hecho un engaño perpetrado para avanzar en las carreras de ambos hombres. Esta fue la acusación más formal, pero no la primera de este tipo: Georg Karo había dicho que Helbig le había dicho que el peroné había sido robado de Tomba Bernardini de Palestrina.
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3. Especies de microscopio electrónico de barrido
Las especies dentro del género Dendronotus incluyen:
Dendronotus albopunctatus Robilliard, 1972
Dendronotus albus MacFarland, 1966 (sinónimo: Dendronotus diversicolor Robilliard, 1972)
Dendronotus arcticus Korshunova, Sanamyan, Zimina, Fletcher & amp Martynov, 2016
Dendronotus bathyvela Martynov, Fujiwara, Tsuchida, R. Nakano, N. Sanamyan, K. Sanamyan, Fletcher & amp Korshunova, 2020
Dendronotus claguei Valds, Lundsten y N. G. Wilson, 2018
Dendronotus comteti Valds y amp Bouchet, 1998
Dendronotus dalli Bergh, 1879
Dendronotus elegans A. E. Verrill, 1880
Dendronotus europaeus Korshunova, Martynov, Bakken y amp Picton, 2017
Dendronotus frondosus (Ascanius, 1774) (sinónimos: D. arborescens, D. reynoldsi)
Dendronotus gracilis Baba, 1949
Dendronotus iris J.G. Cooper, 1863 (sinónimo D. giganteus)
Dendronotus jamsteci Martynov, Fujiwara, Tsuchida, R. Nakano, N. Sanamyan, K. Sanamyan, Fletcher & amp Korshunova, 2020
Dendronotus kalikal Ekimova, Korshunova, Schepetov, Neretina, Sanamyan & amp Martynov, 2015
Dendronotus kamchaticus Ekimova, Korshunova, Schepetov, Neretina, Sanamyan & amp Martynov, 2015
Dendronotus lacteus (W. Thompson, 1840)
Dendronotus nordenskioeldi Korshunova, Bakken, Grtan, Johnson, Lundin & amp Martynov, 2020
Dendronotus patricki Stout, N. G. Wilson & amp Valds, 2011
Dendronotus primorjensis Martynov, Sanamyan & amp Korshunova, 2015
Dendronotus robilliardi Korshunova, Sanamyan, Zimina, Fletcher & amp Martynov, 2016
Dendronotus robustus Verrill, 1870
Dendronotus rufus O'Donoghue, 1921
Dendronotus subramosus MacFarland, 1966
Dendronotus velifer G. O. Sars, 1878
Dendronotus venustus MacFarland, 1966
Dendronotus yrjargul Korshunova, Bakken, Grtan, Johnson, Lundin & amp Martynov, 2020
Dendronotus zakuro Martynov, Fujiwara, Tsuchida, R. Nakano, N. Sanamyan, K. Sanamyan, Fletcher & amp Korshunova, 2020 Especies convertidas en sinonimia
Dendronotus diversicolor Robilliard, 1972: sinónimo de Dendronotus albus MacFarland, 1966
Dendronotus luteolus Lafont, 1871: sinónimo de Dendronotus frondosus (Ascanius, 1774)
Dendronotus nanus Marcus & amp Marcus, 1967: sinónimo de Dendronotus iris J. G. Cooper, 1863
Dendronotus stellifer A. Adams & amp Reeve en A. Adams, 1848: sinónimo de Bornella stellifer (A. Adams & amp Reeve en A. Adams, 1848)
Dendronotus tenellus A. Adams & amp Reeve en A. Adams, 1848: sinónimo de Bornella stellifer (A. Adams & amp Reeve en A. Adams, 1848)

4. Kazachstania yasuniensis del microscopio electrónico de barrido
Kazachstania yasuniensis es una levadura aislada recientemente. Este organismo es parte del género Kazachstania, que se puede encontrar en una gran variedad de hábitats como alimentos fermentados, animales, aguas residuales, etcétera.

5. Criomicroscopía electrónica de barrido del microscopio electrónico de barrido
La criomicroscopía electrónica de barrido (CryoSEM) es una forma de microscopía electrónica en la que se obtiene una imagen de una muestra hidratada pero fijada criogénicamente en la etapa fría de un microscopio electrónico de barrido en una cámara criogénica. El enfriamiento generalmente se logra con nitrógeno líquido. El CryoSEM de muestras biológicas con un alto contenido de humedad se puede realizar más rápido con menos pasos de preparación de muestras que el SEM convencional. Además, los procesos de deshidratación necesarios para preparar una muestra biológica para una cámara SEM convencional crean numerosas distorsiones en el tejido que conducen a artefactos estructurales durante la obtención de imágenes.

6. Descubrimiento del microscopio electrónico de barrido
El peroné fue presentado al público en 1887 por Wolfgang Helbig, un arqueólogo. Según algunas fuentes, Helbig no explicó cómo había llegado a adquirir el artefacto en ese momento, aunque otros afirman que el peroné "se dio a conocer al público por primera vez en tres artículos breves en el Rmische Mitteilungen de 1887 donde se dice que han sido comprados en Palestrina por un amigo de Helbig en el año 1871, o cinco años antes del descubrimiento de la tumba "la tumba en cuestión es la Tumba de Bernardini cuyo tesoro se afirmó más tarde que el peroné era parte de

7. Peroné prenesto del microscopio electrónico de barrido
El peroné Praeneste (el "broche de Palestrina") es un peroné o broche de oro, que hoy se encuentra en el Museo Preistorico Etnografico Luigi Pigorini en Roma. El peroné tiene una inscripción en latín antiguo. En el momento de su descubrimiento a fines del siglo XIX, fue aceptado como el primer espécimen conocido de la lengua latina. Desde entonces se ha cuestionado la autenticidad de la inscripción. Sin embargo, un nuevo análisis realizado en 2011 declaró que era genuino "más allá de cualquier duda razonable" y que data del período orientalizante, en la primera mitad del siglo VII a. C.

8. Otto Klemperer (físico) del microscopio electrónico de barrido
Otto Ernst Heinrich Klemperer (1899-1987) fue un físico experto en óptica electrónica. Se doctoró en la Humboldt-Universitt zu Berlin en 1923. Su director de tesis fue Hans Geiger. Continuó trabajando con Geiger en la década de 1930.
Klemperer fue co-inventor en 1928 del contador de bolas Geiger-Klemperer, "el primer gran avance en el diseño de contadores proporcionales". Durante la década de 1930, trabajó en el Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge sobre las discrepancias entre la teoría de la descomposición de Fermi y las propiedades de radiación observadas del rubidio y el polonio. Más tarde fue profesor asistente y lector de física en el Imperial College de Londres, donde escribió la tercera edición de su libro sobre óptica electrónica con Mike Barnett.
El director Otto Klemperer era primo de su padre.
Su tío fue el romanista Victor Klemperer.

9. Aislamiento del microscopio electrónico de barrido
Kazachstania yasuniensis se aisló en Ecuador y el archipiélago de Galpagos en regiones arbóreas. Se aislaron siete cepas del género Kazachstania con el fin de proporcionar una taxonomía completa para la nueva especie. Estas muestras se cultivaron en medio de etanol al 7,6% (Sniegowski et al. 2002). Fueron aislados de madera podrida, suelo o frutos en descomposición. Según el lugar donde se aislaron estas especies, los investigadores concluyeron que es muy probable que K. yasuniensis resida en un hábitat arbóreo. Las cepas se recolectaron en la Amazonía ecuatoriana, así como en el bosque Scalesia de la isla Santa Cruz en las islas Galpagos.
Aunque no se realizó tinción de Gram, usando un microscopio electrónico de barrido, se encontró que las células de K. yasuniensis eran ovoides y estaban individuales, emparejadas o en cadenas cortas o grupos de células.

10. Crewe (apellido) del microscopio electrónico de barrido
Crewe o Crew es un apellido de origen galés antiguo.
Las personas con este apellido incluyen
Albert Crewe (19272009), físico e inventor del microscopio electrónico de transmisión de barrido
Bertie Crewe (18601937), diseñador de teatro británico
Bob Crewe (19302014), American songwriter, singer, manager, and record producer
Francis Albert Eley Crew (1886-1973), British animal geneticist
Sir George Harpur Crewe, 8th Baronet (17951844), English Tory politician
Harvey and Jeannette Crewe, murder victims in New Zealand
Henry Harpur Crewe (18281883), English clergyman and naturalist
Hungerford Crewe, 3rd Baron Crewe (18121894)
John Crewe (disambiguation), various persons of that name, including:
John Crewe, 1st Baron Crewe (17421829)
John Crewe, 2nd Baron Crewe (17721835)
Quentin Crewe (19261998), English journalist, author and adventurer
Ranulph Crewe (15581646), English judge and Chief Justice of the King's Bench
Thomas Crewe (15651634), English Member of Parliament and lawyer, Speaker of the House of Commons
Amanda Crew, Canadian film and television actress
Gary Crew, Australian writer of young adult fiction
Nathaniel Crew, 3rd Baron Crew, Bishop of Oxford (1671 to 1674) and Bishop of Durham (1674 to 1721)
Rudy Crew, former Superintendent of Schools of Miami-Dade County Public Schools in Florida, USA

11. Further reading of scanning electron microscope
Authors who argue that the Fibula is a forgery:
Hamp, Eric P. (1981). "Is the Fibula a Fake?". American Journal of Philology. 102 (2): 1513. doi:10.2307/294308. JSTOR294308.
Gordon, Arthur E. (1983). Illustrated Introduction to Latin Epigraphy. Berkeley/Los Angeles/London. ISBN0520038983.
Bonfante, Larissa (1986). Etruscan Life and Afterlife: A Handbook of Etruscan Studies. Detroit: Wayne State University Press.Authors who argue that the Fibula is authentic:
Lehmann, Winfred P. (1993). Historical Linguistics (3rd ed.). Routledge.
Wachter, R. (1987). Altlateinische Inschriften. Sprachliche und epigraphische Untersuchungen zu den Dokumenten bis 150 v. Chr. Bern etc.
Formigli, E. (1992). "Indagini archeometriche sull'autenticit della Fibula Praenestina". MDAI(R). 99: 32943, Taf. 8896.
Hartmann, Markus (2005). Die frhlateinischen Inschriften und ihre Datierung: Eine linguistisch-archologisch-palographische Untersuchung (in German). Bremen: Hempen. ISBN978-3-934106-47-5.
"La Fibula Prenestina". Bullettino di Paletnologia Italiana (in Italian). 99. 2014.

12. Anatomy of scanning electron microscope
Snails in this genus create and use love darts as part of their mating behavior.
The scanning electron microscope images on the left show (above) the lateral view of the love dart of Humboldtiana nuevoleonis, scale bar 500 m (0.5mm) and (below) a cross section of the dart, scale bar 50 m.

13. Utricularia meyeri of scanning electron microscope
Utricularia meyeri is a medium-sized, probably perennial carnivorous plant that belongs to the genus Utricularia. It is endemic to western Goias and eastern Mato Grosso in central Brazil. U.meyeri grows as a terrestrial plant in bogs and seasonally flooded swamps and grasslands at altitudes from 400m (1,312ft) to around 600m (1,969ft). It was originally described by Robert Knud Friedrich Pilger in 1901 and later reduced to synonymy under U.erectiflora by Peter Taylor in 1967. He later reevaluated his decision on the basis of scanning electron microscope images of the seed of the two species.

14. Replicas of scanning electron microscope
Replicas of the fibula are held by the National Roman Museum's Museum of Epigraphy at the Baths of Diocletian in Rome, and also by the Arthur M. Sackler Museum at Harvard in Cambridge, Massachussetts.

15. Characteristics of scanning electron microscope
Morphologically, standard methods such as growth temperature testing using yeast extract-malt extract agar cultivation and sporulation tests on various agars were used. As far as physiological characterization goes, the novel species differed from its close relatives in that it absorbed trehalose and ethanol, while growing on ethylamine hydrogen chloride and sodium chloride. It was also unable to grow at 37C and absorb glucose, and could absorb sucrose, all of which are physiological aspects that differ from its close relatives.
The Si value was calculated for the species as well. A higher Si value indicates a more specialized species. The value for K. yasuniensis was 0.62, and therefore characterized with the majority of yeast species found in highly specialized environments.
Kazachstania yasuniensis was found to absorb and metabolize glucose, sucrose, raffinose, galactose, trehalose, cadaverine, ethylamine hydrochloride, and ethanol. It could not grow on inulin, melibiose, lactose, maltose, melezitose, methyl - d-glucoside, starch, cellobiose, salicin, l-sorbose, l-rhamnose, d-xylose, l-arabinose, d-arabinose, d-ribose, methanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, d-mannitol, d-glucitol, inositol, dl-lactate, succinate, citrate, d-glucosamine, glucono- d-lactone, ysine, nitrate, xylitol, or 50% glucose/yeast extract. The organism proliferated at 30C, but there was no growth at 37C.
Multigene sequencing needs to be performed in order to establish clearer boundaries between yeast species. This is a very novel species and there is still much to be discovered.

16. Dendronotus of scanning electron microscope
Dendronotus is a genus of sea slugs, nudibranchs, marine gastropod molluscs in the superfamily Tritonioidea.
This genus is within the clade Cladobranchia (according to the taxonomy of the Gastropoda by Bouchet & Rocroi, 2005).

17. Date and inscription of scanning electron microscope
The fibula was thought to originate from the 7th century BC. It is inscribed with a text that appears to be written in Old Latin or Proto-Latino-Faliscan (shown by MED /med/ as an accusative instead of ablative), here transcribed to Roman letters:
MANIOS MED FHEFHAKED NVMASIOIThe reconstructed Proto-Italic ancestor would have been:
*Mnjos m fefaked NumazjiThe equivalent Classical Latin sentence obtained by applying the appropriate differences between Old Latin and Classical Latin would probably have been:
*MANIVS ME FECIT NVMERIOtranslated as:
Manius made me for Numerius

18. Chilostoma cingulatum of scanning electron microscope
Chilostoma cingulatum is a species of medium-sized, air-breathing land snail, a terrestrial pulmonate gastropod mollusk in the family Helicidae, the true snails.
Subspecies
Chilostoma cingulatum adamii (Pini, 1876)
Chilostoma cingulatum alzonai K. L. Pfeiffer, 1951
Chilostoma cingulatum anauniense (De Betta, 1852)
Chilostoma cingulatum anconae (Gentiluomo, 1868)
Chilostoma cingulatum appelii (Kobelt, 1876)
Chilostoma cingulatum asperulum (Ehrmann, 1910)
Chilostoma cingulatum baldense (Rossmssler, 1839)
Chilostoma cingulatum bizona (Rossmssler, 1842)
Chilostoma cingulatum boccavallense K. L. Pfeiffer, 1951
Chilostoma cingulatum carrarense (Strobel, 1852)
Chilostoma cingulatum cingulatum (S. Studer, 1820)
Chilostoma cingulatum colubrinum (De Cristofori & Jan, 1832)
Chilostoma cingulatum frigidescens (Del Prete, 1879)
Chilostoma cingulatum frigidissimum (Paulucci, 1881)
Chilostoma cingulatum frigidosum (Pollonera, 1890)
Chilostoma cingulatum gobanzi (Frauenfeld, 1867)
Chilostoma cingulatum hermesianum (Pini, 1874)
Chilostoma cingulatum infernale (P. Hesse, 1931)
Chilostoma cingulatum insubricum (De Cristofori & Jan, 1832)
Chilostoma cingulatum medoacense (Adami, 1886)
Chilostoma cingulatum montanum (Paulucci, 1881)
Chilostoma cingulatum nicatis (Costa, 1836)
Chilostoma cingulatum nicolisianum (Adami, 1886)
Chilostoma cingulatum peregrini Falkner, 1998
Chilostoma cingulatum philippii (Kobelt, 1905)
Chilostoma cingulatum preslii (Rossmssler, 1836)
Chilostoma cingulatum sentinense (Piersanti, 1833)
Chilostoma cingulatum transiens (Adami, 1886)
Chilostoma cingulatum anauniense
Chilostoma cingulatum baldense
Chilostoma cingulatum colubrinum
Chilostoma cingulatum nicatis
Chilostoma cingulatum preslii


Información del autor

Present address: Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Afiliaciones

INM — Leibniz Institute for New Materials, Saarbrücken, Germany

Department of Physics, Saarland University, Saarbrücken, Germany

Ernst Ruska-Centre for Microscopy and Spectroscopy with Electrons and Peter Grünberg Institute, Forschungszentrum Jülich, Jülich, Germany

Lothar Houben & Rafal E. Dunin-Borkowski

Department of Chemical Research Support, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel

IBM T. J. Watson Research Center, Yorktown Heights, NY, USA

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Contribuciones

All authors contributed to the discussion of content and researched data for the article. R.E.D.-B. and L.H. wrote the section on aberration correction. N.dJ. and F.M.R. wrote the sections on spatial and temporal resolution. All authors edited the article prior to submission.

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