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¿Cuánto ARN total se puede extraer del cerebro de Drosophila?


Me pregunto cuánto ARN total se podría extraer de un solo D. melanogaster cerebro. No pude encontrar esta información en la literatura.

El impacto más cercano fue este artículo, que afirma que se pueden extraer de 16 a 21,9 µg de ARN total de 100 cerebros, lo que se traduce en al menos 160 ng para un solo cerebro.

También encontré en el material complementario de este artículo que se extrajo 1 µg de ARN total de 5 a 10 cerebros de moscas, lo que también haría> 100 ng para un solo cerebro.

Hago la pregunta porque tengo la visión de realizar RNA-seq de un solo Drosophila sesos. El protocolo de preparación de bibliotecas estándar de Illumina TruSeq funciona con 100 ng de ARN total. Por lo tanto, me pregunto si esto es realista, o si debería apuntar a protocolos de preparación de bibliotecas de entrada baja.


En mi opinión, debería probar los protocolos de preparación de bibliotecas de entrada baja porque, en mi experiencia, incluso con una cantidad decente de ARN, estandarizar la secuenciación no es un trabajo fácil. El manual dice que este kit funciona con 10-20 ng de ARN; siempre asuma que el límite superior es cierto. También hay una mayor probabilidad de pérdida (relativa) durante la extracción. Intente hacer una precipitación con LiCl 5 M y un poco de glucógeno junto con alcohol; pero suponiendo que su rendimiento sea de 80 ng, aún puede ejecutar réplicas para realizar comparaciones estadísticas.


Encuesta de transcripciones en el adulto Drosophila cerebro

Los métodos clásicos de identificación de genes implicados en la función neural incluyen el laborioso proceso de cribado conductual de moscas mutagenizadas y luego volver a cribar líneas candidatas para detectar efectos pleiotrópicos debidos a defectos del desarrollo. Acelerar el análisis molecular de la función cerebral en Drosophila construimos una biblioteca de ADNc exclusivamente a partir de cerebros adultos. Nuestro objetivo era comenzar a desarrollar un catálogo de transcripciones expresadas en el cerebro. Se espera que estas transcripciones contengan una mayor proporción de clones que participan en la función neuronal.

Resultados

La biblioteca contiene aproximadamente 6,75 millones de clones independientes. A partir de nuestra caracterización inicial de 271 clones elegidos al azar, esperamos que aproximadamente el 11% de los clones en esta biblioteca identifiquen secuencias transcritas que no se encuentran en las bases de datos de etiquetas de secuencias expresadas. Además, el 15% de estos 271 clones no se encuentran entre los 13.601 predichos Drosophila genes.

Conclusiones

Nuestro análisis de este único Drosophila La biblioteca cerebral sugiere que el número de genes puede estar subestimado en este organismo. Este trabajo complementa el Drosophila proyecto del genoma proporcionando información que facilita una anotación más completa de la secuencia genómica. Esta biblioteca debería ser un recurso útil que ayudará a determinar cómo operan las funciones básicas del cerebro a nivel molecular.


Fondo

La regulación postranscripcional de la expresión génica juega un papel esencial en numerosos procesos biológicos en una variedad de tipos de células. Un contexto en el que los mecanismos reguladores postranscripcionales son particularmente importantes son las primeras etapas de la embriogénesis, durante las cuales el genoma cigótico está transcripcionalmente inactivo y el desarrollo está dirigido por ARNm y proteínas que se producen a partir del genoma de la madre y se cargan en el ovocito durante la ovogénesis. [1]. En el embrión temprano, la expresión génica se controla postranscripcionalmente mediante la regulación de la traducción, estabilidad y localización del ARNm por trans-factores que actúan como proteínas de unión a ARN (RBP) y microARN (miARN), que se unen a cis-secuencias de acción presentes en sus transcripciones diana. El paso del control del desarrollo de los productos génicos maternos a los cigóticos, denominada transición de la madre al cigótico (MZT), implica la degradación a gran escala de los ARNm derivados de la madre, que está mediada por dos tipos diferentes de mecanismos de degradación, un tipo dependiente exclusivamente de factores derivados de la madre (referidos aquí como maquinarias de descomposición 'materna' o 'temprana') y el otro tipo dependiente de factores expresados ​​zigóticamente (referidos aquí como maquinarias 'cigóticas' o 'tardías') [1, 2].

Drosophila El tumor cerebral (BRAT) juega un papel fundamental durante la Drosophila MZT reprimiendo la traducción de maternal jorobado (media pensión) ARNm en la parte posterior del embrión [3]. BRAT es un miembro de la familia de proteínas TRIM-NHL, que se conservan entre los metazoos. De hecho, la represión mediada por BRAT de media pensión ha servido como modelo para comprender los mecanismos por los cuales las proteínas TRIM-NHL funcionan como reguladores postranscripcionales. BRAT regula media pensión expresión en cooperación con Nanos (NOS) y la familia PUF RBP, Pumilio (PUM) [3]. En embriones de pum, palo de golf, o nos En las madres mutantes, la proteína HB se expresa ectópicamente en la parte posterior del embrión, lo que provoca una pérdida del destino de las células abdominales y letalidad embrionaria [3-8]. El papel de las proteínas TRIM-NHL como reguladores postranscripcionales y determinantes del destino celular no se limita a Drosophila (revisado en [9,10]). Por ejemplo, la proteína TRIM-NHL de mamíferos, TRIM71, funciona en la reprogramación de células diferenciadas en células madre pluripotentes inducidas a través de su capacidad para unirse e inhibir la traducción del ARNm de EGR1 [11] y un estudio reciente ha demostrado que TRIM71 puede reprimir traducción e inducir la degradación del ARNm [12].

En Drosophila, regulación de media pensión La traducción por el complejo BRAT-PUM-NOS está mediada por dos Nanos Response Elements (NRE) en el media pensión 3'UTR de ARNm. Cada NRE contiene dos motivos de secuencia, que se conocen como Caja A y Caja B. El motivo de la Caja B coincide con el sitio de unión por consenso de PUM, UGUANAUA, donde N = A / C / G / U, y está directamente unido por el terminal C de PUM Dominio de homología de PUF, que es un dominio de unión a ARN conservado (RBD). Un modelo anterior para explicar media pensión La regulación propuso que PUM y NOS hacen contacto directo con las NRE y entre sí, mientras que BRAT se recluta a través de su interacción con las proteínas PUM y NOS [3,5,13-16]. Sin embargo, trabajos recientes han demostrado que BRAT se asocia directamente con secuencias en y alrededor media pensión'S Box A motivos de una manera PUM-independiente a través de su dominio NHL C-terminal [17]. El hecho de que los mamíferos TRIM56 y TRIM71 estén reticulados con poli (A) ARN después de la exposición de las células a la irradiación UV [18, 19] es coherente con la capacidad de BRAT para unirse directamente al ARN.

Además de su papel en la represión media pensión ARNm en principios Drosophila Se ha demostrado que los embriones, PUM, BRAT y NOS cooperan en la regulación de otros ARNm en diferentes tipos de células. Por ejemplo, un complejo PUM-NOS-BRAT controla la excitabilidad de la neurona motora mediante la unión y regulación de paralítico (paraca) ARNm [20], y estas tres proteínas cooperan en la regulación de la morfogénesis dendrítica en el sistema nervioso periférico de las larvas [21].

PUM y BRAT también funcionan juntos, y probablemente independientes de NOS, para reprimir enojado y dMyc ARNm y, por lo tanto, promueven la diferenciación de células madre de la línea germinal durante la ovogénesis [22]. Además, PUM y NOS pueden regular los ARNm independientemente de BRAT. Por ejemplo, PUM y NOS actúan juntos, y sin BRAT, para regular ciclina B ARNm en células germinales primordiales [3,23,24].

Los experimentos en células de cultivo de tejidos han demostrado que PUM puede mediar en la represión de los ARNm informadores independientemente de BRAT y NOS [25]. Asimismo, BRAT parece ejercer funciones independientes de PUM. Por ejemplo, además de los defectos en el desarrollo abdominal en embriones de palo de golf madres mutantes, mutaciones en palo de golf causan una proliferación excesiva de neuroblastos en el cerebro de las larvas, lo que conduce a la producción de un crecimiento excesivo tumoral [26-30] que puede hacer metástasis tras el trasplante en el abdomen de moscas adultas [31]. Moscas mutantes para pum, sin embargo, no comparten este fenotipo de sobrecrecimiento de neuroblastos, lo que sugiere que representa una función para BRAT independiente de PUM. Además, BRAT puede reprimir las transcripciones informadoras de una manera independiente de PUM en ensayos basados ​​en líneas celulares [17], lo que respalda la idea de que BRAT puede funcionar independientemente de PUM.

Sin embargo, a pesar de los ejemplos antes mencionados, no está claro hasta qué punto PUM y BRAT cooperan o actúan de forma independiente, y si BRAT tiene alguna función independiente de PUM en la regulación de objetivos endógenos. en vivo es incierto. Además, no se ha definido el espectro de secuencias de ARN reconocidas por BRAT y no se ha explorado la gama de mecanismos que emplea BRAT para regular sus objetivos.

Para abordar estas preguntas e identificar nuevas funciones biológicas potenciales para PUM y BRAT en embriones tempranos, hemos llevado a cabo una identificación de todo el genoma de los ARNm asociados con PUM y BRAT. Nuestros resultados demuestran que cada RBP está asociado con cientos de ARNm en embriones tempranos, menos de un tercio de los cuales están co-unidos por ambos RBP. Además, a través del análisis computacional de ARNm asociados a BRAT y in vitro ensayos, hemos identificado un motivo de ARN de consenso unido por BRAT, cuya importancia funcional se confirmó utilizando ensayos de indicador de luciferasa en Drosophila células de cultivo de tejidos. El análisis de términos de ontología genética (GO) de las funciones de los ARNm asociados a PUM y BRAT sugiere una serie de funciones biológicas novedosas para PUM y BRAT en embriones tempranos. El análisis del estado de traducción y la estabilidad de las dianas de ARNm de PUM y BRAT revela que: (1) las dianas de ambas RBP están reprimidas por traducción (2) las dianas de PUM se degradan principalmente durante la fase tardía de la MZT y (3) los ARNm asociados a BRAT son degradado durante las fases temprana y tardía. De acuerdo con el papel de BRAT tanto en la represión traduccional como en la degradación de la transcripción, un ARNm indicador de luciferasa que lleva sitios de unión a BRAT está sujeto a ambas formas de regulación. Un en vivo El papel de BRAT en la degradación del ARNm se verificó mediante un análisis del transcriptoma de embriones que carecen de la proteína BRAT funcional, que reveló que BRAT media en la degradación de cientos de ARNm maternos durante la MZT, como parte de la descomposición `` temprana '' y `` tardía ''. maquinarias. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan los primeros conocimientos sobre el papel de BRAT como regulador global de la desintegración del ARNm durante la MZT a través de la unión directa a una gran cantidad de transcripciones maternas.


Métodos

Disponibilidad de protocolo.

Se proporciona una instrucción detallada paso a paso como protocolo complementario y también es accesible desde Intercambio de protocolo 21 .

Drosophila tejido cerebral y preparación.

La línea de moscas Pdf-GAL4 era de Renn et al. 22 pJFRC4-3XUAS-IVS-mCD8 :: GFP, pJFRC5-5XUAS-IVS-mCD8 :: GFP y pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8 :: GFP eran de Pfeiffer et al. 17. Mi1 (55C05-p65ADZp (attP40) 71D01-ZpGdbd (attP2)), Mi4 (48A07-p65ADZp (attP40) 79H02-ZpGdbd (attP2)) y Mi9 (48A07-p65ADZp (attP40) VT046779-ZpGdbd (attP2)) Las líneas de controlador split-GAL4 se describen en Strother et al. 12. UAS-myr :: HaloTag era de Kohl et al. 13. Nosotros usamos w 1118 moscas que por lo demás eran de tipo salvaje o eterno experimentos. Para generar las moscas de titulación PDF-GFP, cruzamos Pdf-GAL4 con poblaciones que contenían 3 ×, 5 × o 10 × UAS-IVS-mCD8 :: GFP. Para la línea de inserción de doble GFP, hicimos un stock de pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8 :: GFP (attp18) :: pJFRC2-10XUAS-IVS-mCD8 :: GFP (attp2). A continuación, el stock se cruzó con Pdf-Gal4. Para generar la expresión selectiva de un reportero HaloTag en neuronas específicas del lóbulo óptico, cruzamos Mi1, Mi4, Mi9 a UAS-myr :: HaloTag. Las moscas se criaron en medio estándar de harina de maíz / agar suplementado con levadura en ciclos de 12 h de luz / 12 h de oscuridad a 25 ° C. Se utilizaron moscas macho en experimentos circadianos, moscas hembras en otro caso (ver Tabla complementaria 1). Se recolectaron moscas adultas de 3 a 5 días de edad, luego se diseccionaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron en paraformaldehído al 2% durante 55 min a 25 ° C bajo iluminación normal. Para las muestras de ZT14, se diseccionaron tejidos cerebrales bajo iluminación LED roja. Los tejidos del cerebro se deshidrataron antes de ser almacenados en EtOH al 100% durante la noche. Al comparar las condiciones, se eligieron tamaños de muestra de al menos 3 cerebros por condición. El análisis de datos cuantitativos se realizó sin cegamiento ni asignación al azar.

Las sondas de oligonucleótidos marcadas con amino 5 (Biosearch Technologies) se marcaron con fluoróforos de éster NHS de acuerdo con las pautas del fabricante. Para realizar FISH, rehidratado Drosophila Los tejidos cerebrales se expusieron a ácido acético al 5% a 4 ° C durante 5 min. Después de ser fijados en paraformaldehído al 2% durante 55 min a 25 ° C, los tejidos se incubaron en 1 × PBS con 1% de NaBH4 a 4 ° C durante 30 min y luego en tampón de prehibridación (formamida al 15%, 2 × SSC, Triton X-100 al 0,1%) durante 2 ha 50 ° C. Los tejidos cerebrales se transfirieron a 50 μL de tampón de hibridación (formamida al 10%, 2 × SSC, 5 × solución de Denhardt, 1 mg / ml de ARNt de levadura, 100 μg / ml, ADN de esperma de salmón, SDS al 0,1%) con sondas FISH (50 –100 ng / μL por reacción, que contienen conjuntos de sondas contra uno o varios genes) y se incuban a 50 ° C durante 10 hy luego a 37 ° C durante 10 h más. Después de una serie de pasos de lavado, los tejidos del cerebro se deshidrataron y se introdujeron en xileno para aclarar los tejidos. Se proporciona una descripción detallada de los procedimientos FISH como Protocolo Suplementario.

Tinción HaloTag e IHC.

Los cerebros de las moscas que expresan el indicador HaloTag se tiñeron con HaloTag-JF646 durante la fijación. Después de la disección, los tejidos del cerebro se transfirieron a paraformaldehído al 2% que contenía 2 µM de HaloTag-JF646 (ref. 23). Luego se incubaron con agitación durante 55 min a 25 ° C, seguido de una serie de lavados con PBS 1x. La tinción de anticuerpos se realizó después del marcado FISH. Después de una serie de pasos de lavado, los tejidos cerebrales se bloquearon con suero de cabra normal al 10% (NGS) en 1 × PBS con Triton X-100 al 0,5% (PBT al 0,5%) a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de tinción primaria de anticuerpos durante la noche. a 4 ° C. Las soluciones de anticuerpos primarios y secundarios contenían 5% de NGS en 0,5% de PBT. Para la tinción de anticuerpos primarios de GFP, los tejidos se expusieron a una fracción anti-GFP policlonal de conejo 1: 1000 (Life Technologies A11122) para la tinción de anticuerpos primarios de PDF, los tejidos se expusieron a anti-PDF de ratón 1: 1000 (Developmental Studies Hybridoma Bank, PDF C7) para la tinción primaria nc82, los tejidos se expusieron a 1:30 de ratón anti-bruchpilot (Developmental Studies Hybridoma Bank, nc82). Después de lavar el anticuerpo primario, los tejidos del cerebro se incubaron en el anticuerpo secundario durante la noche a 4 ° C. Para la tinción de anticuerpos secundarios de GFP, los tejidos se expusieron a 1: 1000 AF488 de cabra anti-conejo (Invitrogen A11034). Para la tinción de anticuerpos secundarios de PDF y nc82, los tejidos se expusieron a 1: 1000 Cy3 AffiniPure Goat anti-mouse (Jackson ImmunoResearch 115-165-166). A continuación, los tejidos cerebrales se fijaron en paraformaldehído al 2% durante 55 min a 25 ° C antes de la deshidratación y eliminación de xileno.

Imágenes confocales.

Para la obtención de imágenes confocales, todos los tejidos cerebrales se unieron a un cubreobjetos recubierto de poli-L-lisina y se montaron en DPX (Janelia Adult Drosophila Protocolo de montaje CNS DPX). Usamos un microscopio confocal Zeiss LSM 880 (líneas láser de 561 nm y 633 nm) obtenidas a través de un objetivo de aceite 25 × DIC NA 0.8 para detectar transcripciones de GFP en construcciones de Pdf-Gal4JFRC5 y moscas de tipo salvaje (Fig.1). Las imágenes se adquirieron con excitación secuencial como pilas con 1,5 μm z-espaciado. La ganancia del detector y la potencia del láser se mantuvieron constantes para todas las muestras. Detectar GFP transcripciones en los experimentos de titulación UAS, utilizamos un microscopio confocal Zeiss LSM 800 (líneas láser de 561 nm y 633 nm) obtenidas a través de un objetivo de aceite 63 × DIC NA 1.4. Las imágenes se adquirieron con excitación secuencial como pilas con 1,0 μm z-espaciado. La ganancia del detector y la potencia del láser se mantuvieron constantes para todas las muestras. Para detectar la expresión de neurotransmisores superpuestos en líneas Gal4, utilizamos un microscopio confocal Zeiss LSM 880 (líneas láser de 488 nm, 561 nm y 633 nm) obtenidas a través de un objetivo de aceite 63 × DIC NA 1.4 con exploración de detección lambda hiperespectral con 1,00 μm z-espaciado. Las imágenes del neurotransmisor multiplex se adquirieron en un microscopio confocal Zeiss LSM 880 (líneas láser de 488 nm, 561 nm y 633 nm) obtenidas a través de un objetivo de aceite 25 × DIC NA 0.8. Las imágenes se adquirieron con exploración de detección lambda hiperespectral como pilas con 0,50 μm z-espaciado. El resumen de los parámetros de imagen se encuentra en la Tabla complementaria 1.

Imágenes BB-SIM.

Las imágenes BB-SIM se adquirieron en un microscopio hecho a medida, que se describe con más detalle en la Nota complementaria 1. Se utilizan dos objetivos de excitación montados ortogonalmente para formar haces de Bessel, que se escalonan para crear una hoja de iluminación periódicamente a lo largo X o y, mientras que un tercer objetivo (eje óptico a lo largo del z dirección) detecta la fluorescencia (Fig. 2a). Los objetivos y la muestra se sumergen en medios de imagen (90% 1,2-diclorobenceno, 10% 1,2,4-triclorobenceno) con índice de refracción = 1,5525, emparejado con el tejido aclarado. Para emplear el análisis de iluminación estructurado, recopilamos varias imágenes con el patrón de franjas de iluminación desplazado para colocar el plano en mosaico. Xy repita el proceso ortogonalmente para enlosar el plano en y. Luego, la muestra se mueve en z, y la imagen se repite, y así sucesivamente para obtener la imagen del volumen 3D. En este trabajo, recopilamos 11 imágenes (fases) en X y y, estableciendo la apertura del anillo para lograr un FWHM del perfil de intensidad del haz de 350 nm en la cintura. La resolución después del análisis SIM, medida en perlas fluorescentes con excitación de 560 nm, es 200 x 200 x 290 nm (FWHM). El tratamiento de la muestra es idéntico al de las muestras confocales a través del paso de aclaramiento. Después de aclarar, las muestras se montan en cubreobjetos recubiertos con polilisina de 1,5 x 3 mm y se mantienen en xileno hasta la formación de imágenes.

Análisis de imagen.

Los detalles del análisis de imágenes se tratan en la Nota complementaria 3.

Disponibilidad de código.

Disponibilidad de datos.

Las secuencias de la sonda se enumeran en la Tabla complementaria 2. Todos los demás datos están disponibles de los autores a pedido razonable.


Capítulo diecisiete - Perfilado de RNA-seq de pequeños números de Drosophila Neuronas

Drosophila melanogaster tiene un reloj circadiano robusto, que impulsa un patrón de comportamiento rítmico: la actividad locomotora aumenta por la mañana poco antes de que se enciendan las luces (pico M) y por la noche poco antes de que se apaguen (pico E). Este patrón está controlado por

75 pares de neuronas circadianas en el Drosophila cerebro. Un grupo clave de neuronas son las células M (PDF + LN grandes y pequeñasvs), que controlan el pico M. Un segundo grupo clave son las celdas E, que consta de cuatro LNDsy el quinto LN pequeñov, que controlan el pico E. Estudios recientes muestran que las células M tienen un segundo papel además de controlar el pico M que comunican con las células E (así como DN1s) afectar su sincronización, probablemente en función de las condiciones ambientales (Guo, Cerullo, Chen, & amp Rosbash, 2014).

Para aprender sobre las moléculas dentro de las células M importantes para sus roles funcionales, hemos adaptado métodos para clasificar manualmente las neuronas de interés que expresan proteínas fluorescentes de las disociadas. Drosophila sesos. Aislamos ARNm y miARN de células M clasificadas y amplificamos los ADN resultantes para crear bibliotecas de secuenciación profunda. La inspección visual de las bibliotecas ilustra que son específicas de un subgrupo neuronal particular. Las bibliotecas de células M contienen atemporales y las bibliotecas de células dopaminérgicas contienen ple / TH. Usando estos datos, es posible identificar transcripciones cíclicas, así como muchos ARNm y miARN específicos o enriquecidos en grupos particulares de neuronas.


Modificación química del ARN para su función.

Las modificaciones químicas juegan un papel importante en la modificación y regulación de la función del ADN y el ARN. Delatte et al. muestran que, en la mosca de la fruta, muchos ARN mensajeros (ARNm) contienen la base modificada 5-hidroximetilcitosina (5hmC). La marca química es agregada por la misma enzima que agrega 5hmC al ADN. Debido a que muchos ARNm involucrados en el desarrollo neuronal contienen 5hmC, bloquear la enzima causa defectos cerebrales y es letal. In vivo, la hidroximetilación del ARN promueve la traducción del ARNm.


RESULTADOS

Convergencia de neuronas que expresan DTK e IPC

Antisuero contra las cucarachas (Leucophaea maderae) se sabe que el péptido 1 relacionado con la taquiquinina (LemTRP-1) reconoce las DTK (Siviter et al., 2000 Winther et al., 2003). El inmunomarcado con este antisuero reveló procesos neuronales con terminaciones varicosas adyacentes a las presuntas dendritas de IPC, reveladas por Dilp2-GFP impulsado por Gal4 (Fig. 1A, B). Las terminaciones inmunomarcadas con DTK no hacen muchos contactos directos con las ramas de IPC. Sin embargo, se sabe que los neuropéptidos emiten señales a cierta distancia en el sistema nervioso, lo que se denomina transmisión de volumen o señalización paracrina (véase Maywood et al., 2011 Nässel, 2009 Zupanc, 1996). No pudimos identificar las neuronas individuales que dan lugar a estos procesos de expresión de DTK, pero un estudio anterior (Winther et al., 2003) sugiere que las neuronas candidatas tienen sus cuerpos celulares en el tritocerebro. La inmunocitoquímica con un antisuero contra una secuencia del receptor de DTK, denominado DTKR, marca un conjunto de cuerpos celulares en la pars intercerebralis que recuerdan a las IPC, tanto en cerebros adultos (figura 1C) como en larvas (figura 1D). Desafortunadamente, el antisuero DTKR funciona solo en tejidos fijados con Bouin donde se apaga la fluorescencia de GFP y también la GFP parece desnaturalizada porque el anti-GFP tampoco funciona. Por lo tanto, no pudimos realizar el inmunomarcaje DTKR de Dilp2-GFP impulsado por Gal4 para una identificación adecuada. La especificidad de este antisuero del receptor se probó mediante la ejecución de inmunocitoquímica en cerebros de moscas que expresan DTKR en IPC mediante cruzamiento Dilp2-Gal4 / UAS-Dtkr-GFP. Se observó un fuerte inmunomarcado de DTKR en las IPC de estas moscas (material suplementario Fig. S1).

Niveles de Dilp transcripciones en el cerebro después de la eliminación de DTKR en IPC

Como los procesos neuronales que expresan DTK parecen dirigirse a las IPC cerebrales, probamos si la señalización de DTK afecta los niveles de Dilp transcripciones en estas células. El derribo de DTKR en los IPC se logró cruzando el Dilp2-Conductor Gal4 a UAS-DTKR-Línea ARNi. La eficacia de la UAS-DTKR-RNAi en la eliminación de transcripciones de receptores se ha determinado previamente mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) después de RNAi panneuronal (utilizando un Elav-Gal4 driver) la transcripción de DTKR se redujo en aproximadamente un 40% (Ignell et al., 2009). Tomamos muestras de ARN de este cruce de moscas a las 0 h (moscas alimentadas) y 24 h de inanición, y realizamos qPCR para determinar los niveles de Dilp2, Dilp3 y Dilp5 transcripciones después de la caída de DTKR en IPC.

En control vuela relativo Dilp2 y Dilp3 Las transcripciones no se vieron afectadas significativamente por la inanición de 24 h (Fig. 2A, B) mientras que Dilp5 la transcripción disminuyó significativamente (Fig. 2C). La caída de DTKR en IPC afectó a los tres Dilp transcripciones diferencialmente, tanto en moscas alimentadas como hambrientas (Fig. 2). Ambos Dilp2 y Dilp3 Las transcripciones aumentaron significativamente en moscas alimentadas después de la caída de DTKR en IPC (Fig. 2A, B), mientras que los niveles de Dilp5 no se vieron afectados en comparación con los controles (Fig. 2C). Además, solo el Dilp2 y Dilp3 los niveles se vieron afectados por la inanición de 24 h en las moscas DTKR-knockdown. Dilp2 aumenta significativamente en comparación con las moscas alimentadas del mismo genotipo y en comparación con los controles (Fig. 2A) mientras que Dilp3 disminuye drásticamente después de la inanición (Fig. 2B). Por tanto, parece como si la transcripción de ambos Dilp2 y Dilp3 aumenta después de la reducción de la señalización DTK vía DTKR en moscas que se alimentan normalmente y que la inanición de 24 h disminuye drásticamente Dilp3 transcripción y aumentos Dilp2 cuando la señalización DTKR se reduce en los IPC.

Procesos neuronales que expresan Drosophila taquiquinina, DTK, convergen en las células productoras de insulina (IPC) en la pars intercerebralis del cerebro adulto. (Ai) Los IPC cerebrales son revelados por Dilp2-Proteína verde fluorescente impulsada por Gal4 (GFP). Los cuerpos celulares IPC (cb) se localizan medialmente en la pars intercerebralis. Las presuntas dendritas (Dendr) se extienden lateralmente en el protocerebro dorsal mediano. (Aii) Canales fusionados que muestran IPC (verde) e inmunomarcaje de DTK (magenta). En esta proyección de múltiples secciones ópticas, se observa una superposición entre las dendritas de IPC y las varices que expresan DTK. (Aiii) Canal único que muestra terminaciones de axones que expresan DTK con varices. No es probable que los cuerpos celulares que expresan DTK que se ven en esta imagen sean los que afecten a las IPC [los más pequeños suministran procesos al complejo central (Kahsai et al., 2010 Winther et al., 2003)]. (Bi) Otro espécimen (un cerebro ligeramente inclinado en comparación con A) que muestra varicosidades inmunomarcadas con DTK (magenta) cerca de las dendritas de IPC (Dendr). Esta imagen es una pila de secciones ópticas. (Bii) Sección óptica única de los mismos IPC que muestra algunas de las arborizaciones que parecen ser el objetivo de las terminaciones de axones que expresan DTK. (Biii) Sección óptica única de las neuronas que expresan DTK que se dirigen a las IPC. Nótese que los axones (en las flechas) ascienden desde las porciones ventrales del cerebro (probablemente desde el tritocerebro) y forman terminaciones varicosas (Término). (C) El antisuero contra el receptor DTK DTKR marca un conjunto de células neurosecretoras medianas en la pars intercerebralis del cerebro adulto (flecha). Como se requirieron secciones de parafina y fijación de Bouin para el inmunomarcaje de DTKR, no fue posible revelar simultáneamente Dilp2-GFP impulsado por Gal4. (D) Neuronas inmunomarcadas con DTKR en el cerebro larvario. Los grupos de células indicados por flechas pueden corresponder a las IPC larvarias. La especificidad del antisuero DTKR se verifica en el material complementario Fig. S1.

Procesos neuronales que expresan Drosophila taquiquinina, DTK, convergen en las células productoras de insulina (IPC) en la pars intercerebralis del cerebro adulto. (Ai) Los IPC cerebrales son revelados por Dilp2-Proteína verde fluorescente impulsada por Gal4 (GFP). Los cuerpos celulares IPC (cb) se localizan medialmente en la pars intercerebralis. Las presuntas dendritas (Dendr) se extienden lateralmente en el protocerebro dorsal mediano. (Aii) Canales fusionados que muestran IPC (verde) e inmunomarcaje de DTK (magenta). En esta proyección de múltiples secciones ópticas, se observa una superposición entre las dendritas de IPC y las varices que expresan DTK. (Aiii) Canal único que muestra terminaciones de axones que expresan DTK con varices. No es probable que los cuerpos celulares que expresan DTK que se ven en esta imagen sean los que afecten a los IPC [los más pequeños suministran procesos al complejo central (Kahsai et al., 2010 Winther et al., 2003)]. (Bi) Otro espécimen (un cerebro ligeramente inclinado en comparación con A) que muestra varicosidades inmunomarcadas con DTK (magenta) cerca de las dendritas de IPC (Dendr). Esta imagen es una pila de secciones ópticas. (Bii) Sección óptica única de los mismos IPC que muestra algunas de las arborizaciones que parecen ser el objetivo de las terminaciones de axones que expresan DTK. (Biii) Sección óptica única de las neuronas que expresan DTK que se dirigen a las IPC. Nótese que los axones (en las flechas) ascienden desde las porciones ventrales del cerebro (probablemente desde el tritocerebro) y forman terminaciones varicosas (Término). (C) El antisuero contra el receptor DTK DTKR marca un conjunto de células neurosecretoras medianas en la pars intercerebralis del cerebro adulto (flecha). Como se requirieron secciones de parafina y fijación de Bouin para el inmunomarcaje de DTKR, no fue posible revelar simultáneamente Dilp2-GFP impulsado por Gal4. (D) Neuronas inmunomarcadas con DTKR en el cerebro larvario. Los grupos de células indicados por flechas pueden corresponder a las IPC de las larvas. La especificidad del antisuero DTKR se verifica en el material complementario Fig. S1.

También medimos la inmunofluorescencia relativa de DILP2 en cuerpos celulares de IPC en moscas de control y moscas con DTKR disminuido en los IPC para obtener una estimación de los niveles de péptidos, utilizando un protocolo similar a estudios anteriores (Broughton et al., 2010 Kaplan et al., 2008). ). Hay un nivel significativamente más alto de inmunofluorescencia de DILP2 después de la caída del receptor en las IPC (Fig. 3).

Para determinar si la señalización DTK vía sus dos receptores están modulados por el estado nutricional, probamos los niveles de NKD y DTKR transcripciones de receptores por qPCR en moscas de tipo salvaje que se alimentaron normalmente o murieron de hambre durante 24 h. No encontramos ningún cambio en los niveles relativos de las dos transcripciones del receptor debido a la inanición (material suplementario Fig. S2). Por tanto, es probable que la fuerza de la señalización de DTK a las IPC esté determinada principalmente por la cantidad de péptido de DTK liberado durante la inanición y no por cambios en los niveles de expresión del receptor.

La caída de DTKR en IPC disminuye la supervivencia de las moscas expuestas a la inanición

La señalización de insulina procedente de IPC cerebrales afecta la vida útil de las moscas expuestas a la inanición y la restricción dietética (Broughton et al., 2005 Broughton et al., 2010). Para estudiar la influencia de la señalización de DTK a los IPC sobre la supervivencia durante la inanición, se permitió a las moscas experimentales acceder al agua pero no a la comida. Determinamos los efectos de la inanición en la esperanza de vida total y media (cuando el 50% de las moscas han sucumbido) de diferentes genotipos.

Niveles de Dilp transcripciones en moscas con DTKR anulado en células productoras de insulina (IPC). El efecto de DTKR derribo en los IPCDilp2-Gal4 /DTKR-ARNi) en Dilp La expresión en el cerebro de moscas adultas se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se controlaron las moscas alimentadas (0 h) y las moscas muertas de hambre durante 24 h. Los datos se muestran como expresión relativa media ± desviación estándar. (norte= 10) los asteriscos denotan una diferencia significativa con respecto a los controles (n.s., no significativo, PAG& gt0.05 ***PAG& lt0.001). (A) Los niveles relativos de Dilp2 aumento de la transcripción en moscas derribadas por DTKR en comparación con los controles parentales, tanto en moscas alimentadas como después de 24 h de inanición (PAG& lt0.0001, ANOVA unidireccional). La diferencia entre moscas DTKR-knockdown alimentadas y hambrientas es significativa (PAG& lt0.001, ANOVA bidireccional, Bonferroni post hoc prueba). (B) El pariente Dilp3 la abundancia es mayor en las moscas que expresan DTKR-ARNi en los IPC que en los controles en el estado alimentado (PAG& lt0.001, ANOVA unidireccional). Además, el Dilp3 los niveles de transcripción disminuyen drásticamente después de 24 h de inanición en moscas con DTKR derribado. Esta caída en Dilp3 es significante (PAG& lt0.001, ANOVA bidireccional). (C) El pariente Dilp5 Los niveles de transcripción no difirieron significativamente de los de los controles, ni en moscas alimentadas ni hambrientas (PAG& gt0.05, ANOVA bidireccional). Sin embargo, para cada genotipo, la disminución de Dilp5 El ARN después de 24 h de inanición es significativo (PAG& lt0.05 ANOVA unidireccional). Por lo tanto, Dilp5 parece ser la única transcripción afectada significativamente por la inanición en las moscas de control.

Niveles de Dilp transcripciones en moscas con DTKR anulado en células productoras de insulina (IPC). El efecto de DTKR derribo en los IPCDilp2-Gal4 /DTKR-ARNi) en Dilp La expresión en el cerebro de moscas adultas se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se controlaron las moscas alimentadas (0 h) y las moscas muertas de hambre durante 24 h. Los datos se muestran como expresión relativa media ± desviación estándar. (norte= 10) los asteriscos denotan una diferencia significativa con respecto a los controles (n.s., no significativo, PAG& gt0.05 ***PAG& lt0.001). (A) Los niveles relativos de Dilp2 aumento de la transcripción en moscas derribadas por DTKR en comparación con los controles parentales, tanto en moscas alimentadas como después de 24 h de inanición (PAG& lt0.0001, ANOVA unidireccional). La diferencia entre moscas DTKR-knockdown alimentadas y hambrientas es significativa (PAG& lt0.001, ANOVA bidireccional, Bonferroni post hoc prueba). (B) El pariente Dilp3 la abundancia es mayor en las moscas que expresan DTKR-ARNi en los IPC que en los controles en el estado alimentado (PAG& lt0.001, ANOVA unidireccional). Además, el Dilp3 los niveles de transcripción disminuyen drásticamente después de 24 h de inanición en moscas con DTKR derribado. Esta caída en Dilp3 es significante (PAG& lt0.001, ANOVA bidireccional). (C) El pariente Dilp5 Los niveles de transcripción no difirieron significativamente de los de los controles, ni en moscas alimentadas ni hambrientas (PAG& gt0.05, ANOVA bidireccional). Sin embargo, para cada genotipo, la disminución de Dilp5 El ARN después de 24 h de inanición es significativo (PAG& lt0.05 ANOVA unidireccional). Por lo tanto, Dilp5 parece ser la única transcripción afectada significativamente por la inanición en las moscas de control.

Derribo de DTKR en los IPC por Dilp2-Gal4 /DTKR-RNAi leads to a shortening of total and median lifespan at starvation by approximately 20% compared with controls (PAG<0.001 log rank test, Fig. 4A). In contrast, overexpression of DTKR in the IPCs did not result in a significant change of lifespan (Fig. 4A).

To test whether the other DTK receptor NKD plays a role in IPCs at starvation, we monitored the effect of expressing UAS-NKD-RNAi or UAS-NKD with the Dilp2-Gal4 driver. Neither of these crosses led to a change in lifespan at starvation compared with controls (Fig. 4B). These results suggest that NKD is not expressed in the IPCs or at least it plays no role in the regulation of starvation responses.

DTKR knockdown in IPCs affects trehalose levels during starvation

Trehalose is a non-reducing disaccharide and is the major carbohydrate that is used as an energy source by most insects. Insulin signaling from the brain IPCs is known to regulate trehalose levels (Broughton et al., 2005 Rulifson et al., 2002). Specifically, knockdown of Dilp2 is known to increase the total trehalose content (Broughton et al., 2008). Thus, we tested total trehalose levels in flies with DTKR levels diminished in IPCs. Whole-body trehalose levels in flies of different genotypes were tested at 0 h, 5 h and 12 h of starvation. The wild-type response to starvation is a gradual decrease in trehalose levels over the 12 h starvation period. Here, the 0 h value is a measure of trehalose levels under normal fed conditions.

Knocking down DTKR in the IPCs did not affect trehalose levels in fed flies compared with controls (Fig. 5A). However, after 5 h of starvation the flies with diminished DTKR levels displayed a significantly larger drop in trehalose than controls (PAG<0.001, one-way ANOVA), but after 12 h levels were the same in all genotypes (Fig. 5A). Thus, the trehalose levels in DTKR-knockdown flies fell more rapidly at onset of starvation than in control flies. At starvation the trehalose is likely to be metabolized, partly due to hunger-induced hyperlocomotion, and with increased DILP signaling carbohydrates are depleted more rapidly.

DTKR knockdown in IPCs does not affect lipid content during starvation

Insects, including Drosophila, utilize lipids as fuel for prolonged exercise or in other situations of high-energy demands, as well as at times of restricted availability of nutrients (Baker and Thummel, 2007 Gäde et al., 1997 Van der Horst et al., 2001). Lipid levels in Drosophila are regulated in part by insulin signaling from brain IPCs (Broughton et al., 2005 Grönke et al., 2010), but also by AKH (Baker and Thummel, 2007 Grönke et al., 2007). Thus, we investigated whole-body lipid levels in flies with DTKR knockdown targeted to IPCs in fed conditions (0 h starvation) and after 24 h of starvation. In fed animals there is no significant difference in lipid levels between controls and DTKR-knockdown flies (Fig. 5B). After 24 h starvation there is a significant drop in lipids both in experimental and control flies (Fig. 5B). This suggests that DTK signaling to IPCs does not affect lipid levels in fed or starved flies or that such an action is masked by compensatory DILP or AKH signaling (see Grönke et al., 2010 Grönke et al., 2007).

DILP2 peptide levels in insulin-producing cells (IPCs) after DTKR knockdown in IPCs. Relative immunofluorescence was measured after DILP2 immunolabeling of IPCs in normally fed experimental flies. After DTKR knockdown (Dilp2/DTKR-RNAi) the relative fluorescence increased significantly compared with the control (PAG=0.004, Student's t-test norte=8 brains of each genotype).

DILP2 peptide levels in insulin-producing cells (IPCs) after DTKR knockdown in IPCs. Relative immunofluorescence was measured after DILP2 immunolabeling of IPCs in normally fed experimental flies. After DTKR knockdown (Dilp2/DTKR-RNAi) the relative fluorescence increased significantly compared with the control (PAG=0.004, Student's t-test norte=8 brains of each genotype).

DTKR knockdown in insulin-producing cells (IPCs) increases sensitivity to starvation. We tested the survival of flies with DTKR knocked down in IPCs (Dilp2/DTKR-RNAi) or with DTKR overexpressed in IPCs (Dilp2/UAS-DTKR), compared with parental controls, in a starvation assay where flies were kept on aqueous agarose. All experiments were run in triplicate. Dashed lines indicate 50% survival. (A) A significant decrease in survival was seen after knockdown of DTKR in IPCs. The median survival decreased by 20% (PAG<0.0001, log rank test, norte=128–171 for each genotype). However, no significant difference in survival was observed in flies with DTKR ectopically expressed IPCs (PAG>0.05, norte=128–137). (B) Neither knockdown (Dilp2/NKD-RNAi) nor ectopic expression (Dilp2/UAS-NKD) of the other tachykinin receptor, NKD, in IPCs had any effect on survival at starvation (PAG>0.05, log rank test, norte=128–146).

DTKR knockdown in insulin-producing cells (IPCs) increases sensitivity to starvation. We tested the survival of flies with DTKR knocked down in IPCs (Dilp2/DTKR-RNAi) or with DTKR overexpressed in IPCs (Dilp2/UAS-DTKR), compared with parental controls, in a starvation assay where flies were kept on aqueous agarose. All experiments were run in triplicate. Dashed lines indicate 50% survival. (A) A significant decrease in survival was seen after knockdown of DTKR in IPCs. The median survival decreased by 20% (PAG<0.0001, log rank test, norte=128–171 for each genotype). However, no significant difference in survival was observed in flies with DTKR ectopically expressed IPCs (PAG>0.05, norte=128–137). (B) Neither knockdown (Dilp2/NKD-RNAi) nor ectopic expression (Dilp2/UAS-NKD) of the other tachykinin receptor, NKD, in IPCs had any effect on survival at starvation (PAG>0.05, log rank test, norte=128–146).


Discusión

We report here that, in adult Drosophila, ADAR edits its mRNA with 40% efficiency to encode a less active isoform. We propose that this own-transcript editing is a form of negative autoregulation. When this editing is prevented en vivo so that only the genome-encoded ADAR is expressed, then levels of total ADAR protein otherwise sufficient for phenotypic rescue become lethal. This early lethality is associated with hyperediting of sites in at least one target transcript.

Previously, it has been shown that mammalian ADAR2, which is the orthologue of Drosophila ADAR (J Brindle and LP Keegan, unpublished data), edits a 3′ splice site in its own pre-mRNA so that an additional 47 nucleotides are included in the mRNA ( Rueter et al, 1999 ). This editing is also considered to be a negative autoregulatory mechanism due to frameshifts and inefficient translation initiation from internal methionines that lead to a reduction in protein levels from the edited transcript. Therefore, both Drosophila ADAR and ADAR2 appear to have evolved completely different own-transcript RNA editing sites to control ADAR activity. In another example of convergent evolution of RNA editing sites, the same codon change is introduced by editing at the same position in Drosophila and vertebrate voltage-gated potassium channels in different channel families ( Bhalla et al, 2004 ).

ADAR editing requires only a short RNA duplex to target it nevertheless, the evolution of an RNA duplex within Drosophila Adar exon 7 is surprising and suggests that editing of the mature Adar mRNA may be required. Adar exon 7 probably folds into a very stable secondary structure, as editing of this minisubstrate in vitro to 70% is higher than for any other transcript so far tested in vitro. los Adar exon 7 structure that supports RNA editing is conserved in other Drosophila species but not in the mosquito (RA Reenan and MA O'Connell, unpublished data). If transient increases or decreases in ADAR activity occur in response to unknown regulatory signals in Drosophila, then Adar editing of mature Adar mRNA could respond immediately to restore the correct level of RNA editing. In vertebrates, modulation of ADAR2 activity in response to changes in neurotransmitter levels has been suggested ( Gurevich et al, 2002a , 2002b ).

The conversion of serine to glycine has an unexplained dramatic effect on RNA editing activity and this requires further study. This amino acid is conserved in all ADAR2-type enzymes, whereas ADAR1-type enzymes have a conserved aspartic acid at the same position ( Keegan et al, 2004 ) one possibility is that the serine is phosphorylated but we are unable to detect this. When the serine is mutated to aspartic acid to introduce a negative charge as found in ADAR1, dADAR is completely inactive (MA O'Connell, unpublished results). Defining the function of this serine residue in the deaminase domain awaits the crystallisation of ADAR.

As alternative splicing is critical for generating proteomic diversity, it will be important in the future to determine the functional differences between protein isoforms in an animal model. Here, we demonstrate that Drosophila is an excellent animal model to study proteomic diversity. We observe an excellent correlation between the activities of the different ADAR isoforms that have been overexpressed in yeast and assayed in vitro and their en vivo activities as tested in flies. Even though ADAR 3/4 S is very active in vitro, it is not intuitive that this would be toxic in Drosophila when it is ubiquitously expressed, considering that ADAR 3/4 G, which differs by one amino acid, has no toxic effects. It is improbable that many isoforms of other proteins will have such dramatic effects on activity en vivo however, some will. Drosophila may be the proteomics choice of model organism in future, considering the resource costs of generating equivalent numbers of transgenic mice. While the present work required a great deal of effort to overcome the variations due to position effects on transgene insertions, these limitations arising from the Drosophila transformation method may be relieved by using new genetic techniques that reduce position effects on transgene expression or that express variants from a common site in the chromosome ( Gloor, 2004 ).

En Drosophila, the number of transcripts known to be edited to cause recoding events is much greater than in vertebrates the list of vertebrate targets may now be nearly complete and includes a large amount of editing of Alu elements embedded in transcripts ( Kim et al, 2004 Levanon et al, 2004 ). The number of recoding sites per target transcript is also higher in Drosophila, suggesting that flies make considerable use of RNA editing as an easy and efficient method of generating proteomic diversity. RNA editing contributes to an enormous potential diversity of transcripts from the cacophony gene encoding the large, pore-forming alpha subunit of the main, non-L-type, voltage-gated calcium channel in the CNS. This protein has a critical role at synapses on axon termini where it responds to depolarising signals by allowing calcium entry to induce vesicle fusion and neurotransmitter release. Pairwise choices due to alternative splicing events identified in this study (data not shown), and previously ( Peixoto et al, 1997 Gallo et al, 2002 ), predict 2 5 splice forms. Pairwise choices of edited or unedited isoforms at each editing site where editing changes codon meaning could multiplex this with potentially 2 11 edited isoforms. Transcript diversity in cacophony and other RNA editing targets may not reach the full possible maximum level as is the case for the Adar transcript itself where the edited form of the Adar 3a transcript is not observed. It is not surprising that the misregulation of RNA editing that we have induced experimentally in this study, leading to this proteomic complexity being expressed at the wrong developmental stage, causes lethality.

The highest levels of editing are seen in adult flies, consistent with the Adar mutant phenotype that includes adult locomotion defects and age-dependent neurodegeneration ( Palladino et al, 2000b Ma et al, 2001 ). ADAR mutant phenotypes in mice and Caenorhabditis elegans also demonstrate that editing is essential for viability and for proper functioning of the nervous system ( Higuchi et al, 2000 Palladino et al, 2000b Tonkin et al, 2002 Hartner et al, 2004 Wang et al, 2004 ). We show here that editing also normally occurs outside the nervous system in Drosophila. Loss of RNA editing in muscles may contribute to the locomotion defects in Adar mutant flies. RNA editing outside the nervous system is also necessary in vertebrates ADAR1 mutant mouse embryos undergo widespread apoptosis due to loss of editing in unknown target transcripts ( Hartner et al, 2004 Wang et al, 2004 ). The primary requirement for RNA editing in Drosophila may be in the abundant cholinergic neurons in the brain, consistent with efficient rescue using a Cha-GAL4 driver, with patterns of neurodegeneration seen in Adar mutants ( Palladino et al, 2000b Ma et al, 2001 ), and with electrophysiological measurements linking slow recovery from anoxic stupor to defects in brain interneurons ( Ma et al, 2001 ). Also, several transcripts encoding acetylcholine receptor alpha and beta subunits are edited in Drosophila ( Grauso et al, 2002 Hoopengardner et al, 2003 ). Adar expression is much lower in muscle than in CNS in embryos and it is possible that toxicity arising from ADAR overexpression in embryos could be due to hyperediting of the Ca-alpha 1D transcript encoding an L-type voltage-gated calcium channel. In vertebrates, this channel class is found in muscles and has a critical role on the postsynaptic side of the neuro muscular junction where it responds to depolarisation by allowing calcium entry into muscle cells and subsequent release of calcium from intracellular stores for muscle contraction ( Catterall, 2000 ). We do not, however, know what the effects of editing on most of the channels are nor do we know which channels are critical for either rescue or hyperediting toxicity.

In this study, we describe some of the RNA editing events that we have found to be almost 100% efficient in adult flies. In mice, the GluR-B Q/R site is edited with virtually 100% efficiency. An edited GluR-B construct is able to rescue all the defects in a mouse ADAR2 mutant ( Higuchi et al, 2000 ), and no functional requirement has been found for the unedited GluR-B isoform, which is not found even early in development. For the sites that are 100% edited in adult Drosophila, the situation is somewhat different, that is, the unedited transcripts are expressed significantly earlier in development and our results suggest that these forms are required at this stage. Lethality due to increased ADAR activity is associated with increasing editing at some sites in an embryonic ion channel transcript close to levels seen in adults. In contrast to the case of the GluR-B Q/R site, we suggest that flies require unedited and edited isoforms at different stages. It may be possible to rescue the Adar mutant phenotype in flies by expressing cDNA constructs encoding edited versions of target ion channel transcripts however, the corresponding unedited transcripts may also be required.

The fruit fly undergoes complete metamorphosis to build two very different-looking complex organisms using a gene set that is small and relatively nonredundant compared to that of vertebrates. Many fly genes show complex patterns of embryonic and adult expression, with different enhancers, promoters, RNA splicing patterns and, finally, different RNA editing patterns in adult transcripts. Customising fast neurotransmission to the requirements of the different life-cycle stages by RNA editing is the most baroque of the gene-sparing strategies so far described in Drosophila.


Agradecimientos

We wish to express our gratitude to B. Tannous for supplying the Gluc lentivirus construct, C. Maguire, M. Broekman, K. Miranda, L. Russo and O. Saydam for fruitful discussions. We also would like to thank Applied Biosystems for supplying the miRNA qRT–PCR primers and S. Idema (Neuro-oncology Research Group, Cancer Center Amsterdam) for supplying some of the serum/biopsy samples. This work was supported by the Wenner-Gren Foundation (J.S.) Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (J.S.), NCI CA86355 (X.O.B. and M.S.E.), NCI CA69246 (X.O.B., M.S.E. and B.S.C.), The Goldhirs Foundation (B.S.C.) the Brain Tumor Society (A.M.K.) and the American Brain Tumor Association (T.W.).


DISCUSIÓN

Here, we have described a novel neural-specific lncRNA, CRG. CRG has important biological significance—it is involved in locomotor behavior in Drosophila—which is attributed to its regulation of the transcription of the adjacent protein-coding gene CASK.

Although the functions of the most lncRNAs are still unknown, many are expressed in nervous system in Drosophila embryos ( 21) or in mouse ( 17, 18). Our study traced the expression patterns of CRG from embryonic and larval stages to adult. The spatiotemporal expression pattern of CRG revealed that CRG was confined to specific regions of nervous system, which suggested that it could play important roles in neural functions of Drosophila. The next question is whether the functional site of CRG in CNS or peripherally at the neuromuscular junction (NMJ). To solve this question, electrophysiological experiments can be performed to analyse the excitatory junction potentials (EJPs) in third instar larval muscle in WT comparing with CRG nulls. If no differences were observed then it would suggest a central defect. Here, we performed the behavioral rescue experiments which CRG was over-expressed driven by motoneuron-specific OK6-Gal4 line or muscle-specific G7-Gal4 line, respectively, in the CRG null mutant background. The results showed that defective phenotype of CRG-deficiency line could be rescued by the pan-neuronal CRG restoration, not by the peripheral CRG restoration. Entonces CRG was suggested to play central effects in this study.

Most lncRNAs were located in intergenic or intragenic/intronic configurations with protein-coding genes ( 6, 8, 14). We validated the full-length transcript of CRG using 5′ and 3′ RACE and northern blotting. To check the phylogenetic conservation of CRG, we annotated the genomes of 12 Drosophila-related species. Strong conservation among all the annotated genomes of the Drosophila species suggested CRG may be a functional lncRNA. Además, CRG partially overlaps with the 3′ UTR of the adjacent upstream protein-coding gene CASK, pero CRG does not belong to 3′ UTR-associated RNAs which are contiguous with the upstream protein-coding region in the same mRNA ( 42). Primero, CRG starts in but extends out of the 3′ UTR of CASK. Segundo, CRG y CASK were transcribed separately. Third, the reduced CASK expresión en CRG Δ1877 mutant could be rescued by over-expression of WT CRG. Por lo tanto, CRG is independent of CASK and not a CASK 3′-UTR-derived ncRNA. As for mammal species, such as Homo sapiens, Mus musculus o Cattle genus, despite also host the gene CASK, as homologues of CASK en D. melanogaster, they share poor sequence similarity. Moreover, no EST sequence similar to CRG was detected in Database of Expressed Sequence Tags (dbEST) in NCBI using blast. Thus, no similar phenomenon is detected in mammal species.

CASK belonging to a conservative protein family from Caenorhabditis elegans, Drosophila to mammal, is wildly distributed in nervous system ( 23, 24). As a scaffolding protein, CASK interacts with other proteins suggesting the diversity roles of CASK in neural activity, development and neurological disease ( 43). En Drosophila, CASK which is involved in locomotor behavior was considered as a susceptibility gene for movement disorder ( 27, 28). Both homozygous and heterozygous mutant of CASK caused behavior defects in Buridan’s paradigm ( 27) ( Supplementary Figure S8 ). From our observations, CRG mutants and CASK mutants share similar locomotion defects. CASK over-expression rescued the defective phenotype in the CRG-deficiency line, while CRG positively regulate CASK’s expression. Thus, it is highly possible that CRG is involved in locomotor behavior by regulating CASK expression, which provides a new insight into the pathogenesis of neurological diseases associated with movement disorders.

Increasing evidences suggested that lncRNA could display the biological function by mediating the nearby protein-coding genes in transcriptional regulation and epigenetic gene regulation ( 6, 11, 14). In our study, we found that CRG promoted the recruitment of RNA Pol (II) to the CASK promoter regions to enhance CASK transcription, and the detailed CRG functional regions responsible for the process were identified, but there are still several questions left open. For example, the details about the transcription initiation complex whether CRG recruit RNA Pol (II) by direct interaction, whether CRG is involved in epigenetic regulation, are all not clear. Further experiments are needed to explore the regulation mechanism of CRG. Interestingly, a previous study reported that a lncRNA could promote the dissociation of the transcription initiation complex from the neighboring DHFR promoter through the formation of a complex between the lncRNA, the DHFR promoter, and transcription factor IIB ( 44). The different mechanisms through which ncRNAs exert their regulatory effects highlight their functional diversity and complexity.

To determine whether the expression of any other genes is potentially regulated by CRG, we made a whole-body comparison of genome-wide expression profile between CRG Δ1877 mutants versus CRG WT flies using microarrays and identified 491 genes down-regulated and 329 genes up-regulated significantly in response to CRG mutants ( Supplementary Table S1 ). This has important implications for CRG which has wide-ranging effects on gene expression in Drosophila. Sin embargo, CASK, which was experimentally identified to be essential target gene of CRG regulating in Drosophila CNS in our study, was not included in the down-regulated gene list ( Supplementary Table S2 ). The reason might be, in part, owing to the relative low amount of neural-specific CASK in the whole body of the two flies. It is worth noting tsl, about 1 kb downstream of CRG, was significantly down regulated in CRG Δ1877 mutantes. Sin embargo, CRG Δ1877 did not show similar phenotypes as tsl mutants ( 45–47). It indicated that CRG might regulate tsl in response to other unknown function. The transcriptomic information of CRG regulating leads to new questions about the nature of CRG for further study in Drosophila.

In conclusion, our study suggests that the lncRNA CRG recruits Pol (II) to CASK promoter regions, which in turn promotes CASK expression and thereby influences Drosophila locomotor behavior. Further studies are needed to elucidate the detailed molecular mechanisms of CRG-mediated regulation of CASK expresión.


Ver el vídeo: FURA experiment on Drosophila neurons (Enero 2022).