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7.4: Mutaciones y cáncer - Biología


¿Qué pasaría si este ciclo se desarrolla a voluntad?

Sus células pueden crecer y dividirse sin realizar sus funciones necesarias, o sin replicar completamente su ADN, o sin copiar sus orgánulos. Por lo tanto, el ciclo celular debe estar altamente regulado y estrictamente controlado. Y es.

Control del ciclo celular

¿Cómo sabe la célula cuándo dividirse? ¿Cómo sabe la célula cuándo replicar su ADN? ¿Cómo sabe la célula cuándo pasar a la mitosis o la citocinesis? Las respuestas a estas preguntas tienen que ver con el control del ciclo celular. Pero, ¿cómo se controla o regula el ciclo celular? La regulación del ciclo celular involucra procesos cruciales para la supervivencia de una célula. Estos incluyen la detección y reparación de daños en el ADN, así como la prevención de la división celular descontrolada. La división celular incontrolada puede ser mortal para un organismo; su prevención es fundamental para la supervivencia.

Ciclinas y quinasas

El ciclo celular está controlado por una serie de procesos de retroalimentación controlados por proteínas. Dos tipos de proteínas involucradas en el control del ciclo celular son quinasas y ciclinas. Las ciclinas activan las quinasas al unirse a ellas, específicamente activan quinasas dependientes de ciclina (CDK). Quinasas son enzimas que catalizan la transferencia de un grupo fosfato del ATP a otra molécula en una célula. Funcionan como un interruptor de control en muchas funciones celulares, activando o desactivando una función y regulando otros procesos celulares. Muchas veces participan en la activación de una cascada de reacciones. Las ciclinas comprenden un grupo de proteínas que se producen rápidamente en etapas clave del ciclo celular. Una vez activadas por una ciclina, las enzimas CDK activan o inactivan otras moléculas diana mediante la fosforilación. Es esta regulación precisa de las proteínas la que desencadena el avance a través del ciclo celular. Leland H. Hartwell, R. Timothy Hunt y Paul M. Nurse ganaron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 2001 por su descubrimiento de estas proteínas críticas.

¿Qué hace que una célula sea cancerosa?

Cáncer es una enfermedad caracterizada por una población de células que crecen y se dividen sin respetar los límites normales. Estas células cancerosas invaden y destruyen los tejidos adyacentes y pueden diseminarse por todo el cuerpo. El proceso por el cual las células normales se transforman en células cancerosas se conoce como carcinogénesis. Este proceso también se conoce como oncogénesis o tumorigénesis.

Casi todos los cánceres son causados ​​por mutaciones en el ADN de células anormales. Estas mutaciones pueden deberse a los efectos de carcinógenos, agentes cancerígenos como humo de tabaco, radiación, productos químicos o agentes infecciosos. Estos carcinógenos pueden actuar como un "desencadenante" ambiental, estimulando la aparición del cáncer en ciertos individuos y no en otros. ¿Todas las personas que fuman contraen cáncer? No. ¿Puede el humo de segunda mano aumentar las probabilidades de que una persona no fumadora desarrolle cáncer de pulmón? Si. También aumenta la probabilidad de que una persona no fumadora desarrolle una enfermedad cardíaca.

Las interacciones complejas entre los carcinógenos y el genoma de un individuo pueden explicar por qué solo algunas personas desarrollan cáncer después de la exposición a un desencadenante ambiental y otras no. ¿Todos los cánceres necesitan un desencadenante ambiental para desarrollarse? No. Las mutaciones que causan cáncer también pueden resultar de errores incorporados en el ADN durante la replicación, o pueden ser heredadas. Las mutaciones hereditarias están presentes en todas las células del organismo.

Oncogenes y genes supresores de tumores

Algunos tipos de cáncer ocurren debido a mutaciones en genes que controlan el ciclo celular. Las mutaciones que causan cáncer ocurren con mayor frecuencia en dos tipos de genes reguladores, llamados protooncogenes y genes supresores de tumores.

  • Los protooncogenes son genes que normalmente ayudan a las células a dividirse. Cuando un protooncogén muta para convertirse en oncogén, está continuamente activo, incluso cuando no se supone que lo esté. Esto es como si el pedal del acelerador de un automóvil se atascara a toda velocidad. El coche sigue corriendo a toda velocidad. En el caso de una célula, la célula se sigue dividiendo sin control, lo que puede provocar cáncer.

  • Los genes supresores de tumores son genes que normalmente ralentizan o detienen la división celular. Cuando se produce una mutación en un gen supresor de tumores, ya no puede controlar la división celular. Es como un coche sin frenos. El coche no se puede reducir ni detener. En el caso de una célula, la célula se sigue dividiendo sin control, lo que puede provocar cáncer.

Varias mutaciones que causan cáncer
Los oncogenes pueden ser factores de crecimiento, proteína quinasas, GTPasas o factores de transcripción. Factores de crecimiento son sustancias de origen natural, normalmente una proteína u hormona esteroidea, capaces de estimular el crecimiento, la proliferación y la diferenciación celular. Son importantes para regular una variedad de procesos celulares. Por lo general, deben unirse a un receptor extracelular o intracelular para iniciar una reacción celular.

Por lo general, se requiere una serie de varias mutaciones que activan constitutivamente oncogenes e inactivan genes supresores de tumores para transformar una célula normal en una célula cancerosa (Figura ( PageIndex {2} )). Las células han desarrollado una serie de mecanismos de control para superar mutaciones en protooncogenes. Por lo tanto, una célula necesita múltiples mutaciones para transformarse en una célula cancerosa. Una mutación en un protooncogén no causaría cáncer, ya que los efectos de la mutación estarían enmascarados por el control normal del ciclo celular y las acciones de los genes supresores de tumores. De manera similar, una mutación en un gen supresor de tumores tampoco causaría cáncer, debido a la presencia de muchos genes "de respaldo" que duplican sus funciones. Solo cuando se han mutado suficientes protooncogenes en oncogenes y se han desactivado suficientes genes supresores de tumores, puede comenzar la transformación cancerosa. Las señales de crecimiento celular superan las señales de regulación del crecimiento y la célula se sale de control rápidamente. A menudo, debido a que muchos de estos genes regulan los procesos que previenen la mayor parte del daño a los genes mismos, el daño al ADN se acumula a medida que uno envejece.

Por lo general, los oncogenes son alelos dominantes, ya que contienen mutaciones de ganancia de función. Las acciones del producto génico del alelo mutante, que muchas veces dan como resultado una proteína activada constitutivamente, son dominantes con respecto al producto génico producido por el alelo "normal". Mientras tanto, los supresores de tumores mutados son generalmente alelos recesivos, ya que contienen mutaciones con pérdida de función. Un protooncogén solo necesita una mutación en una copia del gen para generar un oncogén; un gen supresor de tumores necesita una mutación en ambas copias del gen para que ambos productos sean defectuosos. Sin embargo, hay casos en los que un alelo mutado de un gen supresor de tumores puede hacer que la otra copia no sea funcional. Estos casos dan como resultado lo que se conoce como un efecto negativo dominante.

Revisar

  1. Definir cáncer.
  2. ¿Qué son las quinasas dependientes de ciclina? Cual es su papel?
  3. Analice el papel de los oncogenes y los genes supresores de tumores en la carcinogénesis.
  4. ¿Por qué se requieren múltiples mutaciones para la transformación en una célula cancerosa?
  5. Identifique todas las categorías de oncogenes y describa dos categorías.

Mutación

El cáncer es el resultado de la descomposición de los controles que regulan las células. Las causas de la degradación siempre incluyen cambios en genes importantes. Estos cambios a menudo son el resultado de mutaciones, cambios en la secuencia de ADN de los cromosomas. Las mutaciones pueden ser cambios muy pequeños, que afectan solo a unos pocos nucleótidos o pueden ser muy grandes, lo que lleva a cambios importantes en la estructura de los cromosomas.

Tanto las mutaciones pequeñas como las grandes pueden afectar el comportamiento de las células. Las combinaciones de mutaciones en genes importantes pueden conducir al desarrollo de cáncer. El material cubierto en esta página describe la relación entre la mutación y el cáncer, los diferentes tipos de mutaciones y sus causas. También se puede encontrar más información sobre los temas de esta página en la mayoría de los libros de texto de introducción a la biología; recomendamos Campbell Biology, 11a edición.1


Fondo

Los fármacos citotóxicos se han utilizado para la terapia del cáncer desde la década de 1950 y siguen siendo el tratamiento de primera línea para la mayoría de los cánceres en la actualidad. Estos fármacos inhiben la proliferación celular a través de una variedad de mecanismos diferentes, que incluyen dañar directamente el ADN, interferir con el metabolismo del ADN e interferir con la maquinaria mitótica. Los tratamientos exitosos destruyen las células tumorales, pero también ejercen efectos secundarios atribuibles a varios factores, incluida la inhibición de la proliferación celular en tejidos sanos. Los tratamientos también pueden tener consecuencias negativas a largo plazo al inducir cambios genómicos. En las células somáticas normales, las mutaciones inducidas por la quimioterapia pueden acelerar los procesos tumorigénicos. El desarrollo de neoplasias malignas secundarias es un problema especialmente importante después de los cánceres infantiles y los estudios epidemiológicos han asociado el tratamiento con agentes alquilantes e inhibidores de la topoisomerasa con el desarrollo posterior de leucemia mioblástica aguda (LMA) y otros tipos de tumores [1]. Además, las mutaciones inducidas por el tratamiento en las células cancerosas supervivientes aumentan la heterogeneidad genética del tumor y pueden contribuir al desarrollo de resistencia a tratamientos posteriores.

Los quimioterapéuticos se prueban para determinar la genotoxicidad, la capacidad del fármaco para dañar el ADN. Las pruebas más importantes aprobadas actualmente son el ensayo cometa para detectar roturas del ADN, el ensayo de aberración cromosómica y la prueba de formación de micronúcleos [2]. Estos ensayos dan predicciones indirectas e imprecisas del potencial carcinogénico [3], ya que un hallazgo de genotoxicidad solo revela que un compuesto tiene potencial para causar mutaciones genómicas, sin medir el resultado en una célula superviviente. La mutagenicidad en sí se ha ensayado principalmente utilizando genes informadores, incluido el ensayo de mutación inversa de Ames en bacterias [4] y HPRT mutagénesis en líneas celulares de mamíferos [5]. Sin embargo, la detección integral de todos los cambios genómicos de todos los tipos solo estuvo disponible con la secuenciación del genoma completo asequible.

Se han atribuido efectos mutagénicos a una gran proporción de agentes quimioterapéuticos contra el cáncer. Los agentes alquilantes inducen aductos directos de ADN y se ha demostrado que las mostazas de nitrógeno, como la ciclofosfamida, inducen mutaciones de sustitución de bases en los informadores de mutaciones, así como reordenamientos cromosómicos [6]. Los agentes reticulantes que contienen platino funcionan mediante un mecanismo similar al de los agentes alquilantes. Se ha demostrado que los aductos de cisplatino causan sustituciones de bases in vitro y en genes informadores [7], que también se detectaron en pacientes tratados con cisplatino. C. elegans genomas de gusanos [8]. Los inhibidores de la topoisomerasa II, como el etopósido y la doxorrubicina, provocan roturas del ADN, que son las causas probables de las translocaciones cromosómicas en los cánceres secundarios inducidos por estos fármacos [9, 10]. Los fármacos de la diversa familia de antimetabolitos interfieren con la replicación del ADN, lo que conduce a roturas de doble cadena y aberraciones cromosómicas [11-13]. No se espera que la clase de quimioterápicos contra el cáncer dirigida a microtúbulos tenga un impacto directo sobre la mutagénesis, aunque se ha descrito que el paclitaxel afecta la reparación del ADN al interrumpir el tráfico de proteínas reparadoras del ADN [14].

En resumen, mientras que los efectos genotóxicos se han medido indirectamente para la mayoría de los fármacos citotóxicos, los datos de mutagenicidad basados ​​en secuencias sólo están disponibles para cisplatino, a partir de un modelo de invertebrado [8]. Para adquirir datos fiables sobre la mutagenicidad genómica, realizamos la secuenciación del genoma completo en células cultivadas tratadas con representantes de cada categoría principal de quimioterápicos contra el cáncer. Se ha informado que cada uno de los agentes citotóxicos elegidos (Tabla 1) da un resultado positivo en la prueba de Ames o en la prueba de umu bacteriana relacionada [15-19]. HPRT Se informó mutagénesis para cisplatino, ciclofosfamida, doxorrubicina y etopósido [20-23], pero ausente para la hidroxiurea [24]. Nos propusimos determinar qué tan relevantes son estos hallazgos para la mutagénesis genómica en células de vertebrados. Estos estudios no se han realizado anteriormente, pero un informe reciente proporciona una prueba de concepto sobre el efecto genómico de tres mutágenos ambientales en clones de fibroblastos embrionarios de ratón de secuencia única [25], así como estudios anteriores que utilizaron la secuenciación del exoma completo [ 26-28]. El principal beneficio de los datos del espectro mutagénico obtenidos será la capacidad de utilizar secuencias del genoma del cáncer para determinar si los fármacos mutagénicos han contribuido al desarrollo del tumor, y proporcionamos un ejemplo importante de esto en la reversión de mutaciones de genes oncogénicos. La línea celular de linfoblastoma DT40 de pollo se eligió para los tratamientos por las siguientes razones: (1) el tamaño del genoma es aproximadamente un tercio en comparación con el genoma humano (2) esta línea celular se ha utilizado ampliamente para estudios de reparación del ADN y modela mamíferos La reparación del ADN bien [29] y (3) la disponibilidad de una amplia gama de líneas celulares mutantes de reparación de ADN isogénicas permitirá futuras comparaciones sobre la influencia de los factores de reparación individuales en la mutagénesis. Este análisis genómico detallado de múltiples clones de células posteriores al tratamiento proporciona el estudio más completo del potencial mutagénico de los citotóxicos de uso común en la medicina del cáncer.


Resultados

Los niveles de expresión de ARNm de ER, PR y HER2 predicen subtipos de cáncer de mama

Caracterizamos alteraciones genéticas en 51 tumores de mama y 46 líneas celulares de cáncer de mama. Nos propusimos estudiar los tres subtipos principales definidos por la práctica clínica actual: las muestras con HER2 amplificado o sobreexpresado se asignaron al subtipo HER2 +, las muestras negativas que expresan ER o PR se asignaron al subtipo ER + / PR + y se asignaron otras muestras al subtipo triple negativo. Estos subtipos se determinan mediante un algoritmo simple con una base biológica clara y su relevancia para el pronóstico y el tratamiento está bien establecida.

El estado de ER, PR y HER2 generalmente se determina en la práctica clínica mediante inmunohistoquímica o fluorescencia en el lugar hibridación, pero los resultados de estos enfoques estaban disponibles solo para una fracción de las muestras de tumores en este estudio (consulte Materiales y métodos y la Tabla complementaria S1). Por lo tanto, desarrollamos clasificadores de regresión logística para el estado de ER y PR utilizando datos de microarrays para el ESR1 y PGR genes. Los datos de microarrays para estos genes predijeron muy bien el estado del marcador determinado por el patólogo (Fig. Complementaria S1) con tasas de error en el conjunto de datos de entrenamiento de 12 de 143 para ER y 32 de 142 para PR. Para inferir el estado de HER2, identificamos muestras con ganancias de copia en el locus ERBB2 o sobreexpresión de ARNm (ver Materiales y métodos y la Fig. S1 complementaria). Estos procedimientos se utilizaron para asignar 51 tumores de mama a tres subtipos (8 HER2 +, 26 ER + / PR +, 17 triple negativo). La asignación de los tumores a los cinco subtipos principales definidos por los datos de expresión génica (26) dio resultados similares (Tabla complementaria S1). Ninguna de nuestras muestras se asignó al subtipo de expresión génica de tipo normal y solo una se asignó al subtipo B luminal. Por lo tanto, nuestro conjunto de muestra es insuficiente para investigar estos subtipos adicionales.

La aplicación de clasificadores basados ​​en ARNm y número de copias a líneas celulares de cáncer de mama asignó 15 líneas como HER2 +, 12 como ER + / PR + y 19 como triple negativo. Nuestras asignaciones están en buen acuerdo con el estudio reciente de Neve et al. (27), que clasificó todas nuestras líneas celulares triple negativas como basales y todas menos una de nuestras líneas celulares ER + / PR + como luminales. Los resultados tanto de los tumores de mama como de las líneas celulares indicaron que los niveles de expresión de ESR1 y PGR son buenos sustitutos para el estado de ER y PR.

Los tumores de mama HER2 + y triple negativo exhiben una mayor inestabilidad en el número de copias

Para comprender si la inestabilidad genómica general difiere entre los subtipos de cáncer de mama, primero examinamos las frecuencias generales de alteraciones en el número de copias en los tumores (Fig. 1A). Las fracciones del genoma que exhiben ganancias de copia difieren significativamente entre los subtipos (PAG & lt 0,05, cuando se considera cualquier umbral para la ganancia de número de copias ≥ 2,8 copias). Los tumores triple negativos tienen las frecuencias más altas de ganancias modestas. Sin embargo, los tumores HER2 + tienen las frecuencias más altas de ganancias de alto nivel, que incluyen amplificaciones focales. Esta tendencia no se explica simplemente por la ERBB2 amplicón en el cromosoma 17 porque se observan las mismas diferencias entre los subtipos cuando el cromosoma 17 se excluye de la consideración (Fig. 1B). Se observaron las mismas diferencias de subtipo en líneas celulares (datos no mostrados). No encontramos una diferencia estadísticamente significativa en las frecuencias de pérdida del número de copias entre los subtipos.

Asociaciones entre subtipos y frecuencias de alteraciones genéticas en todo el genoma. A y B. La fracción media del genoma que muestra ganancias, incluido y excluido el cromosoma 17, respectivamente, ya que los diferentes umbrales para la ganancia de copia se consideran en triple negativo (rojo), HER2 + (verde) y ER + / PR + (azul) muestras. C. Diagrama de caja de la firma de inestabilidad cromosómica (CIN25) por subtipo. Carter y col. (28) estimaron la aneuploidía de muestras de cáncer individuales cuantificando el grado en que los genes de la misma región cromosómica tienen niveles coordinados de expresión de ARNm. La firma CIN25 está formada por genes cuya expresión se correlaciona con esta medida de aneuploidía. Los valores altos de CIN25 se asocian con un mal pronóstico en varios tipos de tumores.

Para caracterizar aún más las diferencias en la inestabilidad genómica entre los subtipos de tumores, utilizamos una firma de expresión génica que refleja la inestabilidad cromosómica y se asocia con un resultado deficiente en varios tipos de cáncer (28). Probamos si la firma es la misma en los tres subtipos. Encontramos que los tumores triple negativos y HER2 + tienen una mayor expresión de la firma de inestabilidad que los tumores ER + / PR + (PAG = 0,005 Fig. 1C). Esto es consistente con las diferencias de subtipo en las frecuencias de aumento del número de copias y también con el peor pronóstico asociado con HER2 + y cánceres triple negativos (8-10).

Copiar cambios de número asociados con subtipos de cáncer de mama

Además de los patrones globales de alteración del número de copias, nos propusimos identificar regiones específicas de alteración del número de copias asociadas con subtipos y los genes funcionalmente importantes dentro de esas regiones. La Figura 2 muestra las frecuencias de ganancias y pérdidas para los diferentes subtipos, medidas en tumores con matrices de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) de Affymetrix 500k. Observamos algunas diferencias en frecuencias entre subtipos similares a las descritas en estudios recientes (por ejemplo, pérdidas en 5q en triple negativo, ganancias en 10p en triple negativo y HER2 +, ganancias en 11q13 en ER + / PR + refs. 22-24) . También observamos algunas diferencias adicionales (por ejemplo, pérdidas en 6q en ER + / PR +, ganancias en 17q21 y 17q23 en ER + / PR + y HER2 +, pérdidas en 15p en triple negativo).

Ganancias y pérdidas de tumores de mama en todo el genoma por subtipo. Los gráficos muestran ganancias por encima del X eje (frecuencia multiplicada por magnitud) y pérdidas por debajo del X eje (frecuencia) en triple negativo (A), HER2 + (B) y ER + / PR + (C) subtipos. Flechas, regiones de ganancias asociadas a subtipos asteriscos, regiones de pérdidas asociadas a subtipos. Estas regiones se seleccionaron basándose únicamente en los datos del tumor, sin tener en cuenta la replicación en las líneas celulares.

Las diferentes frecuencias de alteración del número de copias dentro de una región pueden ocurrir por casualidad y pueden ser características de un conjunto de muestras pero no observadas en otros. Buscamos identificar regiones que estuvieran asociadas estadísticamente de manera significativa con subtipos y observadas en dos conjuntos de muestras independientes. Primero identificamos regiones cromosómicas con ganancias o pérdidas recurrentes (& gt2.5 copias o & lt1.6 copias en al menos el 10% de las muestras de tumores) con diferencias en la frecuencia de ganancia o pérdida entre subtipos de tumores. Luego validamos estas regiones en datos de un conjunto independiente de 47 líneas celulares de cáncer de mama. Un total de siete regiones cromosómicas mostraron una asociación constante en ambos conjuntos de muestras (Tabla 1, Fig. 3).

Regiones de alteración del número de copias asociadas con el subtipo en dos conjuntos de muestras independientes

Copiar el número en las regiones asociadas con el subtipo. Azul, pérdidas rojas, ganancias. Se identificaron los intervalos genómicos asociados consistentemente con el subtipo tanto en tumores como en líneas celulares. Los intervalos físicamente adyacentes con el mismo patrón de asociación de subtipos se fusionaron para formar las siete regiones mostradas. El número medio de copias de los intervalos fusionados se indica mediante el color: azul, pérdidas, rojo, ganancias.

Genes impulsores candidatos para regiones asociadas a subtipos

Una región recurrente de alteración del número de copias se extiende típicamente sobre múltiples genes. La identificación de los genes impulsores (genes implicados funcionalmente en la tumorigénesis) con confianza generalmente requiere una experimentación extensa. Por lo tanto, desarrollamos una estrategia computacional para identificar genes impulsores candidatos para el seguimiento experimental basada en tres hipótesis: primero, que los genes impulsores se encuentran en la parte de una región de alteración del número de copias recurrente que se gana o pierde con mayor frecuencia y de manera más significativa, segundo , que los genes impulsores sufren alteraciones marcadas en la expresión génica como consecuencia del cambio en el número de copias y, en tercer lugar, que los cambios en la expresión de los genes impulsores pueden estar asociados con un resultado clínico deficiente. No todas estas tres hipótesis pueden ser válidas para todos los genes impulsores, pero la combinación de la evidencia de las tres puede identificar candidatos.

En el amplicón HER2, por ejemplo, ERBB2 se encuentra en el punto más amplificado, se sobreexpresa en la amplificación y se asocia con una mayor incidencia de metástasis a distancia en el estudio de van't Veer et al. (ref. 29 Fig. 4A). Otro gen en el amplicón, GRB7, también cumple con estos criterios. Esto puede deberse simplemente a su proximidad a ERBB2, pero los estudios de interferencia de ARN sugieren que GRB7 también puede contribuir a la proliferación de células de cáncer de mama (30).

Identificación de genes impulsores candidatos. UNA. Región de 35 Mbp del cromosoma 17. B. Región de 45 Mb del cromosoma 17. C. Cromosoma 17 Región de 55 Mb. D. Cromosoma 11 Región de 70 Mb. Ganancia de copia superior resumida (rojo) y las ubicaciones de genes asociados con metástasis a distancia en PAG & lt 0.05 (azul). Las líneas de puntos definen la región focal dentro de la cual el número de copias se asoció con el subtipo y dentro de la cual se buscaron los genes impulsores. Abajo, −log10 transformado PAG valores que reflejan un aumento de la expresión génica en la amplificación. Los genes que pasan el PAG umbral de valor (0,05) están etiquetados.

La aplicación del mismo procedimiento a otras regiones de ganancia de copia identifica otros oncogenes candidatos. En el amplicón de alrededor de 45 Mbp en el cromosoma 17q21 (Fig. 4B), que está asociado con los subtipos ER + / PR + y HER2 +, hay un solo gen que cumple los tres criterios: MYST2, que codifica una histona acetiltransferasa (HBO1) que ha sido implicada en la regulación de la síntesis de ADN y en la señalización del receptor de hormonas esteroides (31-34). En el amplicón alrededor de 55 Mbp (17q23), PPM1D es el único gen que cumple con los tres criterios, aunque no está fuertemente respaldado por ninguna línea de evidencia individual. Los genes TMEM49 y RPS6KB1 (que codifica la quinasa p70 ribosomal S6) también se encuentran debajo del pico de esta amplificación, y sus niveles de expresión están fuertemente asociados con la alteración del número de copias en la región (Fig. 4C). El pico de amplificación de alrededor de 70 Mbp en el cromosoma 11q13, también asociado con los subtipos ER + / PR + y HER2 +, no contiene genes asociados con la recurrencia (Fig. 4D). El estado del gen conductor a menudo se atribuye a CCND1 (que codifica la ciclina D1), que ha aumentado significativamente la expresión en muestras amplificadas, junto con los genes vecinos ORAOV1, FADD, y PPFIA1. En la región de alrededor de 35 Mbp en el cromosoma 14q13, que está asociado con el subtipo ER + / PR +, solo FOXA1 tiene una expresión elevada en tumores con mayor número de copias (Fig. complementaria S2A).

Para las regiones de deleción / pérdida, la amplitud o la frecuencia de la alteración no proporciona tanta información como en las regiones de ganancia de copia porque hay como máximo dos cromosomas para perder y las deleciones suelen ser amplias. Por tanto, la identificación de candidatos se basa principalmente en la asociación de la expresión génica con la pérdida del número de copias y el resultado clínico (Fig. Suplementaria S2B y C). Ambas líneas de evidencia apoyan a los candidatos ARHGAP18, HDAC2, y NCOA7 en deleciones alrededor de 116 Mbp en el cromosoma 6q (asociado con el subtipo ER + / PR +). La deleción ubicada alrededor de 80 Mb en el cromosoma 5q13-14 (asociado con subtipos HER2 + y triple negativo) contiene un solo gen respaldado por dos líneas de evidencia: RASA1, que codifica la proteína activadora de RAS GTPasa p120GAP.

MYST2 Impulsa el crecimiento de células cancerosas de mama

Seleccionamos el gen conductor candidato MYST2 (también conocido como HBO1) para estudio adicional porque tiene evidencia de apoyo particularmente sólida en nuestro análisis. MYST2 se requiere para el crecimiento en células 293T (31) pero no es un oncogén establecido. Sobreexpresión de MYST2 (Fig. S4 complementaria) mejoró dramáticamente el crecimiento independiente del anclaje de las células de cáncer de mama MCF7 (Fig. 5A y B) y SKBR3 (Fig. 5C y D). Estudios previos en células MCF7, que tienen una ganancia modesta en el número de copias en esta región, también han demostrado que la eliminación de ARNsi mediada MYST2 Altera sustancialmente la proliferación celular y bloquea la progresión a través de la fase S del ciclo celular en comparación con el tratamiento de control de ARNip (31). En conjunto, las observaciones que MYST2 derribo bloquea la proliferación y eso MYST2 la sobreexpresión puede cambiar las líneas celulares a un estado más transformado, lo que respalda la hipótesis de que es el oncogén que impulsa la amplificación alrededor de 45 Mbp en el cromosoma 17.

MYST2 la sobreexpresión mejora la formación de colonias en agar blando. UNA. Colonias de MCF7. Fila superior, células transfectadas con el vector de expresión MYST2, fila inferior, células transfectadas con el vector de control. C. Colonias SKBR3. Columnas izquierda y central, células transfectadas con el vector de expresión MYST2, columna derecha, células transfectadas con el vector de control. B y D. Diagramas de caja que representan el número de colonias en MCF7 y SKBR3, respectivamente.

Asociación de pérdida de PTEN y mutaciones somáticas con subtipos de cáncer de mama

Secuenciamos un panel de genes con mutaciones causantes de cáncer bien caracterizadas en la colección de líneas celulares, y evaluamos tanto las mutaciones que encontramos como los datos de mutaciones publicados para su asociación con subtipos de cáncer de mama (Tabla 2). Observamos las siguientes frecuencias generales de mutación: 73% (TP53), 34% (PIK3CA), 11%(RB1), 9% (PTEN), 7% (CDKN2A), 5% (BRAF), 2% (KRAS), y 2% (HRAS). Estos son generalmente muy similares a los reportados en la base de datos COSMIC (35). TP53, sin embargo, tiene una tasa de mutación más baja en COSMIC (54%), por lo que nuestra colección de líneas celulares puede tener características diferentes de las 80 muestras de carcinoma de mama que actualmente tienen datos en COSMIC. No vimos evidencia de que mutaciones en TP53, PTEN, o CDKN2A están asociados con subtipos específicos de cáncer de mama. PIK3CA las mutaciones se enriquecieron en los subtipos ER + / PR + y HER2 +, lo que concuerda con informes anteriores (17), aunque este enriquecimiento no fue estadísticamente significativo.

Mutaciones de aminoácidos y pérdida de proteína PTEN en líneas celulares de cáncer de mama

Las cuatro mutaciones en BRAF, KRAS, y HRAS estaban en muestras triple negativas. Esto sugiere una asociación entre mutaciones en la vía de la quinasa RAS / RAF / proteína quinasa activada por mitógenos / quinasa regulada por señal extracelular / quinasa regulada por señal extracelular y el subtipo triple negativo (PAG = 0,05). También se ha informado que una línea celular triple negativa adicional (CAL-51) alberga una mutación oncogénica activadora en un miembro de la familia RAS (36, 37).

Se ha informado anteriormente que la pérdida de PTEN está asociada con un estado negativo de RE y PR (15, 17, 38). Mutación y deleción en el PTEN locus son sustitutos imperfectos de la pérdida de proteína PTEN (15, 27), por lo que evaluamos la asociación entre PTEN y subtipos en líneas celulares mediante Western blot. Observamos una pérdida de PTEN en el 59% (10 de 17) de las muestras triple negativas, pero solo en el 17% (2 de 12) de las muestras ER + / PR + y el 8% (1 de 13) de las muestras HER2 + (PAG = 0,002). La firma de inestabilidad cromosómica fue mayor en las muestras con pérdida de PTEN que en las que no la tenían, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa (PAG & gt 0.05 datos no mostrados).

Las cuatro mutaciones en RB1 se encontraron en muestras triple negativas, y encontramos que la pérdida de la función de la proteína del retinoblastoma (RB) está asociada con el subtipo triple negativo (PAG = 0,006). La inactivación de RB se examinó adicionalmente en las 51 muestras de tumores de mama utilizando una firma de expresión de 59 genes que refleja la desregulación de RB (39, 40). Esta firma fue significativamente mayor en el subtipo triple negativo que en los subtipos HER2 + y ER + / PR + (PAG = 0,002, figura 6). Además, la firma de inestabilidad cromosómica fue mayor en las muestras con la mutación RB1 que en las que no tenían (PAG = 0.01 datos no mostrados).

La desregulación de la vía RB se asocia con el subtipo triple negativo. La puntuación de la firma RB, que refleja la desregulación de la vía, se resume en un diagrama de caja por subtipo.


Vías de metástasis

Hay tres formas principales en que los tumores se pueden diseminar a órganos distantes:

  1. A través del sistema circulatorio (sangre) (hematógeno)
  2. A través del sistema linfático
  3. A través de la pared corporal hacia las cavidades abdominal y torácica (transcelómica).

El sistema circulatorio es la ruta principal de diseminación a órganos distantes, mientras que los vasos linfáticos proporcionan una ruta a los ganglios linfáticos locales, después de lo cual las metástasis a menudo viajan a través de la sangre. La diseminación hematógena parece depender del origen y la ubicación del tumor primario.6 Por ejemplo, los tumores óseos y de tejidos blandos (sarcomas) se diseminan principalmente a través de la sangre, mientras que el melanoma, los tumores de mama, pulmón y gastrointestinales se diseminan a través del sistema linfático7. La diseminación es bastante infrecuente y parece estar restringida a mesoteliomas y carcinomas de ovario8.

Para que las células tumorales accedan a los vasos linfáticos o sanguíneos, los tumores necesitan promover el crecimiento de estos vasos dentro y alrededor del tumor. El crecimiento de vasos sanguíneos se llama angiogénesis y el crecimiento de vasos linfáticos es linfangiogénesis.

El sistema linfático
El sistema linfático juega un papel importante en el control del movimiento de líquidos por todo el cuerpo. Específicamente, el sistema linfático controla el flujo de la linfa, un líquido incoloro que contiene oxígeno, proteínas, azúcar (glucosa) y linfocitos (cyte = célula). Existen algunas similitudes y diferencias entre el sistema circulatorio (más conocido) y el sistema linfático.

Los vasos linfáticos pequeños se fusionan en otros más grandes y estos vasos grandes eventualmente se vacían en los ganglios linfáticos. Los ganglios linfáticos son tejidos con forma de frijol que se encuentran en racimos en forma de uva en varios lugares del cuerpo. Los ganglios linfáticos son sitios de activación del sistema inmunológico y de proliferación (crecimiento) de células inmunitarias. El fluido de esta extensa red fluye por todo el cuerpo, de manera muy similar al suministro de sangre. Es el movimiento de las células cancerosas hacia el sistema linfático, específicamente los ganglios linfáticos, que se utiliza en la detección de enfermedad metastásica. La estadificación del cáncer se analiza con más detalle en la sección Diagnóstico y detección.

El modelo anatómico
En el modelo anatómico de metástasis, los tumores secundarios se producen en los órganos que encuentran primero durante su diseminación desde el tumor primario. This scenario appears to occur in regional metastases, where tumor cells gain access to nearby tissue or lymph nodes through the blood or lymphatic circulation. 9 For example, liver metastasis is a major occurrence in patients with colorectal cancer. In this case, the capillary bed of the liver is the first encountered by the tumor cells after leaving the colon, and the liver seems to provide a suitable environment for the growth of these secondary tumors. 3 However, metastasis to distant organs occurs through a different mechanism (see next section).

The Seed and Soil Hypothesis
Early cancer researchers noticed a propensity for certain cancers to metastasize to the same organ. In 1889 Stephen Paget observed that patients with breast cancer often developed secondary tumors in the liver. He considered it unlikely that this occurrence was due primarily to accessibility of the liver by the blood supply, as other organs receiving equivalent blood supply rarely developed metastases. He instead developed the "Seed and Soil" hypothesis, in which certain tumor cells (the seeds) can only successfully colonize selective organs (the soil) that have suitable growth environments 10

The current view of the Seed and Soil Hypothesis consists of three important concepts.

  1. Primary tumors and their metastases consist of genetically diverse tumor and host cells (for more on the role of the host cells in cancer, see the section on Tumor Microenvironment).
  2. Metastasis selects for cells that can succeed in all phases of the metastatic process. In essence, a successful metastatic cell must be a decathalete: good in all the events, and not just one or two.
  3. Metastases generally develop in a site specific way. Because the microenvironments (the soil) of each organ is different, individual cancer cells may be able to colonize one specific organ.9

At the heart of the Seed and Soil hypothesis is the idea that successful metastasis depends on the interaction of the metastasizing tumor cells with the cells of the target organ (the stroma, or tumor microenvironment). Not only must tumor cells must be able to Produce factors that alter the stromal cells in such a way as to better serve the survival and growth of the tumor, but the environment in which the cancer cell finds itself must be capable of responding to those signals. If the cancer cell finds itself in an inhospitable soil (i.e. it cannot subvert the stroma to serve its needs), successful metastsis will be impossible. 4

Recent studies examining the profile of genes expressed in tumors that metastasis to specific organs have identified specific genetic signatures of these tumors. For example, genes that mediate the metastasis of breast cancer to bone are different than those that mediate metastasis to the lung. In essence, different sets of genes allow tumor cells to specifically interact with the stromal cells of the target organ. These findings may lead to therapeutic strategies to target the metastatic properties of tumors.11


Targeting receptor tyrosine kinases

Members of the EGF receptor family have proved important potential targets for anti-cancer drugs, and several inhibitors have been approved or are in clinical trials. They include the monclonal antibody Herceptin (trastuzumab), which targets the receptor Her, and small-molecule inhibitors. Gary Pestano (Ventana Medical Systems, Tucson, USA) discussed the evaluation of tissue-derived diagnostic phosphorylated biomarkers in the EGF receptor pathway and presented the company's experiences with biomarker validation in the context of colorectal cancer progression. Upward and downward trends of various markers were documented as colorectal tumors underwent local and then distal metastasis. He presented a case study in which biomarker levels measured by the company's proprietary technology revealed a poor prognosis phenotype in a colorectal tumor of a Ventana employee, enabling the patient to elect to have adjuvant combination chemotherapy following radiation and colostomy.

Janet Dancey (National Cancer Institute, NIH, Bethesda, USA) described outcomes in clinical trials of EGF receptor inhibitors. Her receptors, which bind the EGF-like growth factor heregulin, were inhibited using either antibodies that target the extracellular portion of the receptor, or small molecules that target one or more kinase domains, or antisense oligonucleotides intended to suppress expression of a specific Her-family gene. Differences were observed in the toxicity and efficacy of antibodies versus small molecules that can be explained, at least in part, in terms of differences in mechanism of action, off-target activity, and pharmacokinetic behavior en vivo. Single-agent treatment of EGF receptor inhibitors (antibodies or small-molecule inhibitors) gave modest objective responses in lung, brain, head and neck, ovarian, esophageal, liver, and colon cancers. Studies of antibodies or small-molecule inhibitors in combination with cytotoxic chemotherapy or radiation have demonstrated survival benefits in some cases. Many additional randomized controlled trials are under way, and a clearer view of the utility of numerous single-agent and combination approaches to EGF-receptor-targeted therapy should emerge within the next two to three years.

Many cancer patients have mutations of EGF receptor genes, and Daniel Haber (Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston, USA) presented analyses of the impact of EGF receptor mutations on individual sensitivity and resistance to tyrosine-kinase inhibitors. Opening with an anecdotal report of a Boston woman apparently cured of lung cancer with gefitinib, a small-molecule tyrosine-kinase inhibitor that has proved of very limited efficacy in most people, his presentation focused on studies of patients and model systems aimed at understanding why some patients respond to therapy with gefitinib and others do not. Most of the patients (40-80%) responding to small-molecule inhibitors of EGF receptor kinase domains exhibit kinase-activating mutations or gene amplification. In contrast, patients lacking mutations or amplification respond only rarely (10-15%). When compared with signaling by wild-type EGF receptors, signaling by mutant EGF receptors increases phosphorylation of the kinase Akt and the transcription factor Stat5 and downregulates Erk. Exposure of cells bearing mutant receptors to clinically achievable concentrations of small-molecule inhibitors of EGF receptors leads to apoptosis. Significantly higher drug concentrations are required to produce apoptosis in the context of the wild-type receptor. Regrettably, approximately half of the patients responding well to the small-molecule inhibitors do so for only a short time (3-6 months), after which relapse occurs, because the kinase domain has developed a drug-resistance mutation - Thr790Met, which is analogous to the imatinib-resistant Thr315Ile mutation in Bcr-Abl.

Mark Sliwkowski (Genentech, South San Francisco, USA) is examining the EGF receptor family with a view to designing new antibodies that target the receptor Her2, the target Herceptin. High-resolution X-ray crystallographic structures have provided detailed insights into Her2 heterodimerization and Her2-antibody interactions. These structures suggest alternative epitopes for targeting with novel antibodies. The Her2 sheddase (Mmp15, a membrane-linked metalloprotease) is responsible for cleavage of the extracellular component of the receptor, and Sliwkowski also described how resistance to Herceptin may be correlated with Mmp15 cleavage activity, which yields an activated, truncated form of the receptor lacking the epitope recognized by Herceptin. This hypothesis is currently being evaluated. Enzyme-kinetic analyses of Her2 with mutations in the kinase domain have explained the increased sensitivity of tumors bearing these mutant receptors to small-molecule inhibitors compared with tumors bearing a non-mutant receptor. These results suggest that high doses of small-molecule inhibitors will be crucial for treating patients with tumors driven to proliferate by non-mutant Her2.

Flt3 is a receptor tyrosine kinase that is important in leukocyte development and is being targeted as a possible treatment for AML. Donald Small (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, USA) described studies on Flt3 in AML patients. Individuals carrying the internal tandem duplication mutation in FLT3 have considerably poorer responses to conventional induction chemotherapy with cytarabine and daunarubicin (the so-called 7+3 therapy) and correspondingly poor prognoses. Recent advances in preclinical characterization and clinical studies of Flt3 inhibitors were described in detail. The responses of patients with the internal tandem duplication mutation to therapy with a single Flt3 inhibitor are critically dependent on the blood levels of the drug. Current clinical studies on Flt3 inhibitors focus on relapsed AML patients who are receiving either high-dose cytarabine or a combination of mitoxantrone, etoposide and cytarabine. Ultimately, the best prospects for such inhibitors are likely to be in the setting of 7+3 induction chemotherapy for newly diagnosed AML patients with the Flt3 internal tandem duplication mutation.


Conclusions and perspectives

The advent of CRISPR technology has revolutionized the biological sciences and provided cancer biologists with a powerful gene-editing method that can alter the genetic make-up of cells in unprecedented ways. Indeed, promising results have been achieved in diverse disciplines, from basic research to the development of potential therapies against cancer, congenital defects, and other chronic diseases. Many challenges associated with CRISPR technology still exist, mainly in clinical use associated with delivery and safety. 69 Improved strategies will be required to increase the targeting efficiency and to minimize off-target effects. Ensuring that CRISPR/Cas9 has precise genome-editing ability is also important. Following CRISPR/Cas9 mediated DSBs, DNA repair can be achieved by either the “error-prone NHEJ” or “precise repair through HDR” in the genome. In an effort to promote HDR over NHEJ, a study by Maruyama et al. used the NHEJ inhibitor Scr7 and observed that Scr7 treatment did indeed increase the levels of HDR-mediated genome editing over NHEJ. 70 In addition to concerns regarding off-target effects, considerations regarding the immune response to CRISPR-mediated gene-editing must also be considered. The Cas9 protein is bacterial in origin and thus might elicit an immune response, which could in turn affect its gene-editing efficiency. Also, the exogenous sgRNAs may be cleared by immune cells like monocytes and macrophages. 71 The delivery approach for CRISPR/Cas9 thus depends upon the objective as well as the target. Transient expression of the sgRNA and the Cas9 protein through microinjection might be safer than other non-viral or viral delivery methods. Viral delivery has the highest efficiency for the expression of the Cas9 protein and sgRNA, but comes with risks. During one in vivo study, the lentivirus particles elicited a strong immune response in treated animals, which affected the efficacy of the lentiviral vector. 72 Another issue with lentiviral delivery is also the possibility that the lentiviral vector could randomly integrate into the cellular genome. To overcome this issue, integrase-deficient lentiviral vectors, nanoparticle carriers, or an inducible system could be used for delivery of CRISPR/Cas9.

The prohibitively high costs for CAR T-cell therapy have made this treatment unavailable to a large section of society. CAR T-cell therapy offered by Novartis, the first approved by the FDA, costs $475,000 per treatment however, further advances in CRISPR technology might help reduce costs and make CAR T-cell therapy available to more patients. So far, the majority of CRISPR clinical trials are being conducted in China. A recent article in the Wall Street Journal suggested that this may be due to the fact that fewer rules and restrictions exist in China. Indeed, Dr. Shixiu Wu from the Hangzhou Cancer Hospital, who was featured in the article, 73 has been able to use CRISPR technology-based treatments on his cancer patients, without the need for national regulatory approval and has few reporting requirements. Many scientists worry that the technology has the potential to harm patients and that unintended consequences from using CRISPR on patients without sufficient oversight could hinder progress in the whole field. Dr. Wu recognized that he was undertaking risks in using CRISPR-based treatments for his cancer patients, but was considering their limited available survival time. The thought is that being able to live for additional time is better than imminent death. Persistent post-treatment monitoring of patients could help to eliminate or treat any unwanted consequences. Indeed, treatment-related observations could potentially save many lives of those who are on the brink of death.

We need consider the limitation as seriously as the potential benefits of this technology. A new human trial, in which the team took a crash course in bioethics and created CRISPR babies, brought the ethical issues and controversies into the public. One hundred and twenty-two Chinese scientists and many other scientists worldwide have already condemned the trial. How to use this powerful without overstepping the ethical bottom line is a serious question that needs careful consideration. We might expect more positive reports from clinical trials as well as the development of improved approaches that will bring new hope for personalized therapy.


Notas al pie

Declaration of Conflicting Interests: The author(s) declared no potential conflicts of interest with respect to the research, authorship, and/or publication of this article.

Fondos: The author(s) received the following financial support for the research, authorship, and/or publication of this article: Patrick C. Ma received research support from Daiichi Sankyo Inc. and ArQule Inc. in sponsored clinical trial funding and has received consultant honoraria as an advisory board member.


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