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¿Por qué la introducción de una copia adicional de un gen relacionado con la pigmentación provoca una interferencia del ARN en Petunia?


El ARNi se hizo famoso después del experimento de Fire y Mello en C.elegans; sin embargo, se había observado antes. En los años 80, Jorgensen estaba tratando de aumentar la pigmentación de las flores de Petunia mediante la introducción de copias adicionales del gen de la calcona sintetasa, que codifica una enzima involucrada en la síntesis de antocianinas.

Sin embargo, este experimento condujo al silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) mediante un mecanismo que no se entendía en ese momento, llamado interferencia de ARN.

Aquí puede encontrar más información sobre el experimento (incluido el vector utilizado para introducir el gen).

Sé cómo funciona el ARNi por la vía clásica; sin embargo, no entendí cómo una copia adicional del gen podría generar silenciamiento génico. La introducción de secuencias de ADN se ha utilizado para eliminar genes diana, sin embargo, generalmente estas secuencias se planifican de manera que formen una horquilla que es reconocida por Dicer; probablemente, el investigador no utilizó tal secuencia. Además, los genes exogénicos se utilizan ampliamente sin dar lugar a ARNi no planificado.

¿Alguien sabe más información sobre lo que posiblemente sucedió en el experimento para producir ARNi?


La respuesta está en las diapositivas a las que proporcionó un enlace. El hecho clave es que Craig & Andy realizaron controles cuidadosos para demostrar que era la presencia de dsRNA tanto en el control de sentido como en la muestra experimental antisentido la responsable de la eliminación mediada por RNAi. En realidad, Ken Kemphues demostró esto anteriormente en un artículo de Nature (el control también derribó la expresión génica) pero no persiguió el mecanismo.

Por tanto, infiero que la construcción de expresión génica transgénica introducida en las petunias también debe dar lugar al dsRNA. Estoy menos familiarizado con las consecuencias de introducir ADN extraño en una célula vegetal (por ejemplo, ¿se integra una sola copia, múltiples copias ?, ¿se mantiene extracromosómicamente?)


ARNi y microARN: tecnologías innovadoras para la mejora del valor nutricional de las plantas y la ingeniería metabólica

Este artículo plantea la compleja cuestión de mejorar el valor nutricional de las plantas a través de la ingeniería metabólica y el potencial del uso de tecnologías de ARNi y micro ARN para superar esta complejidad, centrándose en algunos ejemplos clave. También destaca el conocimiento actual de las funciones de ARNi y microARN y analiza los avances recientes en el desarrollo de nuevos vectores de ARNi y sus aplicaciones. La interferencia de ARN (ARNi) y el microARN (miARN) son avances recientes en las ciencias de la vida reconocidos por el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006. La importancia de estos descubrimientos se relaciona no solo con el esclarecimiento de los aspectos reguladores fundamentales de la expresión génica, sino también con el tremendo potencial de sus aplicaciones en plantas y animales. Aquí, revisamos aplicaciones recientes de ARNi y microARN para mejorar el valor nutricional de las plantas, discutimos aplicaciones de tecnologías metabolómicas en ingeniería genética y proporcionamos una actualización sobre las tecnologías relacionadas de ARNi y microARN.


Contenido

RdDM participa en una serie de procesos biológicos en la planta, incluidas las respuestas al estrés, la comunicación de célula a célula y el mantenimiento de la estabilidad del genoma a través del silenciamiento de TE.

Silenciamiento de elementos transponibles y estabilidad del genoma Editar

Los TE son fragmentos de ADN que, cuando se expresan, pueden moverse por el genoma mediante un mecanismo de copiar y pegar o cortar y pegar. Las nuevas inserciones de TE pueden alterar la codificación de proteínas o las secuencias reguladoras de genes, lo que puede dañar o matar la célula u organismo huésped. [1] Como resultado, la mayoría de los organismos tienen mecanismos para prevenir la expresión de TE. Esto es particularmente clave en los genomas de las plantas, que a menudo son ricos en TE. Algunas especies de plantas, incluidos cultivos importantes como el maíz y el trigo, tienen genomas que constan de más del 80% de ET. [1] [2] RdDM juega un papel clave en el silenciamiento de estos elementos móviles de ADN en plantas al agregar la metilación del ADN sobre nuevas inserciones de TE y reforzar constantemente la metilación del ADN sobre los TE existentes, inhibiendo la transposición y manteniendo la estabilidad del genoma a largo plazo. [3] Aunque el mecanismo RdDM en sí es exclusivo de las plantas, el uso de la metilación del ADN para silenciar los ET es una estrategia común entre los eucariotas. [4]

RdDM se dirige principalmente a pequeños TEs y fragmentos de TE cerca de genes, que generalmente se encuentran en regiones eucromáticas abiertas y accesibles del genoma que son permisivas para la expresión génica. [3] [5] En estas regiones, el estado "activo" de la cromatina tiene una tendencia a extenderse desde genes expresados ​​a regiones reprimidas cercanas, como TE, lo que puede hacer que estos TE se activen y transpongan. [3] La actividad continua de RdDM se opone a la propagación de la cromatina activa, manteniendo un estado heterocromático represivo silencioso sobre los ET en estas regiones por lo demás eucromáticas. A su vez, la actividad de RdDM recluta otras vías que ayudan a establecer y propagar el estado heterocromático silencioso (ver 'Interacciones entre RdDM y otras vías de modificación de cromatina'). Debido a la naturaleza autorreforzante de estas vías de silenciamiento, la actividad de RdDM excesiva también puede hacer que el estado de cromatina heterocromático silencioso sobre los ET se propague a los genes cercanos y los reprima, con consecuencias potencialmente dañinas para el organismo. [3] [5] Por lo tanto, la actividad de RdDM debe ajustarse con precisión para mantener un equilibrio entre la represión de los ET y permitir la expresión de genes cercanos. [3]

Además de mantener un silenciamiento estable de TE, RdDM también puede iniciar el silenciamiento transcripcional de ADN extraño, incluidas las inserciones de TE novedosas, secuencias derivadas de virus y transgenes (ver también 'Estreses bióticos' y 'Silenciamiento de transgenes' más abajo). [6] [7] [8] [9] [10] Cuando los ET se integran cerca de los genes, el silenciamiento de los ET mediado por RdDM a menudo afecta la expresión génica. [3] [1] Sin embargo, esto no siempre es perjudicial y, a veces, puede superarse mediante otros procesos, [11] o alterar la expresión génica de formas beneficiosas para la planta. A lo largo del tiempo evolutivo, los ET beneficiosos pueden convertirse en una parte importante del mecanismo por el cual se regula un gen. [3] [1] En un ejemplo, el gen ROS1 se encuentra adyacente a un pequeño helitrón TE que normalmente está metilado por RdDM. [12] [13] Si bien la metilación del ADN se asocia normalmente con la represión transcripcional, este no es el caso en el ROS1 lugar. En cambio, la metilación del helitrón TE promueve ROS1 expresión, entonces ROS1 la expresión se pierde en mutantes de la vía RdDM que no pueden metilar el TE. [12] [13] Curiosamente, ROS1 codifica una ADN glicosilasa que funciona para eliminar la metilación del ADN del genoma. [14] El vínculo entre ROS1 La expresión y la actividad RdDM en este TE asegura que las actividades de metilación y desmetilación del ADN permanezcan en equilibrio, lo que ayuda a mantener la homeostasis de la metilación del ADN en todo el genoma. [12] [13] Por lo tanto, la regulación de los TEs mediada por RdDM puede conducir a resultados regulatorios beneficiosos.

Algunos ET han desarrollado mecanismos para suprimir o escapar del silenciamiento basado en RdDM con el fin de facilitar su propia proliferación, lo que lleva a una carrera armamentística evolutiva entre los ET y sus genomas anfitriones. En un ejemplo, se encontró que una secuencia derivada de TE produce ARNs que desencadenan la represión postranscripcional de un componente de la ruta RdDM, que inhibe RdDM. [15] Esta secuencia puede haber ayudado al TE original a escapar del silenciamiento basado en RdDM e insertarse en el genoma del hospedador.

El estudio de cómo RdDM apunta y reprime diferentes tipos de TE ha llevado a muchos conocimientos importantes sobre cómo funciona el mecanismo RdDM. El retrotransposón EVADIR (EVD) fue uno de los primeros ET que se mostró específicamente reprimido por ARNs derivados de RdDM. [16] Trabajo posterior utilizado EVD para rastrear el mecanismo por el cual una nueva inserción de TE se silencia, revelando un importante vínculo mecanicista entre el silenciamiento génico postranscripcional y RdDM. [9] Estudios de otros retrotransposones, incluidos ONSEN, que está regulado tanto por RdDM como por estrés por calor, [17] [18] y los TE de la familia Athila, [10] entre muchos otros, también han proporcionado información valiosa sobre el silenciamiento de TE mediado por RdDM.

Desarrollo y reproducción Editar

Una serie de cambios epigenéticos necesarios para el desarrollo y la reproducción normales en plantas con flores involucran RdDM. En un ejemplo bien estudiado, se requiere RdDM para la represión de la FWA gen, que permite el momento adecuado de la floración en Arabidopsis. [19] El FWA El promotor contiene repeticiones en tándem que normalmente son metiladas por RdDM, lo que conduce a la represión transcripcional. [20] La pérdida de esta metilación reactiva FWA expresión, provocando un fenotipo de floración tardía. [19] [20] La pérdida de metilación del ADN y el fenotipo asociado de floración tardía pueden transmitirse de manera estable a la progenie. Dado que el desmetilado fwa alelo conduce a un cambio estable y hereditario en la expresión de FWA sin ningún cambio en la secuencia de ADN, es un ejemplo clásico de un epialélico.

Las mutaciones en la vía RdDM pueden afectar fuertemente la formación de gametos y la viabilidad de las semillas, particularmente en especies de plantas con alto contenido de TE como el maíz y Brassica rapa, destacando la importancia de esta vía en la reproducción vegetal. [21] [22] [23] Durante la formación de gametos, se ha planteado la hipótesis, y en algunos casos se ha demostrado, que RdDM ayuda a reforzar el silenciamiento de TE en las células germinales. [24] [25] Tanto en el polen como en los óvulos, una célula de soporte sufre una reprogramación epigenética, perdiendo la metilación del ADN y otras marcas epigenéticas en varios loci, incluidos los ET. [26] [24] Esto provoca la reactivación de TE y estimula la producción de ARNs derivados de RdDM contra estos TE en las células de soporte. Luego, se cree que los ARNs se mueven desde la célula de soporte a la célula germinal para reforzar el silenciamiento de TE en la próxima generación. Este fenómeno se ha observado en el polen, pero aún no se ha demostrado definitivamente en el óvulo. [27] [28] Esta función de los ARNs en plantas se asemeja a la función de los ARNpi en el desarrollo de la línea germinal en Drosophila y algunos otros animales. [29] [30] Un fenómeno similar también puede ocurrir en las raíces para preservar el silenciamiento de TE en poblaciones importantes de células madre. [31]

La vía RdDM también participa en la regulación de la expresión impresa en algunos genes. [32] Este patrón de expresión inusual específico del padre de origen ocurre en varios loci en el endospermo durante el desarrollo de semillas en plantas con flores. Algunos factores involucrados en la vía RdDM están impresos (favoreciendo la expresión del alelo paterno) en diversas especies, incluyendo A. thaliana, A. lyrata, C. rubéolay maíz. [33] [34] [35] [36] La RdDM también juega un papel en la mediación de los efectos de la dosis de genes observados en semillas derivadas de cruces interploides, [37] [38] aunque el mecanismo para esto sigue siendo en gran parte desconocido.

También hay evidencia de que RdDM juega un papel en varios otros aspectos del desarrollo de la planta, incluida la latencia de las semillas, [39] la maduración de la fruta [40] y otras vías involucradas en la floración. [41] Sin embargo, la mayoría de estos datos son correlativos y se necesitan más estudios para comprender el papel de RdDM en estos procesos.

Respuesta al estrés Editar

Estrés abiótico Editar

RdDM ayuda a las plantas a responder a una serie de estreses abióticos, como el estrés por calor, la sequía, la falta de fosfato, el estrés por sal y otros. [42] Muchos ET se regulan positivamente en condiciones de estrés abiótico, [43] [44] y, por lo tanto, una función de RdDM en la respuesta al estrés es ayudar a contrarrestar esta activación. En un ejemplo, el retrotransposón ONSEN está regulado positivamente por el estrés por calor, pero normalmente permanece suprimido por los ARNs asociados a RdDM y solo puede transponerse de manera eficiente en plantas sometidas a estrés por calor que también son deficientes en RdDM. [17] [18] De manera más general, en plantas expuestas al estrés por calor, varios componentes de la vía RdDM se regulan al alza y las mutaciones en algunos componentes de la maquinaria RdDM reducen la tolerancia al calor, lo que sugiere que RdDM juega un papel importante durante el estrés por calor. [45] [46] Además de regular los ET en condiciones de estrés, RdDM también puede regular genes para desencadenar respuestas de estrés adecuadas. En condiciones de baja humedad, las hojas producen menos estomas debido a la regulación a la baja de dos genes implicados en el desarrollo de los estomas, mediada por RdDM. [47] De manera similar, RdDM se regula negativamente en respuesta al estrés salino, y se ha demostrado que esto desencadena la expresión de un factor de transcripción importante en la resistencia al estrés salino. [48]

Estrés biótico Editar

RdDM se descubrió inicialmente como una respuesta a la infección por viroides, [49] y junto con el ARNi juega un papel importante en la defensa de la planta contra viroides y virus. La maquinaria RdDM y RNAi reconoce los RNA virales y los procesa en sRNA, que luego se pueden usar en ambas vías para degradar el RNA viral (RNAi) y silenciar el DNA viral (RdDM). [50] [51] [52] Sin embargo, se sabe poco acerca de cómo la maquinaria RdDM y RNAi distingue entre los RNA virales y los RNA producidos por la planta huésped. Los mutantes defectuosos en RdDM y otros mutantes deficientes en metilación son a menudo hipersensibles a la infección viral. [53] [54] Las interacciones virus-huésped son otro ejemplo de una carrera armamentista evolutiva, y muchos virus de plantas codifican supresores tanto de RdDM como de RNAi en un intento de evadir las defensas de la planta huésped. [55] [53] [56] [57]

RdDM también participa en la protección de la planta de otras tensiones bióticas, [50] incluidas las infecciones bacterianas, [58] las infecciones por hongos, [59] y la depredación. [60] La pérdida de RdDM puede tener efectos opuestos sobre la resistencia de diferentes patógenos. Por ejemplo, algunos mutantes de RdDM tienen una mayor susceptibilidad a la bacteria. Agrobacterium tumefaciens, [61] pero esos mismos mutantes tienen menor susceptibilidad a la bacteria Pseudomonas syringae, [58] destacando la complejidad de las diferentes vías de defensa de patógenos y sus interacciones con RdDM. [62]

Silenciamiento transgénico Editar

Además de los factores estresantes de ácidos nucleicos extraños de origen natural como los ET y los virus, las secuencias de ADN introducidas artificialmente, como los transgenes, también son objeto de represión por parte de RdDM. [63] [6] Los transgenes se utilizan ampliamente en la investigación genética para estudiar la función y regulación de los genes, y en el fitomejoramiento para introducir propiedades nuevas y deseables en una planta. Por lo tanto, el silenciamiento de transgenes por RdDM y otros mecanismos ha resultado problemático para los investigadores de plantas. Los esfuerzos para comprender cómo se silencian los transgenes han ayudado en última instancia a revelar gran parte de lo que sabemos ahora sobre la vía RdDM (consulte 'Historia y descubrimiento de RdDM'). En un ejemplo temprano, los investigadores transformaron secuencialmente plantas con dos transgenes diferentes que compartían parte de su secuencia de ADN. [64] Descubrieron que la transformación del segundo transgén en plantas conducía a que el primer transgén ganara la metilación del ADN y se inactivara. [64] Esto proporcionó una pista temprana de que existía un mecanismo basado en secuencias de acción trans para el silenciamiento transcripcional de ADN extraño, que más tarde se demostró que era RdDM.

Estrés y "memoria" epigenética mediada por RdDM Editar

Debido a la heredabilidad de los patrones de metilación del ADN en las plantas, y la naturaleza autorreforzante de RdDM y otras vías de metilación del ADN, cualquier cambio de metilación del ADN causado por factores ambientales estresantes tiene el potencial de mantenerse y transmitirse a las generaciones futuras. Esto puede permitir que los cambios de metilación del ADN inducidos por el estrés actúen como una "memoria" del factor estresante y ayuden a preparar la planta o su progenie para responder de manera más eficiente al estrés si se vuelven a exponer. [50] [65] Por ejemplo, los ARNs derivados de RdDM contra ET o virus que ya se han integrado en el genoma y han sido silenciados sirven como una "memoria" de esas infecciones previas, protegiendo contra futuras invasiones por secuencias similares. También hay evidencia de que los cambios de metilación del ADN debido a otros factores estresantes, como el estrés por calor o la sal, pueden persistir en la progenie de las plantas estresadas incluso en ausencia del factor estresante original. [66] En este estudio, la persistencia de los cambios de metilación del ADN inducidos por el estrés requirió varias proteínas relacionadas con RdDM, lo que sugiere que RdDM participó en el mantenimiento de los patrones de metilación del ADN alterados por estrés. En otro ejemplo, la resistencia al ataque de insectos se transmitió a la progenie a través de cambios de metilación del ADN, y esta herencia también dependía de las vías funcionales de biogénesis del ARNc. [60] [50] Por lo tanto, RdDM puede alterar potencialmente el epigenoma de la planta en respuesta al estrés y ayuda a mantener estos cambios para modular futuras respuestas al estrés en la planta afectada y sus descendientes.

Señalización de corto y largo alcance Editar

Las moléculas de ARNc producidas por RdDM y otras vías pueden moverse entre las células a través de plasmodesmos y también pueden moverse sistémicamente a través de la planta a través de la vasculatura. [67] [68] [69] Por lo tanto, tienen el potencial de actuar como moléculas de señalización. Esto se ha demostrado en plantas diseñadas para expresar proteína verde fluorescente (GFP). [70] La proteína GFP producida por estas plantas hizo que brillaran de color verde bajo ciertas condiciones de luz. Cuando se injertó tejido de una segunda planta que expresaba una construcción de sRNA complementaria a GFP en la planta que expresaba GFP, se perdió la fluorescencia de GFP: después del injerto, los sRNA que se producían en los tejidos de la segunda planta se movían hacia los tejidos de la primera, GFP -expresando la planta y activando el silenciamiento de GFP. [70] El mismo estudio mostró que un subconjunto de estos ARNs móviles desencadenaban la adición de metilación del ADN al locus GFP a través de RdDM. Por lo tanto, los ARNs involucrados en RdDM pueden actuar como moléculas de señalización y desencadenar la adición de metilación del ADN en loci complementarios en células alejadas de donde se generaron originalmente los ARNs. Desde entonces, los estudios han demostrado que los sRNA pueden moverse y dirigir RdDM tanto de brote a raíz como de raíz a brote, aunque el efecto de silenciamiento es más robusto cuando los sRNA se mueven de brote a raíz. [69] [70] [71] [72]

El movimiento de los ARNs que impulsan la actividad de RdDM juega un papel importante en el desarrollo de las plantas, incluso durante la reproducción [23] [24] [27] y el desarrollo de las raíces. [31] En ambos casos, el movimiento del ARNs parece funcionar principalmente como una forma de reforzar la metilación del ADN y el silenciamiento de los ET en tipos de células importantes para el desarrollo, como las células germinales y las células madre. Silenciar los ET y mantener la integridad del genoma en estas células es particularmente importante porque dan lugar a muchas otras células, todas las cuales heredarán cualquier defecto o mutación en la célula madre o célula germinal original.El movimiento del sRNA también está involucrado en las interacciones planta-patógeno: los sRNA pueden moverse de las células infectadas a los tejidos distales no infectados para generar una respuesta de defensa, aunque hasta la fecha esto solo se ha demostrado para RNAi, no RdDM. [73]

Esta sección se centra en las vías y los mecanismos por los cuales RdDM conduce a la metilación del ADN de secuencia específica. Las vías presentadas aquí se caracterizaron principalmente en la planta modelo. Arabidopsis thaliana, pero probablemente sean similares en otras angiospermas. La conservación de RdDM en otras especies de plantas se analiza con más detalle en 'Conservación evolutiva' a continuación.

Contexto de metilación del ADN Editar

RdDM es el único mecanismo en las plantas que puede agregar la metilación del ADN a las citosinas independientemente del contexto de la secuencia. [55] La metilación del ADN en plantas se divide típicamente en tres categorías según el contexto de secuencia de la citosina metilada: CG, CHG y CHH, donde H es cualquier nucleótido excepto G. Estos reflejan los diferentes contextos de secuencia a los que se dirigen varias vías de metilación del ADN. en plantas. Estas vías específicas del contexto están involucradas principalmente en el mantenimiento de los patrones de metilación del ADN existentes. La metiltransferasa altamente conservada MET1 (homóloga de DNMT1 de mamífero) mantiene la metilación del ADN en el contexto CG, mientras que dos metiltransferasas específicas de plantas conservadas, la cromometilasa 3 (CMT3) y la CMT2, ayudan a mantener la metilación de CHG y CHH, respectivamente. [74] [75] [76] [77] A diferencia de estas vías, RdDM conduce a la adición de metilación del ADN en todas las citosinas independientemente de su contexto de secuencia. Al igual que MET1, CMT2 y CMT3, RdDM participa principalmente en el mantenimiento de los patrones de metilación del ADN existentes. [55] Sin embargo, RdDM es también la única vía capaz de agregar metilación del ADN. de novo a regiones previamente no metiladas en plantas.

Mecanismo Editar

La vía RdDM se puede dividir en dos procesos principales: la producción de ARNs y el reclutamiento de la maquinaria de metilación del ADN por esos ARNs en loci diana específicos en el ADN. [78] [55] [79] Estas dos actividades juntas constituyen RdDM y, en última instancia, conducen a que se agregue la metilación del ADN a las citosinas en loci diana específicos.

Canonical RdDM Editar

La vía canónica RdDM es, como su nombre indica, la vía RdDM mejor caracterizada hasta la fecha. Canonical RdDM se recluta preferentemente en regiones que ya están metiladas en ADN y son heterocromáticas, y actúa para reforzar los patrones de metilación de ADN existentes en estos loci, formando un bucle de retroalimentación positiva. [55] [79] Canonical RdDM constituye la mayor parte de la actividad de RdDM en una celda. [79]

Producción de ARNs Editar

La primera parte de la vía RdDM gira en torno a la biogénesis de los ARNs. Un complejo de ARN polimerasa específico de una planta, la ARN polimerasa IV (Pol IV), se recluta primero en heterocromatina silenciosa a través de su interacción con las proteínas CLASSY (CLSY) y el homólogo 1 del homeodominio SAWADEE (SHH1) (ver también 'Interacciones entre RdDM y otros modificadores de cromatina vías 'a continuación). [80] [79] [81] Pol IV transcribe estas regiones para producir ARN monocatenarios cortos (ARNs) de aproximadamente 30 a 45 nucleótidos de longitud, cada uno de los cuales es el precursor de un solo ARNs. [82] [83] [84] Estos ssRNA se convierten en RNA bicatenarios (dsRNA) cotranscripcionalmente mediante la RNA polimerasa 2 dirigida por RNA (RDR2), que se asocia físicamente con Pol IV. [83] Los dsRNA son luego escindidos por la endoribonucleasa Dicer-like 3 (DCL3) en sRNA de 24 nucleótidos (nt). Pol IV, RDR2 y DCL3 solos son suficientes para la producción de ARNs de 24 nt in vitro, [84] sugiriendo que si bien otros factores involucrados en esta parte de la vía pueden ayudar a aumentar la eficiencia o especificidad, no son necesarios para la producción de ARNs mediada por Pol IV.

Si bien casi todos los ARNs de 24 nt involucrados en RdDM se producen a través de la vía Pol IV-RDR2-DCL3, una pequeña proporción se produce a través de otras vías. Por ejemplo, algunos transcritos de ARN polimerasa II (Pol II) que contienen una secuencia repetida invertida forman estructuras de horquilla de doble hebra que pueden ser escindidas directamente por DCL3 para formar ARNs de 24 nt. [85] [79]

Metilación del ADN de los loci diana Editar

En la segunda parte de la ruta, la maquinaria de metilación del ADN de RdDM se guía a secuencias de ADN complementarias a los ARNs generados en la primera parte de la ruta. Una hebra de cada ARNs bicatenario de 24 nt se carga en las proteínas de argonauta (AGO) AGO4, AGO6 o AGO9. [55] AGO3 también puede funcionar en esta vía. [86] Los argonautas son una gran familia de proteínas altamente conservadas que pueden unirse a ARNs, formando un dúplex proteína-ARNs que les permite reconocer y unir otras secuencias de ARN complementarias a su pareja ARNs. [87] Una vez formado, el dúplex AGO-sRNA encuentra y une secuencias complementarias a lo largo de un 'andamio' de RNA producido por la RNA polimerasa V (Pol V) específica de la planta, con la ayuda de interacciones con Suppressor of Ty insertion 5-like ( SPT5L), el complejo Involved in de novo 2 - IDN2 Paralog (IDN2-IDP) y la subunidad Pol V NRPE1. [88] Esto conduce al reclutamiento de la enzima ADN metiltransferasa Domains Rearranged Methyltransferase 2 (DRM2), que metila el ADN cercano. [89] [55] [79] El mecanismo por el cual el dúplex AGO-sRNA recluta DRM2 aún no se comprende bien. [90]

RdDM no canónico Editar

Un trabajo reciente ha revelado una serie de variaciones de la vía RdDM, denominada colectivamente RdDM no canónica. [79] A diferencia de la RdDM canónica, las vías no canónicas generalmente están involucradas en el establecimiento de la metilación inicial del ADN en nuevos loci diana, como inserciones de TE novedosas, en lugar de mantener la heterocromatina existente. Los elementos que expresan activamente, como las nuevas inserciones de TE, suelen estar fuertemente dirigidos por vías de silenciamiento génico postranscripcional (PTGS / RNAi). La RdDM no canónica ocurre principalmente como un subproducto de estas vías de PTGS, lo que lleva al establecimiento inicial de un estado heterocromático silencioso sobre el nuevo TE u otro locus diana. Una vez que se establece ese estado silencioso inicial, CLSY y SHH1 pueden reclutar Pol IV en el locus, y la vía RdDM canónica se hace cargo del mantenimiento a largo plazo del silenciamiento. [79] Por lo tanto, las vías de RdDM no canónicas a menudo actúan como un puente temporal entre el silenciamiento postranscripcional inicial de elementos nuevos por RNAi y el silenciamiento transcripcional transgeneracional a largo plazo a través de RdDM canónico. [10] [9] [79] De acuerdo con este papel en el inicio del silenciamiento novedoso, la RdDM no canónica se dirige a relativamente pocos loci en comparación con la RdDM canónica. [79]

La principal diferencia entre las vías RdDM canónicas y no canónicas radica en el origen y la biogénesis de los ARNs involucrados. La vía canónica RdDM involucra ARNs de 24 nt, que son específicos de esa vía y provienen predominantemente de una sola fuente (el complejo Pol IV-RDR2). En contraste, las vías RdDM no canónicas involucran ARNs de 21-22 nt de una variedad de fuentes, lo que permite de novo La metilación del ADN debe iniciarse en muchos tipos diferentes de loci. Estos ARNs de 21-22 nt no son específicos de RdDM no canónicos y también funcionan en otras vías de PTGS. De hecho, solo una pequeña fracción de los ARNs de 21-22 nt están involucrados en RdDM, y la mayoría, en cambio, impulsa un bucle de retroalimentación positiva que amplifica la respuesta de PTGS. [91] El resultado funcional de un ARNs específico de 21-22 nt depende de la proteína AGO con la que finalmente se asocia: ARNs que se asocian con AGO4, AGO6 o AGO9 dan como resultado RdDM y metilación del ADN, mientras que ARNs que se asocian con otros AGO, como AGO1 , principalmente dan como resultado PTGS. [55] [79]

Mediante el uso de ARNs de 21-22 nt derivados de una variedad de fuentes, la RdDM no canónica puede inducir de manera flexible de novo Metilación y silenciamiento del ADN en muchos tipos diferentes de loci. Una de las fuentes principales de ARNs de 21-22 nt son las transcripciones Pol II. Algunas de estas transcripciones, en particular las producidas a partir de TE, virus o ciertas transcripciones que no codifican proteínas, están dirigidas por vías de PTGS como miARN o ARNi, lo que lleva a la escisión de la transcripción. Los fragmentos resultantes pueden convertirse en dsRNA por RDR6 y luego procesados ​​en sRNA de 21-22 nt por DCL2 o DCL4. [8] La mayoría de estos ARNs de 21-22 nt se cargan en AGO1 y se retroalimentan en PTGS, lo que amplifica la eficiencia de PTGS. [79] Sin embargo, algunos se asociarán con AGO6, lo que conducirá a RdDM. [10] Los dsRNA resultantes de la actividad de RDR6 a veces también pueden ser procesados ​​por DCL3 en lugar de DCL2 / 4 y desencadenar RdDM. [9] Además, algunas transcripciones Pol II contienen secuencias repetidas invertidas, que pueden formar estructuras en forma de horquilla de doble hebra. Estos pueden ser escindidos por proteínas DCL independientes de los RDR para producir ARNs de 21-22 nt o 24 nt que pueden participar en RdDM. [79] De manera similar, los precursores de miARN, que también forman estructuras en horquilla y normalmente son escindidos por DCL1 para producir miARN, pueden ser escindidos por otras DCL para formar ARNs para RdDM. [79] Si bien la mayoría de las RdDM no canónicas ocurren a través de AGO6 o AGO4, también existe una versión de la vía en la que los ARNs se asocian con AGO2, que junto con el complejo NERD (necesario para la metilación del ADN independiente de RDR2) recluta DRM2 para apuntar a los loci. y desencadena la metilación del ADN. [92] Dado que las vías no canónicas aún no están tan bien caracterizadas como la vía canónica RdDM, [79] es probable que queden fuentes adicionales de ARNs utilizados para RdDM que aún no se han descubierto.

Factores involucrados Editar

A continuación se enumeran varios factores involucrados en RdDM, junto con detalles adicionales sobre su función y las referencias correspondientes. También se enumeran varios factores involucrados principalmente en PTGS que a veces participan en RdDM.

Factores involucrados en RdDM
Factor (es) Tipo de factor Ruta Rol en RdDM Interactores directos conocidos Descripción Referencias
NRPD1 y el complejo Pol IV Polimerasa de ARN RdDM canónico producción de ARNs Proteínas CLSY, RDR2 Pol IV es un complejo de ARN polimerasa específico de una planta y NRPD1, su subunidad más grande, es específico del complejo. A través de su interacción con las proteínas CLSY y SHH1, Pol IV se recluta en regiones heterocromáticas (específicamente en cromatina que contiene H3K9me2 y H3K4me0) y transcribe ARN monocatenario precursores de los ARNs utilizados en la vía canónica RdDM. [93] [80] [94] [81]
NRPE1 y el complejo Pol V Polimerasa de ARN Todo RdDM Metilación del ADN de los loci diana Pol V es un complejo de ARN polimerasa específico de una planta y NRPE1, su subunidad más grande, es específico del complejo. Pol V transcribe ARN no codificantes que sirven como andamios para varios otros componentes RdDM, lo más importante el dúplex AGO-sRNA, pero también SPT5L y el complejo IDN2-IDP. Tanto NRPE1 como SPT5L contienen un motivo de gancho AGO que ayuda a reclutar AGO4 en las transcripciones de Pol V. La mutación de los motivos de gancho AGO en ambas proteínas da como resultado una metilación reducida del ADN en los loci diana de RdDM, que se asemejan a los fenotipos mutantes nulos de nrpe1. La unión del dúplex AGO-sRNA a sitios complementarios a lo largo del transcrito Pol V conduce al reclutamiento de DRM2 y la adición de metilación del ADN a los loci diana. [93] [80] [94] [95] [81]
RDR2 ARN polimerasa dependiente de ARN RdDM canónico producción de ARNs Pol IV Existe en un complejo con Pol IV y convierte la transcripción naciente de Pol IV en ARN bicatenario, que luego puede ser procesado por DCL3 para generar ARNs para RdDM canónica. [83] [80]
RDR6 ARN polimerasa dependiente de ARN PTGS, RdDM no canónico producción de ARNs Convierte ARN monocatenario en ARN bicatenario para su procesamiento en ARNs de 21-22 nt mediante DCL2 y DCL4. La mayoría de estos ARNs conducen a PTGS, pero algunos se cargan en AGO6 y participan en RdDM no canónicos. [9] [80]
DCL1 Endoribonucleasa PTGS, RdDM no canónico producción de miRNA, producción de sRNA Endoribonucleasa que escinde el ARN bicatenario, que participa principalmente en la producción de microARN que conducen a PTGS a través de AGO1. También puede catalizar la producción de ARNs de 21 nt a partir de ARNm que contienen repeticiones invertidas, que pueden usarse tanto en PTGS como en RdDM no canónicas, dependiendo de la proteína AGO con la que se asocian. Las cuatro proteínas DCL en A. thaliana (DCL1,2,3,4) compiten por el acceso a sustratos de dsRNA. [96] [97] [81] [98]
DCL2 Endoribonucleasa PTGS, RdDM no canónico producción de ARNs Endoribonucleasa que escinde el ARN bicatenario, lo que da como resultado ARNs de 22 nt que se pueden usar tanto en PTGS como en RdDM no canónicos. Las cuatro proteínas DCL en A. thaliana (DCL1,2,3,4) compiten por el acceso a sustratos de dsRNA, y DCL2,4 puede sustituir la pérdida de DCL3 para la mayoría de los objetivos de RdDM. [96] [99] [97] [80]
DCL3 Endoribonucleasa RdDM canónico producción de ARNs Una endoribonucleasa que escinde el ARN bicatenario, lo que da como resultado ARNs de 24 nt utilizados en RdDM canónica. Se dirige preferentemente a los dsRNA cortos producidos por Pol IV-RDR2, pero también puede cortar otros sustratos de dsRNA, incluidos los mRNA que contienen repeticiones invertidas o precursores de miRNA. Las cuatro proteínas DCL en A. thaliana (DCL1,2,3,4) compiten por el acceso a sustratos de dsRNA, y DCL2,4 puede sustituir la pérdida de DCL3 para la mayoría de los objetivos de RdDM. Cuando las vías de PTGS a través de DCL2,4 se saturan, DCL3 puede intervenir y procesar los sustratos de dsRNA de DCL2,4, lo que activa un cambio de PTGS a TGS mediado por RdDM. [96] [9] [99] [97] [80]
DCL4 Endoribonucleasa PTGS, RdDM no canónico producción de ARNs Una endoribonucleasa que escinde el ARN bicatenario, lo que da como resultado ARNs de 21 nt que se pueden usar tanto para PTGS como para RdDM no canónicos. Las cuatro proteínas DCL en A. thaliana (DCL1,2,3,4) compiten por el acceso a sustratos de dsRNA, y DCL2,4 puede sustituir la pérdida de DCL3 para la mayoría de los objetivos de RdDM. [96] [99] [97]
AGO4 Proteína argonauta RdDM canónico Metilación del ADN de los loci diana NRPE1, SPT5L La principal proteína Argonaute involucrada en RdDM canónica. AGO4 es parcialmente redundante con AGO6, que también puede funcionar en esta vía, así como con AGO9 en los tejidos reproductivos. Se une a los sRNA de 24 nt producidos por la vía para formar un dúplex AGO4-sRNA, que puede reconocer secuencias complementarias al sRNA. Con la ayuda de interacciones con SPT5L, NRPE1 y el complejo IDN2-IDP, el dúplex AGO4-sRNA se une a un ARN monocatenario no codificante producido por Pol V y ayuda a reclutar DRM2 al ADN. [93] [80] [100]
AGO6 Proteína argonauta Todo RdDM Metilación del ADN de los loci diana Una proteína argonauta que puede funcionar en vías RdDM canónicas o no canónicas. Parcialmente redundante con AGO4 (el principal RDDM canónico AGO). Puede asociarse con ARNs de 24 nt o 21-22 nt para desencadenar RdDM en loci complementarios. Al interactuar con ARNs de 21-22 nt y 24 nt, AGO6 ayuda en la transición de PTGS (normalmente mediado por ARNs de 21-22 nt) al silenciamiento estable por RdDM (normalmente mediado por ARNs de 24 nt). Se expresa particularmente en los meristemos de raíces y brotes, que son las dos principales poblaciones de células madre en las plantas. Esto puede indicar que las plantas aumentan la vigilancia de los nuevos ET para garantizar la integridad del genoma en las células clave que darán lugar a la mayoría de las otras células de la planta. [93] [101] [10] [80] [100]
AGO9 Proteína argonauta RdDM canónico Metilación del ADN de los loci diana Un AGO altamente especializado que se expresa principalmente en la línea germinal, donde se requiere para la formación adecuada de gametos femeninos. Interactúa con ARNs de 24 nt para silenciar los ET en la línea germinal, similar al papel de las proteínas PIWI Argonaute en animales. [102] [25] [100]
AGO1 Proteína argonauta PTGS, RdDM no canónico producción de ARNs Se une a microARN o ARNs de 21-22 nt, que utiliza para reconocer secuencias complementarias en otros ARN. Cuando un dúplex AGO1-sRNA (a menudo llamado RISC) encuentra un mRNA complementario de una sola hebra, el RNA es escindido por AGO1, destruyendo el mRNA y causando PTGS. Los fragmentos de ARN resultantes pueden luego convertirse en dsRNA por RDR6 y procesados ​​por DCL2,4 para formar sRNA secundarios de 21-22 nt. Estos se cargan predominantemente de nuevo en AGO1, formando un "bucle de ARNi" que se refuerza a sí mismo. Sin embargo, algunos de los ARNs de 21-22 nt se cargan en AGO6 en su lugar, lo que conduce a RdDM. [91] [97] [80] [100]
DRM2 ADN metiltransferasa Todo RdDM Metilación del ADN de los loci diana La principal ADN metiltransferasa involucrada en RdDM. Cataliza la adición de un grupo metilo a las citosinas en el ADN. Reclutado por el dúplex AGO4-sRNA después de que se une a una secuencia complementaria en una transcripción de Pol V, pero el mecanismo por el cual esto sucede no se comprende bien. [103] [80]
SHH1 / DTF1 Proteína de unión a ADN y cromatina Canónico producción de ARNs CLSY1 Requerido para la producción de ARNs derivado de Pol IV en un subconjunto de loci RdDM. A través de su dominio SAWADEE, SHH1 se une a la histona H3 con modificaciones específicas asociadas con la heterocromatina y la metilación del ADN: metilación de la novena lisina (H3K9me2) y K4 no metilada (H3K4me0). Al interactuar con SHH1 a través de las proteínas CLSY, Pol IV se recluta en cromatina heterocromática / silenciosa. Hasta la fecha, solo se ha demostrado que SHH1 interactúa directamente con CLSY1. La capacidad de SHH1 para asociarse con Pol IV / NRPD1 se elimina principalmente en los mutantes dobles clsy1,2, por lo que el reclutamiento de Pol IV por SHH1 probablemente requiere proteínas CLSY. [104] [105] [106] [107]
CLSY1, CLSY2 remodeladores de cromatina putativos Canónico producción de ARNs Pol IV, SHH1 Requerido para la interacción SHH1 y el reclutamiento de Pol IV a un subconjunto de loci objetivo. Mutuamente excluyentes con loci regulados por CLSY3 y CLSY4. Juntas, las cuatro proteínas CLSY regulan casi todos los ARNs derivados de Pol IV, y la pérdida de los cuatro da como resultado una pérdida casi total de la producción de ARNs de 24 nucleótidos. Requiere H3K9me2, probablemente a través de la interacción con SHH1. Los ARNs regulados por CLSY1,2 se enriquecen en los brazos cromosómicos, mientras que los regulados por CLSY3,4 se enriquecen en el pericentrómero. [107] [108]
CLSY3, CLSY4 remodeladores de cromatina putativos Canónico Producción de ARNs, focalización de Pol IV Pol IV Involucrado en el reclutamiento de Pol IV a un subconjunto de loci objetivo. Mutuamente excluyentes con loci regulados por CLSY1 y CLSY2. Juntas, las cuatro proteínas CLSY regulan casi todos los ARNs de Pol IV, y la pérdida de los cuatro da como resultado una pérdida casi total de la producción de ARNc de 24 nucleótidos. Los sRNA regulados por CLSY3,4 están enriquecidos en el pericentrómero, mientras que los sRNA regulados por CLSY1,2 están enriquecidos en los brazos cromosómicos. [107] [108]
HEN1 Metilasa de ARN Ambos producción de ARNs ninguno Estabiliza los ARNs añadiendo metilación a los grupos 3'-OH. [109]
SUVH2, SUVH9 proteínas de unión a metil-ADN Ambos Metilación del ADN de los loci diana Complejo DDR, MORC1, MORC6 Un par de proteínas de unión a metil-ADN estrechamente relacionadas que interactúan con el complejo DDR y son necesarias para la localización adecuada del complejo DDR y Pol V. Al reclutar Pol V en regiones con metilación del ADN, que tienden a ser regiones heterocromáticas silenciosas, SU Los homólogos (VAR) 3-9 (SUVH) 2 y 9 ayudan a formar un bucle de retroalimentación positiva que refuerza el silenciamiento mediado por RdDM. También puede asociarse con MORC. [110]
Complejo DDR (RDM1, DMS3, DRD1) complejo de remodelación de cromatina putativo Ambos Metilación del ADN de los loci diana SUVH2, SUVH9 Se cree que el complejo DDR, compuesto por DRD1, DMS3 y RDM1, facilita el acceso de Pol V a sus sitios objetivo, posiblemente desenrollando el ADN corriente abajo de Pol V.Interactúa con SUVH2,9, que se une al ADN metilado, y esta interacción puede ayudar a reclutar Pol V a regiones de heterocromatina existente. RDM1 también se une al ADN monocatenario, lo que puede ayudar a desenrollar el ADN para facilitar el reclutamiento de DRM2. [88] [111] [112] [113] [110]
SPT5L / RDM3 / KTF1 factor de transcripcion Ambos Metilación del ADN de los loci diana AGO4, transcripciones Pol V Interactúa con AGO4 y ayuda a reclutarlo en el andamio de ARN producido por Pol V. Al igual que la subunidad NRPE1 de Pol V, SPT5L contiene un motivo de gancho AGO en su dominio C-terminal. Los motivos tanto en NRPE1 como en SPT5L ayudan de forma redundante a reclutar AGO4 en los loci que se transcriben mediante Pol V. La mutación de los motivos de gancho AGO en ambas proteínas da como resultado una metilación reducida del ADN en los loci diana RdDM, que se asemejan a los fenotipos mutantes nulos de nrpe1. También se requiere para el corte cotranscripcional de las transcripciones de Pol V. [114] [95] [115]
Complejo SWI / SNF complejo remodelador de cromatina Ambos Metilación del ADN de los loci diana IDN2 El complejo Switch / Sacarosa no fermentable (SWI / SNF) es un complejo de remodelación de cromatina que se recluta en los andamios de Pol V por el complejo IDN2-IDP, donde afecta la posición de los nucleosomas. SWI / SNF puede promover RdDM al hacer que la cromatina sea más accesible, lo que puede facilitar el acceso de DRM2 al ADN. [116]
Complejo IDN2-IDP proteína de unión a dsRNA Ambos Metilación del ADN de los loci diana Complejo SWI / SNF Un complejo compuesto por IDN2 e IDP1 (también llamado IDNL1) o IDP2 (IDNL2). IDN2, y posiblemente IDP1, pueden unirse al dúplex de dsRNA formado cuando los sRNA asociados a AGO se hibridan con el andamio Pol V. Se cree que este complejo ayuda a estabilizar el apareamiento de bases entre el ARNs de AGO y el ARN de andamio de Pol V. IDN2-IDP también puede facilitar el reclutamiento del complejo SWI / SNF a los andamios Pol V. Además, IDP1 puede unirse al ADN no metilado, lo que puede ayudar a reclutar DRM2 a las regiones que carecen de metilación del ADN. [117] [116] [118]
NERD Proteína que contiene el dedo de repetición GW y PHD RdDM no canónico Producción de ARNs, metilación del ADN de los loci diana. AGO2 Forma una vía RdDM no canónica que incluye varios genes implicados en PTGS, incluido AGO2. Se une a la histona H3 y AGO2. Requerido para la acumulación de ARNs de 21 nt en algunos objetivos RdDM no canónicos, incluidas las inserciones de TE novedosas. Conduce a modificaciones de la cola de histonas asociadas con la represión transcripcional porque estas modificaciones pueden reclutar otra maquinaria de metilación del ADN, incluida la RdDM canónica, no está claro si el efecto de NERD sobre la metilación del ADN es directo o indirecto. [92] [79]
MORC1, MORC6 ATPasas GHKL Ambos Metilación del ADN de los loci diana (?) SUVH2, SUVH9, IDN2, DMS3 Microrchidia 1 (MORC1) y MORC6 forman un heterodímero y pueden interactuar con el complejo DDR para reclutar Pol V. Sin embargo, se cree que actúan principalmente aguas abajo de la metilación del ADN para promover el silenciamiento. Su papel preciso en RdDM aún no está claro. [110] [80] [90]
DRM1 ADN metiltransferasa Todo RdDM Metilación del ADN de los loci diana Un homólogo de DRM2 que solo se expresa durante la reproducción sexual, específicamente en el óvulo y potencialmente en el embrión temprano. DRM2 es probablemente la principal metiltransferasa de RdDM en todos los demás tejidos. [119]
HDA6 Histona desacetilasa RdDM canónico producción de ARNs Puede facilitar el reclutamiento de Pol IV al crear un estado de cromatina permisivo para la unión de SHH1 al eliminar la acetilación de histonas, promoviendo la metilación de H3K9. En histona desacetilasa 6 (hda6) plantas mutantes, los loci diana de HDA6 pierden el direccionamiento de Pol IV y la biogénesis de sRNA, lo que sugiere que HDA6 está involucrado en el reclutamiento de Pol IV en un subconjunto de loci diana de RdDM. Además, el direccionamiento normal de Pol IV no se puede restaurar después de la reintroducción de HDA6 funcional, lo que sugiere que el HDA6 también es necesario para propagar la "memoria" transgeneracional de dónde debería dirigirse Pol IV. HDA6 se asocia físicamente con MET1 y facilita el mantenimiento de la metilación de CG por MET1, que también puede ser importante para la producción de ARNs en loci dependientes de HDA6. [120] [80]

Interacciones con otras vías de modificación de la cromatina Editar

Los diferentes estados de cromatina, como la eucromatina activa o la heterocromatina silenciosa, se definen por una combinación de modificaciones específicas de histonas y patrones de metilación del ADN. Las modificaciones de la cromatina represiva, como la metilación del ADN, ayudan a promover la compactación del ADN y reducen la accesibilidad del ADN, mientras que otras modificaciones ayudan a abrir la cromatina y aumentan la accesibilidad. La metilación de la novena lisina de la histona H3 (H3K9), principalmente en forma de trimetilación de H3K9 (H3K9me3) en animales y dimetilación de H3K9 (H3K9me2) en plantas, es una modificación represiva muy conservada. [121] [122] La falta de metilación de H3K4 (H3K4me0) también se asocia con la represión, junto con varias otras modificaciones y variantes de histonas. La combinación de metilación del ADN, H3K9me2 y H3K4me0 está fuertemente asociada con la heterocromatina en las plantas.

Dado que la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas represivas definen juntas la heterocromatina, la mayoría de las vías de metilación del ADN en las plantas reconocen e interactúan con las marcas de histonas represivas y viceversa, formando bucles de retroalimentación positiva que ayudan a mantener el estado represivo de la cromatina. [123] La proteína SHH1 asociada a RdDM reconoce H3K4me0 y H3K9me2 en loci heterocromáticos y recluta Pol IV en estos loci para desencadenar una metilación adicional del ADN en estas regiones. [106] De manera similar, SUVH2 y SUVH9 ayudan a reclutar Pol V a loci con metilación del ADN. [110] Por lo tanto, las dos partes principales de la vía de RdDM canónica se reclutan preferentemente en regiones que ya se encuentran en el estado heterocromático silencioso marcado por la metilación del ADN, H3K9me2 y H3K4me0. La metilación del ADN en estos mismos loci heterocromáticos también es reconocida por las histonas metiltransferasas SUVH4 / KYP, SUVH5 y SUVH6, que se unen a la metilación no CG y agregan H3K9me2 a las histonas cercanas, [123] [124] cerrando el ciclo de retroalimentación positiva. De manera similar, CMT3 y CMT2, las dos metiltransferasas de ADN implicadas en el mantenimiento de la metilación de CHG y CHH respectivamente, [75] se unen y añaden metilación de ADN a la heterocromatina marcada con H3K9me2, formando su propio circuito de retroalimentación con SUVH4 / 5/6. [125] [123] Estas interacciones ayudan a reforzar fuertemente el silenciamiento en TE y otras regiones heterocromáticas.

Un ciclo de retroalimentación similar ocurre en los animales. HP1 juega un papel vital en el mantenimiento de la heterocromatina al propagar la metilación de H3K9 a través de un circuito de retroalimentación positiva con la metiltransferasa SUV39H de H3K9. [126] La metilación de H3K9 recluta a HP1, que recluta a SUV39H para depositar más metilación de H3K9. [126] Aunque HP1 se conserva en las plantas, su función en este circuito de retroalimentación no lo es. [127] En cambio, los bucles de retroalimentación positiva entre H3K9me2 y las vías de metilación del ADN RdDM y CMT2 / 3 cumplen una función similar en la propagación de H3K9me2. Más recientemente, también se identificó una proteína específica de planta, la proteína que contiene el dominio Agenet 1 (ADCP1), que puede funcionar de manera análoga a HP1 para mantener los niveles de H3K9me2 en heterocromatina, lo que facilita la formación de heterocromatina. [128]

En última instancia, el refuerzo constante del silenciamiento de las modificaciones de la cromatina en los loci heterocromáticos crea un estado represivo de la cromatina en el que el ADN y las histonas (nucleosomas) se empaquetan de forma muy compacta. Esto ayuda a silenciar la expresión génica inhibiendo físicamente el acceso al ADN, evitando que la ARN polimerasa II, los factores de transcripción y otras proteínas inicien la transcripción. [129] Sin embargo, esta misma compactación también evita que los factores involucrados en el mantenimiento de la heterocromatina accedan al ADN, lo que podría conducir a la pérdida del estado silencioso y compacto. Esto es particularmente cierto en la heterocromatina constitutiva densa que rodea al centrómero. En estas regiones, el remodelador de cromatina DDM1 juega un papel crucial en el mantenimiento de la metilación del ADN al desplazar los nucleosomas temporalmente para permitir que las metiltransferasas y otros factores accedan al ADN. [130] [131] [5] Sin embargo, dado que la mayoría de los objetivos de RdDM son pequeños TE en regiones abiertas, accesibles y ricas en genes (ver “Silenciamiento de TE y estabilidad del genoma”), pocos sitios de RdDM requieren DDM1. [5] [99] De hecho, la heterocromatina densa inhibe la RdDM. [5] Por el contrario, CMT2 y CMT3 funcionan preferentemente en heterocromatina constitutiva y dependen en gran medida de DDM1 para mantener el silenciamiento en estas regiones. [131] [5] [3] De manera similar, MET1, que mantiene la metilación del ADN en los sitios CG después de la replicación, requiere que DDM1 acceda a la heterocromatina y mantenga la metilación CG en esas regiones. [132] Por lo tanto, DDM1 es un regulador clave de la metilación del ADN en heterocromatina densa, pero regula los sitios principalmente independientemente de RdDM. [5] [99]

Las interacciones entre RdDM y las otras tres vías de metilación del ADN de mantenimiento son limitadas y predominantemente indirectas. La ADN metiltransferasa MET1 mantiene de manera sólida la metilación de CG en todo el genoma, incluso en los sitios objetivo de RdDM. En mutantes de RdDM, se pierde la metilación sin CG en los sitios diana de RdDM, pero la metilación de CG todavía se mantiene, lo que sugiere que la actividad de MET1 es independiente de RdDM. [99] Sin embargo, aunque met1 los mutantes pierden la metilación CG como se esperaba, también pierden gran parte de su metilación no CG, incluso en los loci diana RdDM. [99] En estos sitios, RdDM aún puede iniciar el silenciamiento en met1 mutantes, pero no se mantiene ni se transmite a la progenie, lo que sugiere que MET1 es importante para el mantenimiento, pero no la iniciación, del silenciamiento en un subconjunto de loci diana RdDM. [133] [120] Este efecto es probablemente indirecto: la pérdida de MET1 conduce a la pérdida de H3K9me2 en algunos sitios, lo que inhibe el reclutamiento de Pol IV y, por lo tanto, evita el mantenimiento de la metilación del ADN a través de RdDM canónica, aunque las vías no canónicas (que no involucran Pol IV) no se ven afectados. [99] [120] La pérdida de la histona desacetilasa HDA6, que facilita la metilación de mantenimiento por MET1 en algunos loci, tiene un efecto similar, lo que sugiere que múltiples factores diferentes involucrados en el mantenimiento de la heterocromatina probablemente faciliten el mantenimiento de la metilación del ADN mediada por RdDM. [120]

La pérdida de RdDM conduce a una fuerte pérdida de metilación no CG en TEs en regiones ricas en genes en los brazos cromosómicos, pero tiene poco efecto sobre los niveles de metilación del ADN en la heterocromatina constitutiva alrededor del centrómero. [99] [5] [3] Esto sugiere que CMT2 y CMT3, que funcionan principalmente para mantener la metilación de CHG y CHH en heterocromatina constitutiva densa, no dependen de la actividad de RdDM. [99] [5] [3] Del mismo modo, en cmt2, cmt3 mutantes dobles, muchos ET en los brazos cromosómicos permanecen metilados, presumiblemente debido a la actividad persistente de RdDM, lo que indica que la pérdida de CMT2 / 3 tiene poco efecto sobre la actividad de RdDM. [5] [3] Esto sugiere que RdDM y CMT2 / 3 funcionan principalmente de forma independiente y en loci distintos: RdDM es la vía principal responsable de mantener la metilación del ADN no CG en regiones eucromáticas ricas en genes, mientras que CMT2 y CMT3 mantienen no CG Metilación del ADN en heterocromatina constitutiva. En mutantes defectuosos tanto en RdDM como en CMT2 / CMT3, se elimina toda la metilación no CG en el genoma, [74] lo que demuestra que, juntas, RdDM y CMT2 / CMT3 explican toda la metilación no CG en el genoma.

Equilibrio entre la metilación y desmetilación del ADN Editar

La mayoría de los mecanismos de metilación del ADN en las plantas se refuerzan por sí mismos (ver arriba), incluyendo RdDM: Pol IV y Pol V se reclutan en regiones heterocromáticas que ya tienen metilación del ADN, lo que fomenta la metilación adicional del ADN a través de RdDM canónica. [55] Los bucles de retroalimentación positiva como estos pueden hacer que la actividad de metilación del ADN se extienda desde los sitios meta metilados previstos hacia los genes u otros elementos reguladores, lo que puede afectar negativamente la expresión génica. Para evitar esta propagación, las vías de metilación del ADN se oponen a la desmetilación pasiva y activa del ADN. La metilación del ADN se puede perder pasivamente con cada división celular, porque las hebras de ADN recién sintetizadas carecen de metilación del ADN hasta que se vuelve a agregar mediante una de las vías de metilación del ADN de mantenimiento. [134] La metilación del ADN también puede eliminarse activamente en las plantas mediante las glicosilasas del ADN, que eliminan las citosinas metiladas mediante la vía de reparación por escisión de bases. En Arabidopsis, hay cuatro proteínas responsables de eliminar la metilación del ADN: Represor de silenciamiento 1 (ROS1), Demeter (DME), Demeter-like 2 (DML2) y Demeter-like 3 (DML3). [135] [136] Estas glicosilasas de ADN ayudan a prevenir la propagación de la metilación del ADN de los objetivos de RdDM a los genes activos. [137] [14] Pérdida de desmetilación activa del ADN en ros1dml2dml3 los mutantes triples conducen a un aumento generalizado de los niveles de metilación del ADN, mientras que la expresión ectópica de ROS1 conduce a la pérdida progresiva de la metilación del ADN en muchos loci, [138] destacando la importancia de equilibrar la metilación y la desmetilación del ADN.

Curiosamente, la expresión de la ADN desmetilasa ROS1 está directamente ligada a la actividad de RdDM: metilación del ADN sobre un TE dirigido por RdDM en el ROS1 Se requiere promotor para ROS1 expresión, [12] [13] aunque otros factores también están involucrados en la regulación ROS1. [139] [140] Desde ROS1 la expresión está ligada a la metilación del ADN en un TE específico, ROS1 La expresión también está fuertemente reducida en plantas con RdDM defectuoso que pierden la capacidad de metilar ese TE y otros. [12] Este mecanismo general ayuda a mantener la homeostasis de metilación del ADN al ajustar la actividad de desmetilación del ADN a la actividad de metilación del ADN, lo que ayuda a garantizar que los patrones de metilación del ADN se puedan mantener de manera estable a lo largo del tiempo.


Agradecimientos

Agradezco a los miembros del laboratorio Hannon por la lectura crítica del manuscrito J. Duffy por su ayuda en la preparación de las figuras D. Baulcombe, M. Tijsterman, R. Carthew y S. Prasanth por proporcionar las imágenes a los compañeros investigadores de la Fig.1 que concedieron permiso para discutir observaciones no publicadas y C. Mello y C. Sherr por proporcionar motivo y oportunidad, respectivamente, para nuestro trabajo inicial sobre RNAi. G.J.H. es una becaria de la Fundación Rita Allen y cuenta con el apoyo de un Premio al Innovador del Programa de Investigación del Cáncer de Mama del Ejército de los EE. UU. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de los NIH.


Resultados

Estructura de antisentido Chs loci transgénico

Van der Krol et al. (1988) han descrito la inhibición de Chs Expresión en el VR híbrido de petunia por el constructo de ADN-T VIP104 que contiene un promotor de CaMV-35S antisentido ChsA ADNc (Fig. 1a, mapa superior). Además de estos transformantes, se analizó otro. Esta planta se obtuvo mediante la introducción de la construcción pAS9 que lleva un gen quimérico impulsado por el promotor 35S compuesto por la región codificante de la β-glucuronidasa (uidA) y un antisentido ChsA ADNc (Fig. 1a, mapa inferior). Se obtuvieron diez transformantes primarios PAS9 y uno mostró un Chs fenotipo silenciador (PAS9-2 Van Blokland 1994).

Estructura de antisentido (as-)ChsA construcciones de ADN-T transgénico y genealogías de transformantes que contienen estas construcciones de ADN-T.

(a) Mapas físicos de las construcciones de T-DNA utilizadas para generar petunias transgénicas (Van der Krol et al. 1988 este estudio). Solo se indican los sitios de restricción más relevantes. Las flechas sobre los mapas marcan los sitios de inicio de la transcripción del nptII gen, impulsado por el promotor de la nopalina sintasa (Pnos), y de la Chs transgén, impulsado por el promotor CaMV-35S. Las flechas debajo de los mapas indican la orientación de las secuencias de codificación. Los fragmentos de ADN usados ​​como sondas en transferencias Southern se indican debajo del T-ADN pAS9. Abreviaturas: B, BamESCONDIDO, Dra.ES DECIR, EcoRI H, HindIII Hp, HpaII N, SuboficialI LB, borde izquierdo del T-DNA RB, nos del borde derecho del ADN-T, nos región de poliadenilación.

(b) Cruces que indican cómo se obtuvieron las plantas que hemos estudiado. A excepción del transformante PAS9-2, todos los demás transformantes indicados en negrita han sido descritos por Van der Krol et al. (1988, 1990a). El asterisco indica que la planta es descendiente de un retrocruzamiento del transformante primario con la línea V23 o R51 (serie VIP104) o de una autofecundación del transformante primario (PAS9-2).

Para todos nuestros análisis usamos la progenie de los transformantes primarios obtenidos por los cruces descritos en la Fig. 1 (b). Por conveniencia, en el resto del texto nos referimos principalmente a los nombres de los transformantes primarios que también se utilizan para indicar los loci de T-DNA en estos transformantes. Primero caracterizamos los loci de ADN-T mediante análisis de transferencia Southern. El único HindIII y EcoLos sitios RI en las construcciones de T-DNA nos permitieron determinar el número de copias de T-DNA y, en caso de que hubiera múltiples copias, si los T-DNAs estaban dispersos o enlazados. La integridad se determinó mediante digestiones dobles y triples. Estos análisis se realizaron esencialmente como se describe para los sentidos.Chs transformantes que contienen transgenes (Stam et al. 1997a). En total, se analizaron siete transformantes diferentes, de los cuales se muestran las transferencias Southern en la Fig. 2 (a-g). Los detalles sobre el mapeo de los T-DNA se describen en Procedimientos experimentales. Los análisis revelaron que los transformantes se pueden dividir en dos grupos, los que contienen un locus de ADN-T compuesto por un solo ADN-T (S 104-2, 104-8, 104-9 y 104-30), y los que contienen un locus de T-DNA compuesto por dos T-DNA que se organizaron como repeticiones invertidas (IR 104-10, 104-31 y PAS9-2). Además de un locus IR, el transformante 104-10 también contenía un locus S. Cuando el nptII los genes de un IR están ubicados proximales al centro del IR se denota un IRnorte y cuando el as-Chs los genes están en esa posición se denota un IRC. Los mapas físicos de los loci de ADN-T examinados se muestran en la Fig. 2 (h).

Mapeo físico de loci de T-DNA.

Los paneles (a-g) muestran una selección de hibridaciones de transferencia Southern de la progenie derivada de retrocruces (ver Fig. 1b) de los transformantes 104-2 (a), 104-8 (b), 104-9 (c ), 104-30 (d), 104-10 (e), 104-31 (f) y PAS9-2 (g). Los ADN se digirieron con las enzimas indicadas en la parte superior de cada panel y las transferencias Southern se hibridaron con las sondas indicadas debajo de los paneles. El locus de ADN-T presente en los transformantes se indica en la parte superior de cada carril. Los carriles indicados por - contienen ADN de plantas de RV sin transformar. Los números a la derecha de cada panel se refieren a los fragmentos de restricción que se muestran debajo de los mapas físicos que se muestran en (h). Fragmentos derivados de lo endógeno ChsA los genes no están etiquetados. Fragmentos de PstSe utilizó ADN de fago lambda digerido con I como marcadores de tamaño. (h) Mapas físicos de loci de ADN-T cromosómico en los diversos transformantes, como se deduce de los datos de transferencia de Southern de la Fig. 2 (a-g). Solo se muestran los sitios de restricción más relevantes. Los recuadros negros de los mapas indican la posición de losChsA ADNc: las líneas interrumpidas que flanquean los loci de ADN-T representan ADN vegetal. Las flechas sobre los mapas indican los sitios de inicio de la transcripción de los genes. Las flechas etiquetadas debajo de los mapas se refieren a fragmentos / bandas detectados en las transferencias Southern que se muestran en los paneles (a – g).Las flechas punteadas debajo de 104–2 y 104–10 St Los mapas indican que la posición de los sitios de restricción relevantes en el ADN de la planta que flanquea el ADN-T no se conoce con exactitud. Clave: S, un inserto de ADN-T de copia única, el subíndice t denota que el ADN-T está truncado mientras que el subíndice r denota que está reordenado IRnorte, Inserto de ADN-T repetido invertido con el nptII genes cerca del centro del IR IRC, Inserto de ADN-T repetido invertido con el ChsA genes cerca del centro del IR H * indica que el HinEl sitio dIII se escinde parcialmente, probablemente como resultado de la metilación del ADN. Para obtener más detalles, consulte la leyenda de la Fig.1.

Chs silenciar por copia única (S) antisentidoChs Loci de T-DNA

Las líneas parentales no transformadas de los transformantes híbridos VIP104 VR son V23 y R51 y la progenie de los retrocruces de los transformantes a V23 o R51 mostró una variedad de colores de flores, que varían de rosa, a rojo, a púrpura, debido a la segregación de diferentes alelos de genes implicados en la modificación de pigmentos de antocianina (Holton y Cornish 1995). Por tanto, estas diferencias en la pigmentación de la corola no están relacionadas con cambios en Chs expresión como resultado del silenciamiento.

El análisis de transferencia Southern de la progenie del retrocruzamiento 104-2 reveló que de las 17 plantas analizadas, 10 portaban el locus S (no mostrado). Las corolas de las plantas S mostraron una variedad de patrones de pigmentación. Algunos estaban completamente coloreados, otros tenían bordes blancos o sectores blancos, o una distribución aleatoria de celdas blancas y púrpuras (Fig. 3a). Las plantas cultivadas en condiciones estándar de invernadero generalmente producían corolas con pequeños sectores blancos. Se obtuvo un fenotipo de silenciamiento más severo cuando se cultivaron en condiciones de alta intensidad de luz (Fig.3a Van der Krol et al. 1990b).

Patrones de pigmentación de la corola de Chs transformantes antisentido.

Algunas de las flores tienen tubos blancos que no se deben a Chs silenciar sino a una segregación diferente de los genes reguladores de la pigmentación.

(a) Fenotipos de pigmentación de plantas que contienen un locus S T-DNA. La planta de realidad virtual no transformada muestra la pigmentación de tipo salvaje (wt). Los transformantes se derivaron de retrocruces con R51 o V23 no transformados (Fig. 1b), que son los padres del híbrido VR. Los loci de T-DNA en estas plantas se indican debajo de cada imagen. Las corolas de plantas cultivadas en condiciones de luz de alta intensidad se indican con el símbolo del sol. Las fotografías de estas corolas se tomaron 2-3 semanas después de que se inició el tratamiento con luz mejorada.

(b) Fenotipos de pigmentación de plantas que contienen un locus de ADN-T IR y el 104-10 St locus que acompañó al 104-10 IRnorte en el transformante primario. Las plantas se derivaron de retrocruces con R51 / V23 sin transformar (padres VR) o, en el caso de PAS 9-2, con V26 (wt V26, ver Fig. 1b). El locus de T-DNA que contienen estas plantas se indica debajo de cada fotografía.

Del retrocruzamiento 104-30, se examinaron 14 plantas de las cuales ocho portaban el locus S. La pigmentación de la corola varió, algunas flores crecieron con una distribución errática de células blancas y pigmentadas, mientras que otras contenían grandes sectores blancos irregulares o eran casi completamente blancas (Fig. 3a). Sin embargo, la mayoría de las flores apenas mostraron un fenotipo silenciador. Las plantas homocigotas para un locus S mostraron un fenotipo silenciador más fuerte que las plantas hemicigotas (no mostradas). Ninguna de las plantas no transgénicas tenía un fenotipo silenciador. A partir del retrocruzamiento 104-8, se obtuvo una planta transgénica. Esto mostró silenciamiento en el borde de la corola (Fig. 3a) solo cuando se cultivó en condiciones de luz de alta intensidad. A partir del retrocruzamiento 104-9, se obtuvieron dos plantas que portaban el locus S, que mostraban un fenotipo silenciador débil (Fig. 3a). Estos resultados muestran que el silenciamiento se correlacionó con la presencia del locus S y que la capacidad de silenciar Chs varía considerablemente entre los S loci.

Chs silenciar por repetitivo antisentidoChs Loci de T-DNA

La heredabilidad de Chs silenciamiento con los loci IR y, cuando está presente, el locus S acompañante se examinó en la progenie de retrocruces de los transformantes 104-10 (8 plantas), 104-31 (3 plantas) y PAS9-2 (15 plantas) para las líneas parentales no transformadas. Las corolas de la progenie 104-10 que albergan solo la St locus estaban completamente pigmentados (Fig. 3b), similar a las plantas no transgénicas. Corolas de plantas que llevan solo el 104-10 IRnorte locus (3 plantas) o ambos el IRnorte y St loci (1 planta) estaban completamente coloreados o contenían pequeñas manchas blancas en la punta de las extremidades (Fig. 3b) ocasionalmente se observaron sectores blancos más grandes. Esto muestra que el IRnorte es el locus de silenciamiento, aunque débil. SuC los loci de las plantas 104-31 y PAS9-2 indujeron un silenciamiento mucho más fuerte. La progenie 104–31 produjo flores blancas, a veces con sectores de color púrpura (Fig. 3b). El PAS9–2 IRC-Las plantas que contienen producen flores con un gran anillo blanco alrededor del tubo (Fig. 3b). Silenciamiento en plantas homocigotas para PAS9-2 IRC el locus fue más severo que en las plantas hemicigotas (no mostrado).

Expresión de as-ChsA genes

Los datos de la transferencia Southern indicaron que hay dos tipos de transformantes antisentido, los que llevan un locus S y los que contienen un locus IR. Dado que los transformantes S mostraron un silenciamiento más débil que los transformantes IR, excepto el que lleva el 104-10 IRnorte locus, era de interés ver si los genes as de los loci S eran realmente menos activos que los de los loci IR. Por lo tanto, primero determinamos los niveles de ARN en estado estacionario mediante análisis de transferencia Northern (Fig. 4). Aunque se utilizaron diferentes líneas de petunia, Chs la expresión en estas líneas y en las progenies es comparable (véanse también las Figuras 5 y 6).

Estado estable ChsA niveles de ARN sentido y antisentido (as-).

(a) Análisis de transferencia Northern de transformantes que contienen un S as-Chs locus transgénico. El ARN total se aisló de las hojas (L) y las ramas de la corola (C) de las plantas indicadas en la parte superior que eran hemicigotas (hemi) u homocigóticas (homo) para el locus de T-ADN particular. Los filtros se hibridaron con sondas de ARN específicas de cadena que detectan ya sea antisentidoChsA ARN (como-ChsA) o sentido-ChsA ARN (sChsA), y a un DfrA y SSU Sonda de ADN, que sirvió como controles internos para el ARN de la corola y la hoja, respectivamente. Se muestran ejemplos representativos de cada genotipo. Los carriles indicados por wt contienen ARN de plantas VR no transformadas. Los carriles 5 y 6 se derivan de una transferencia Northern diferente. Según la tinción con bromuro de etidio, todos los carriles contienen cantidades iguales de ARN total.

(b) Análisis de transferencia Northern de los transformantes indicados que contienen un IR como-Chs locus transgénico o el 104-10 St locus que en el transformante primario se unió al 104-10 IRnorte lugar. Se aisló el ARN total de hojas (L) y ramas de corola (C). Se indica el tipo de locus de IR que contienen los transformantes. Los carriles indicados por VR y V26 contienen ARN de plantas VR y V26 sin transformar, respectivamente. Los transformantes que presentan un fenotipo silenciador débil, intermedio, severo o extremo se indican mediante *, **, ***, ****, respectivamente. El símbolo del sol indica que las plantas se cultivaron en condiciones de luz de alta intensidad. Cp y Cw indican que el ARN se deriva de tejido morado y blanco, respectivamente, de las mismas corolas. Para obtener más detalles, consulte las leyendas de las figuras 2 y 4.

Actividad transcripcional de as-ChsA transgenes que residen en loci de copia única (S).

(a) Hibridaciones de transferencia de ranura representativas con ARN naciente sintetizado por transcripción continua con núcleos de corola de los transformantes 104-2 y 104-30, que eran hemicigóticos para los loci S, y de plantas VR no transformadas (wt). Los filtros de transferencia de ranura contienen ADN recombinantes M13 monocatenario específicos de gen capaces de hibridar con los ARN indicados a la izquierda. los DfrA y ChiLas hibridaciones sirvieron como controles internos.

(b) Razones de as-ChsA sentir-ChiNiveles de ARN naciente en corolas de los transformantes 104-2 y 104-30, ya sea hemicigotos (he) u homocigotos (ho) para el locus S. Las señales de hibridación se cuantificaron con un PhosphorImager.

(c) Razones de as-ChsA sentir ChsNiveles de ARN naciente en corolas de los transformantes 104-2 y 104-30. Se muestran los resultados de dos ensayos de ejecución independientes (columnas negras y grises). Para obtener más detalles, consulte las leyendas de las Figuras 2 y 4.

Actividad transcripcional de antisentido (as) ChsA transgenes que residen en loci de ADN-T de IR y en un locus S que acompaña a un locus de IR.

(a) Ejemplos representativos de hibridaciones con ARN naciente sintetizado mediante transcripción continua. Los núcleos de la corola se obtuvieron a partir de transformantes hemicigotos para el 104-10 IRnorte, 104-10 St, 104–31 IRCy PAS9–2 IRC locus, y de las líneas de tipo salvaje (wt) VR y V26. Los filtros de transferencia de ranura contenían ADN recombinantes M13 monocatenarios específicos de genes capaces de hibridar con los ARN indicados a la izquierda de los filtros. DfrA y ChiA las hibridaciones sirvieron como controles internos.

(b) Razones de as-ChsA para ChiNiveles de ARN naciente en corolas de los transformantes indicados. A modo de comparación, la columna gris muestra esta relación para un transformante que era hemicigótico para la copia única 104-2 St lugar.

(c) Razones de uidA para ChiA, y nptII para ChiA niveles de ARN naciente en partes pigmentadas (P) y blancas (W) de corolas de transformantes que eran hemicigotos (he) u homocigotos (ho) para PAS9-2 IRC lugar. Para obtener más detalles, consulte las leyendas de las figuras 2, 4 y 5.

Se aisló ARN de hojas y ramas jóvenes de corola. Se utilizó toda la corola porque, debido a los patrones de pigmentación erráticos, no fue posible separar los sectores blanco de púrpura puro. Los filtros se hibridaron con sentido y antisentido. ChsA-sondas de ARN específicas, y a un Dfr (control de corola) y SSU Sonda de ADN (control de hojas). Las hibridaciones representativas se muestran en la Fig. 4. La hibridación con el sentidoChsA La sonda de ARN muestra que todos los transformantes S contienen como-ChsA ARN, tanto en hojas como en corolas (Fig. 4, panel superior). Se necesitaba una exposición prolongada porque los niveles eran relativamente bajos. Se encontraron dos tamaños diferentes que presumiblemente resultan del uso de dos sitios alternativos de poliadenilación (Van der Krol et al. 1988). El as-ChsA transcripciones en 104-9 corolas eran ligeramente más cortas, probablemente debido al truncamiento en el extremo 3 ′ de la as-ChsA transgén y el uso de sitios de poliadenilación crípticos.

En corolas casi completamente blancas, la cantidad de as-ChsA El ARN se redujo en relación con el de las hojas (Fig. 4a, compare los carriles 5 y 6 con 13 y 14). los ChsA El nivel de ARNm también se redujo, lo que indica que tanto los ARN sentido como los as-ARN se eliminan simultáneamente. En algunos transformantes S, no se eliminó todo el ARN-as. Atribuimos esto a la expresión del gen as conducido por 35S en las células L2 de la corola donde el Chs los genes no se expresan (Martin y Gerats 1993) y, por lo tanto, el as-ARN no se degrada. Además, algunos de los ARN-as pueden haber escapado a la formación de híbridos en las células L1, lo que se ha sugerido que ocurre en el núcleo (Cornelissen y Van de Wiele 1989). El supuesto dsRNA no siempre puede producirse porque en los transformantes que muestran un silenciamiento débil, el ChsA Los niveles de ARNm se redujeron solo ligeramente o comparables a los de tipo salvaje (Fig. 4a, carriles 4, 8, 10 y 12), mientras que losChsA Los niveles de ARN en las corolas de la mayoría de los transformantes eran aproximadamente los mismos que en las hojas.

Los resultados de los transformantes que llevan un locus IR fueron bastante diferentes. En ninguna de estas plantas se as-Chs Se detectó ARN, ni siquiera en las hojas donde no se supone que esté degradado (Fig. 4b, panel superior, carriles 3, 4, 7-10 y 13-15). Sin embargo, Chs expresión en las corolas del 104–31 y PAS9–2 IRC transformantes fue fuertemente reprimido como lo indica la severa reducción ChsA Nivel de ARNm (Fig. 4b, segundo panel desde la parte superior, carriles 4 y 15). El 104-10 IRnorte locus causa silenciamiento en pequeños sectores de la corola (Fig. 3b), lo que puede explicar por qué no hay una reducción detectable en Chs ARNm en muestras obtenidas de toda la corola (Fig. 4b, segundo panel, carriles 7 y 8). Tenga en cuenta que no hubo as-Chs ARN detectable en el 104-10 S no silenciadot transformante (panel superior, carriles 5 y 6) que indica que el gen as de este locus está silenciado como los genes as del 104-10 IRnorte lugar.

Tasas de transcripción de antisentido Chs transgenes

La presencia de as-Chs ARN en los transformantes S, excepto 104-10 St transformante, indica que el as-Chs los genes son transcripcionalmente activos pero no cuán activos. La ausencia de as-RNA en los transformantes de IR podría significar que el as-Chs los genes son silenciados transcripcionalmente o post-transcripcionalmente silenciados. Se realizaron ensayos de transcripción continua en núcleos de las extremidades de la corola para abordar estas cuestiones. Los ARN nacientes marcados con 32 P-UTP se hibridaron con filtros que contenían ADN de fagos recombinantes M13 monocatenarios específicos de hebra y gen.

Para los loci S, probamos los transformantes 104-2 y 104-30, y las hibridaciones representativas se muestran en la Fig. 5. Esto reveló que el as-ChsA Los transgenes eran transcripcionalmente activos como se esperaba y se ilustra por una as-ChsA Señales de ARN. En las plantas homocigotas, la señal fue más alta que en las plantas hemicigotas (Figs. 5b, 104-30, compare ho y he). Sin embargo, está claro que la cantidad de as-ARN naciente es considerablemente menor que la de los sentidos.Chs ARN. En corolas homocigotas para el locus 104-30 S que mostraban un fenotipo silenciador fuerte (no mostrado), los genes as se transcribieron aproximadamente cuatro veces más bajo que los endógenos. ChsA genes (Fig. 5c).

La Figura 6 (a) muestra una selección de hibridaciones con ARN naciente de los transformantes IR. Las cuantificaciones de todas las hibridaciones que hemos realizado se muestran en la Fig. 6 (b). El as-Chs Las señales se normalizaron a las de la calcona isomerasa (Chi) gen. Los as-transgenes del 104-10 IRnorte locus fueron silenciados transcripcionalmente y el as-transgen del 104-10 St locus también fue silenciado (Fig.6a, b) así como el nptII genes de ambos loci. Los as-transgenes del 104-31 IRC el locus parecía haber sido transcrito, pero dado que elChs La señal de ARN es comparable a lo que ocasionalmente observamos con las corolas VR no transformadas (Fig. 6b, datos no publicados), están severamente reprimidos. En el PAS9-2 IRC transformante, el as-Chs los genes parecían más activos transcripcionalmente (Fig. 6b). Como era de esperar, el nivel detectado en homocigotos fue mayor que en hemicigotos (Fig. 6c). En el Chs partes silenciadas (Fig. 6c, w), es aproximadamente tan alto como en las partes no silenciadas (p), lo que indica que el silenciamiento no está directamente correlacionado con la cantidad de ARN as producido. los uidA gen reportero aguas arriba de la as-Chs gen y controlado por el mismo promotor 35S parece ser transcrito a una tasa más baja que el as-Chs Parte de ADNc. La razón de esta diferencia no está clara. La as-Chs La señal podría deberse a la hibridación con el ARN-as derivado del transgén, además de algún ARN no específico que ocasionalmente observamos con plantas no transformadas (Fig. 6b, resultados no publicados). En cualquier caso, estos ensayos de ejecución indican que los genes as de IR están reprimidos transcripcionalmente aunque no son completamente silenciosos en todos los casos.

En contraste con el uidA-como-Chs transgenes del PAS9-2 IRC locus, el nptII los genes estaban altamente transcritos (Fig. 6). Es interesante notar que en el transformante primario, el PAS9-2 IRCuidA-como-Chs los transgenes se transcribieron a una velocidad mucho mayor (Van Blokland 1994). Por tanto, parece que con el tiempo los transgenes se han reprimido transcripcionalmente. Sin embargo, los fenotipos de silenciamiento del transformante primario y el de la progenie eran aproximadamente los mismos, lo que sugiere que el silenciamiento no depende directamente de la cantidad de as-Chs ARN derivado del locus IR.

Metilación de transgenes y genes del huésped silenciados

La metilación de los loci IR y S se examinó utilizando la enzima de restricción sensible a la metilación Sau3AI y la enzima insensible MboYo, en combinación con HindIII y EcoRI, esencialmente como lo describe Stam et al. (1998). Los resultados de las hibridaciones por transferencia Southern se muestran en la Fig. 7, mientras que la Fig. 8 muestra los mapas físicos y el estado de metilación de los insertos de T-DNA. Describimos estos análisis con más detalle a continuación.

Patrón de metilación de los ADN-T S e ​​IR.

El grado y el nivel de metilación se determinaron mediante la digestión del ADN genómico de las corolas con la enzima sensible a la metilación. Sau3AI y la enzima insensible MboI.

(a) Mapas físicos de las construcciones de T-DNA VIP104 y pAS9, y de las estructuras endógenas ChsA genes (exones mostrados en negro). Sau3AI /MboLos sitios I están marcados con círculos abiertos, mientras que H y E marcan la posición de HindIII y EcoSitios RI, respectivamente. Los sitios marcados con un asterisco indican sitios para los que no se pudo determinar el estado de metilación. Los fragmentos de restricción más prominentes detectados después de la digestión completa por HindIII /EcoRHODE ISLAND/MboI (principales fragmentos esperados) y después de la digestión parcial por HindIII /EcoRHODE ISLAND/Sau3AI (fragmentos parciales principales) se indican debajo de los mapas. Los fragmentos indicados anteriormente pAS9 se utilizaron como sondas para hibridaciones de transferencia Southern. La línea petunia V26 contiene una ChsA gen por genoma, mientras que el híbrido VR contiene dos activos ChsA genes cuyos intrones difieren en tamaño (1,68 kb y 1,01 kb Reif et al. 1985), ilustrado por //. El mapa de la realidad virtual ChsA gen se basa en la secuencia que estaba disponible para uno de los dos genes. (b-g) Hibridaciones por transferencia Southern de ADN de corola de la progenie de los transformantes indicados. Los loci de T-DNA en estos transformantes se indican en la parte superior. El ADN fue digerido con HindIII, EcoRI y MboI (carriles marcados con M) o HindIII, EcoRI y Sau3AI (carriles marcados con S). Las transferencias se hibridaron con las siguientes sondas: DfrA (B), ChsA (C), nptII (D), uidA (e), 3′nos (f) y PCaMV (gramo). La flecha en (c) indica la posición de un fragmento único para el endógeno ChsA gene. los ChsA sonda detectaba de forma rutinaria fragmentos de aproximadamente 2,5 y 5 kb en MboDigerí ADN de V26 que no se veía en el Sau3A digiere.El origen de estas bandas no está claro, pero suponemos que son el resultado de una hibridación no específica. Los fragmentos indicados en negrita se mencionan en el texto. Los carriles indicados por wt VR y V26 contienen ADN de plantas VR y V26 sin transformar, respectivamente. PstSe usó ADN de fago lambda digerido con I como marcador de tamaño de ADN. Los carriles marcados por P y W contienen ADN de tejidos pigmentados y blancos, respectivamente, derivados de las mismas corolas.

Patrón de metilación de los diversos loci (a) de ADN-T S e ​​IR y de los ChsA genes (b). Usando los datos de Southern blot de la Fig.7, el estado de metilación del SauSe determinaron los sitios 3AI. Se utilizaron los siguientes criterios para estimar el nivel de metilación: tamaño de los fragmentos parcialmente escindidos, intensidad de las bandas, que se cuantificó con un PhosphorImager (datos no mostrados) y si el mismo fragmento fue detectado por sondas vecinas. SauLos sitios 3AI que no estaban metilados o apenas estaban metilados están indicados por círculos abiertos, los sitios indicados por círculos sólidos estaban hipermetilados, mientras que los círculos grises y manchados designan sitios grave y moderadamente metilados, respectivamente. Abreviaturas: E, EcoRI H, HindIII. Para obtener más detalles, consulte las leyendas de las figuras 2 y 7.

Para verificar que los diferentes ADN fueron digeridos por completo por Sau3AI y MboYo, primero se hibridaron con una sonda para la dihidroflavonol 4-reductasa endógena (DfrA) gen (Fig. 7b) que sirvió como control interno. Esto demostró que los patrones de bandas del SauEl ADN digerido con 3AI de los transformantes de VR (panel izquierdo) fue comparable, lo que indica que los ADN se digirieron igualmente bien. Lo mismo se encontró para los transformantes V26 (panel derecho). Tenga en cuenta que el DfrA gen en V26 está más metilado que en el híbrido VR como Sau3AI generó varios fragmentos parcialmente escindidos con ADN V26 mientras que con ADN VR, el Sau3AI y MboLos patrones I eran los mismos (Fig. 7b, compare los carriles 1 y 2 con los carriles 17 y 20).

Las hibridaciones con el ChsA La sonda se complicó por el hecho de que la sonda no distingue fragmentos de la Chs transgén (s) y genes endógenos (Fig. 7c), excepto por un fragmento de 713 pb que es único para el gen endógeno y que se extiende por el sitio de corte y empalme 3 '(Fig. 7a, c). Hemos tomado la intensidad de la banda de 713 pb como medida de la metilación del gen endógeno. En el MboI digiere, la banda de 713 pb era claramente visible (Fig.7c, flecha), mientras que en el Sau3AI digiere se reduce y en su lugar se observaron fragmentos más grandes. En realidad virtual sin transformar, Sau3AI generó una fuerte banda de 1400 pb compuesta por 713 pb, 143 pb y 519 pb ChsA fragmentos de genes del hospedador (Fig.7c, carril 2) que muestran que el ChsA los genes de la línea VR están gravemente metilados. En V26, el más pequeño SauLos fragmentos de 3AI eran mucho más abundantes (carril 20), lo que indica que el V26 ChsA el gen está mucho menos metilado. Es importante señalar que a pesar de la diferencia en la metilación, la intensidad de la banda de 713 pb en los transformantes VR o en el transformante V26 es comparable a la de las plantas no transformadas.

El nivel de metilación del as-ChsA transgenes en los loci S se evaluó comparando las intensidades de 1396 pb (1,4 kb) y 520 pb Sau3AI (fragmentos de 523, 519 y 512 pb combinados) a la del fragmento de 713 pb específico del gen endógeno, y por la presencia o ausencia de fragmentos más grandes, parcialmente escindidos detectados por el PCaMV y sondas 3′nos (Fig. 7f, g). Esto reveló que los as-transgenes de los loci 104–8, 104–9 y 104–30 seg estaban en su mayoría sin metilar (Fig. 7c, carriles 6, 8 y 10). El locus 104-2 estaba más metilado ya que muestra un claro parcial de 1600 pb. SauFragmento 3AI que también fue detectado por la sonda 3′nos (Fig. 7f, carril 4). Los promotores del 35S del as-ChsA los genes de los loci S no estaban metilados (fig. 6g, carriles 3-10). Esta falta de metilación está en consonancia con la actividad transcripcional de los transgenes (Fig. 5). los nptII Los genes de los loci S estaban en su mayoría sin metilar (Fig.7d, carriles 4, 8 y 10), excepto por el nptII gen del locus 104-8 S (figura 7d, carril 6).

En contraste con los loci S, el as-ChsA los genes de los loci de IR estaban gravemente metilados, incluidos sus promotores 35S. Sondas para ChsA, 3′nos y PCaMV detectado varios parciales SauFragmentos de 3AI (Fig.7c, f, g compare M (MboI) carriles 13, 15, 18 y 19 con S (Sau3AI) carriles 14, 16, 21 y 22), algunos de los cuales fueron detectados por las tres sondas. los uidA genes del PAS9-2 IRC también se metilaron locus (Fig. 7e, carriles 5 y 6).

Hemos mostrado previamente por sentido Chs transgenes dispuestos en RI cuyas secuencias proximales al centro de un RI están mucho más metiladas que las secuencias más distales (Stam et al. 1998). Se encontró un patrón de metilación similar para el PAS9-2 IRC lugar. los ChsA hibridación de SauEl ADN digerido con 3AI mostró fragmentos parciales de 1650 y 1850 pb (Fig. 7c, carriles 21 y 22), cada uno de los cuales abarca todo el Chs región de codificación. Además, el uidA la hibridación mostró varios fragmentos parciales (Fig. 7e, carriles 5 y 6). El centro de IR distal nptII la mayoría de los genes no estaban metilados (Fig. 7d, carriles 21 y 22). No se encontró el patrón de metilación centrado en el IR para el IR de 104-10norte y 104–31 IRC loci. El distal nptII Los genes del último locus eran casi tan resistentes a la escisión (Fig. 7d, carril 16) como el centro de IR proximal. nptII genes del 104-10 IRnorte locus (carril 14). Lo mismo se encontró para el Chs transgenes.

Cuando un sentido primario Chs El transformante contiene, además de un IR, un locus S, el patrón de metilación de los dos loci es comparable (Stam et al. 1998). Esto también se encontró para el 104-10 IRnorte y S loci. los nptII El gen del locus S (Fig. 7d, carril 12) estaba severamente metilado similar al del IRnorte lugar. Se encontró lo mismo para el promotor 35S (Fig. 7g, carril 12). Este patrón de metilación comparable está en línea con el estado transcripcionalmente reprimido de los transgenes en ambos loci (Fig. 6a).


Discusión

El ADN repetido causa HDGS de alta frecuencia

Los datos muestran que unidades repetidas de la región no traducida 5 ′ introducidas deliberadamente en un ACO1 aumento transgénico del 15% a casi el 100% del número de líneas transgénicas en las que se ha suprimido la expresión génica homóloga (Figuras 1 y 2). Lo más probable es que esto se deba a la fuerte cosupresión de las ACO1 ARNm y el transgénico ACO1 transcripción (Fig. 4). Estos datos pueden tener aplicaciones prácticas en situaciones donde se requiere un silenciamiento confiable de genes endógenos. No se sabe si el efecto informado aquí es el resultado de la repetición directa o la repetición invertida en la construcción V, si el ADN repetido necesita estar en la región transcrita y si el ADN repetido se metila. Los posibles mecanismos para la eficacia de esta repetición se analizan a continuación en el contexto de las hipótesis existentes sobre el mecanismo de HDGS.

El papel del ADN repetido

Para probar si el silenciamiento de ACO fue causado por las 2 × 79 bases de la transcripción V que son antisentido a la ACO1 ARNm (Fig.1), analizamos la expresión de los relacionados ACO2 gen en presencia del transgén V. ACO2 tiene 85% de homología con ACO1 en la secuencia de codificación (Barry et al. 1996) pero prácticamente ninguno en la región 5 'sin traducir. La figura 5 muestra que la abundancia de ACO2 El ARNm fue fuertemente suprimido por el ACOTransgén de 1 V. Esto argumenta en contra de la supresión de ACO1 ya sea mediante el apareamiento intermolecular directo con la región antisentido o el tipo propuesto para la supresión de la calcona sintasa (Metzlaff et al. 1997). Estos datos también sugieren que, aunque la secuencia repetida puede ser el desencadenante para generar una señal de silenciamiento, la secuencia de codificación adyacente forma parte de la señal propagada. Esto está respaldado por la observación de que la replicación del virus de la papa X fusionada con el ACO1 secuencia codificante (es decir, sin ninguna secuencia presente en la repetición) se evita en plantas de tomate transgénicas que llevan el ACO construir. (A. Hamilton y D. Baulcombe, datos no publicados).

Una pregunta obvia es: ¿podría la repetición dentro del transgénico ACO1 El ARN produce el tipo de superabundancia de transcripciones que se ha sugerido que conduce a HDGS (Dehio & Schell 1994 Dougherty & Parks 1995 Elmayan & Vaucheret 1996 Meins & Kunz, 1994 Mol et al.1989 Que et al. 1997) y así explicar la alta frecuencia de silenciamiento con el transgén V? Se esperaría que la formación de horquillas interfiriera con el inicio de la traducción a partir de las transcripciones del transgén V (Kozak 1986) y, por lo tanto, se traducirían de manera deficiente en comparación con las transcripciones del transgén de control (C). Los datos que se analizan a continuación sugieren que la supresión de la traducción de ACO1 El ARN aumenta ligeramente su abundancia, pero parece poco probable que un aumento tan pequeño pueda resultar en el aumento dramático en la frecuencia de HDGS observado con la construcción V en comparación con la construcción C. Además, la síntesis autocatalítica de etileno durante la maduración del fruto requiere el mantenimiento durante varios días de los niveles de ACO1 ARNm comparable con los inducidos en hojas por cicloheximida (A. Hamilton y D. Grierson, datos no publicados) sin provocar silenciamiento.

La alta frecuencia de HDGS con el transgén V es consistente con observaciones previas de que muchos casos de HDGS están asociados con loci transgénicos complejos que contienen repeticiones de ADN-T completos o parciales en lugar de inserciones simples simples (Assad et al. 1993 Elmayen y Vaucheret 1996 Goodwin et al. 1996 Hobbs et al. 1993 Matzke y Matzke 1993 Mittlesten Scheid et al. 1991 Stam et al. 1997 Van Blockland et al. 1994) y sugieren que la repetitividad es un determinante principal de la supresión más que una asociación indirecta. Por lo tanto, la pequeña repetición puede sustituir un requisito para la inserción de unidades de ADN-T repetidas para producir el silenciamiento.

Se ha demostrado previamente que una copia de una secuencia genómica repetitiva (RPS) aislada aleatoriamente aumenta la frecuencia de expresión variada de un gen indicador de GUS cuando se enlaza en cis (Lohuis et al. 1995). Este ejemplo de cisLa inactivación, (ver Matzke & Matzke 1995 para una revisión), probablemente actúa a nivel transcripcional, y los autores la consideraron distinta de los fenómenos de cosupresión / supresión de sentido. Más recientemente, Sijen et al. (1996) describieron cómo la presencia de una gran repetición directa de un gen viral aumentaba la frecuencia de plantas transgénicas resistentes del 20% al 60% apoyando el papel del ADN repetitivo en el silenciamiento postranscripcional.

La importancia de las repeticiones en HDGS se pone en duda por ejemplos de silenciamiento de inserción única y supresión de alta frecuencia sin la introducción deliberada de ADN repetido (Elmayen y Vaucheret 1996 Goodwin et al. 1996 corneado et al. 1991 Lindbo et al. 1993 Que et al. 1997 Seymour et al. 1993 Smith et al. 1990). Aunque en algunos casos esto podría explicarse por la introducción inadvertida de pequeñas regiones de ADN repetitivo (generalmente como resultado de la naturaleza modular del ensamblaje transgénico), estos ejemplos sugieren que algún otro factor puede sustituir al ADN repetitivo al provocar el silenciamiento.

La supresión de la expresión de ACO es postranscripcional

HDGS se clasifica como transcripcional o postranscripcional. Por lo general, la transcripción se analiza midiendo la de novo incorporación de nucleótidos radiactivos por núcleos aislados, pero existe evidencia de que el aislamiento de núcleos puede resultar en un estado transcripcional alterado de un gen (Schilling y Farnham 1994). Para abordar el estado transcripcional de genes que se sometieron a HDGS sin utilizar núcleos aislados, utilizamos sondas transcritas de regiones de clones genómicos que contienen intrones en ensayos de protección de ribonucleasa de ARN total. Las cantidades de pre-mRNA y mRNA sin procesar se midieron en el mismo ensayo en virtud de que protegen diferentes longitudes de la sonda radiactiva. Este método también permite el análisis transcripcional de genes expresados ​​en tejidos de los que los núcleos son difíciles de extraer. La figura 6 muestra que aunque ACO1 La abundancia de ARNm se suprimió fuertemente en una línea que contenía el transgén V, la cantidad de ACO1 transcripciones no se redujo. Se obtuvieron datos similares para el ARN extraído de otras dos líneas V (A. Hamilton y D. Grierson, datos no publicados). Esto clasifica este tipo de HDGS como postranscripcional. Supresión de la hoja de tomate ACO También se encontró que la expresión por un gen antisentido y la expresión de la poligalacturonasa (PG) del fruto del tomate por un gen de sentido parcial eran postranscripcionales usando el mismo método (A. Hamilton, S. Brown y D. Grierson, datos no publicados).

La Fig.6 también muestra que no hay una acumulación excesiva de ACO1, lo que sugiere que es poco probable que la falta de acumulación de ARNm sea el resultado de un procesamiento inhibido. Contrariamente a esto, hemos encontrado una mayor abundancia de transcritos sin procesar de PG en plantas que contienen un transgén de PG con sentido supresor (S. Brown, A. Hamilton y D. Grierson, datos no publicados). Es posible que más de un paso en la transcripción, procesamiento y acumulación de ARNm sea un objetivo potencial de HDGS y quizás una pregunta más crítica, discutida a continuación, es: ¿cuál es la señal que comunica la dependencia de homología de la supresión?

La cicloheximida estimula ACO1 expresión por eventos transcripcionales y postranscripcionales, pero no logra aliviar HDGS

El tratamiento de hojas de tomate con cicloheximida resultó en un aumento dramático en el nivel de transcripciones de ACC-oxidasa que fue aproximadamente cinco veces mayor que la inducción de ACO ARNm por herida (Fig. 3). La cicloheximida aumenta la abundancia de ARN específicos mediante la estabilización postranscripcional en numerosos organismos (para una revisión, ver Green 1993 Ross 1995), incluidos los pequeños ARN de auxina arriba en la soja (Li et al. 1994). Se ha informado la inducción transcripcional por cicloheximida del gen de la apolipoproteína II en células de hepatoma de pollo (Sensel et al. 1994), pero es la excepción más que la regla. La Figura 6 muestra que este antibiótico estimuló un aumento de seis y 13 veces en la abundancia de transcripciones primarias y procesadas de ACO1, respectivamente. Esto sugiere que el efecto positivo de la cicloheximida fue principalmente sobre la transcripción del ACO1 gen con un componente postranscripcional menor. Modesta estabilización del ACO1 Los ARN de la cicloheximida también pueden explicar el aumento en la abundancia de la transcripción del transgén de control (Fig. 4). Suponemos que tanto la estimulación transcripcional como la postranscripcional son efectos indirectos de la cicloheximida. La cicloheximida tuvo poco o ningún efecto sobre la supresión postranscripcional de ACO1 ARNm causado por genes con sentido o antisentido. Esto sugiere que la reducción en la cantidad de ARNm no fue el resultado de un mecanismo de renovación de ARNm que requiriera traducción continua.

La naturaleza y el mecanismo de la señal de silenciamiento.

Las observaciones detalladas en este artículo se explican mejor mediante un modelo en el que la estructura repetida en el constructo V ACO1 transgén es responsable de la generación de una señal específica de secuencia basada en ARN. Las secuencias repetidas en la construcción pueden funcionar como un objetivo para el inicio de la producción de la señal, pero al menos parte de esto se sintetiza (directa o indirectamente) a partir de secuencias adyacentes. Entonces la señal puede funcionar en trans, reconociendo secuencias homólogas, incluso si no están unidas físicamente a la secuencia repetida, y conduce al silenciamiento de genes al evitar la acumulación de ARNm. Generación de transcripciones de ARN antisentido, ya sea en respuesta a una superabundancia de esa transcripción (Dougherty y Parks 1995), o en respuesta a una característica estructural o posicional del transgén (Grierson et al. 1991) o un ARN (Baulcombe & English (1996), podría proporcionar una señal con la especificidad de secuencia apropiada para causar el silenciamiento génico postranscripcional de genes o virus relacionados. Hasta ahora, no se han detectado ARN antisentido específicos que estén asociados con el gen sentido silenciar, pero sigue siendo un mecanismo atractivo.

¿Por qué un sistema de supresión de ARN postranscripcional debería responder a la naturaleza repetitiva de secuencias de ADN o ARN homólogas? Se ha sugerido que la HDGS puede haber evolucionado como respuesta al ADN invasivo, como los elementos transponibles (Matzke et al. 1996). El silenciamiento transcripcional sería una respuesta eficaz a un elemento que se replica a través de un intermedio de ADN. Sin embargo, podría restringir solo parcialmente la proliferación de retrotransposones, que son particularmente abundantes en las plantas (Wessler 1996), ya que los intermedios replicativos de ARN no degradado podrían servir como una fuente persistente de ADN mutagénico. los trans-La forma de silenciamiento postranscripcional dominante permitiría la degradación de estos ARN. Puede estar dirigido a secuencias de retrotransposón en virtud de su naturaleza repetitiva interna o como resultado de dos o más de estos elementos que se integran de forma adyacente. Quizás relacionada con esto está la restricción de la proliferación del virus del mosaico de la coliflor (un pararetrovirus) mediante un mecanismo que se asemeja al silenciamiento génico postranscripcional informado recientemente por Covey. et al. (1997) .


LFS252 Biología molecular

Tanto el ARN como el ADN tienen un esqueleto de azúcar-fosfato, por lo que el fosfato no es exclusivo del ADN o del ARN. En la conferencia discutimos 5 formas en las que el ARN es diferente al ADN:

Como sabe, los ingredientes principales necesarios para la PCR son una plantilla de ADN de doble hebra, cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos (dNTP), cebadores para iniciar la síntesis, magnesio (Mg2 +), un cofactor enzimático y, por supuesto, la ADN polimerasa. Una vez mezclado, la reacción se produce mediante el termociclado de los siguientes tres pasos:

Realice las siguientes tareas:
Cree la secuencia complementaria para hacer ADN de doble hebra y etiquete los extremos 5 'y 3' (1 marca)
Transcriba la secuencia en moléculas de ARN (1 punto)
Encierre en un círculo y etiquete el primer codón de inicio en la secuencia de ARN (1 marca)
Encierre en un círculo y etiquete el primer codón de parada correspondiente en la secuencia de ARN (1 marca)
Traducir cualquier secuencia de codificación potencial en secuencias de aminoácidos (proteínas) (1 marca)

5 'GGA, AUG, AGA, AUC, AAU, GUC, UGA, AAA, CGG 3'
3 'Gly Met Arg Ile Asn Val Stop Lys Arg 5'

Se extrajo médula ósea de ratones machos adultos y luego se trasplantó a ratones receptores hembras isogénicas que tenían
han sido tratados con un nivel de irradiación suficiente para destruir sus propias células madre hematopoyéticas (ver figura).Aunque la dosis de irradiación administrada fue letal para los ratones que no recibieron un trasplante, la mayoría de los ratones receptores que recibieron el trasplante sobrevivieron. Después de 4 semanas, se analizó la sangre periférica de los ratones receptores. La composición de la sangre fue normal con respecto a todos los tipos de células sanguíneas. Se determinó que cada célula sanguínea examinada era positiva para la presencia del cromosoma Y.

A. ¿Cuál fue el propósito de usar ratones machos como donantes de médula ósea y ratones hembras como receptores? ¿Habría funcionado el experimento inverso (donantes femeninas, receptores masculinos)?

B. ¿Cuál fue el propósito de irradiar a los ratones receptores antes del trasplante? ¿Qué resultado podría esperar si se trasplantaran células de médula ósea a ratones no irradiados?

B. El propósito de irradiar a los ratones receptores antes del trasplante mata las células madre del receptor haciéndolas inmunodeprimidas. Si las células madre se trasplantaran a ratones no irradiados, es probable que el receptor rechace las células madre "extrañas", provocando una reacción inmunitaria. Pequeño porcentaje de células de interés (donantes masculinos)

C. Las manchas rojas indican que el gen expresado está en un estado fallecido. Las manchas verdes indican que el gen expresado se encuentra en un estado normal. Las manchas amarillas indican que el gen expresado está en ambos estados.

Alargamiento: se agregan nucleótidos, la ARN polimerasa se mueve a lo largo del ADN molde desenrollando el ADN a medida que se mueve. El alargamiento del ARNm es catalizado por RNAP. El ADN se reanuda después.

ii. Transcrito como ARNm único. Sitios de promotor único: sitios de transcripción únicos, sitios de terminación de transcripción únicos, codifican sitios de proteínas múltiples. Una sola molécula de ARN permite la regulación coordinada de genes.

iii. La unión de Bocks o70 a la región promotora en una conformación específica. LacI se une al ADN en la secuencia del operador, previene la transcripción del operón lac (represor).

Cuadro TATA: efectos de mutación unión de la proteína de unión para la transcripción

Elementos proximales al promotor: el ARN pol II no puede unirse al sitio de inicio de la transcripción, por lo tanto, no hay expresión génica (transcripción disminuida)

Elemento potenciador: un elemento potenciador activa la transcripción del gen. Una mutación resultará en la no activación del gen. Si es un área esencial del gen y está por encima de la tasa normal. Si no es un área esencial del gen, la mutación no tendría ningún efecto.

Asegura que el evento del siguiente ciclo no se active antes de que se complete el anterior (o antes de que se corrijan los errores).
Puntos monitoreados: crecimiento, replicación del ADN, daño del ADN, unión al huso mitótico, posicionamiento del huso dentro de las células.
Asegura que cada célula hija reciba la cantidad correcta de cromosomas replicados con precisión
El evento de mala segregación ocurre solo una vez en 10 ^ 4-10 ^ 5 divisiones

¿Cómo monitorea?
Los sensores monitorean un evento celular particular
Activa una vía de transducción de señales (una serie de interacciones moleculares) para iniciar una respuesta
Un efector (algo que actúa en respuesta a un estímulo) detiene la progresión del ciclo celular y activa las vías de reparación o destrucción.

El ARN que lleva el código de una proteína muscular se inyecta en el gusano C. elegans. El ARN monocatenario no tiene ningún efecto. Pero cuando se inyecta ARN de doble hebra, el gusano comienza a contraerse de manera similar a los gusanos que portan un gen defectuoso para la proteína muscular.

La interferencia de ARN (ARNi) es un mecanismo biológico importante en la regulación de la expresión génica. El ARN bicatenario (dsRNA) se une a la proteína Dicer que escinde el dsRNA en fragmentos más pequeños. Una de las cadenas de ARN se carga en un complejo RISC y une el complejo a la cadena de ARNm mediante apareamiento de bases. El ARNm se escinde y se destruye. No se puede sintetizar ninguna proteína.

La transcripción está mediada por la enzima ARN polimerasa.
La polimerasa se une a la secuencia promotora en el ADN dúplex (complejo cerrado)
La ADN polimerasa derrite el ADN dúplex cerca del sitio de inicio de la transcripción, formando una burbuja de transcripción (complejo abierto)
La polimerasa cataliza el enlace fosfodiéster de dos rNTP iniciales
La polimerasa avanza en la hebra de plantilla 3 '→ 5' hacia abajo, derritiendo el ADN dúplex y agregando rNTP al ARN en crecimiento
En el sitio de parada de la transcripción, la polimerasa libera ARN completo y el amplificador se disocia del ADN

Hay cuatro requisitos principales para la ADN polimerasa I:
Una plantilla de ADN de doble hebra
Cuatro desoxirribonucleósidos trifosfatos (dNTP)
Primers para iniciar la síntesis
Magnesio (Mg2 +): un cofactor enzimático

Si tomamos estos ingredientes + ADN polimerasa I, podemos replicar el ADN in vitro usando ciclos de temperatura

La desnaturalización del ADN ocurre a 92-95 ° C
La hibridación del ADN se produce por debajo de la Tm de los cebadores (45 - 65 ° C)
Se produce una extensión del ADN (alargamiento de los cebadores)

Las proteínas no histonas y el propio ADN organizan la cromatina en grandes bucles
Algunas secuencias separadas por millones de pares de bases pueden acercarse mucho entre sí en los núcleos de interfase
Base de bucles que se mantiene en su lugar mediante el mantenimiento estructural de las proteínas cromosómicas (SMC) (involucradas en la condensación cromosómica y la reparación del ADN)

Interfase: cromosomas organizados en territorios
Los cromosomas grandes tienden a ubicarse en la periferia del núcleo y los cromosomas pequeños hacia el centro.

Las repeticiones de la transcripción del ARNr (organizadores nucleolares) se asocian con los nucléolos
El nucleolo es el sitio de la biogénesis de los ribosomas.

En los seres humanos, una secuencia de seis pares de bases, TTAGGG, se repite de 100 a 1000 veces. Después de cada ronda de replicación del ADN, algunas secuencias teloméricas se pierden en el extremo 5 'de la hebra recién sintetizada en cada ADN hijo, pero debido a que se trata de secuencias no codificantes, su pérdida no afecta negativamente a la célula. Sin embargo, incluso estas secuencias no son ilimitadas. Después de suficientes rondas de replicación, todas las repeticiones teloméricas se pierden y el ADN corre el riesgo de perder secuencias codificantes con rondas posteriores.

Larvas rastreras: & quotEndociclo & quot
Las células desarrollan citoplasma, se introducen fases de brecha, pero la mayoría de las células dejan de dividirse
Replican el ADN pero no sufren mitosis
Las larvas crecen aumentando el tamaño de las células físicas (no el número de células)

Síndrome de Marfan - Tonterías: tirosina para detener el codón en la posición 2113 del gen de la fibrilina-1

Hipercolesterolemia familiar - Inserción: varias inserciones cortas en todo el gen LDLR

Ciclo de vida viral:
Adsorción y penetración de amplificador
Replicación: el virus se apodera de la maquinaria celular para
Produce ARNm / proteínas.
Replicar el genoma viral
Ensamblaje del genoma viral en partícula viral
Lanzamiento de miles de virus replicados

Las células eucariotas utilizan:

Unión final no homóloga para reparar la rotura
Da como resultado la deleción / interrupción del gen

2. Cuando la concentración de subunidades G libres es alta, el filamento crece y cuando la G libre es baja, el filamento se encoge. El extremo positivo tiene una alta concentración de ATP-G actina, lo que da como resultado una menor concentración requerida, lo que significa que se agrega ATP-actina en el lado positivo y ADP-actina se disocia del extremo negativo. Las células también tienen mecanismos para regular el ensamblaje, así como el desensamblaje, de los filamentos, así como las proteínas de protección que pueden bloquear el ensamblaje y el desensamblaje en los extremos de los filamentos.

3. Las miosinas son proteínas motoras basadas en actina. Se unen a la actina (área de la ranura). Tome pasos discretos & quot; a lo largo de los filamentos de actina, p. Ej. Contracciones musculares

4. Puede provocar grandes cambios en la forma celular o impulsar los movimientos intracelulares. La polimerización se produce en tres fases.

2. Los - extremos están anclados a MTOC, por lo que la dinámica es relevante para el final positivo. Dinámica determinada por la tasa de crecimiento, despolimerización, 'catástrofes' y 'rescates'. La dinámica también se regula mediante la estabilización de proteínas asociadas a microtúbulos (MAP)

3. Cinesinas: Median el transporte anterógrado (+) dirigido al extremo de los orgánulos. Colorantes: median el transporte retrógrado (-) dirigido al final de los orgánulos

4. Los microtúbulos son tubos rígidos que pueden generar fuerzas de empuje y tracción sin deformarse, lo que les permite extenderse largas distancias dentro de una celda. La nucleación se produce a partir de centros organizadores de microtúbulos o MTOC. El centrosoma es el principal MTOC en las células animales. Durante la mitosis, las células reorganizan completamente sus microtúbulos para formar un huso que se extiende desde dos centrosomas (polos del huso).

5. Las células duplican los MTOC (centrosomas) durante la fase S. Los centrosomas duplicados se separan cuando las células entran en la mitosis y luego nuclean el ensamblaje de los microtúbulos para convertirse en los dos polos del huso mitótico.

Los cromosomas se capturan y orientan durante la prometafase.
El cinetocoro media la unión entre el cromosoma y los microtúbulos. Ensamblar en centrómero. Los microtúbulos que capturan cinetocoros se estabilizan. Las dineínas mueven el cromosoma duplicado hacia el polo del huso

2. Se someten a un montaje y desmontaje regulados, lo que proporciona flexibilidad a la celda. Aún se ensambla y desmonta dinámicamente dentro de las celdas.

3. No tienen polaridad (extremos +/-) y amplificador, por lo que no son & quot; pistas & quot del motor.

4. Mantener la integridad del núcleo. Unido a cromatina por un lado. Unido al citoesqueleto por el otro. Tienen una gran resistencia a la tracción (por ejemplo, el cabello y las uñas son filamentos intermedios de células muertas).

Durante el inicio de la transcripción, la ARN polimerasa se une a un sitio específico en el ADN (el promotor), derrite localmente el ADN de doble hebra para revelar la hebra plantilla desaparecida y polimeriza los dos primeros nucleótidos complementarios a la hebra plantilla. La región fundida de 12-14 pares de bases se conoce como burbuja de transcripción.

Durante el alargamiento de la hebra, la ARN polimerasa desciende por el ADN, derritiendo el ADN por delante de la polimerasa para que la hebra plantilla pueda entrar en el sitio activo de la enzima y permitiendo que las hebras complementarias de la región recién transcrita se vuelvan a recocer detrás de ella. La burbuja de transcripción se mueve con la polimerasa a medida que la enzima agrega ribonucleótidos complementarios a la hebra molde al extremo 3 'de la cadena de ARN en crecimiento.

Cuando la ARN polimerasa alcanza una secuencia de terminación en el ADN, la enzima detiene la transcripción, lo que provoca la liberación del ARN completo y la disociación de la enzima del ADN molde.

En el ADN procariótico, varios genes que codifican proteínas se agrupan comúnmente en una región funcional, denominada operón, que se transcribe de un solo promotor a un ARNm que codifica múltiples proteínas con funciones relacionadas. La traducción de un ARNm bacteriano puede comenzar antes de que se complete la síntesis del ARNm.
En el ADN eucariota, cada gen que codifica proteínas se transcribe a partir de su propio promotor. La transcripción primaria inicial contiene muy a menudo regiones no codificantes (intrones) intercaladas con regiones codificantes (exones).

Las transcripciones primarias eucariotas deben someterse a un procesamiento de ARN para producir ARN funcionales. Durante el procesamiento, los extremos de casi todas las transcripciones primarias de genes que codifican proteínas se modifican mediante la adición de una tapa 5 'y una cola poli (A) 3'. Las transcripciones de genes que contienen intrones se someten a empalme, eliminación de intrones y unión de exones.


Información de soporte

Tabla S1. Números de presentación de NCBI SRA e información sobre la raza de las aves utilizadas para el análisis genómico en este estudio.

Tabla S2. Número de copias de los resultados del ensayo Taqman de Mlana región.

Tabla S3. Tamaños de muestra e identificadores de aves incluidos en cada categoría fenotípica para el análisis de qRT-PCR en la Figura 5.

Tabla S4. Resultados de qRT-PCR sin procesar para la figura 5.

Tabla S5. Resultados de qRT-PCR sin procesar para S5 Fig.

Tabla S6. Secuencias de cebadores utilizadas en este estudio.

S1 Fig. Gráficos de profundidad de datos de secuenciación del genoma completo alrededor de la región de brecha genómica en la Almond CNV.

Se encontró que esta región contenía un elemento similar a CR-1. Los gráficos muestran la profundidad de lectura normalizada para los genomas de paloma resecuenciados titulados por el número de acceso de SRA. Las lecturas se alinearon con la región Almond CNV, con la brecha en el ensamblaje del genoma (Cliv_2.1) puenteada con la secuencia obtenida de la secuenciación de Sanger. Los individuos representativos que no son almendros se muestran en la columna de la izquierda, con los individuos almendros a la derecha. Las dos filas superiores son machos y las dos filas inferiores son hembras. El eje x es la distancia desde la secuencia de la región del espacio, y el eje y muestra la profundidad de cobertura, normalizada a los primeros 10000 pb de la región. Todos los individuos tienen un pico en la cobertura en la región que contiene la secuencia de elementos transponibles de tipo CR-1, y las hembras muestran un aumento mayor que los machos. El mayor aumento de hembras podría deberse a una abundancia de secuencias de elementos transponibles similares a CR-1 en el cromosoma W.

S2 Fig. La almendra está asociada con los alelos del patrón T-check (y / o checker) en el C lugar geométrico en el andamio ScoHet_527 (recuadro rojo).

Repetimos la prueba de asociación que se muestra en la Fig. 2A, excepto que las aves T-check y checker se eliminaron de la población de fondo (no almendra). Elegimos este ejemplo para mostrar la selección de un modificador de Almond porque previamente identificamos la base molecular de este rasgo y conocíamos su ubicación genómica. El pico asociado a Almond permanece en la misma ubicación hacia el lado derecho de la parcela. Los diferentes tonos de gris indican diferentes andamios genómicos (mismo orden que la Fig. 2A), y la línea gris discontinua horizontal indica el umbral de significación de todo el genoma.

S3 Fig. S tLos fenotipos de pigmentación ligados muestran una variación cuantitativa en la CNV de la almendra.

Los puntos negros representan los resultados de un ensayo de número de copias de TaqMan. Los números medios de copia para cada fenotipo se muestran como puntos rojos. Estos son los mismos datos que se muestran en la Figura 4 separados por sexo.

S4 Fig. Bajos niveles de aumento del número de copias de la NVC asociada a la almendra se encuentran con baja frecuencia en palomas que no son almendras.

Los gráficos de cada panel comparan la cobertura de un individuo representativo que no es Almond (rojo) con la profundidad de lectura media normalizada para 10 aves Almond hembras (negro) en la región Almond CNV de ScoHet5_227. Los números de acceso a la SRA para las aves que no son almendras se indican encima de cada panel. La línea discontinua gris en y = 1 es el nivel de cobertura esperado si no hay expansión de la CNV. (A) Gráfico de cobertura para un ave que no es Almond con un aumento de cobertura solo en la región interior de la CNV. Se encontraron aumentos de cobertura similares en 2 de 131 individuos analizados en el panel de resecuenciación del genoma completo (SRS346902, SRS2803087). (B) Gráfico de cobertura para una paloma que tiene un aumento de cobertura de toda la región de la CNV pero que no tiene la duplicación de la CNV anidada interna dentro de la CNV más grande. Esta configuración se encontró en 5 individuos en todo el panel de resecuenciación del genoma (SRS346897, SRS346875, SRR8430387, SRS346889, SRS2803080). (C) Gráfico de cobertura para un ave que no es almendra que tiene expansión de la CNV externa y una mayor duplicación de la región interna de la CNV. Esta configuración se encontró en dos individuos de nuestro panel de resecuenciación del genoma completo (SRS346903, SRS346890).

S5 Fig. El segundo macho de almendra homocigoto tiene un perfil de expresión similar al de la almendra homocigota original ensayada en la figura 5.

Los gráficos de puntos muestran los resultados de los ensayos de qRT-PCR de la expresión génica de genes en la región de CNV de almendra y genes de pigmentación analizados como parte del experimento original en la Fig. 5. (A) Genes dentro de la CNV. (B) Genes fuera de la CNV. (C) Genes relacionados con los melanocitos. Para complementar los datos de expresión génica del experimento original, los ensayos de expresión de qRT-PCR se volvieron a ejecutar en un par de muestras de yemas de plumas en regeneración de los siguientes fenotipos: no almendra (NA), almendra oscura (DA), el homocigoto original Almendra para este estudio (HA1), y una Almendra homocigota obtenida recientemente (HA2). Las pruebas T mostraron que las dos almendras homocigotas no eran estadísticamente diferentes.


11.3 Expresión genética

La expresión génica es el proceso mediante el cual se utiliza la información de un gen en la síntesis de un producto génico funcional. Estos productos son a menudo proteínas, pero en genes que no codifican proteínas, como los genes de ARN de transferencia (ARNt) o ARN nuclear pequeño (ARNnn), el producto es un ARN funcional. La expresión génica se resume en el Dogma Central formulado por primera vez por Francis Crick en 1958, desarrollado en su artículo de 1970 y ampliado por los descubrimientos posteriores de la transcripción inversa y la replicación del ARN.

El proceso de expresión génica lo utilizan todas las formas de vida conocidas, eucariotas (incluidos los organismos multicelulares), procariotas (bacterias y arqueas) y los virus, para generar la maquinaria macromolecular para la vida.

En genética, la expresión génica es el nivel más fundamental en el que el genotipo da lugar al fenotipo, es decir, rasgo observable. La información genética almacenada en el ADN representa el genotipo, mientras que el fenotipo resulta de la "interpretación" de esa información. Estos fenotipos a menudo se expresan mediante la síntesis de proteínas que controlan la estructura y el desarrollo del organismo, o que actúan como enzimas que catalizan vías metabólicas específicas.

Todos los pasos del proceso de expresión génica pueden modularse (regularse), incluida la transcripción, el corte y empalme de ARN, la traducción y la modificación postraduccional de una proteína. La regulación de la expresión génica da control sobre el momento, la ubicación y la cantidad de un producto génico dado (proteína o ARNc) presente en una célula y puede tener un efecto profundo en la estructura y función celular. La regulación de la expresión génica es la base de la diferenciación celular, el desarrollo, la morfogénesis y la versatilidad y adaptabilidad de cualquier organismo. Por tanto, la regulación genética puede servir como sustrato para el cambio evolutivo.

11.3.1 Transcripción y procesamiento de ARN

La transcripción es el primero de varios pasos de la expresión génica basada en ADN, en la que un segmento particular de ADN se copia en ARN (especialmente ARNm) por la enzima ARN polimerasa. Durante la transcripción, una ARN polimerasa lee una secuencia de ADN, que produce una hebra de ARN complementaria y antiparalela denominada transcripción primaria.

La transcripción procede en los siguientes pasos generales:

  1. La ARN polimerasa, junto con uno o más factores de transcripción generales, se une al ADN promotor.
  2. La ARN polimerasa crea una burbuja de transcripción que separa las dos hebras de la hélice de ADN. Esto se hace rompiendo los enlaces de hidrógeno entre los nucleótidos de ADN complementarios.
  3. La ARN polimerasa agrega nucleótidos de ARN (que son complementarios a los nucleótidos de una hebra de ADN).
  4. El esqueleto de ARN azúcar-fosfato se forma con la ayuda de la ARN polimerasa para formar una cadena de ARN.
  5. Los enlaces de hidrógeno de la hélice ARN-ADN se rompen, liberando la cadena de ARN recién sintetizada.
  6. Si la célula tiene un núcleo, el ARN puede procesarse más. Esto puede incluir poliadenilación, taponado y empalme.
  7. El ARN puede permanecer en el núcleo o salir al citoplasma a través del complejo de poros nucleares.

El tramo de ADN transcrito en una molécula de ARN se denomina unidad de transcripción. Si el ADN codifica una proteína, la transcripción produce ARN mensajero (ARNm); el ARNm, a su vez, sirve como molde para la síntesis de la proteína a través de la traducción. Alternativamente, el ADN transcrito puede codificar ARN no codificante, como microARN, ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt) o moléculas de ARN enzimático llamadas ribozimas.

Una unidad de transcripción de ADN que codifica una proteína puede contener tanto una secuencia codificante, que se traducirá en la proteína, como secuencias reguladoras, que dirigen y regulan la síntesis de esa proteína.La secuencia reguladora antes ("aguas arriba" de) la secuencia codificante se denomina región no traducida de cinco primos (5'UTR) y la secuencia posterior ("aguas abajo" de) la secuencia codificante se denomina región no traducida de tres primos (3'UTR).

A diferencia de la replicación del ADN, la transcripción da como resultado un complemento de ARN que incluye el nucleótido uracilo (U) en todos los casos en los que se habría producido timina (T) en un complemento de ADN.

Solo una de las dos cadenas de ADN sirve como plantilla para la transcripción. La ARN polimerasa lee la hebra antisentido de ADN desde el extremo 3 'hasta el extremo 5' durante la transcripción (3 '→ 5'). El ARN complementario se crea en la dirección opuesta, en la dirección 5 '→ 3', coincidiendo con la secuencia de la hebra sentido con la excepción de cambiar uracilo por timina. Esta direccionalidad se debe a que la ARN polimerasa solo puede agregar nucleótidos al extremo 3 'de la cadena de ARNm en crecimiento. Este uso de solo la cadena de ADN 3 '→ 5' elimina la necesidad de los fragmentos de Okazaki que se ven en la replicación del ADN. Esto también elimina la necesidad de un cebador de ARN para iniciar la síntesis de ARN, como es el caso de la replicación del ADN.

La hebra de ADN sin molde (sentido) se llama hebra codificante, porque su secuencia es la misma que la de la transcripción de ARN recién creada (excepto por la sustitución de timina por uracilo). Esta es la hebra que se usa por convención cuando se presenta una secuencia de ADN.

La transcripción tiene algunos mecanismos de corrección de pruebas, pero son menos y menos efectivos que los controles para copiar ADN. Como resultado, la transcripción tiene una menor fidelidad de copia que la replicación del ADN.

La transcripción se divide en iniciación, escape del promotor, alargamiento y terminación.

11.3.2 Iniciación

La transcripción comienza con la unión de la ARN polimerasa, junto con uno o más factores de transcripción generales, a una secuencia de ADN específica denominada "promotor" para formar un "complejo cerrado" ARN polimerasa-promotor. En el "complejo cerrado", el ADN promotor sigue siendo completamente bicatenario.

La ARN polimerasa, asistida por uno o más factores de transcripción generales, luego desenrolla aproximadamente 14 pares de bases de ADN para formar un "complejo abierto" de ARN polimerasa-promotor. En el "complejo abierto", el ADN del promotor está parcialmente desenrollado y es monocatenario. El ADN monocatenario expuesto se denomina "burbuja de transcripción".

La ARN polimerasa, asistida por uno o más factores de transcripción generales, luego selecciona un sitio de inicio de la transcripción en la burbuja de transcripción, se une a un NTP de inicio y un NTP de extensión (o un cebador de ARN corto y un NTP de extensión) complementario a la secuencia del sitio de inicio de la transcripción y cataliza la formación de enlaces para producir un producto de ARN inicial.

En las bacterias, la holoenzima de la ARN polimerasa consta de cinco subunidades: 2 subunidades α, 1 subunidad β, 1 subunidad β ’y 1 subunidad ω. En las bacterias, existe un factor de transcripción de ARN general conocido como factor sigma. La enzima del núcleo de la ARN polimerasa se une al factor de transcripción general bacteriano (sigma) para formar la holoenzima de la ARN polimerasa y luego se une a un promotor. (La ARN polimerasa se denomina holoenzima cuando la subunidad sigma está unida a la enzima central, que consta de 2 subunidades α, 1 subunidad β y 1 subunidad β 'únicamente).

En arqueas y eucariotas, la ARN polimerasa contiene subunidades homólogas a cada una de las cinco subunidades de ARN polimerasa en bacterias y también contiene subunidades adicionales. En arqueas y eucariotas, las funciones del factor de transcripción general bacteriano sigma son realizadas por múltiples factores de transcripción general que trabajan juntos. En las arqueas, hay tres factores de transcripción generales: TBP, TFB y TFE. En eucariotas, en la transcripción dependiente de la ARN polimerasa II, hay seis factores de transcripción generales: TFIIA, TFIIB (un ortólogo de TFB arqueal), TFIID (un factor de múltiples subunidades en el que la subunidad clave, TBP, es un ortólogo de TBP arqueal), TFIIE (un ortólogo de archaeal TFE), TFIIF y TFIIH. El TFIID es el primer componente que se une al ADN debido a la unión de TBP, mientras que TFIIH es el último componente en ser reclutado. En arqueas y eucariotas, el complejo cerrado de ARN polimerasa-promotor generalmente se denomina "complejo de preiniciación".

El inicio de la transcripción está regulado por proteínas adicionales, conocidas como activadores y represores y, en algunos casos, coactivadores o correpresores asociados, que modulan la formación y función del complejo de inicio de la transcripción.

Después de que se sintetiza el primer enlace, la ARN polimerasa debe escapar del promotor. Durante este tiempo, existe una tendencia a liberar la transcripción de ARN y producir transcripciones truncadas. Esto se llama iniciación abortiva y es común tanto para eucariotas como para procariotas. La iniciación abortiva continúa ocurriendo hasta que se sintetiza un producto de ARN de una longitud umbral de aproximadamente 10 nucleótidos, momento en el que se produce el escape del promotor y se forma un complejo de elongación de la transcripción.

Mecánicamente, el escape del promotor se produce mediante la compresión del ADN, lo que proporciona la energía necesaria para romper las interacciones entre la holoenzima de la ARN polimerasa y el promotor.

En eucariotas, en un promotor dependiente de la ARN polimerasa II, tras la eliminación del promotor, TFIIH fosforila la serina 5 en el dominio carboxi terminal de la ARN polimerasa II, lo que lleva al reclutamiento de la enzima de protección (CE). El mecanismo exacto de cómo la CE induce la eliminación del promotor en eucariotas aún no se conoce.

11.3.3 Alargamiento

Una hebra del ADN, la hebra plantilla (o hebra no codificante), se utiliza como plantilla para la síntesis de ARN. A medida que avanza la transcripción, la ARN polimerasa atraviesa la hebra de la plantilla y utiliza la complementariedad de emparejamiento de bases con la plantilla de ADN para crear una copia de ARN (que se alarga durante el recorrido). Aunque la ARN polimerasa atraviesa la hebra molde de 3 '→ 5', la hebra codificante (no molde) y el ARN recién formado también se pueden usar como puntos de referencia, por lo que la transcripción puede describirse como 5 '→ 3'. Esto produce una molécula de ARN de 5 '→ 3', una copia exacta de la cadena codificante (excepto que las timinas se reemplazan con uracilos y los nucleótidos están compuestos de un azúcar ribosa (5 carbonos) donde el ADN tiene desoxirribosa (un oxígeno menos átomo) en su esqueleto de azúcar-fosfato).

La transcripción de ARNm puede involucrar múltiples ARN polimerasas en una única plantilla de ADN y múltiples rondas de transcripción (amplificación de ARNm particular), por lo que muchas moléculas de ARNm se pueden producir rápidamente a partir de una sola copia de un gen. Las tasas de alargamiento características en procariotas y eucariotas son de aproximadamente 10-100 nts / seg. En eucariotas, sin embargo, los nucleosomas actúan como barreras importantes para la transcripción de polimerasas durante el alargamiento de la transcripción. En estos organismos, la pausa inducida por nucleosomas puede regularse por factores de elongación de la transcripción como TFIIS.

El alargamiento también implica un mecanismo de corrección de pruebas que puede reemplazar bases incorporadas incorrectamente. En eucariotas, esto puede corresponder con breves pausas durante la transcripción que permiten que se unan los factores de edición de ARN apropiados. Estas pausas pueden ser intrínsecas a la ARN polimerasa o debido a la estructura de la cromatina.

11.3.4 Terminación

Las bacterias utilizan dos estrategias diferentes para la terminación de la transcripción: terminación independiente de Rho y terminación dependiente de Rho. En la terminación de la transcripción independiente de Rho, la transcripción del ARN se detiene cuando la molécula de ARN recién sintetizada forma un bucle en horquilla rico en G-C seguido de una serie de Us. Cuando se forma la horquilla, la tensión mecánica rompe los enlaces débiles rU-dA, llenando ahora el híbrido ADN-ARN. Esto saca la transcripción de poli-U del sitio activo de la ARN polimerasa, terminando la transcripción. En el tipo de terminación “dependiente de Rho”, un factor proteico llamado “Rho” desestabiliza la interacción entre la plantilla y el ARNm, liberando así el ARNm sintetizado por el new1 del complejo de elongación.

La terminación de la transcripción en eucariotas se comprende menos que en bacterias, pero implica la escisión de la nueva transcripción seguida de la adición de adeninas independiente de la plantilla en su nuevo extremo 3 ', en un proceso llamado poliadenilación.

11.3.5 Inhibidores de la transcripción

Los inhibidores de la transcripción pueden usarse como antibióticos contra, por ejemplo, bacterias patógenas (antibacterianos) y hongos (antifúngicos). Un ejemplo de tal antibacteriano es la rifampicina, que inhibe la transcripción bacteriana del ADN en ARNm al inhibir la ARN polimerasa dependiente de ADN al unirse a su subunidad beta, mientras que la 8-hidroxiquinolina es un inhibidor de la transcripción antifúngico. Los efectos de la metilación de histonas también pueden inhibir la acción de la transcripción.

En los vertebrados, la mayoría de los promotores de genes contienen una isla CpG con numerosos sitios CpG. Cuando muchos de los sitios CpG del promotor de un gen están metilados, el gen se inhibe (silencia).

11.3.6 Factores de transcripción

Las unidades de transcripción activas se agrupan en el núcleo, en sitios discretos llamados fábricas de transcripción o eucromatina. Dichos sitios pueden visualizarse permitiendo que las polimerasas comprometidas extiendan sus transcripciones en precursores marcados (Br-UTP o Br-U) e inmunomarcando el ARN naciente marcado. Las fábricas de transcripción también se pueden localizar usando hibridación in situ con fluorescencia o marcadas con anticuerpos dirigidos contra polimerasas. Existen

10.000 fábricas en el nucleoplasma de una célula HeLa, entre las que se encuentran

8.000 fábricas de polimerasa II y

2.000 fábricas de polimerasa III. Cada fábrica de polimerasa II contiene

8 polimerasas. Como la mayoría de las unidades de transcripción activas están asociadas con una sola polimerasa, cada fábrica generalmente contiene

8 unidades de transcripción diferentes. Estas unidades pueden estar asociadas a través de promotores y / o potenciadores, con bucles que forman una "nube" alrededor del factor.

François Jacob y Jacques Monod plantearon la hipótesis de una molécula que permite que el material genético se convierta en una proteína. Severo Ochoa ganó un Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1959 por desarrollar un proceso para sintetizar ARN in vitro con polinucleótido fosforilasa, que fue útil para descifrar el código genético. La síntesis de ARN por la ARN polimerasa fue establecida in vitro por varios laboratorios en 1965.

Roger D. Kornberg ganó el Premio Nobel de Química de 2006 "por sus estudios de las bases moleculares de la transcripción eucariota".

11.3.7 Procesamiento de ARN

La modificación postranscripcional o modificación cotranscripcional es un conjunto de procesos biológicos comunes a la mayoría de las células eucariotas mediante los cuales una transcripción primaria de ARN se altera químicamente después de la transcripción de un gen para producir una molécula de ARN madura y funcional que luego puede salir del núcleo y funcionar. cualquiera de una variedad de funciones diferentes en la célula. Hay muchos tipos de modificaciones postranscripcionales que se logran a través de una clase diversa de mecanismos moleculares.

Quizás el ejemplo más notable es la conversión de transcripciones de ARN mensajero precursor en ARN mensajero maduro que posteriormente es capaz de traducirse en proteína. Este proceso incluye tres pasos principales que modifican significativamente la estructura química de la molécula de ARN: la adición de una tapa de 5 ', la adición de una cola poliadenilada de 3' y el empalme de ARN. Dicho procesamiento es vital para la traducción correcta de genomas eucariotas porque el ARNm precursor inicial producido por transcripción a menudo contiene exones (secuencias codificantes) e intrones (secuencias no codificantes). El empalme elimina los intrones y une los exones directamente, mientras que el casquete y la cola Facilitar el transporte del ARNm a un ribosoma y protegerlo de la degradación molecular.

Las modificaciones postranscripcionales también pueden ocurrir durante el procesamiento de otras transcripciones que finalmente se convierten en ARN de transferencia, ARN ribosómico o cualquiera de los otros tipos de ARN utilizados por la célula.

11.3.8 procesamiento de ARNm

La molécula de pre-ARNm sufre tres modificaciones principales. Estas modificaciones son el taponamiento 5 ', la poliadenilación 3' y el empalme de ARN, que se producen en el núcleo celular antes de que se traduzca el ARN.

11.3.9 Procesamiento de 5 '

El taponamiento del pre-mRNA implica la adición de 7-metilguanosina (m7G) al extremo 5 '. Para lograr esto, es necesario eliminar el fosfato 5 'terminal, que se realiza con la ayuda de una enzima fosfatasa. La enzima guanosil transferasa luego cataliza la reacción, que produce el difosfato extremo 5 '. El extremo 5 'del difosfato ataca el átomo de fósforo alfa de una molécula de GTP para agregar el residuo de guanina en un enlace trifosfato 5'5'. La enzima (guanina-N7 -) - metiltransferasa ("cap MTasa") transfiere un grupo metilo de S-adenosil metionina al anillo de guanina. Este tipo de tapa, con solo el (m7G) en posición, se llama estructura de tapa 0. La ribosa del nucleótido adyacente también puede metilarse para dar un casquete 1. La metilación de nucleótidos corriente abajo de la molécula de ARN produce estructuras de casquete 2, casquete 3 y así sucesivamente. En estos casos, los grupos metilo se agregan a los grupos 2 ’OH del azúcar ribosa. La tapa protege el extremo 5 'del transcrito de ARN primario del ataque de ribonucleasas que tienen especificidad para los enlaces fosfodiéster de 3'5'.

11.3.10 Procesamiento de 3 '

El procesamiento de pre-ARNm en el extremo 3 'de la molécula de ARN implica la escisión de su extremo 3' y luego la adición de aproximadamente 250 residuos de adenina para formar una cola de poli (A). Las reacciones de escisión y adenilación ocurren principalmente si una secuencia señal de poliadenilación (5'-AAUAAA-3 ') se encuentra cerca del extremo 3' de la molécula de pre-ARNm, que es seguida por otra secuencia, que generalmente es (5'-CA -3 ') y es el sitio de escisión. Una secuencia rica en GU también suele estar presente más corriente abajo en la molécula de pre-ARNm. Más recientemente, se ha demostrado que secuencias señal alternativas como UGUA corriente arriba del sitio de escisión también pueden dirigir la escisión y la poliadenilación en ausencia de la señal AAUAAA. Es importante comprender que estas dos señales no son mutuamente independientes y, a menudo, coexisten. Después de la síntesis de los elementos de la secuencia, varias proteínas de subunidades múltiples se transfieren a la molécula de ARN. La transferencia de estas proteínas de unión específicas de secuencia, factor de especificidad de escisión y poliadenilación (CPSF), factor de escisión I (CF I) y factor de estimulación de escisión (CStF) se produce a partir de la ARN polimerasa II. Los tres factores se unen a los elementos de la secuencia. La señal AAUAAA está unida directamente por CPSF. Para los sitios de procesamiento dependientes de UGUA, la unión del complejo de múltiples proteínas se realiza mediante el Factor de escisión I (CF I). El complejo de proteínas resultante formado contiene factores de escisión adicionales y la enzima poliadenilato polimerasa (PAP). Este complejo escinde el ARN entre la secuencia de poliadenilación y la secuencia rica en GU en el sitio de escisión marcado por las secuencias (5'-CA-3 '). Luego, la poli (A) polimerasa agrega aproximadamente 200 unidades de adenina al nuevo extremo 3 'de la molécula de ARN utilizando ATP como precursor. A medida que se sintetiza la cola de poli (A), se une a múltiples copias de la proteína de unión de poli (A), que protege el extremo 3 de la digestión por ribonucleasa.

11.3.11 Empalme de intrones

El empalme de ARN es el proceso mediante el cual los intrones, regiones de ARN que no codifican proteínas, se eliminan del pre-ARNm y los exones restantes se conectan para volver a formar una única molécula continua. Los exones son secciones de ARNm que se "expresan" o se traducen en una proteína. Son las porciones codificantes de una molécula de ARNm. Aunque la mayoría de los empalmes de ARN se producen después de la síntesis completa y la terminación del pre-ARNm, las transcripciones con muchos exones pueden empalmarse co-transcripcionalmente. La reacción de empalme es catalizada por un gran complejo de proteínas llamado spliceosoma ensamblado a partir de proteínas y pequeñas moléculas de ARN nuclear que reconocen los sitios de empalme en la secuencia de pre-ARNm. Muchos pre-ARNm, incluidos los que codifican anticuerpos, pueden empalmarse de múltiples formas para producir diferentes ARNm maduros que codifican diferentes secuencias de proteínas. Este proceso se conoce como empalme alternativo y permite la producción de una gran variedad de proteínas a partir de una cantidad limitada de ADN.

11.3.12 Transcripción inversa

Algunos virus (como el VIH, la causa del SIDA) tienen la capacidad de transcribir ARN en ADN. El VIH tiene un genoma de ARN que se transcribe de forma inversa en ADN. El ADN resultante se puede fusionar con el genoma de ADN de la célula huésped. La principal enzima responsable de la síntesis de ADN a partir de una plantilla de ARN se llama transcriptasa inversa.

En el caso del VIH, la transcriptasa inversa es responsable de sintetizar una hebra de ADN complementaria (ADNc) al genoma del ARN viral. La enzima ribonucleasa H digiere entonces la cadena de ARN y la transcriptasa inversa sintetiza una cadena complementaria de ADN para formar una estructura de ADN de doble hélice ("ADNc"). El cDNA se integra en el genoma de la célula huésped por la enzima integrasa, que hace que la célula huésped genere proteínas virales que se reensamblen en nuevas partículas virales. En el VIH, después de esto, la célula huésped sufre una muerte celular programada o apoptosis de las células T. Sin embargo, en otros retrovirus, la célula huésped permanece intacta a medida que el virus sale de la célula.

Algunas células eucariotas contienen una enzima con actividad de transcripción inversa llamada telomerasa. La telomerasa es una transcriptasa inversa que alarga los extremos de los cromosomas lineales. La telomerasa lleva una plantilla de ARN a partir de la cual sintetiza una secuencia repetida de ADN o ADN "basura". Esta secuencia repetida de ADN se llama telómero y se puede considerar como un "casquete" para un cromosoma. Es importante porque cada vez que se duplica un cromosoma lineal, se acorta. Con este ADN "basura" o "tapa" en los extremos de los cromosomas, el acortamiento elimina parte de la secuencia repetida no esencial en lugar de la secuencia de ADN que codifica la proteína, que está más lejos del extremo del cromosoma.

La telomerasa a menudo se activa en las células cancerosas para permitir que las células cancerosas dupliquen sus genomas indefinidamente sin perder una secuencia importante de ADN que codifica proteínas. La activación de la telomerasa podría ser parte del proceso que permite que las células cancerosas se vuelvan inmortales. Se ha demostrado que el factor de inmortalización del cáncer a través del alargamiento de los telómeros debido a la telomerasa ocurre en el 90% de todos los tumores cancerígenos in vivo y el 10% restante utiliza una ruta alternativa de mantenimiento de los telómeros llamada ALT o alargamiento alternativo de los telómeros.

11.3.13 Exportación de ARN

En eucariotas, la mayor parte del ARN maduro debe exportarse al citoplasma desde el núcleo. Si bien algunos ARN funcionan en el núcleo, muchos ARN se transportan a través de los poros nucleares hacia el citosol. La exportación de ARN requiere la asociación con proteínas específicas conocidas como exportinas. Las moléculas específicas de exportina son responsables de la exportación de un tipo de ARN determinado. El transporte de ARNm también requiere la asociación correcta con Exon Junction Complex (EJC), lo que garantiza que se complete el procesamiento correcto del ARNm antes de la exportación.En algunos casos, los ARN se transportan adicionalmente a una parte específica del citoplasma, como una sinapsis, luego son remolcados por proteínas motoras que se unen a través de proteínas enlazadoras a secuencias específicas (llamadas "códigos postales") en el ARN.

11.3.14 Traducción y código genético

En biología molecular y genética, la traducción es el proceso por el cual los ribosomas en el citoplasma o retículo endoplásmico (RE) sintetizan proteínas después del proceso de transcripción de ADN a ARN en el núcleo de la célula. Todo el proceso se llama expresión genética.

11.3.15 Ribosomas

Los ribosomas son máquinas macromoleculares complejas, que se encuentran dentro de todas las células vivas, que sirven como sitio de síntesis de proteínas biológicas. Los ribosomas unen los aminoácidos en el orden especificado por las moléculas de ARN mensajero (ARN). Los ribosomas constan de dos componentes principales: las subunidades ribosómicas pequeñas, que leen el ARNm, y las subunidades grandes, que se unen a los aminoácidos para formar una cadena polipeptídica. Cada subunidad consta de una o más moléculas de ARN ribosómico (ARNr) y una variedad de proteínas ribosómicas. Los ribosomas y las moléculas asociadas también se conocen como aparato de traducción.

La secuencia de ADN, que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína, se copia en una cadena de ARN mensajero. Puede copiarse muchas veces en cadenas de ARN. Los ribosomas pueden unirse a una cadena de ARN mensajero y usar su secuencia para determinar la secuencia correcta de aminoácidos para generar una proteína determinada. Los aminoácidos se seleccionan, recogen y transportan al ribosoma mediante moléculas de ARN de transferencia (ARNt), que entran en una parte del ribosoma y se unen a la cadena del ARN mensajero. Es durante esta unión que se produce la traducción correcta de la secuencia de ácido nucleico a la secuencia de aminoácidos. Para cada triplete codificante en el ARN mensajero hay un ARN de transferencia distinto que coincide y que lleva el aminoácido correcto para ese triplete codificante. Los aminoácidos adjuntos se unen luego entre sí por otra parte del ribosoma. Una vez que se produce la proteína, puede plegarse para producir una estructura tridimensional funcional específica, aunque durante la síntesis algunas proteínas comienzan a plegarse en su forma correcta.

Un ribosoma está hecho de complejos de ARN y proteínas y, por lo tanto, es una ribonucleoproteína. Cada ribosoma se divide en dos subunidades:

  1. una subunidad más pequeña que se une a una subunidad más grande y al patrón de ARNm, y
  2. una subunidad más grande que se une al ARNt, los aminoácidos y la subunidad más pequeña.

Cuando un ribosoma termina de leer una molécula de ARNm, estas dos subunidades se separan. Los ribosomas son ribozimas, porque la actividad de la peptidil transferasa catalítica que une los aminoácidos la realiza el ARN ribosómico. Los ribosomas a menudo se asocian con las membranas intracelulares que forman el retículo endoplásmico rugoso.

Los ribosomas de bacterias, arqueas y eucariotas en el sistema de tres dominios se parecen entre sí en un grado notable, evidencia de un origen común. Se diferencian por su tamaño, secuencia, estructura y proporción de proteína a ARN. Las diferencias en la estructura permiten que algunos antibióticos maten bacterias al inhibir sus ribosomas, sin afectar a los ribosomas humanos. En bacterias y arqueas, más de un ribosoma puede moverse a lo largo de una sola cadena de ARNm a la vez, cada uno "leyendo" su secuencia y produciendo una molécula de proteína correspondiente.

Los ribosomas mitocondriales de las células eucariotas se producen a partir de genes mitocondriales y se parecen funcionalmente a muchas características de los de las bacterias, lo que refleja el probable origen evolutivo de las mitocondrias.

Los ribosomas fueron observados por primera vez a mediados de la década de 1950 por el biólogo celular rumano-estadounidense George Emil Palade, utilizando un microscopio electrónico, como partículas densas o gránulos. El término "ribosoma" fue propuesto por el científico Richard B. Roberts a finales de la década de 1950.

Albert Claude, Christian de Duve y George Emil Palade fueron galardonados conjuntamente con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina, en 1974, por el descubrimiento del ribosoma. El Premio Nobel de Química 2009 fue otorgado a Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz y Ada E. Yonath por determinar la estructura detallada y el mecanismo del ribosoma.

11.3.16 Ribosomas bacterianos

Los ribosomas procarióticos miden alrededor de 20 nm (200 Å) de diámetro y están compuestos por 65% de rRNA y 35% de proteínas ribosómicas. Los ribosomas eucariotas tienen entre 25 y 30 nm (250-300 Å) de diámetro con una relación de ARNr a proteína cercana a 1. El trabajo cristalográfico ha demostrado que no hay proteínas ribosómicas cerca del sitio de reacción para la síntesis de polipéptidos. Esto sugiere que los componentes proteicos de los ribosomas no participan directamente en la catálisis de formación de enlaces peptídicos, sino que estas proteínas actúan como un andamio que puede mejorar la capacidad del ARNr para sintetizar proteínas.

Figura 11.11: Estructura cristalina del ribosoma bacteriano 70S de la bacteria. Thermus thermophilus. Las proteínas de la subunidad ribosómica 30S (pequeñas) están coloreadas en verde, las proteínas de la subunidad 50S (grandes) están coloreadas en azul, el ARN ribosómico está coloreado en naranja. Las subunidades 30S contienen 3 moléculas de ARNt (basadas en coordenadas atómicas de PDB 1JGQ y PDB 1GIY representadas con la herramienta de visualización molecular de código abierto PyMol).

La unidad de medida utilizada para describir las subunidades ribosómicas y los fragmentos de ARNr es la unidad de Svedberg, una medida de la velocidad de sedimentación en la centrifugación en lugar del tamaño. Esto explica por qué los nombres de los fragmentos no cuadran: por ejemplo, los ribosomas bacterianos 70S están formados por subunidades 50S y 30S.

Las bacterias tienen ribosomas 70S, cada uno de los cuales consta de una subunidad pequeña (30S) y una grande (50S). Escherichia coli, por ejemplo, tiene una subunidad de ARN 16S (que consta de 1540 nucleótidos) que está unida a 21 proteínas. La subunidad grande está compuesta por una subunidad de ARN 5S (120 nucleótidos), una subunidad de ARN 23S (2900 nucleótidos) y 31 proteínas.

11.3.17 Ribosomas eucariotas

Los eucariotas tienen ribosomas 80S ubicados en su citosol, cada uno de los cuales consta de una subunidad pequeña (40S) y una grande (60S). Su subunidad 40S tiene un ARN 18S (1900 nucleótidos) y 33 proteínas. La subunidad grande está compuesta por subunidades de ARN 5S (120 nucleótidos), ARN 28S (4700 nucleótidos), subunidades de ARN 5.8S (160 nucleótidos) y 46 proteínas.

Figura 11.12: Estructura cristalina del ribosoma 80S humano (basada en coordenadas atómicas de PDB 4V6X renderizadas con la herramienta de visualización molecular de código abierto PyMol). Las proteínas de la subunidad ribosómica 40S (pequeñas) se muestran en azul claro, las proteínas de la subunidad 60S (grandes) en verde pálido y el ARN ribosómico en naranja.

Los químicos farmacéuticos aprovechan las diferencias entre los ribosomas bacterianos y eucariotas para crear antibióticos que pueden matar bacterias sin dañar las células eucariotas. Debido a las diferencias en sus estructuras, los ribosomas bacterianos 70S son vulnerables a estos antibióticos, mientras que los ribosomas eucariotas 80S no lo son.

Los diversos ribosomas comparten una estructura central, que es bastante similar a pesar de las grandes diferencias de tamaño. Gran parte del ARN está altamente organizado en varios motivos estructurales terciarios, por ejemplo, pseudonudos que exhiben apilamiento coaxial. El ARN extra en los ribosomas más grandes se encuentra en varias inserciones continuas largas, de modo que forman bucles fuera de la estructura del núcleo sin interrumpirla ni cambiarla. Toda la actividad catalítica del ribosoma es llevada a cabo por el ARN, las proteínas residen en la superficie y parecen estabilizar la estructura.

Las aminoacil tRNA sintetasas (enzimas) catalizan la unión entre tRNA específicos y los aminoácidos que requieren sus secuencias anticodón. El producto de esta reacción es un aminoacil-tRNA. En los procariotas, este aminoacil-tRNA es transportado al ribosoma por EF-Tu, donde los codones de mRNA se emparejan a través del apareamiento de bases complementarias con anticodones de tRNA específicos.

El ribosoma tiene tres sitios para que el tRNA se una. Son el sitio aminoacilo (abreviado A), el sitio peptidilo (abreviado P) y el sitio de salida (abreviado E). Con respecto al ARNm, los tres sitios están orientados de 5 'a 3' E-P-A, porque los ribosomas se mueven hacia el extremo 3 'del ARNm. El sitio A une el ARNt entrante con el codón complementario del ARNm. El sitio P contiene el ARNt con la cadena polipeptídica en crecimiento. El sitio E contiene el tRNA sin su aminoácido y luego se libera el tRNA. Cuando un aminoacil-tRNA se une inicialmente a su codón correspondiente en el mRNA, está en el sitio A. Luego, se forma un enlace peptídico entre el aminoácido del tRNA en el sitio A y el aminoácido del tRNA cargado en el sitio P. La cadena polipeptídica en crecimiento se transfiere al ARNt en el sitio A. Se produce la translocación, moviendo el ARNt en el sitio P, ahora sin un aminoácido, al sitio E, el ARNt que estaba en el sitio A, ahora cargado con la cadena polipeptídica, se mueve al sitio P. El tRNA en el sitio E sale y otro aminoacil-tRNA entra en el sitio A para repetir el proceso.

Después de que se agrega el nuevo aminoácido a la cadena, y después de que el ARNm se libera del núcleo al núcleo del ribosoma, la energía proporcionada por la hidrólisis de un ATP unido a la translocasa EF-G (en procariotas) y eEF- 2 (en eucariotas) mueve el ribosoma hacia abajo un codón hacia el extremo 3 '. La energía requerida para la traducción de proteínas es significativa. Para una proteína que contiene n aminoácidos, el número de enlaces fosfato de alta energía necesarios para traducirla es 4n + 1. La velocidad de traducción varía; es significativamente mayor en células procariotas (hasta 17-21 residuos de aminoácidos por segundo) que en células eucariotas (hasta 6-9 residuos de aminoácidos por segundo).

Aunque los ribosomas suelen considerarse máquinas procesadoras precisas, el proceso de traducción está sujeto a errores que pueden conducir a la síntesis de proteínas erróneas o al abandono prematuro de la traducción. Se ha estimado que la tasa de error en la síntesis de proteínas está entre 1/10 5 y 1/10 3 aminoácidos mal incorporados, dependiendo de las condiciones experimentales. En cambio, se ha estimado que la tasa de abandono prematuro de la traducción es del orden de magnitud de 10 -4 eventos por codón traducido. El aminoácido correcto se une covalentemente al ARN de transferencia correcto (ARNt) mediante amino acil transferasas. El aminoácido está unido por su grupo carboxilo al 3 ’OH del tRNA por un enlace éster. Cuando el tRNA tiene un aminoácido ligado a él, el tRNA se denomina "cargado". La iniciación implica la unión de la pequeña subunidad del ribosoma al extremo 5 'del ARNm con la ayuda de factores de iniciación (IF). En los procariotas, el inicio de la síntesis de proteínas implica el reconocimiento de una secuencia de inicio rica en purina en el ARNm llamada secuencia de Shine-Dalgarno. La secuencia de Shine-Dalgarno se une a una secuencia complementaria rica en pirimidina en el extremo 3 'de la parte del ARNr 16S de la subunidad ribosómica 30S. La unión de estas secuencias complementarias asegura que la subunidad ribosómica 30S esté unida al ARNm y esté alineada de manera que el codón de iniciación se coloque en la porción 30S del sitio P. Una vez que el mRNA y la subunidad 30S se unen correctamente, un factor de iniciación lleva el complejo iniciador tRNA-aminoácido, f-Met-tRNA, al sitio 30SP. La fase de inicio se completa una vez que una subunidad 50S se une a la subunidad 30, formando un ribosoma 70S activo. La terminación del polipéptido ocurre cuando el sitio A del ribosoma está ocupado por un codón de terminación (UAA, UAG o UGA) en el ARNm. Por lo general, el ARNm no puede reconocer ni unirse a los codones de parada. En cambio, el codón de parada induce la unión de una proteína de factor de liberación (RF1 y amp RF2) que provoca el desensamblaje de todo el complejo ribosoma / ARNm mediante la hidrólisis de la cadena polipeptídica del centro de la peptidil transferasa del ribosoma. Los fármacos o motivos de secuencia especial en el ARNm pueden cambiar la estructura ribosómica de modo que los ARNt casi afines se unan al codón de terminación en lugar de a los factores de liberación. En tales casos de "lectura traslacional", la traducción continúa hasta que el ribosoma encuentra el siguiente codón de parada.

El proceso de traducción está altamente regulado en organismos procariotas y eucariotas. La regulación de la traducción puede afectar la tasa global de síntesis de proteínas, que está estrechamente relacionada con el estado metabólico y proliferativo de una célula. Además, un trabajo reciente ha revelado que las diferencias genéticas y su posterior expresión como ARNm también pueden afectar la tasa de traducción de una manera específica de ARN.

11.3.18 Traducción

En la traducción, el ARN mensajero (ARNm) se decodifica en el centro de decodificación del ribosoma para producir una cadena de aminoácidos o polipéptido específico. El polipéptido luego se pliega en una proteína activa y realiza sus funciones en la célula. El ribosoma facilita la decodificación al inducir la unión de secuencias anticodón de ARNt complementarias a codones de ARNm. Los ARNt transportan aminoácidos específicos que están encadenados en un polipéptido a través del cual pasa el ARNm y es leído por el ribosoma.

La traducción se desarrolla en tres fases:

  1. Iniciación: El ribosoma se ensambla alrededor del ARNm diana. El primer ARNt se une al codón de inicio.
  2. Alargamiento: El tRNA transfiere un aminoácido al tRNA correspondiente al siguiente codón. El ribosoma luego se mueve (transloca) al siguiente codón de ARNm para continuar el proceso, creando una cadena de aminoácidos.
  3. Terminación: Cuando un peptidil tRNA encuentra un codón de parada, el ribosoma se desprende.

En los procariotas, la traducción se produce en el citosol, donde las subunidades medianas y pequeñas del ribosoma se unen al ARNt. En eucariotas, la traducción se produce en el citosol o a través de la membrana del retículo endoplásmico en un proceso llamado translocación cotraduccional. En la translocación cotraduccional, todo el complejo ribosoma / ARNm se une a la membrana externa del retículo endoplásmico rugoso (RE) y la nueva proteína se sintetiza y se libera en el RE.

Muchos tipos de ARN transcrito, como el ARN de transferencia, el ARN ribosómico y el ARN nuclear pequeño, no se traducen en proteínas.

Varios antibióticos actúan inhibiendo la traducción. Estos incluyen clindamicina, anisomicina, cicloheximida, cloranfenicol, tetraciclina, estreptomicina, eritromicina y puromicina. Los ribosomas procarióticos tienen una estructura diferente a la de los ribosomas eucarióticos y, por lo tanto, los antibióticos pueden atacar específicamente las infecciones bacterianas sin dañar las células del huésped eucariótico.

En 1954, Zamecnik y Hoagland descubrieron el ARNt. En 1955, George E. Palade descubrió los ribosomas.

11.3.19 Traducción eucariota

11.3.20 Iniciación

El inicio de la traducción generalmente implica la interacción de ciertas proteínas clave, los factores de iniciación, con una etiqueta especial unida al extremo 5 'de una molécula de ARNm, la tapa 5', así como con la UTR 5 '. Estas proteínas se unen a la subunidad ribosómica pequeña (40S) y mantienen el ARNm en su lugar. eIF3 está asociado con la subunidad ribosómica 40S y desempeña un papel en la prevención de la unión prematura de la subunidad ribosómica grande (60S). eIF3 también interactúa con el complejo eIF4F, que consta de otros tres factores de iniciación: eIF4A, eIF4E y eIF4G. eIF4G es una proteína de andamiaje que se asocia directamente tanto con eIF3 como con los otros dos componentes. eIF4E es la proteína de unión a la tapa. La unión de la tapa por eIF4E a menudo se considera el paso limitante de la velocidad de iniciación dependiente de la tapa, y la concentración de eIF4E es un nexo regulador del control de la traducción. Ciertos virus escinden una parte de eIF4G que se une a eIF4E, evitando así que la traducción dependiente de la tapa se apropie de la maquinaria del huésped a favor de los mensajes virales (independientes de la tapa). eIF4A es una ARN helicasa dependiente de ATP que ayuda al ribosoma resolviendo ciertas estructuras secundarias formadas a lo largo del transcrito del ARNm. La proteína de unión a poli (A) (PABP) también se asocia con el complejo eIF4F a través de eIF4G y se une a la cola poli-A de la mayoría de las moléculas de ARNm eucariotas. Este complejo de preiniciación 43S (43S PIC) acompañado por los factores proteicos se mueve a lo largo de la cadena de ARNm hacia su extremo 3 ', en un proceso conocido como "exploración", para alcanzar el codón de inicio (típicamente AUG). En eucariotas y arqueas, el aminoácido codificado por el codón de inicio es la metionina. El iniciador tRNA cargado con Met (Met-tRNAiMet) se lleva al sitio P de la subunidad ribosómica pequeña mediante el factor de iniciación eucariota 2 (eIF2). Hidroliza GTP y señala la disociación de varios factores de la subunidad ribosómica pequeña, lo que finalmente conduce a la asociación de la subunidad grande (o subunidad 60S). El ribosoma completo (80S) comienza entonces el alargamiento de la traducción. La regulación de la síntesis de proteínas está parcialmente influenciada por la fosforilación de eIF2 (a través de la subunidad α), que es parte del complejo ternario eIF2-GTP-Met-tRNAiMet (eIF2-TC). Cuando se fosforilan grandes cantidades de eIF2, se inhibe la síntesis de proteínas. Esto ocurre con la inanición de aminoácidos o después de una infección viral. Sin embargo, una pequeña fracción de este factor de iniciación está fosforilada de forma natural. Otro regulador es 4EBP, que se une al factor de iniciación eIF4E e inhibe sus interacciones con eIF4G, evitando así la iniciación dependiente de la tapa. Para oponerse a los efectos de 4EBP, los factores de crecimiento fosforilan 4EBP, reduciendo su afinidad por eIF4E y permitiendo la síntesis de proteínas. Si bien la síntesis de proteínas está regulada globalmente mediante la modulación de la expresión de factores de iniciación clave, así como el número de ribosomas, los ARNm individuales pueden tener diferentes velocidades de traducción debido a la presencia de elementos de secuencia reguladora. Se ha demostrado que esto es importante en una variedad de entornos, incluida la meiosis de la levadura y la respuesta al etileno en las plantas. Además, trabajos recientes en levaduras y seres humanos sugieren que la divergencia evolutiva en las secuencias reguladoras cis puede afectar la regulación de la traducción. Además, las helicasas de ARN como DHX29 y Ded1 / DDX3 pueden participar en el proceso de inicio de la traducción, especialmente para ARNm con 5'UTR estructurados.

Iniciación independiente del casquete El ejemplo mejor estudiado de inicio de la traducción independiente del casquete en eucariotas es el del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES). Lo que diferencia la traducción independiente de la tapa de la traducción dependiente de la tapa es que la traducción independiente de la tapa no requiere la tapa 5 'para iniciar la exploración desde el extremo 5' del ARNm hasta el codón de inicio. El ribosoma se puede enviar al sitio de inicio mediante unión directa, factores de iniciación y / o ITAF (factores de acción trans de IRES) sin pasar por alto la necesidad de escanear todo el UTR de 5 '. Se ha encontrado que este método de traducción es importante en condiciones que requieren la traducción de ARNm específicos durante el estrés celular, cuando se reduce la traducción general. Los ejemplos incluyen factores que responden a la apoptosis y respuestas inducidas por estrés.

11.3.21 Alargamiento

El alargamiento depende de factores de alargamiento eucariotas. Al final del paso de iniciación, el ARNm se coloca de modo que el siguiente codón pueda traducirse durante la etapa de elongación de la síntesis de proteínas. El tRNA iniciador ocupa el sitio P en el ribosoma, y ​​el sitio A está listo para recibir un aminoacil-tRNA.Durante el alargamiento de la cadena, cada aminoácido adicional se agrega a la cadena polipeptídica naciente en un microciclo de tres pasos. Los pasos de este microciclo son (1) colocar el aminoacil-tRNA correcto en el sitio A del ribosoma, (2) formar el enlace peptídico y (3) desplazar el mRNA en un codón con respecto al ribosoma. A diferencia de las bacterias, en las que el inicio de la traducción se produce tan pronto como se sintetiza el extremo 5 'de un ARNm, en eucariotas no es posible un acoplamiento tan estrecho entre la transcripción y la traducción porque la transcripción y la traducción se llevan a cabo en compartimentos separados de la célula (el núcleo y citoplasma). Los precursores de ARNm eucariotas deben procesarse en el núcleo (p. Ej., Taponamiento, poliadenilación, empalme) antes de exportarse al citoplasma para su traducción.

11.3.22 Terminación

La terminación del alargamiento depende de factores de liberación eucariotas. El proceso es similar al de la terminación procariota, pero a diferencia de la terminación procariota, existe un factor de liberación universal, eRF1, que reconoce los tres codones de terminación. Tras la terminación, el ribosoma se desmonta y se libera el polipéptido completo. eRF3 es una GTPasa dependiente de ribosoma que ayuda a eRF1 a liberar el polipéptido completo.

11.3.23 El código genético

Mientras que otros aspectos como la estructura 3D, denominada estructura terciaria, de la proteína solo pueden predecirse utilizando algoritmos sofisticados, la secuencia de aminoácidos, denominada estructura primaria, se puede determinar únicamente a partir de la secuencia de ácido nucleico con la ayuda de una tabla de traducción.

Tabla 11.1: El código genético: codones de ARN.
U C A GRAMO
U UUU Fenilalanina (Phe) UCU Serina (Ser) UAU Tirosina (Tyr) Cisteína UGU (Cys) U
UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C
Leucina UUA (Leu) UCA Ser PARADA UAA PARADA UGA A
UUG Leu UCG Ser PARADA UAG Triptófano UGG (Trp) GRAMO
C Leucina CUU (Leu) CCU Proline (Pro) Histidina CAU (His) CGU Arginina (Arg) U
CUC Leu CCC Pro CAC Su CGC Arg C
CUA Leu CCA Pro CAA Glutamina (Gln) CGA Arg A
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg GRAMO
A AUU isoleucina (Ile) Treonina ACU (Thr) AAU Asparagina (Asn) AGU Serina (Ser) U
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C
AUA Ile ACA Thr AAA Lisina (Lys) AGA Arginina (Arg) A
AGOSTO Metionina (Met) o INICIO ACG Thr AAG Lys AGG Arg GRAMO
GRAMO GUU Valine Val GCU Alanina (Ala) Ácido aspártico GAU (Asp) GGU Glicina (Gly) U
GUC (Val) GCC Ala GAC Asp GGC Gly C
GUA Val GCA Ala Ácido glutámico GAA (Glu) GGA Gly A
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly GRAMO

Hay muchos programas de computadora capaces de traducir una secuencia de ADN / ARN en una secuencia de proteína. Normalmente esto se realiza utilizando el Código Genético Estándar (Tabla 11.1), sin embargo, pocos programas pueden manejar todos los casos “especiales”, como el uso de codones de iniciación alternativos. Por ejemplo, el codón de inicio alternativo raro CTG codifica para metionina cuando se usa como codón de inicio, y para leucina en todas las demás posiciones.

11.3.24 Plegado de proteínas

Cada proteína existe como un polipéptido desplegado o una espiral aleatoria cuando se traduce de una secuencia de ARNm a una cadena lineal de aminoácidos. Este polipéptido carece de estructura tridimensional desarrollada (el lado izquierdo de la figura vecina). El polipéptido luego se pliega en su estructura tridimensional característica y funcional a partir de una espiral aleatoria. Los aminoácidos interactúan entre sí para producir una estructura tridimensional bien definida, la proteína plegada (el lado derecho de la figura) conocida como estado nativo. La estructura tridimensional resultante está determinada por la secuencia de aminoácidos (dogma de Anfinsen).

La estructura tridimensional correcta es esencial para el funcionamiento, aunque algunas partes de las proteínas funcionales pueden permanecer desplegadas. La falta de plegado en la forma deseada generalmente produce proteínas inactivas con diferentes propiedades, incluidos priones tóxicos. Se cree que varias enfermedades neurodegenerativas y de otro tipo son el resultado de la acumulación de proteínas mal plegadas. Muchas alergias son causadas por el plegamiento de las proteínas, ya que el sistema inmunológico no produce anticuerpos para ciertas estructuras proteicas.

Las enzimas llamadas chaperonas ayudan a la proteína recién formada a alcanzar (plegarse) la estructura tridimensional que necesita para funcionar. De manera similar, las chaperonas de ARN ayudan a los ARN a alcanzar sus formas funcionales. Ayudar al plegamiento de proteínas es una de las funciones principales del retículo endoplásmico en eucariotas.

11.3.25 Translocación de proteínas

Las proteínas secretoras de eucariotas o procariotas deben translocarse para entrar en la vía secretora. Las proteínas recién sintetizadas se dirigen al canal de translocación eucariota Sec61 o procariota SecYEG mediante péptidos señal. La eficacia de la secreción de proteínas en eucariotas depende en gran medida del péptido señal que se haya utilizado.

11.3.26 Transporte de proteínas

Muchas proteínas están destinadas a otras partes de la célula además del citosol y se utiliza una amplia gama de secuencias de señalización o (péptidos señalizadores) para dirigir las proteínas a donde se supone que deben estar. En los procariotas, este es normalmente un proceso simple debido a la compartimentación limitada de la célula. Sin embargo, en eucariotas existe una gran variedad de diferentes procesos de focalización para asegurar que la proteína llegue al orgánulo correcto.

No todas las proteínas permanecen dentro de la célula y muchas se exportan, por ejemplo, enzimas digestivas, hormonas y proteínas de la matriz extracelular. En eucariotas, la vía de exportación está bien desarrollada y el mecanismo principal para la exportación de estas proteínas es la translocación al retículo endoplásmico, seguida del transporte a través del aparato de Golgi.


Notas al pie

Al compilar esta revisión, nuestro pensamiento se dirige a las decenas de colegas que han pasado por los laboratorios e invernaderos de Florigene Pty. Ltd. y Suntory Ltd. Agradecemos a todos y cada uno de ellos su contribución y agradecemos al Dr. Yoshi Tanaka por su revisión crítica de este manuscrito. Nuestros pensamientos especiales van a la familia del difunto Dr. Michael Dalling, quien falleció trágicamente en 2010. Mike fue una de las principales fuerzas impulsoras detrás del desarrollo y eventual comercialización de las primeras flores genéticamente modificadas del mundo y lo extrañamos profundamente.

Ambos autores tienen intereses económicos en Florigene Pty. Ltd. y Suntory Ltd.


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