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¿Tengo que usar sacarosa para inducir un promotor lac?

¿Tengo que usar sacarosa para inducir un promotor lac?



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Me gustaría optimizar la expresión de una Fab fragmento en Escherichia coli. Para la inducción de la laca promotor en el vector pAK400 Yo uso IPTG y sacarosa. ¿Optimizo la expresión en caso de que simplemente agregue IPTG?


Puede inducir el operón lac por dos cosas: lactosa (o más precisamente alolactosa, un metabolito de la misma) y análogos de lactosa que no son metabolizados por las bacterias.

La lactosa induce la expresión y se metaboliza, mientras que IPTG no es un objetivo de la $ beta $ -Galactosidasa y le dará una inducción fuerte y permanente. La sacarosa no tendrá ningún efecto sobre el promotor.


T7 y DH5 alpha: ayúdame a aclarar algunas cosas (04 / Febrero / 2010)

Hola & # 33
Estoy haciendo mi tesis de maestría y estoy tratando de aclarar algunas cosas para entenderlas completamente. Ahora estoy investigando el sistema de expresión T7. Si entiendo bien las cosas, la ARN polimerasa T7 generalmente se incorpora al genoma cromosómico bajo el control de un operador lac que inicia la transcripción con la adición de IPTG. Luego, la polimerasa encuentra el promotor T7 en el plásmido y comienza a transcribir el ARNm de este sitio.

Sin embargo, leí en alguna parte que mi cepa bacteriana, DH5 alfa, no tiene su propio gen de polimerasa de ARN T7, y que esto debería estar presente en el plásmido y necesita ser transformado. ¿Es esto cierto? Estoy sospechando que no, porque no puedo ver que mis plásmidos (pTZ19R y pSE420) contienen tal cosa. ¿Podrías ayudarme a aclarar las cosas?

Lo que leíste es correcto. La mayor parte de la expresión de T7 se realiza en cepas de bacterias que se han lisogenizado con el fago DE3, que llevan la ARN polimerasa de T7 bajo el control del promotor lac. DH5a no tiene esto. Por lo general, las cepas que tienen esta modificación se indican en su nombre, como BL21 (DE3). La razón por la que la DH5a no suele llevar esta modificación es que es pobre para la expresión de proteínas, ya que todavía tiene la proteasa lon, que tiende a degradar las proteínas expresadas. La cepa BL21 está inactiva para esta y otras proteasas.

Sin duda, podría portar el promotor lac y el gen de la ARN polimerasa T7 en un plásmido (el mismo o uno cotransformante) en DH5a. Pocas personas hacen esto, porque se preocupan por la expresión de proteínas resultante.

Gracias por su respuesta & # 33. Esperaba haber hecho las cosas mal para que tuvieran más sentido. Volví a mi fuente original y clonaron mi gen en un vector de expresión pTZ19R y se transformaron en DH5a para su expresión. Si la DH5a es una cepa de expresión génica deficiente, ¿por qué querría alguien hacer eso? ¿Y cómo se produce la expresión si no hay polimerasa de ARN T7?

He intentado investigar el tema ahora, pero todo lo que hace es confundirme más. Encontré esto en algún documento de información de Invitrogen:
Importante: DH5 & # 945 E. coli no requiere IPTG para inducir la expresión del promotor lac incluso
aunque la cepa expresa el represor Lac. El número de copias de la mayoría de los plásmidos supera
el número de represores en las células. Si le preocupa obtener niveles máximos de
expresión, agregue IPTG a una concentración final de 1 mM.

Mi fuente original no menciona IPTG en absoluto, y asumí que era porque no querían dar toda la información sobre la producción de la proteína, pero ¿tal vez simplemente no la usan?

Además, he notado que obtengo resultados más claros en mi SDS-PAGE mientras uso un método que involucra PMSF. Mi opinión de los supervisores es que no es necesario, pero supongo que bloquearía la proteasa lon y tendría algún tipo de efecto. Probablemente haré más pruebas sobre eso, solo por diversión personal.

Ok, estoy balbuceando mis preguntas, pero las primeras son las más importantes. ¿Dónde está la polimerasa?

El plásmido pTZ19R tiene AMBOS un promotor lac y un promotor T7 corriente arriba de su sitio de clonación múltiple. En una cepa LacI-, esto se expresará a partir del promotor lac, sin tener nada que ver con el promotor T7. El promotor T7 está ahí para permitir la expresión en una cepa BL21 (DE3). Si me importara la proteína, subclonaría en BL21 (DE3) e induciría con IPTG, luego (como está haciendo) purificaría en presencia de PMSF, aunque eso es menos importante en las cepas BL21.


Sistemas de expresión T7 para la producción inducible de proteínas a partir de genes clonados en E. coli

Los sistemas de expresión inducible de T7 son capaces de producir una amplia gama de proteínas en E. coli. Las mejoras sobre la práctica común incluyen: (1) prevenir la inducción involuntaria mediante el establecimiento y mantenimiento de cepas de expresión en medios de crecimiento no inductores compuestos completamente de componentes purificados en lugar de medios de crecimiento complejos que pueden inducir de forma variable proteínas diana al acercarse a la saturación y (2) expresar muchas proteínas diana en paralelo por autoinducción conveniente y productiva en BL21 (DE3) y otros huéspedes adecuados, en lugar de la inducción de IPTG. Desde los primeros días, la expresión basal impidió el establecimiento de cepas inducibles para producir proteínas que son estresantes para el huésped. Los vectores pAL recientemente desarrollados reducen ahora la expresión basal a niveles en los que se pueden mantener e inducir secuencias codificantes incluso para las proteínas más estresantes. La ligación asimétrica permite la clonación simple y eficaz de secuencias codificantes individuales o la clonación simultánea de dos o tres secuencias codificantes para la coexpresión de un solo vector pAL. © 2018 por John Wiley & Sons, Inc.


Resultados

Ingeniería de Synechococcus 2973 para la producción de sacarosa

Para diseñar una exportación de sacarosa Synechococcus Cepa 2973, la sacarosa permeasa cscB El gen se clonó en un plásmido 17 dirigido al sitio neutral 3 (NS3), que luego se introdujo en Synechococcus 2973 mediante conjugación bacteriana (Fig. 1B). Se obtuvo una cepa completamente segregada reparchando las placas varias veces, y la modificación del genoma corregida se confirmó mediante genotipificación por PCR (Fig. 1C). Para probar la producción de sacarosa en Synechococcus 2973, el 2973 diseñadocscB La cepa (Tabla 1) se cultivó en BG11 con NaCl 100-200 mM (Fig. 2A). Se añadió IPTG (1 mM) para inducir cscB la expresion genica. Los sobrenadantes se recogieron para el análisis de sacarosa. El título de sacarosa más alto, 8 g L -1 en 5 días, se observó en BG11 con NaCl 150 mM. La productividad volumétrica más alta fue de 1.9 g L -1 día -1 en 4 días, lo que corresponde a un rendimiento de sacarosa de 3.1 g.g -1 de biomasa celular. Esta productividad es más del doble que la de la cepa estrechamente relacionada Synechococcus 7942 (Fig. Suplementaria S1). El pH del medio fue más bajo en condiciones de producción de sacarosa porque los protones son exportados con sacarosa por el transportador CscB sacarosa / H + (Tabla complementaria S1). Además, observamos que el estrés salino resultó en un crecimiento deficiente de Synechococcus 2973 (Fig. 2B), lo que conduce a una disminución de la DO730 valores a medida que aumentaban las concentraciones de NaCl.

Producción de sacarosa en cscB-expresando Synechococcus 2973. (A) Evolución temporal de la producción de sacarosa en el cscB-expresión de cepa en medio BG11 con diversas concentraciones de NaCl. (B) OD730 de El cscB-expresión de tensión. (C) Reparto de carbono entre sacarosa y biomasa celular (BG11 con NaCl 150 mM). (D) Producción de sacarosa en diferentes condiciones de cultivo con NaCl 150 mM (5 días). El WT Synechococcus 2973 se incluyó como control. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. ND, no detectado.

Para investigar cuánto carbono fijado fotosintéticamente se dirige a la producción de sacarosa en condiciones de estrés salino, analizamos la distribución del carbono entre la sacarosa y la biomasa celular (Fig. 2C). Durante las primeras 24 horas de crecimiento, el 71% del carbono fijo (0,8 g L -1) se utilizó para la síntesis de biomasa celular, y solo se produjeron 0,3 g L -1 de sacarosa en este período. Desde el día 1 hasta el día 4, el título de sacarosa aumentó drásticamente. Durante cada uno de estos días, la productividad de sacarosa fue superior a 2 g L -1 día -1. La mayor cantidad de sacarosa se produjo entre el día 3-4, durante el cual la productividad de sacarosa alcanzó 2,8 g L -1. Después del día 3, más del 88% del carbono fijado se dirigió a sacarosa. El título disminuyó durante el día 4-5, en el que solo se produjeron 0,7 g L -1 de sacarosa.

Además, probamos la capacidad de producción de sacarosa sin la adición de IPTG o el antibiótico kanamicina. Sin inducción IPTG, el 2973-cscB La cepa produjo 6,4 g L-1 de sacarosa (Fig. 2D), que es un 21% menor que en condiciones inducidas por IPTG (Fig. 2A). Un estudio reciente informó que los promotores inducibles de IPTG (trc, laca, y Llaco-1) tienen fugas en Synechococcus 2973 18. Nuestros datos también indican que el lacUV5 el promotor tiene fugas en Synechococcus 2973. Del mismo modo, el 2973-cscB La cepa produjo 6,6 g L -1 de sacarosa sin la adición de kanamicina (Fig. 2D). Aunque el cscB gen se insertó en el genoma, este resultado muestra que se requiere kanamicina para mantener una alta productividad de sacarosa en Synechococcus 2973.

Investigación del metabolismo de carbohidratos en productores de sacarosa. Synechococcus 2973

Después de su fase de crecimiento exponencial, Synechococcus 2973 acumula una cantidad significativa de glucógeno para reservar el exceso de carbono fijo 16. Para comprender mejor la asignación de carbono entre el glucógeno y la sacarosa, analizamos el contenido de glucógeno en la producción de sacarosa. Synechococcus Cepa 2973. El 2973-cscB las células se cultivaron en BG11 con o sin NaCl 150 mM y se analizaron las cantidades de glucógeno y sacarosa. La biomasa celular fue 2 veces mayor en medio BG11 sin adición de NaCl (Fig. 3A). En ausencia de NaCl, Synechococcus 2973 produjo sólo 0,4 g L -1 de sacarosa en 5 días, que es 19 veces menor que en presencia de la sal (Fig. 3B). Por el contrario, el contenido de glucógeno disminuyó significativamente en condiciones de producción de sacarosa. En presencia de NaCl 150 mM, el 2973-cscB la cepa acumuló glucógeno menos del 1% del peso seco celular (DW) durante el día 1 y el día 3 (Fig. 3C). El día 5, el contenido de glucógeno aumentó al 10% de DW, correspondiente a 0,2 g L -1 de glucógeno (40 veces menor que la sacarosa). Sin la adición de NaCl, las células acumularon glucógeno hasta más del 40% de DW después de 3 días (Fig. 3C). Estas observaciones confirmaron además que el estrés salino redirigió los flujos de carbono de la acumulación de glucógeno a la producción de sacarosa en esta cepa diseñada.

Análisis del metabolismo de carbohidratos en Synechococcus 2973 cscB-expresión de tensión. Las células se cultivaron en medio BG11 con o sin la adición de NaCl 150 mM. (A) Acumulación de biomasa. (B) Producción de sacarosa. (C) Contenido de glucógeno. (D) RT-PCR semicuantitativa para el seguimiento de la expresión génica en síntesis de glucógeno y sacarosa. El gen de la limpieza rpoA se utilizó como control. Los números debajo del gel representan las intensidades de banda relativas de muestras que crecen con NaCl 150 mM frente a NaCl 0 mM. Los geles de longitud completa se presentan en la Fig. S2 complementaria. Los datos en los paneles A – C representan la media ± de de tres réplicas biológicas. DW, peso seco celular rpoA, Subunidad α de la ARN polimerasa.

A continuación, realizamos una RT-PCR semicuantitativa para examinar la transcripción de genes implicados en la biosíntesis de glucógeno y sacarosa, incluyendo glgC, glgA, y sps (Figura 1A). GlgC (ADP-glucosa pirofosforilasa) y GlgA (glucógeno sintasa) son las enzimas responsables de la biosíntesis de glucógeno. En Synechococcus elongatus, la enzima SPS tiene actividades de sacarosa-fosfato sintasa y sacarosa-fosfato fosfatasa 19. Por tanto, la expresin del sps se monitorizó el gen. El gen de la limpieza rpoA (que codifica la subunidad α de la ARN polimerasa) se utilizó como control para este experimento de RT-PCR 20. Niveles de transcripción de glgC y glgA no fueron significativamente diferentes con o sin la adición de NaCl (Fig. 3D). Por el contrario, el gen de síntesis de sacarosa sps se expresó en gran medida en condiciones de estrés salino (Fig. 3D), lo que sugiere que el aumento de la producción de sacarosa en el medio salino se debe a la regulación positiva de la vía biosintética de la sacarosa.

Ingeniería de la vía biosintética de la sacarosa

En las cianobacterias, se requiere estrés salino para inducir la producción de sacarosa. El gen de la biosíntesis de sacarosa sps se regula al alza en medio salino BG11 (Fig. 3D). Para expandir las aplicaciones de la producción de sacarosa en cianobacterias, diseñamos Synechococcus 2973 para producir sacarosa en medio BG11 sin NaCl añadido. La vía biosintética de sacarosa de Synechocystis sp. PCC 6803 se expresó en el 2973-cscB deformación (Fig. 4A). Se sabe que la sobreexpresión de la sps y spp genes de Synechocystis 6803 conduce a una mejora del doble en la producción de sacarosa intracelular en condiciones de estrés salino [14]. Para expresar el Synechocystis 6803 sps y spp genes en Synechococcus 2973, los clonamos en el plásmido 21 RSF1010 autorreplicable bajo el control de un IPTG inducible trc1O promotor. Los plásmidos que expresan ya sea sps Solo o sps-spp Luego se introdujeron genes en el 2973-cscB cepa (Tabla 1). Ambos sps y sps-spp Las cepas de sobreexpresión pudieron producir sacarosa en medio BG11 sin NaCl adicional (Fig. 4B). En ausencia de IPTG, el sps y sps-spp Las cepas produjeron 1.6 g L -1 y 3.4 g L -1 de sacarosa en 3 días, respectivamente, que fueron 11 veces y 23 veces más altas que el control 2973-cscB deformación (Fig. 4B). Para el sps cepa, los títulos de sacarosa no tuvieron diferencias significativas con o sin la adición de IPTG 1 mM. Curiosamente, el título de sacarosa disminuyó significativamente con la adición de IPTG 1 mM en el sps-spp cepa (Fig. 4B), lo que indica que la inducción completa de sps y spp la expresión puede ser perjudicial para la producción de sacarosa.

Ingeniería de la vía biosintética de sacarosa en Synechococcus 2973. (A) Esquemas de expresar el Synechocystis 6803 sps y spp genes en el 2973-cscB cepa. (B) Producción de sacarosa en sps y sps-spp cepas de expresión. Las células se cultivaron en medio BG11 durante 3 días sin adición de NaCl. El símbolo "+" indica que la cepa contiene las enzimas sobreexpresadas indicadas. Los datos representan la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. RBS, sitio de unión al ribosoma.


La subunidad σ 70 de la ARN polimerasa induce lacaPausa de la transcripción proximal al promotor UV5

La subunidad σ 70 de Escherichia coli La ARN polimerasa (RNAP) es un factor de inicio de la transcripción que también puede asociarse con RNAP durante el alargamiento. Proporcionamos evidencia bioquímica de que σ 70 induce una pausa de transcripción en el lacaEl promotor UV5 después de que RNAP haya sintetizado un transcrito de 17 nucleótidos. La pausa dependiente de σ 70 requiere una interacción entre σ 70 y una parte del laca secuencia del operador represor que se asemeja a un consenso promotor -10. El polisacárido heparina desencadena la liberación de σ 70 de los complejos en pausa, lo que respalda la opinión de que durante la transición del inicio al alargamiento, las interacciones entre σ 70 y el núcleo RNAP se debilitan. Proponemos que la unión y retención de σ 70 en complejos de alargamiento se estabilizan por su capacidad para formar contactos con el ADN de la burbuja de transcripción. Además, sugerimos que la subunidad σ 70 en el complejo de elongación puede proporcionar un objetivo para la regulación de la expresión génica.


Embrionario

Klaus I. Matthaei, en Manual de células madre, 2004

Operón lac bacteriano

los laca operón en la bacteria Escherichia coli funciona mediante un mecanismo de represión en el que una proteína inhibidora (lacI) se une a los sitios reguladores (lacO) en el promotor y desactiva la transcripción (fig. 59-2). Con la adición de lactosa, la proteína lacI sufre un cambio conformacional, que cambia su afinidad de unión por la LACO secuencias. La proteína lacI se desprende de la LACO sitios, y puede ocurrir la transcripción. E. coli utiliza este sistema para controlar estrictamente los genes necesarios para el uso de lactosa, y es completamente reversible.

Figura 59-2. Operón lac bacteriano. los laca El operón funciona mediante un mecanismo de represión. (A) Una proteína inhibidora, lacI, se une a sitios reguladores LACO en el promotor (P) y desactiva la transcripción de los genes necesarios para el metabolismo de la lactosa. (B) En la adición de lactosa, la proteína lacI sufre un cambio conformacional, que cambia su afinidad de unión por la LACO secuencias. La proteína lacI se desprende de la LACO sitios y transcripción del laca pueden ocurrir genes. (A, transacetilasa Y, permeasa y Z, β-galactosidasa).


Materiales y métodos

Xenopus manipulación de embriones

Xenopus tropicalis Los embriones se obtuvieron mediante fertilización in vitro, se desjelizaron en cisteína al 3% y se recolectaron en las etapas deseadas. Los huevos fertilizados se inyectaron con 500 ng de ARNm sintético en la etapa de 1 célula y se cultivaron hasta que los embriones de control alcanzaron la etapa 8. Se explantaron las tapas de los animales en la etapa 8 y se cultivaron hasta la etapa 10,5 en 0,1 x MMR. Las licencias de uso de animales fueron proporcionadas por los permisos de DEC RU-DEC 2012-116, 2014-122 y la aprobación de CCD AVD1030020171826.

ATAC-seq específico para el estadio y el tejido

Después de la demultiplexación, las lecturas se recortaron utilizando fastp v0.20.1 (Chen et al, 2018) y alineado con la X. tropicalis genoma (xt9.0 y xt10.0) con bwa-mem v0.7.17 usando la configuración predeterminada. Las lecturas que se asignan al ADN mitocondrial se excluyeron del análisis junto con las lecturas de baja calidad, incluidas las repeticiones y duplicados (MAPQ & lt 10). Todas las lecturas mapeadas se compensaron con + 4 pb para la cadena + y - 5 pb para la cadena -. Se llamaron picos para cada muestra utilizando MACS2 v2.2.7 (Zhang et al, 2008) con los parámetros “-q 0.05 --nomodel –shift −100 --extsize 200 –keep-dup 1".

ATAC-seq de celda única

Los núcleos se aislaron con un método adaptado de Mariano (Mariano, 1964). Brevemente, 100 Xenopus Los embriones se suspendieron en 300 µl de tampón E1 helado (KCl 110 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl 5 mM2, EDTA 0,1 mM, DTT 2 mM) que contiene sacarosa 0,25 M. A la muestra, se le añadieron 2,4 ml de tampón E1 enfriado con hielo con 2,2 M de sacarosa y se mezclaron suavemente. A continuación, la suspensión de embriones se colocó en capas sobre un cojín de 150 µl de sacarosa 2,2 M enfriada con hielo en un tubo de polialómero SW60 Beckman. Los núcleos se sedimentaron mediante centrifugación a 130.000 gramo a 4 ° C. El sedimento se resuspendió cuidadosamente en 250 µl de tampón nuclear (glicerol al 25%, Tris-HCl 25 mM pH 7,4, KCl 70 mM, MgCl 5 mM2, EDTA 0,2 mM, DTT 2 mM), y los núcleos se lavaron dos veces haciéndolos girar a través de una almohadilla de glicerol al 80% de 20 mu l. Después del último lavado, los núcleos se resuspendieron en 200 µl de tampón de núcleos 1x (10x Genomics). Las bibliotecas se generaron usando Cromo Single Cell ATAC (v1.1 Chemistry 10 × Genomics). La llamada de base, la demultiplexación y el mapeo se realizaron utilizando cellranger-atac (v1.2.0, 10 × Genomics). Las lecturas se asignaron al X. tropicalis genoma (xt10.0), descargado de Xenbase (http://www.xenbase.org/, RRID: SCR_003280 Karimi et al, 2018). Las estadísticas de secuenciación y mapeo se presentan en Dataset EV7. Los códigos de barras con cobertura de secuencia baja (células con & lt 1.000 fragmentos de transposición), bajo enriquecimiento (enriquecimiento de TSS & lt 4.5) o cobertura cromosómica muy variable (fragmentos únicos por Mbp, calculado por coeficiente de variación cromosómico de cobertura cromosómica & gt 1) se excluyeron de la secuencia descendente análisis.

Preparación y secuenciación de bibliotecas de ARN unicelular y ARN total

Los explantes de embriones disecados se disociaron en células individuales utilizando medios libres de Ca 2+ y Mg 2+ (Sive et al, 2007). Se seleccionaron 200 células para realizar RNA-seq de una sola célula utilizando la versión modificada del protocolo STRT-seq (Islam et al, 2012 Dong et al, 2018) Se agregó ARN de aumento de ERCC (Thermo Fisher Scientific, 4456740) al tampón de lisis. Después de la reacción de transcripción inversa, realizamos 4 + 16 ciclos de amplificación por PCR para la síntesis de ADNc. El ADNc amplificado se purificó con el kit de purificación Zymo y perlas Agencourt AMPure XP, respectivamente, y su concentración se midió con el fluorómetro Qubit® 2.0 (Q32866, Life Technologies). La calidad del ADNc amplificado y la distribución del tamaño del fragmento de ADN se evaluaron mediante el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies) con el kit de ADN de alta sensibilidad (5067-4626, Agilent). Las bibliotecas de secuenciación se prepararon utilizando el KAPA Hyper Pre-Kit (KR0961 - v6.17, Kapa Biosystems). Las concentraciones de los fragmentos con los adaptadores indexados aproximados se cuantificaron mediante la cuantificación de la biblioteca KAPA. Las bibliotecas se secuenciaron en la plataforma Illumina y los datos se mapearon usando Bowtie (versión: 1.2.2 Langmead & Salzberg, 2012) a los archivos indexados del genoma xt9 (cf. Dataset EV7).

El ARN total se extrajo de las tapas de los animales utilizando nuestro protocolo híbrido Trizol-Zymo adaptado internamente. Las concentraciones de todas las muestras de ARN se midieron utilizando el ensayo DeNovix dsDNA High Sensitivity (número de catálogo: KIT-DSDNA-HIGH-1). El cDNA se construyó usando KAPA RNA HyperPrep con RiboErase (Número de catálogo: 08278555702, Kapa Biosystems). Comprobamos la calidad de las muestras mediante RT-qPCR utilizando cebadores que abarcan regiones codificantes de genes candidatos y de mantenimiento.

Análisis de datos ATAC-seq

Análisis de datos de secuencia de ARN de una sola célula

El conjunto de datos se filtró y se verificó la calidad de las células y los genes utilizando el paquete Scater (McCarthy et al, 2017). El conjunto de datos filtrados se cargó en el paquete R Seurat (Satija et al, 2015). Los genes hipervariables se utilizaron para el análisis de componentes principales, a partir de los cuales se utilizaron los PC estadísticamente significativos para la proyección UMAP (reducción de dimensionalidad). Identificamos siete grupos distintos de células utilizando la función FindClusters en Seurat. Sobre la base de los grupos predichos, los genes marcadores relevantes para cada grupo se tomaron para un análisis adicional con otros conjuntos de datos. Procesamiento y visualización de los datos de secuenciación de ARN unicelular de embriones completos (Briggs et al, 2018) se realizaron con scanpy (Wolf, Angerer & Theis, 2018). Los grupos de células unicelulares de estadio 10½ AC y DMZ se colocaron en los datos de embriones completos basándose en las correlaciones de Spearman entre grupos de ambos conjuntos de datos, basadas en la expresión media del grupo de los genes hipervariables comunes a los dos conjuntos de datos.

Integración de ATAC-seq y RNA-seq de una sola célula

Los genes hipervariables superiores (HVG) del análisis de scRNA-seq se asociaron con los picos de AC-DMZ ATAC-seq más cercanos usando el análisis GREAT (Fig. 5B y C). Este modelo de pico a gen consta de una matriz, con filas como ubicaciones de picos y columnas como valores de expresión de genes diana en los siete grupos. Esto se utilizó como entrada de la predicción de motivos utilizando la función gimme maelstrom de GimmeMotifs (preimpresión: Bruse & Heeringen, 2018). A continuación, se examinaron los factores de transcripción asociados con los motivos predichos basándose en su correlación entre la actividad del motivo y su expresión génica en los grupos.

  • secuenciación ATAC a granel: número de acceso GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • secuenciación ATAC de celda única: número de acceso GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • secuenciación de ARN unicelular: número de acceso GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • secuenciación de ARN a granel: número de acceso GEO GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).

¿Tengo que usar sacarosa para inducir un promotor lac? - biología

a) En presencia de altas concentraciones de triptófano, solo se sintetizan transcripciones cortas del operón trp debido a la atenuación de la transcripción 5 'a los genes estructurales. Esto está mediado por el reconocimiento de dos codones Trp en la secuencia líder. Si estos codones fueran mutados para ser mutaciones sin sentido de UAG ámbar, ¿qué efecto tendría esto sobre la regulación del operón en presencia o ausencia de triptófano? Explicar

Recuerde, a diferencia del operón his, el operón t rp está controlado tanto por la represión como por la atenuación.

Si hay una gran cantidad de trp, el operón se reprimirá.

El efecto de las mutaciones sin sentido se revelaría bajo niveles intermedios de trp donde el atenuador normalmente modula la eficiencia de terminación de la transcripción. Normalmente, a concentraciones intermedias de trp, algunas transcripciones terminan y otras pasan a través del operón, dependiendo de la rapidez con la que se traducen los codones trp en el líder. Cambiarlos para detener los codones haría que los ribosomas se detuvieran allí, imitando de manera efectiva la inanición extrema de trp que conduce a la máxima expresión del operón.

El operón trp se expresaría a niveles máximos en ausencia de triptófano, ya que el represor trp no estaría unido y la región líder mutante permitiría la expresión completa.

b) Se ha identificado un gen de fusión lacI-lacZ que produce una proteína quimérica con función represora y szlig-gal. ¿Qué fenotipo (s) de Lac esperaría de una cepa portadora de este gen de fusión?

El mutante debería expresar la actividad lacZ de forma constitutiva pero a niveles muy bajos, ya que la expresión de la proteína de fusión estaría dirigida por el promotor lacI.

Esto sería fenotípicamente Lac, ya que la expresión de bajo nivel no permitiría el crecimiento en lactosa. Recuerde que no hay forma de inducir la síntesis de la proteína de fusión o del gen lacY porque se elimina la región del promotor-operador lac.

c) Cuando una cepa de Hfr que lleva un profago lambda se aparea con un receptor no lisogénico, se induce al profago a crecer líticamente poco después de la transferencia al receptor. ¿Qué sugiere esto sobre el mecanismo por el cual el profago lambda se mantiene en el cromosoma bacteriano?

Esto es exactamente análogo al experimento PaJaMo e indica que la lisogenia está controlada por la represión.

d) Cuando un macho de una cepa P de Drosophila se cruza con una hembra de tipo M, la progenie suele ser estéril. Si un macho de tipo M o P se cruza con una hembra de tipo P, la progenie es fértil.

& # 9i) ¿Qué implica esto sobre el mecanismo por el cual se controla la transposición del elemento P?

Esto es exactamente análogo al caso con lambda anterior y al PaJaMo expt. Trae elementos P a un citotipo M y obtiene la transposición. Al revés o P en P no pasa nada. El control es negativo.

& # 9ii) ¿Por qué la progenie del cruce P X & trade M es viable pero estéril?

Porque la transposición se limita a la línea germinal. La movilización de los elementos P ocurre solo en las gónadas de la progenie. Por tanto, la progenie es somáticamente normal pero, debido a la movilización masiva de elementos P en sus gónadas, es estéril.

P) Un asistente de enseñanza de pre-medicina ideó un experimento para demostrar el concepto de mutaciones dominantes en cis a una clase de laboratorio. El TA hizo que la clase creara dos clones recombinantes en el vector plásmido multicopia pBR322. El primer plásmido portaba la región de promotor-operador lac de tipo salvaje y genes estructurales Z e Y mutantes. El segundo plásmido portaba la región de promotor-operador de tipo salvaje y los genes Z + e Y +. Los plásmidos se introdujeron en cepas de E. coli de los genotipos I + o c Z + Y + e I + o c Z - Y - y se analizaron para determinar la actividad lacZ mediante placa en placas X-gal con los siguientes resultados:

Fenotipo de colonia en placas X-gal

I + o + Z + Y + control de tensión

I + o c Z + Y + control de tensión

pBR322 o + Z - Y - / I + o c Z + Y +

pBR322 o + Z + Y + / I + o c Z - Y -

a) ¿Por qué sorprendieron los resultados a la AT?

El TA esperaba que la deformación en la fila inferior de la tabla fuera inducible y no constitutiva. La implicación de los resultados en la tabla es que la mutación o c es trans dominante y no cis dominante.

b) ¿Qué salió mal? Proporcione una explicación de los resultados aparentemente anómalos.

El problema se debe al plásmido multicopia. El TA quería imitar el estado diploide, pero en lugar de utilizar un F 'de copia única, utilizó el pBR322 de varias copias. Esto significa que la secuencia del operador estaba presente en multicopia y tituló la cantidad limitada de represor (

10 moléculas) presentes en la cepa de tipo salvaje. Por tanto, la mayoría de los plásmidos expresaron los genes lacZ e Y en la fila inferior dando la apariencia de que o c actúa en trans.

c) Sugiera un experimento para probar su respuesta a la parte b).

Si es cierto, se debería poder imitar la situación clonando solo el operador de tipo salvaje (sin genes Z + o Y +) en el plásmido e introduciéndolo en una cepa de tipo salvaje. Uno esperaría una expresión constitutiva de lac ya que el operador del plásmido valorará el represor.

Una segunda prueba sería incluir el gen represor en el plásmido multicopia. En este caso, debería hacerse suficiente represor para reprimir todos los operadores o + y se vería el efecto dominante en cis de la mutación o c.

Una tercera prueba sería utilizar un plásmido de copia única. Allí, la situación sería como el caso con una F 'y el carácter cis-actuante del alelo o c sería evidente.

P) Los siguientes tres gráficos trazan el crecimiento de E. coli y la producción de ßzlig-galactosidasa (producto lacZ) cuando se cultiva en un medio con glucosa y lactosa como fuentes de carbono.

P) Los siguientes tres gráficos trazan el crecimiento de E. coli y la producción de zlig-galactosidasa (producto lacZ) cuando se cultiva en un medio con glucosa y lactosa como fuentes de carbono.

(a) Explique el significado de la gráfica de la izquierda.

El gráfico ilustra el proceso de crecimiento diauxico. Las células usan la mejor fuente de carbono (glucosa) primero y solo usan lactosa cuando la glucosa se agota. Los genes lac permanecen reprimidos mientras la glucosa está presente aunque el inductor (lactosa) esté presente, y solo se sintetizan cuando se agota la glucosa.

(b) ¿Los resultados que se muestran en los gráficos del medio y de la derecha son consistentes con la idea de que la glucosa-lactosa diauxie (represión de catabolitos) está regulada directamente por la concentración celular de AMPc? Explica por qué o por qué no.

No, los datos son incompatibles con la idea. El gráfico central indica que B-gal se sintetiza a una velocidad alta en presencia de glucosa si no hay proteína represora. Esto indica que el complejo CRP-cAMP debe unirse al promotor del operón lac incluso en presencia de glucosa. Según el modelo de concentración de AMPc, los niveles de AMPc deberían ser bajos en glucosa y, por tanto, el operón lac debería estar esencialmente apagado incluso en ausencia de represor. Los datos del gráfico de la derecha sugieren esencialmente lo mismo. Cuando se añade el inductor IPTG en presencia de glucosa, se induce inmediatamente el operón lac. Esto también indica que CRP-cAMP debe unirse al promotor lac en presencia de glucosa.

6) El VIH infecta las células humanas a través de un proceso que implica la interacción física entre la glicoproteína gp120 de la envoltura viral y la proteína CD4 presente en la superficie de muchas células del sistema inmunológico. Para que el VIH entre en las células, se cree que la gp120 también debe interactuar con el producto del gen ccr-5 (también conocido como ckr-5). Una posibilidad alternativa es que la proteína de la cápside viral interactúe con CCR-5 después de que la membrana celular y las envolturas virales se hayan fusionado, y que esta interacción permita que la cápside viral entre en el citoplasma.

a) Proponer una prueba genética que distinga si es gp120 o la proteína de la cápside la que contacta físicamente con CCR-5. Describa los experimentos, incluidos los controles que considere útiles, e indique los resultados esperados si la primera hipótesis es cierta.

Utilice el sistema de dos híbridos. Fusionar CCR-5 y CD4 al dominio de unión de ADN lexA y gp120 y la proteína de la cápside al dominio de activación de la transcripción GAL4. Construya una construcción informadora que coloque a lacZ bajo el control de un promotor basal de levadura y los sitios del operador lexA. Pruebe las diversas proteínas de fusión observando la expresión de lacZ. Los altos niveles de actividad de & szlig-gal indican una interacción positiva entre la proteína fusionada al dominio de unión al ADN y la fusionada al dominio de activación.


Tipos de promotores inducibles

Chemical agents, temperature, and light are all examples of factors that can lead to the induction of a promoter. Below, you’ll find a short description of these three types of inducible promoters, and examples of each type. Many of these promoter systems are available at Addgene!

Chemically inducible promoters

Chemically regulated promoters are among the most common inducible promoters. The positive inducible tetracycline ON (Tet-On) system, a versatile tool developed for use in prokaryotes and eukaryotes, works via direct activation. En este sistema, el activator rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) is normally inactive and cannot bind the tetracycline response elements (TRE) in a promoter. Tetracycline and its derivatives serve as inducing agents to allow promoter activation.

One of the most commonly used prokaryotic promoters is the negative inducible pLac promoter. This promoter requires removal of the lac repressor (lacI protein) for transcription to be activated. In the presence of lactose or lactose analog IPTG, the lac repressor undergoes a conformational change that removes it from lacO sites within the promoter and ceases repression of the target gene. A simplified lac inducible system is found in many bacterial expression vectors.

Negative inducible promoter pBad is another popular prokaryotic promoter often used for bacterial protein purification. When arabinose is absent, regulatory protein AraC binds O and I1 sites upstream of pBad, blocking transcription. The addition of arabinose causes AraC to bind I1 and I2 sites, allowing transcription to begin. In addition to arabinose, cAMP complexed with cAMP activator protein (CAP) can also stimulate AraC binding to I1 and I2 sites. Supplementing cell growth media with glucose decreases cAMP and represses pBad, decreasing promoter leakiness.

Other examples of chemically induced promoters include positive inducible alcohol y steroid regulated promoters commonly used in plant research.

Temperature inducible promoters

Temperature sensitive expression systems are typically less leaky than chemically induced promoters they show near-zero expression at regular temperatures but can be induced by heat or cold exposure. Examples include the heat shock-inducible Hsp70 or Hsp90-derived promoters, in which a gene of choice is only expressed following exposure to a brief heat shock. In the case of Hsp70, the heat shock releases heat shock factor 1 (HSF-1), which subsequently binds to heat shock elements in the promoter, thereby activating transcription. Addgene depositors have developed heat shock-inducible Cre and Cas9 for easy genome engineering in species like C. elegans and Drosophila.

Light inducible promoters

Light is another way to activate gene expression, and two-component systems used in synthetic biology use light to regulate transcription. Red flame plasmid pDawn contains the blue-light sensing protein YFI. When light is absent, YFI phosphorylates FixJ, which binds to the FixK2 promoter to induce transcription of the phage repressor cI. Repressor cI inhibits transcription from phage promoter pR, preventing expression of a reporter gene. When light is present, YFI is inactive, preventing repressor cI synthesis and allowing reporter gene transcription to take place. Addgene also has yellow flame light-regulated two component systems designed by the Tabor lab.


This work was supported by grants from the National Key R&D Program of China (2018YFA0900600), the National Natural Science Foundation of China (31788103, 31971370 and 31900301), the Chinese Academy of Sciences (QYZDY-SSW-SMC030), and R&D Program in Key Areas of Guangdong Province (2018B020202005).

Sinian Xing and Kunling Chen contributed equally to this work.

Afiliaciones

State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Center for Genome Editing, Institute of Genetics and Developmental Biology, Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China

Sinian Xing, Kunling Chen, Haocheng Zhu, Rui Zhang, Huawei Zhang & Caixia Gao

College of Advanced Agricultural Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing, China