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Descubrir la mejor concentración para que mi extracto vegetal se utilice como fármaco para la diabetes


Estoy usando extracto de planta de Ajuga parviflora y descubrí que posee propiedades antidiabéticas al usar un ensayo inhibidor de alfa-amilasa. Usé varias concentraciones de 250 µg / ml (29% de inhibición de alfa-amilasa), 500 µg / ml (37%), 750 µg / ml (46%) y 1000 µg / ml (63%). Básicamente, la alfa-amilasa aumenta el nivel de glucosa después de ingerir alimentos. Así que quería saber cómo podría averiguar cuál es la mejor concentración de mi extracto de planta para usar como fármaco.


Tienes que intentar determinar la mejor concentración.

Por lo general, hay múltiples ensayos clínicos, primero en animales, luego en humanos para

  1. averiguar la dosis efectiva
  2. buscar efectos secundarios
  3. comparar la eficacia del nuevo fármaco con los fármacos existentes

Aloe vera

El aloe es una planta suculenta muy utilizada en medicina alternativa. Hay al menos 420 especies de plantas diferentes de Aloe. El aloe vera se refiere específicamente a la planta Aloe barbadensis Miller, que es la forma más común utilizada en los productos a base de Aloe.

¿Cómo se usa el Aloe?

Tradicionalmente, el gel transparente de la planta de Aloe se frota sobre la piel como un ungüento para tratar heridas y quemaduras. La parte verde de la hoja se puede convertir en jugo o secar y tomar por vía oral como laxante. El aloe vera se usa en muchos productos comerciales en diversas formas, incluidas bebidas, concentrados, cápsulas, polvos y como saborizante.

¿Qué pasa si uso gel de aloe vera en mi piel, me hará daño?

No es probable que la aplicación de gel de aloe vera en la piel cause daño. Aunque estos estudios de NTP en particular solo analizaron la exposición oral al Aloe vera, otros estudios de NTP examinaron los efectos del gel en la piel y no encontraron un vínculo fuerte entre el Aloe vera en los productos para el cuidado de la piel, la luz solar y el desarrollo de cáncer de piel. Los resultados de esos estudios de piel se informaron en el Informe Técnico NTP 553 sobre el Estudio de Fotococarcinogénesis del Aloe Vera.

¿Por qué la gente consumiría bebidas que contengan Aloe?

Los anuncios de productos afirman que las bebidas se pueden usar para limpiar el sistema digestivo o aliviar el estreñimiento.

¿Qué hace que el Aloe actúe como un laxante?

Un componente orgánico en la pulpa de la hoja exterior de las hojas de Aloe, conocido como látex, contiene antraquinonas. La aloína es un ejemplo de una antraquinona que se encuentra en el látex y que puede dar a la planta sus cualidades laxantes.

¿Cuánta aloína hay en los productos de EE. UU. Que el público puede consumir?

Hay muy pocos datos sobre los niveles de aloína en los productos de consumo. Según la investigación publicada, los niveles de aloína en la mayoría de los productos líquidos son menos de 1 parte por millón (ppm); sin embargo, los niveles en los productos sólidos o semisólidos pueden ser de 10 a 100 veces más altos.

¿Cuánta aloína hay en una bebida típica?

Esto no está claro. La industria generalmente procesa la hoja de Aloe vera para hacer un extracto de hoja entera decolorada para eliminar la aloína. La industria tiene un estándar de límite superior autorregulado de 10 ppm de aloína en productos ingeridos por vía oral, pero no hay requisitos de etiquetado para el contenido de aloína.

¿Cuáles son los efectos adversos de la exposición excesiva al Aloe en humanos?

Se necesita más investigación para responder a esta pregunta. En roedores, provocó tumores intestinales. Si está preocupado, tiene una condición médica o está tomando otros medicamentos, hierbas o suplementos, debe hablar con su médico antes de modificar los tratamientos existentes o comenzar cualquier tratamiento nuevo.

¿Cuán similares son las dosis de aloína en el agua potable que se les da a los animales con las que se encuentran en los productos de aloe vera?

Esto no está claro, ya que no existen requisitos de etiquetado para enumerar el contenido de aloína. La concentración de aloína en el agua que bebieron los roedores en el estudio de NTP es similar a la que se encuentra en algunos productos de aloe vera, pero más alta que en otros productos. El NTP quería probar una preparación de Aloe que incluye todos los componentes que pueden estar en los productos en el mercado. El estudio de NTP utilizó un extracto de hoja entera de Aloe barbadensis Miller que no se sometió a filtración de carbón durante el procesamiento. Muchos productores comerciales de bebidas de Aloe vera utilizan la filtración de carbón para reducir los niveles de aloína en sus productos.

¿Está regulado el aloe vera?

El aloe vera es un suplemento dietético y no una droga regulada. No hay garantía de resistencia, pureza o seguridad de estos productos. El aloe vera está aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos como aditivo alimentario para dar sabor.

Aloe vera

El estudio de dos años del NTP sobre el consumo de extracto de hoja entera no decolorado de Aloe vera encontró evidencia clara de actividad carcinogénica en ratas macho y hembra, basada en tumores del intestino grueso.

Por lo que sabemos en este momento, no hay nada que nos lleve a creer que estos hallazgos no son relevantes para los humanos.

Sin embargo, se necesita más información, incluida la forma en que las personas usan los diferentes tipos de productos de Aloe vera, para determinar los riesgos potenciales para los humanos.

¿Qué significan los estudios de roedores NTP para los humanos?

Los estudios en ratas del NTP son motivo de gran preocupación. Algunas preguntas que deben responderse antes de que se pueda apreciar plenamente su importancia incluyen:

  1. ¿Qué productos hay realmente en el mercado?
  2. ¿Cuáles son los niveles de aloína en un amplio espectro de productos?
  3. ¿Cuáles son los patrones de exposición humana?

Actualmente no hay suficiente información disponible para saber cuánto Aloe vera consumen las personas o por cuánto tiempo. Con base en lo que sabemos en este momento, no hay nada que nos lleve a creer que este hallazgo no sería relevante para los humanos.

¿Tiene alguna idea de qué puede estar causando los tumores y los otros efectos?

Sospechamos que puede ser la aloína, pero no lo sabemos con certeza. Esperamos hacer más estudios para determinar qué puede estar causando los tumores. Pensé que beber productos de Aloe era bueno para mí.

¿Debo dejar de beber aloe?

Esa es una decisión que quizás desee tomar con su proveedor de atención médica. Como cualquier decisión personal, cuanta más información tenga, mejor. Actualmente, los fabricantes de estos productos no están obligados a etiquetar la concentración de aloína en los productos de aloe vera. Si la aloína es la causa de los tumores en ratas, en términos generales, cuanto menor sea la concentración de aloína en un producto, menor será la posibilidad de que cause daño. Los tumores se desarrollaron en animales que bebieron agua que contenía 60 ppm de aloína al día durante casi toda su vida.


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POTENCIAL ANTICANCERICO DEL EXTRACTO DE FLOR DE TECOMA STANS

Acerca de los autores:
S.Kameshwaran 1 * , V.Suresh 1, M.Mohanraj 2
1 Departamento de farmacología,
Fundación de investigación médica JKK munirajah y Facultad de Farmacia,
B.Komarapalayam, Namakkal, Tamilnadu - 638183
2 laboratorios de Marineboitoxinología, CAS en biología marina, Universidad de Annamalai,
Chidambaram, Tamilnadu-608502
*[email protected]

ABSTRACTO
Tecoma stans Las flores se han utilizado tradicionalmente para muchas dolencias, incluido el cáncer. En el presente estudio, la actividad anticancerígena del extracto de flor metanólica de T.stans (METS) se evaluó utilizando métodos tanto in vitro como in vivo. METS se sometió a investigaciones fitoquímicas cualitativas preliminares mediante el uso de procedimientos estándar. La actividad antitumoral in vitro de METS se evaluó mediante el método de ensayo MTT utilizando líneas celulares Vero y HEP-2. Entonces el extracto sometido a en vivo actividad anticancerígena utilizando un modelo de tumor de carcinoma de ascitis de Ehrlich (EAC). Se evaluó la actividad Aumento de la vida útil, aumento promedio del peso corporal, cambios en la ingesta de alimentos, volumen del tumor, peso del tumor, recuento de células viables, recuento de células no viables, PCV, recuento de células totales y estudios hematológicos. La potencia del extracto se comparó con el 5-flurouracilo estándar (20 mg / kg i.p.). Actividad anticancerígena in vitro, los METS exhibieron una actividad citotóxica significativa contra ambas líneas celulares incluso a diferentes concentraciones. La administración oral de METS a dosis de 200 y 400 mg / kg, aumentó significativamente (p & lt 0,001) el tiempo de supervivencia, el recuento de células no viables y disminuyó el peso corporal medio y la ingesta de alimentos, el recuento de células viables de los ratones portadores de tumores. Después de 14 días de inoculación, METS pudo revertir los cambios en los parámetros hematológicos, proteína y PCV consecuentes a la inoculación del tumor. Los resultados indican que METS posee una actividad antitumoral significativa de manera dosis dependiente.

IDENTIFICACIÓN DE REFERENCIA: PHARMATUTOR-ART-1275

INTRODUCCIÓN
El cáncer, la segunda causa de muerte a nivel mundial después de las enfermedades cardiovasculares, es un grupo de más de 100 enfermedades diferentes, caracterizadas por un crecimiento celular descontrolado, invasión local de tejidos y metástasis a distancia 1. El cáncer es la causa de más de seis millones de muertes cada año en el mundo. En 2001, se notificaron alrededor de 1.268.000 nuevos casos de cáncer y 553.400 muertes en los Estados Unidos 2. Puede tratarse con cirugía, radiación, quimioterapia, terapia hormonal y terapia biológica. La quimioterapia sigue siendo un desafío importante para los pacientes con cáncer porque un fármaco tan potente puede ser tóxico y menos del 1% de las moléculas del fármaco inyectado pueden llegar a sus células diana, mientras que el resto puede dañar las células y los tejidos sanos, especialmente la médula ósea, los tejidos epiteliales, el retículo. sistema endotelial y gónadas 3 Desde la época medieval, las plantas han sido la fuente de medicamentos para el tratamiento de enfermedades. Independientemente de la disponibilidad de una gran cantidad de drogas sintéticas, las plantas siguen siendo, incluso en el siglo XXI, una parte integral de la atención de la salud en diferentes países, especialmente en los países en desarrollo. A finales de los 90, la OMS afirmó que un gran porcentaje de la población mundial depende de terapias vegetales para cubrir las necesidades de la atención primaria de salud (OMS 1999) 4. Las áreas de cáncer y enfermedades infecciosas tienen una posición de liderazgo en la utilización de plantas medicinales como fuente de descubrimiento de fármacos. Entre las preparaciones contra el cáncer y antiinfecciosas aprobadas por la FDA, los medicamentos de origen natural tienen una participación del 60% y el 75%, respectivamente 5. Vale la pena mencionar el vivo interés actual en el descubrimiento de fármacos naturales para el tratamiento del cáncer y la quimioprevención 6,7. Un gran número de especies de plantas se criban y se realizan bioensayos con este fin en todo el mundo 8.
Tecoma stans(Nombre común: campana amarilla) también conocido como arbusto de trompeta amarilla perteneciente a la familia Bignoniaceae. Es una planta ornamental. Es un arbusto erecto, ramificado, escasamente peludo o casi liso de 2 a 4 metros de altura. Las hojas son opuestas, pinnadas impares y de hasta 20 centímetros de largo con 5 a 7 folíolos. Los folíolos son lanceolados a oblongo-lanceolados, de 6 a 13 centímetros de largo, puntiagudos en ambos extremos y dentados en los márgenes. Las flores en forma de trompeta son amarillas, ligeramente perfumadas y nacen en racimos terminales cortos, densos. El cáliz es verde, de 5 a 7 milímetros de largo y 5 dientes. La floración puede comenzar en abril y continuar hasta el otoño. Las flores son seguidas por tánpodos de 6 pulgadas de largo que están llenos de pequeñas semillas aladas como el papel 9.

Hojas de la T.stans contienen los alcaloides tecomina y tecostamina son potentes agentes hipoglucemiantes cuando se administran por vía intravenosa. El ácido antranílico es el responsable de la actividad antidiabética de las raíces, son potentes diuréticos y vermífugos 10. El tecoma no es tóxico porque esta planta se utiliza en América Latina como remedio para la diabetes y además para la alimentación del ganado vacuno y caprino en México 11. El cribado fitoquímico preliminar del extracto metanólico de extracto de flor de Tecoma stans mostró la presencia de flavonoides, fenol, alcaloides, taninos, esteroides, triterpenos, antraquinonas y saponinas, etc.
Los flavonoides son un grupo de más de 4000 compuestos polifenólicos que se encuentran de forma natural en los alimentos de origen vegetal. Estos compuestos poseen una estructura común de fenilbenzopirona (C6-C3-C6), y se categorizan de acuerdo con el nivel de saturación y apertura del anillo de pirano central, principalmente en flavonas, flavanoles, isoflavonas, flavonoles, flavanonas y flavanonoles 12,13. El peso de la evidencia epidemiológica del efecto protector de los flavonoides contra el cáncer es impresionante. Un número creciente de estudios epidemiológicos sugiere que la ingesta elevada de flavonoides puede estar correlacionada con una disminución del riesgo de cáncer 14. los flavonoides pueden inhibir varias etapas del proceso de carcinogénesis, a saber, el inicio, la promoción y la progresión del tumor. También en estudios in vivo e in vitro, pueden estar involucrados muchos mecanismos de acción. Estos incluyen inactivación de carcinógenos, antiproliferación, detención del ciclo celular, inducción de apoptosis y diferenciación, inhibición de la angiogénesis, antioxidación y reversión de la resistencia a múltiples fármacos o una combinación de estos mecanismos 15. Con base en esta información sobre los flavonoides como agentes anticancerígenos, el presente estudio se centra en la actividad anticancerígena (in in vitro e in vivo) del extracto metanólico de flores de Tecoma stans.

MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección y extracción

Las flores de Tecoma stans fueron recolectados en el mes de mayo de Rasipuram (distrito de Namakkal) Tamil Nadu. La planta fue identificada por el doctor G.V.S.Murthy, director adjunto del Estudio Botánico de la India, círculo sur, campus de TNAU, Coimbatore, quien autenticó la planta a partir de la literatura disponible. Los pétalos de las flores se secaron a la sombra y se pulverizaron y se extrajeron 100 g del polvo seco con metanol mediante un aparato soxhlet caliente. El disolvente se eliminó a presión reducida y temperatura controlada usando un evaporador flash rotatorio. El cribado fitoquímico del extracto reveló la presencia de taninos, flavonoides, fenol, alcaloides, esteroides, triterpenos y saponinas, etc.

Líneas de células tumorales
Vero y Hep-2 (línea celular de carcinoma de laringe humano). Las líneas celulares se adquirieron del Instituto de Investigación Amla, Trichur. Las células EAC se obtuvieron bajo la cortesía del Centro de Investigación del Cáncer Amala, Trissur, Kerala, India. Se mantuvieron mediante la inoculación intraperitoneal semanal de 106 células / ratón.

Animales
En este experimento se utilizaron ratas albinas suizas macho que pesaban entre 150 y 180 g. Se alojaron en condiciones ambientales estándar como temperatura ambiente (25 o C ± 1 o C), humedad relativa (55 ± 5%) y ciclo de luz oscuro de 12/12 h. Los animales tenían libre acceso a la dieta estándar en gránulos y al agua ad libitum. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de CPCSEA. El comité de ética animal del instituto ha aprobado la realización de experimentos con animales (aprobación nº 1158 / ac / 07 / CPCSEA).

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ACTIVIDAD ANTICANCER
Actividad anticancerosa in vitro
Ensayo de MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5- bromuro de difenilterazolio) 16. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 a 37ºC bajo incubación durante 6-7 horas. 5% de CO2 en incubadora humificada. Las células se recogieron, se contaron (3 x 104 células / ml), se transfirieron a una placa de 24 pocillos y se incubaron durante 24 horas. Antes de la adición del compuesto de prueba. Se prepararon diluciones en serie de muestras de prueba disolviendo compuestos en DMSO seguido de dilución con medio RPMI-1640 para dar una concentración final de 250, 500, 1000 μg / ml. Se prepararon soluciones madre de muestras. La muestra a 10 μl y las líneas celulares a 90 μl se incubaron durante 72 horas. Se disolvió una solución de MTT a 5 mg / ml en 1 ml de solución tampón fosfato (PBS) y se añadieron 10 µl de la misma a cada uno de los 24 pocillos. Los pocillos se envolvieron con papel de aluminio y se incubaron a 37ºC durante 4 horas. La solución en cada pocillo que contenía medio, MTT sin banda y células muertas se eliminaron por succión y se añadieron 150 µl de DMSO a cada pocillo. Luego se agitaron las plantas y se registró la densidad óptica usando un lector de microplacas (espectrofotómetro) a 595 nm. DMSO en blanco. Los controles y las muestras se analizaron y replicaron para cada concentración y se replicaron tres veces para cada línea celular. Después de 24 h de incubación de las células mononucleares con extractos de plantas, se evaluó la citotoxicidad en las líneas de células cancerosas usando el ensayo MTT. La citotoxicidad se obtuvo comparando la absorbancia entre las muestras y el control. A continuación, los valores se utilizaron para calcular iterativamente la concentración de extractos de plantas necesaria para provocar una reducción del 50% (IC50) del crecimiento (número de células) para cada línea celular.

Viabilidad celular (%) = DO media / DO de control x 100

ACTIVIDAD ANTICANCER IN VIVO
Determinación de la actividad antitumoral.

Los animales se aclimataron a las condiciones de nuestro laboratorio. Se dividieron en cinco grupos a saber. Control normal (G1), animal inducido por cáncer (G2), animal inducido por cáncer tratado con 20 mg / kg del grupo tratado con 5-fluorouracilo (G3) 200 mg / kg de flores METS (G4) y 400 mg / kg de flores METS (G5) de diez cada uno y utilizados para el estudio 17. Las células EAC se obtuvieron del Amala Cancer Institute, Thrissur, Kerala y se inyectaron intraperitonialmente (2 x 10 6 células / ratones) a todos los grupos de animales. El segundo día, los animales de G4 y G5 se trataron con 200 y 400 mg / kg / día p.o. de METS florece mientras que G3 con 5- fluorouracilo (20 mg / kg. i.p.) y el tratamiento se continuó durante los siguientes 14 días. A G2 no se le asignó ningún tratamiento después de la inoculación con células EAC. Se observó a los ratones durante los siguientes 14 días para detectar el desarrollo de un tumor ascítico. El día 15, veinticuatro horas de última dosis y 18 h de ayuno, se sacrificaron 6 animales de cada grupo mediante dislocación cervical para medir parámetros antitumorales y hematológicos y el resto se mantuvo con alimento y agua ad libitum para comprobar el porcentaje de incremento de vida. extensión del hospedador tumoral. La actividad antitumoral del extracto se midió en animales EAC con respecto a los siguientes parámetros. Volumen del tumor, peso del tumor, volumen de células empaquetadas (PCV), recuento de células viables, recuento de células no viables, porcentaje de células viables, porcentaje de células no viables, aumento de la esperanza de vida (ILS), aumento medio del peso corporal, cambios en los alimentos ingesta 17-18.

Determinación de parámetros hematológicos
Para detectar la influencia de las flores METS sobre el estado hematológico de los ratones portadores de EAC, se realizó una comparación entre cinco grupos (n = 6) de ratones el día 15 después de la inoculación. Los grupos estaban compuestos por (I) ratones de control normal, (II) ratones portadores de tumores, (III) ratones portadores de tumores tratados con 5-fluorouracilo (20 mg / kg i.p.. durante 14 días). (IV) Flores METS (200 mg / Kg / día, p.o. durante 14 días) y (V) ratones portadores de tumores tratados con flores METS (400 mg / kg / día, p.o. durante 14 días). Se extrajo sangre de cada ratón mediante el método del plexo retroorbital y se determinaron los glóbulos blancos (WBC), los glóbulos rojos (RBC), la hemoglobina y las proteínas 19-21. Preparación de suero de la misma sangre utilizada para evaluar los parámetros bioquímicos.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Todos los valores se expresaron como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó con análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey Kramer. Los valores de p & lt 0,001 se consideraron muy significativos y & lt0,05 se consideraron significativos en comparación con el control.

RESULTADOS
Actividad anticancerígena in vitro
A partir del ensayo MTT, después del tratamiento con diversas concentraciones de parámetros de METS Flowers como el porcentaje de viabilidad celular, el porcentaje de citotoxicidad se comparó con las células no tratadas (control). Se observó una disminución en la viabilidad celular y un aumento en la citotoxicidad por METS Flowers en ambas líneas celulares de manera dependiente de la dosis, pero se observó una disminución significativa en la viabilidad celular (P & lt 0,001) para 1000 μg / ml 500 μg / ml y 250 μg / ml Las dosis de METS Flowers produjeron una inhibición significativa del crecimiento. La actividad inhibidora del crecimiento de Tecoma stans flores fue más significativa a medida que aumenta la concentración de flores METS en el caso de las líneas celulares Vero y Hep-2. [Tabla 1]

Actividad citotóxica in vitro de METS en líneas celulares VERO y HEP2

LÍNEA VERO CELL

LÍNEA DE CÉLULAS HEP 2

% DE VIABILIDAD CELULAR

% DE CITOTOTOXICIDAD

% DE VIABILIDAD CELULAR

% DE CITOTOTOXICIDAD

Actividad anticancerígena in vivo

Parámetros de supervivencia y crecimiento tumoral
La actividad antitumoral de METS Flowers contra ratones portadores de tumores EAC se evaluó mediante parámetros como el volumen del tumor, el peso del tumor, el recuento de células viables y no viables, el tiempo medio de supervivencia y el% de aumento de la esperanza de vida, el aumento medio del peso corporal, los cambios en la comida. consumo. Se encontró que el volumen del tumor, el peso del tumor y el recuento de células viables aumentaron significativamente (p & lt0,001) y el recuento de células no viables, el aumento en el peso corporal y la ingesta de alimentos fue significativamente (p & lt0,001) bajo en los animales de control de EAC en comparación con animales de control normales. Además, el tiempo medio de supervivencia se incrementó a 31,66 ± 6,02 (% ILS = 75,39) y 26 ± 1,0 (% ILS = 61,9) con la administración de Flores METS a la dosis de 400 mg / kg y 200 mg / kg respectivamente. Finalmente, el cambio en el peso corporal de los animales sugiere la propiedad inhibidora del crecimiento tumoral de T.stans flores. La ingesta de alimentos también se redujo en los animales de control de tumores en comparación con los animales de control normales. Todos estos resultados indican claramente que el extracto tiene una capacidad notable para inhibir el crecimiento de tumor sólido inducido por células EAC [Tabla-2].

Efecto de la METS sobre el tiempo medio de supervivencia (MST), porcentaje de aumento de la esperanza de vida (% ILS), aumento medio del peso corporal, cambios en la ingesta de alimentos, volumen tumoral, peso tumoral, PCV, recuento de células tumorales viables y no viables en EAC teniendo ratones

CONTROL EAC

5 - FU (20 mg / kg)

35.33±5.85***

26±1.0*

31.66±6.02***

84.12**

61.9**

AUMENTO PROMEDIO DEL PESO CORPORAL (gms)

4.0±0.50*

CAMBIOS EN LA INGESTA DE ALIMENTOS (gms)

48.83±2.32***

34.32±0.41***

41.71±0.78***

VOLUMEN DE TUMOR (ml)

3.73±0.40***

6.2±0.20***

5.53±0.40***

PESO DEL TUMOR

0.63±0.07***

2.32±0.11***

1.20±0.17***

3.16±0.28***

6.33±0.28***

5.5±0.50***

CÉLULAS VIABLES

(× 10 6 células / ml)

2.21±0.20***

3.98±0.10***

3.28±0.21***

CÉLULAS NO VIABLES (× 10 6 células / ml)

3.89±0.12***

1.91±0.07***

2.74±0.09***

23.12**

41.65**

34.33**

% NO VIABLE

97.25**

47.83**

68.58**

CÉLULAS TOTALES

(× 10 6 células / ml)

6.00±0.32***

5.89±0.17***

6.02±0.30***

n = 6 animales en cada grupo, los valores se representan como media ± SEM de seis animales. * PAG& lt0.05, ** PAG& lt0.01 y *** PAG& lt0.001 entre el control de la enfermedad y los grupos tratados. (Analizado por prueba de comparación múltiple ANOVA Tukey-Kramer)

Parámetros hematológicos
Se encontró que los parámetros hematológicos de los ratones portadores de tumores a los 15 días estaban alterados significativamente en comparación con el grupo normal. Se encontró que el recuento total de glóbulos blancos aumentaba con una reducción del contenido de Hb de glóbulos rojos. El número total de glóbulos rojos mostró un cambio modesto. Al mismo tiempo, el intervalo en el extracto a una dosis de 400 mg / kg y 200 mg / kg restauró todos los parámetros hematológicos alterados a casi casi lo normal [Tabla-3].

TABLA 3 Efecto de METS sobre parámetros hematológicos de ratones portadores de EAC

DISEÑO DE TRATAMIENTO

CONTROL DE TUMOR

RBC(106 células / mm3)

WBC (103 células / mm3)

Cuenta diferencial

Linfocitos

Neutrófilos

n = 6 animales en cada grupo, los valores se representan como media ± SEM de seis animales. * PAG& lt0.05, ** PAG& lt0.01 y *** PAG& lt0.001 entre el control de la enfermedad y los grupos tratados. (Analizado mediante prueba de comparación múltiple ANOVA Tukey-Kramer).

Parámetros bioquímicos
Varios parámetros bioquímicos como Tot.Protein, SGPT, SGOT, ALP, LPO, GSH, SOD, CAT valores de METS A la dosis de 400 mg / kg fueron comparables a los del fármaco estándar 5- fluorouracilo (20 mg / kg ip) (Tabla -4). Estudio de histopatología del hígado de cada grupo de animales que se muestra en la figura -2.

TABLA 4: Efecto de METS en parámetros bioquímicosde ratones portadores de EAC.

n = 6 animales en cada grupo, los valores se representan como media ± SEM de seis animales. * PAG& lt0.05, ** PAG& lt0.01 y *** PAG& lt0.001 entre el control de la enfermedad y los grupos tratados. (Analizado por prueba de comparación múltiple ANOVA Tukey-Kramer)

DISCUSIÓN
El tumor de ehrlich se describió inicialmente como un adenocarcinoma mamario murino espontáneo. Es un carcinoma de rápido crecimiento con un comportamiento muy agresivo y puede crecer en casi todas las cepas de ratones. En forma ascética se ha utilizado como modelo tumoral trasplantable para investigar los efectos antitumorales de varias sustancias 22. Los criterios fiables para juzgar el valor de cualquier fármaco contra el cáncer son la prolongación de la vida, la inhibición del aumento de peso corporal medio y la disminución de leucocitos 23,24. Los resultados del presente estudio mostraron un efecto anticancerígeno de METS Flowers contra EAC en ratones albinos suizos. Se observó una mejora significativa (p & lt 0,001 y 0,05) de MST y una disminución de la ganancia en el peso corporal medio [Tabla - 1]. Hubo un aumento regular y rápido en el volumen de fluido ascético de los ratones portadores de EAC. El líquido ascítico es la fuente nutricional directa del crecimiento tumoral; cumple con los requisitos nutricionales de las células tumorales 25. El tratamiento con METS Flowers disminuyó el volumen del tumor, el peso del tumor y la PCV del tumor sólido.

La reducción del recuento de células viables y el aumento del recuento de células no viables hacia lo normal en el hospedador tumoral sugieren un efecto antitumoral contra las células EAC en ratones. En este estudio, las flores METS aumentan el recuento de células no viables hasta un 68,58% y 47,83% a una dosis de 400 mg / kg, 200 mg / kg respectivamente [Tabla-2], lo que sugiere que el extracto crudo tiene una relación directa con las células tumorales como estas Las células tumorales son absorbidas por el fármaco contra el cáncer por absorción directa y este agente contra el cáncer lisa las células por un mecanismo citotóxico directo.

Se han observado con frecuencia anemia y mielosupresión en el carcinoma de ascitis (26). Anemia encontrada en el carcinoma ascítico principalmente debido a deficiencia de hierro, ya sea por condiciones hemolíticas o mielopáticas que finalmente conducen a una reducción del número de glóbulos rojos 27. El análisis de los parámetros hematológicos mostró un efecto tóxico mínimo en los ratones tratados con METS Flowers después de 15 días de trasplante, METS Flowers pudo revertir los cambios en los parámetros hematológicos consecuentes a la inoculación del tumor. Esto indica que el efecto protector de METS Flowers sobre el sistema hematopoyético sin inducir mielotoxicidad, los efectos secundarios más comunes de la quimioterapia contra el cáncer [Tabla-3].
La actividad antitumoral de la EPG fue comparable a la del 5-fluorouracilo, que se utiliza habitualmente como agente antitumoral activo en una amplia serie de estudios clínicos y preclínicos 28.

Los estudios fitoquímicos indican que la presencia de taninos, flavonoides, fenol, alcaloides, esteroides, triterpenos y saponinas, etc. Los compuestos polifenólicos pueden inhibir las células cancerosas por enzimas metabolizadoras xenobióticas que alteran la activación metabólica de carcinógenos potenciales, mientras que algunos flavonoides también pueden alterar la producción de hormonas e inhibir aromatasa para prevenir el desarrollo de células cancerosas 29. El mecanismo de acción de la actividad anticancerígena de los fenólicos podría ser alterando la división celular durante la mitotis en la etapa de telofase. También se informó que los fenólicos redujeron la cantidad de proteína celular y el índice mitótico, y la formación de colonias durante la proliferación celular de las células cancerosas 30,31.
Finalmente, se sugirió que las actividades anticancerígenas in vitro e in vivo del extracto metanólico de flores de Tecoma stans se deben probablemente a la presencia de alcaloides, compuestos fenólicos, flavonoides y terpenoides. Se están realizando más estudios para caracterizar los principios activos y dilucidar el mecanismo de acción.


¿Qué ingredientes contiene Mellitox?

Como se mencionó anteriormente, Mellitox se fundó sobre una práctica vietnamita, que Rob afirma que marcó una diferencia positiva en su propia curación. Para ser más específico, Rob supuestamente se embarcó en un "viaje de curación" que lo llevó a un pueblo de Vietnam. Los habitantes compartieron el efecto positivo de un puñado de plantas, hierbas, vitaminas y minerales sobre la diabetes tipo 2. En los casos en que se ha establecido un diagnóstico, se cree que los ingredientes disminuyen gradualmente su impacto en la salud de los pacientes. Dejemos que & rsquos descubra primero los ingredientes que componen la mezcla patentada y luego repase también la combinación de apoyo:

Ashwagandha

Ashwagandha es un tipo de hierba que se ha utilizado durante mucho tiempo en la medicina ayurvédica. En cuanto a sus propiedades, se confía en que actúe como adaptógeno, es decir, puede ayudar al organismo a responder mejor a los diferentes factores estresantes de la vida. Un estudio que analizó específicamente los efectos de la ingesta de ashwagandha sobre la resistencia a la insulina en ratas concluyó que el ingrediente, de hecho, redujo los marcadores inflamatorios, lo que condujo a mejores tasas de sensibilidad a la insulina (es decir, cómo responden las células a la insulina, cuanto más alto, mejor ) [1].

Rhodiola

Rhodiola es un tipo de planta perenne que pertenece a la familia Crassulaceae. Es similar a la ashwagandha en el sentido de que también tiene propiedades adaptogénicas. Si bien no parece afectar directamente a la hormona insulina, podría ayudar a reducir los niveles de cortisol para que se pueda lograr un equilibrio hormonal.

Esto último parece confirmarse en un estudio que analizó explícitamente la asociación de Rhodiola y cortisol. Específicamente, los investigadores informaron que 576 mg de Rhodiola podrían reducir el agotamiento, aumentar el rendimiento mental y "disminuir la respuesta del cortisol al despertar del estrés en pacientes agotados con síndrome de fatiga". [2] y rdquo

Manzanilla

La manzanilla es una hierba que se ha apreciado durante mucho tiempo por sus efectos sedantes. Es decir, a menudo se fomenta como un medio para mejorar la calidad del sueño. Dicho esto, se dice que un estudio que involucró la ingesta de varios tés de manzanilla por día encontró que los niveles de glucosa en sangre, de hecho, mejoraron entre los pacientes con diabetes. Se explicó además que tal mejora podría deberse a sus propiedades antioxidantes, limitando el estrés oxidativo y su impacto en la resistencia a la insulina [3].

Ácido gamma-aminobutrérico (GABA)

El ácido gamma aminobutírico (GABA) es un tipo de neurotransmisor que tiene como objetivo evitar que señales específicas se exciten demasiado. Dado que Mellitox tiene como objetivo rectificar la barrera hematoencefálica, se confía en un ingrediente como GABA para aliviar la ansiedad o promover el sueño, por nombrar lo mínimo. Es importante señalar que este componente ha tenido problemas para cruzar la barrera hematoencefálica, pero varios estudios pudieron demostrar lo contrario. Por el momento, los resultados de este hallazgo son mixtos y justifican una mayor investigación [4].

Bálsamo de limón

El toronjil es una hierba antigua que pertenece a la familia de la menta. Al igual que los ingredientes anteriores, parece reducir el estrés y mejorar el sueño en general. Una fuente destacó que contiene una rica fuente de una sustancia química llamada ácido rosmarínico, que previene la degradación del GABA [5]. De hecho, también se confía en ayudar a reducir los niveles de azúcar en sangre en personas con diabetes, hasta un punto en el que uno podría querer controlar sus niveles para prevenir la hipoglucemia [6] con regularidad.

Casquete

Botánicamente conocida como Scutellaria, la escutelaria es otra hierba de la familia de la menta en la que se confía para mejorar diferentes áreas de la salud. Al investigar un poco sus beneficios, un estudio en animales que analizó la eficacia del extracto de escutelaria encontró que los niveles de colesterol dañino disminuyeron entre el grupo que siguió una dieta hipercolesterolémica y tomaron el extracto en comparación con el grupo de dieta sola. ¿Por qué entran en escena los niveles de colesterol? Resulta que los niveles fluctuantes de azúcar pueden agotar las grasas saludables, lo que lleva a una serie de condiciones de salud no deseadas [7].

Espino

Hawthorn is a type of berry that has been long known for its rich source of polyphenols and anti-inflammatory properties. A review that summarized several studies regarding the berry&rsquos potential has since noted that it can reduce the risk of developing some cancers and asthma, infections, heart problems, premature skin aging, and type 2 diabetes. Seeing that diabetes is a condition that is also a result of chronic inflammation, hawthorns can be especially useful. Unfortunately, for the time being, only animal studies on hawthorn ingestion and diabetes have been conducted [ 8 ] .

Bacopa Monnieri

Bacopa monnieri is yet another herb that Ayurveda practitioners stand by. Its antioxidant and anti-inflammatory properties are trusted to ease the brain. One study showed that both 300mg and 600mg of bacopa extract could significantly improve cognitive function among the elderly [ 9 ] . To add to that, an article that looked at its antihyperglycemic activity explained that the herb&rsquos component, bacosine, &ldquoproduced a significant decrease in the blood glucose level when compared to with the diabetic control rats&rdquo group. In fact, lost weight was also regained to a certain level (i.e., within normal ranges) [ 10 ] .

Passionflower

Passionflower, native to Southeastern U.S. and Central and South America, is an herb that has been linked to enhanced sleep quality. By now, it should be clear that certain elements of Mellitox aim to ease anxiousness and stress, which might give rise to sleep. Given that the metabolism is linked to blood sugar levels, the former&rsquos reparation processes become crucial. These often take place during one&rsquos sleep. Having said that, a study was able to show that 500mg of passionflower can induce a &ldquosignificant incremental in total sleep time&rdquo in Wistar rats [ 11 ] .

Valerian

Valerian root is popularly considered as a treatment for insomnia. Its ability to bind to GABA is reasoned as having a positive, sedative effect. This means that neurotransmitters are calmed, and consequently, consumers are as well. Sleep is sought-for by people with diabetes, seeing that fluctuating blood sugar levels prevent restfulness altogether [ 12 ] .

L-Theanine

Of all the ingredients listed in Mellitox, an amino acid found in excess in tea leaves called l-theanine is trusted to cross the blood-brain barrier. This is said to improve cognition and healthy changes to specific brain wave activity [ 13 ] . Moreover, a study that investigated L-theanine&rsquos absorption levels concluded that there was a &ldquodecline in insulin secretion and glucose concentration,&rdquo adding that it &ldquocould inhibit the glucose uptake by downregulating the related gene expression in the small intestine of rats. [ 14 ] &rdquo

Oat Straw

Oat straw is derived from the Avena sativa plant. In general, it has been found to reduce inflammation. That said, the same source highlighted that its antioxidants property (i.e., avenanthramides) could improve blood flow in the heart and brain [ 15 ] . The latter is normally negatively related to blood glucose levels. Precisely, excess sugar is said to deplete blood vessels&rsquo elasticity, which in turn might impede blood flow [ 16 ] . In this case, oat straw clearly aims to rectify damages caused.

Mucuna Pruriens

Mucuna pruriens is considered an &ldquoestablished herbal drug&rdquo that has been traditionally used to treat nervous disorders and male infertility. Concerning its anti-diabetic effect, a team of researchers mentioned that mucuna pruriens are typical of interest because of their &ldquoinsulin-mimetic effect[s].&rdquo A relatively outdated study that involved the administration of 500mg of mucuna pruriens per kg was also included. Significant evidence was allegedly found, namely, in the form of a reduction in plasma glucose levels [ 17 ] .

St. John&rsquos Wort

St. John&rsquos Wort is a flowering plant from the family Hypericaceae. Used over a span of hundreds of years, today, it can be found over-the-counter for treating mild and moderate depression, anxiety, and sleep problems [ 18 ] . At the time of writing, some sources affirm that depression and diabetes have a link – whether it is direct or indirect is somewhat complicated. That said, this ingredient also carries some mixed results. An example of this involves one study that was able to show that &ldquoSt. John&rsquos Wort produces persistent glucose intolerance via decreased beta-cell function,&rdquo further explaining that it &ldquomay increase risk of type 2 diabetes in the already at-risk depressed population [ 19 ] .&rdquo

Hop is a plant known for its sedative effects. This is something that has been confirmed across several studies. One particular group of researchers that wanted to precisely understand the effect of hops on rest rhythm was able to find that small doses can make the biggest of differences [ 20 ] . The whole point in including this ingredient appears to rest in recovering sleep, which is often lost with type 2 diabetes.

Griffonia Simplicifolia

Griffonia simplicifolia is a plant that carries an active compound called 5-HTP (i.e., short for 5-hydroxytryptophan). This chemical works primarily in the brain to create serotonin, which can positively impact sleep, appetite, pain, and mood. With the aforementioned in mind, it is clear that this ingredient does not appear to have a direct link to type 2 diabetes [ 21 ] .

  • Vitamin B1 (6mg): Can support people with diabetes.
  • Vitamin B2 (6mg): This might lower the risk of developing type 2 diabetes.
  • Niacin (14mg): Surprisingly, it might trigger blood sugar levels to increase.
  • Vitamin B6 (4mg): Mixed reviews on whether it can increase/ decrease blood sugar.
  • Biotin (150mcg): Early research suggests that it might lower blood sugar when combined with chromium.
  • Pantothenic Acid (8mg): This might be useful for diabetes treatment, but more research is needed to make strong claims.
  • Calcium (13mg): Is trusted to lower the risk of developing incident diabetes.
  • Magnesium (12.5mg): Might regulate blood sugar and reduce insulin resistance.
  • Zinc (12.5mg): This is believed to improve glucose levels among those with diabetes.
  • Potassium (12.5mg): Low levels of potassium have been linked to reduced insulin production, possibly triggering blood sugar levels to rise.

Discusión

Native communities in the Sultanate of Oman utilize a plenty of indigenous medicinal plants since the ancient times as a primary health care. However, there are no proper herbalist documentation or biological studies on the indigenous plants existed in current literature.

More than three-quarters of the active constitutes which are derived from plants presently available in global use to treat human diseases that have been partially discovered through established research steps on folk and ethnomedicinal uses. It is authoritative that ethno botanically based research to find active phytochemicals be inaugurated on a broad scale production [16].

This above data encouraged us to exploit the available natural resources in Oman towards the study on pharmacological and alleviation of different human oxidative stress. All kinds of oxidative stress plays a major part in the pathogenesis of numerous main human chronic diseases, such as cancer, heart diseases, diabetes and Alzheimer’s condition. Also, transferable sicknesses are a vital concern in our present society due to the advent of manifold drug resistant strains of bacteria that cause millions of deaths worldwide. Therefore, the selected medicinal plant was undertaken to screen the bioactivities and phenols and flavonoids contents which were collected from the Southern part of Oman. The plant aerial parts were collected during the month of September, 2018. After collection, the samples necessary process was done in the preparation of the extract. Total of six extracts with increasing polarity were prepared according to the standard protocols mentioned above in the experimental sections.

Medicinal plants are a gift of Allah and they contain a several groups of biologically active constituents, minerals, different types of vitamins and minor percentage of trace elements which is badly needed for human health. All the chemical constituents are a fascinating yet secretive group of several thousands of phytochemicals found in plant sources. Most of the phytochemicals are well known to be biologically active, which may exert a beneficial action on the human body. The mentioned phytochemicals have a wide range of positive action on the human body which include mainly the complex carbohydrates, flavonoids, terpenoids, proteins, several organic acids, alcohols and their corresponding complex, oils, tannins, saponins glycoside, glucosides and so on [17]. In addition, the primary and secondary compounds produced by plants to support their existence and biological effects. These above mentioned phytochemicals are being researched for nutrition and herbal medicine [18]. They have significant antioxidants, antimicrobial, antiviral and inspiration hormones, immune function, various inflammations, detoxification and other cell functions. Most of the natural sources, especially plant sources afford a source of biologically active compounds which are currently used as poisons, drugs or beneficial agents [19].

Total phenol content

The total phenols content assay of the aerial six extracts was performed according to a procedure established by Al-Saeedi et al. [14]. All extracts exhibit some amount of total phenol content. The maximum level of phenols was obtained in the ethyl acetate extract and minimum was in hexane extract and the following hierarchy: ethyl acetate>water>methanol>chloroform>butanol> hexane extract (Table 2). The present phenols content results are unable to compare with other results due to the usability of the literature on the selected plant species. But, there are several reports are available in the literature on the other species belong to this family. The total phenol content of other species also showed the average amount present in the plant extracts reported [20, 21].

Total flavonoids content

Similarly, total flavonoids content of the aerial six extracts of H. gallagheri was performed according to the procedure established by Al-Saeedi et al. [14]. All extracts showed some amount of total flavonoids content. In our experiment, butanol extract has a significant amount of flavonoids compare to other prepared extract. But the minimum amount of flavonoids was obtained in water extract and the following hierarchy: butanol>chloroform>hexane>methanol> ethyl acetate>water extract (Table 3). This result showed that most of the flavonoids were present in the butanol aerial extract. In addition, butanol is polar solvent and all of the flavonoids obtained in the butanol extract are polar in nature. The flavonoids content results are unable to compare with other results due to the usability of the literature on the selected plant species. But, several reports are available in literature on the other species belong to this family. Several authors reported on the other species belonging to the family and it was supported in our results [22, 23].

Evaluation of antioxidant activity

The determination of antioxidant activity of aerial various extracts of H. gallagheri was measured by the DPPH method developed by Alabri et al. [15], with further slight modifications. Almost all the crude extracts showed significant inhibition compared to gallic acid. Among them, the highest inhibition was obtained in ethyl acetate and the lowest was in hexane extract. The antioxidant as a percentage of inhibition is presented in Table 4 and Fig. 4. All crude extract basically reacts with DPPH and form a free radical and finally gradually decrease the colour of DPPH. The present experiment, all the aerial extracts from H. gallagheri were able to decolourize the DPPH colour. However, the ethyl acetate gave us the best results for decolourization that indicates the extract contains the maximum number of antioxidant compounds which can decolorize the colour rapidly of DPPH. We could not find any reports on antioxidant activity of the various polarities extracts of the selected plant species, however, there are several reports available on antioxidant activity screening belongs to this family’s plant species [24,25,26,27,28]. Therefore, we are unable to compare our results to the other reports. However, our experimental data are consistent with the other species belonging to this family.


Métodos

In vitro experimental study was employed to evaluate combined antibacterial effect of essential oils obtained from B. cuspidata, B. ogadensis y T. schimperi against clinical isolated MDR gram negative (E.coli y K. pneumoniae) y MRSA and their reference strains.

Medicinal plants selection criteria

In this study, plant selection was on the basis of knowledge of herbalist lived in Bale zone. Those herbalists were used for treating various skin diseases, urinary tract infection sexual transmitted infection, hypertension, tumorcidal, sexual impotence and others. Dawe Kechen and Dawe Serare are found in Bale zone, south east Ethiopia. They are the most remote area with no infrastructure (transport and power supplies). Until this field work, there is no hospital even one health center with no full functioning the health activity in each district. As a result, the community imposed to use medicinal plants for treatment of various diseases. For instance, V. schimper (Qorsa finchaanii), C. myricoides (Handaraafa) and Z. scabra was used to treat cancer, tumor, urinary tract infection and gonorrhea. Whereas, B. cuspidate (Qoree waraantii), B. ogadensis y B. edulis (Suree Lukkuu) used for treatment of kidney, liver cirrhosis, hepatitis, skin diseases, cancer and diabetes.

Plant collection and preparation

Essential oils obtained from aerial parts of T. schimper, B. cuspidate y B. ogadensis were evaluated for their antibacterial effect on multidrug resistant bacteria. T. schimper was collected from Dawe Kechen. B.cuspidate y B. ogadensis were collected from Dawe Serare. Authentication of each plant sample was carried out in the Department of Biology, Faculty of Natural and Computational Science, Addis Ababa University by Dr. Melaku Wondafrash. Those identified plant samples were deposited at the National Herbarium with voucher number Thymus schimperi (E-25/07), Blepharis cuspidate (E-11/07) and Boswellia ogadensis (E-09/07).

Extraction of essential oils

Health and well grown fresh leaves of each plant was collected and cut into small pieces. Plant materials were washed thoroughly under running tap water. Then, it’s subjected to steam distillation using AMIO-37/04 model for 4 h. Essential oils were extracting from aerial parts of T.schimperi, B. cuspidate y B. ogadensis as guideline described by WHO on quality of herbal medicine. The purified essential oils were stored in brown colored bottle vials at 4 °C until used [9, 11, 26, 27].

Culture media

Nutrient agar, MacConkey, Muller Hinton agar (MHA), Muller Hinton Broth (MHB), blood agar (BA), manitol salt agar (MSA), chocolate agar and biochemical reagents were obtained from Department of Medical Microbiology, Immunology and Parasitology, CHS, AAU and Tikur Anbessa Specialized Hospital (TASH), Bacteriology Unit.

Test organisms

The reference strains of S. aureus (ATCC25923), E.coli (ATCC25922), K. pneumoniae (ATCC700603) were obtained from TASH and Ethiopian Public Health Institution and their multidrug resistant strains isolated from different samples of patient’s attending TASH according to CLSI guideline [26].

Modern antibiotics

Modern antibiotics such as tetracycline (30 μg), ciprofloxacin (5 μg), gentamycin (10 μg), cephalotaxon (30 μg), chloramphenicol (30 μg), cefotaxime (5 μg), ceftazidime (10 μg), ceftriaxone (30 μg), amikacin (30 μg), cefuroxime (5 μg), ceftriaxone (30 μg), cefoxitin (30 μg), cloxacillin (5 μg), augmentin (30 μg) were used for testing MDR bacteria according to CLSI guideline [26].

Screening for multidrug resistant bacteria

Multidrug resistance gram negative and S. aureus were isolated from clinical specimen such as CSF, urine, wound and blood. Triplicate of each MRSA and MDR gram negative bacteria were isolated from clinical specimen. All bacterial cultures were first grown on 5% blood agar plates at 37 °C for 18 to 24 h prior to inoculation onto the MHA. Few colonies (3 to 5) of similar morphology of the respective bacteria were transferred with a sterile inoculating loop to a liquid medium until adequate growth of turbidity with McFarland of 0.5. Then the bacterial suspension was streaked on MHA plates using a sterile swab in such a way as to ensure thorough coverage of the plates and a uniform thick lawn of growth following incubation. The susceptibilities of clinical isolates were tested by using the MHA contains a range of antimicrobial agents. Dilutions of overnight broth cultures were inoculated onto antibiotic containing plates to yield final inoculums of approximately 10 6 CFU per spot according to CLSI for MRSA y E.coli y K. pneumoniae [26, 28].

Screening for gram negative

Selected multidrug resistant gram negative such as K. pneumoniae y E. coli were screened for their resistant for more than two different classes of antibiotics following disk diffusion method as CLSI guideline and WHO recommendation [26].

Screening for methicillin resistance Staphylococcus aureus

In this study, cefoxitin was used as marker of mecA /mecC mediated by methicillin resistant S. aureus and drug of choice for disk diffusion method as recommended by CLSI guideline [26]. This strain was selected based on antibiotic profile mentioned (Table 1).

Determination of MIC and MBC values

After preliminary screening of essential oils, those revealed potent antimicrobial effect were further tested to determine MIC and MBC for MDR gram negative bacteria (K. pneumoniae y E. coli) and MRSA. It was determined by MHB broth micro-dilution method. Each 96-well micro-titer plate was liquated with 50 μL of MHB 10 th well (sterility control) was added with 100 μL of MHB. And the 9 th well (growth control) was added with MHB with 5% DMSO. 50 μL of essential oils initially dissolved in 5% DMSO was added into the first well. A serial 2-fold dilution was performed by transferring 50 μL of the suspension to the subsequent wells up till the 8 th well this procedure was performed by modifying Wiegand protocol. 0.5 McFarland broth inoculum was diluted in the ratio of 1:100 and added into 1st-8 th well in achieving the final inoculums size at 5 × 10 5 CFU per ml [27].

Bacterial cell viability and MIC values were determined by observing the turbidity. The lowest concentrations of essential oils with clear suspension were considered as the MIC values. The lowest concentrations of essential oils in the post-incubation suspensions which did not harbor any bacterial growth upon spotting on MHA after overnight incubation at 37 °C were considered as the MBC values. Test was performed in triplicates alongside antibiotics ciprofloxacin (5 μg) for gram negative and cefoxitin (30 μg) for MRSA as positive control respectively [5, 9, 26, 27].

Fractional inhibitory concentration index

In vitro drug interaction was determined by the checkerboard method as described elsewhere and the results were analyzed with the FIC index. Growth control wells containing medium were included in each plate. Each test was performed in triplicate. The concentration of antibiotics needed to inhibit growth was recorded. The following formula was used to calculate FIC: MIC of drug in combination FIC/ MIC of drug alone = The FIC index (∑FIC) calculated as the sum of each FIC, was interpreted as follows: synergy is defined as a FIC index of ≤0.5. Antagonism is defined as a FIC index of ≥2. An indifferent/additive effect is defined as a FIC index of 0.5 < X < 2 or a micro dilution decrease of 1 dilution in the MIC of one or the other drug or no change in the MIC of either of the drugs [24].

Análisis estadístico

Statistical data were reading values of inhibition zones (in diameter) and concentration values (MIC &MBC) analyzed using SPSS, version 21 according to CLSI. Each experiment values are expressed as mean ± S.D. Statistical significance was determined by student’s t-test. Values with pag < 0.05 were considered significant.


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In cell studies, seaweed extract outperforms remdesivir in blocking COVID-19 virus

In a test of antiviral effectiveness against the virus that causes COVID-19, an extract from edible seaweeds substantially outperformed remdesivir, the current standard antiviral used to combat the disease. Heparin, a common blood thinner, and a heparin variant stripped of its anticoagulant properties, performed on par with remdesivir in inhibiting SARS-CoV-2 infection in mammalian cells.

Published online today in Cell Discovery, the research is the latest example of a decoy strategy researchers from the Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies (CBIS) at Rensselear Polytechnic Institute are developing against viruses like the novel coronavirus that spawned the current global health crisis.

The spike protein on the surface of SARS-CoV-2 latches onto the ACE-2 receptor, a molecule on the surface of human cells. Once secured, the virus inserts its own genetic material into the cell, hijacking the cellular machinery to produce replica viruses. But the virus could just as easily be persuaded to lock onto a decoy molecule that offers a similar fit. The neutralized virus would be trapped and eventually degrade naturally.

Previous research has shown this decoy technique works in trapping other viruses, including dengue, Zika, and influenza A.

"We're learning how to block viral infection, and that is knowledge we are going to need if we want to rapidly confront pandemics," said Jonathan Dordick, the lead researcher and a professor of chemical and biological engineering at Rensselaer Polytechnic Institute. "The reality is that we don't have great antivirals. To protect ourselves against future pandemics, we are going to need an arsenal of approaches that we can quickly adapt to emerging viruses."

los Cell Discovery paper tests antiviral activity in three variants of heparin (heparin, trisulfated heparin, and a non-anticoagulant low molecular weight heparin) and two fucoidans (RPI-27 and RPI-28) extracted from seaweed. All five compounds are long chains of sugar molecules known as sulfated polysaccharides, a structural conformation that the results of a binding study published earlier this month in Antiviral Research suggested as an effective decoy.

The researchers performed a dose response study known as an EC50 -- shorthand for the effective concentration of the compound that inhibits 50% of viral infectivity -- with each of the five compounds on mammalian cells. For the results of an EC50, which are given in a molar concentration, a lower value signals a more potent compound.

RPI-27 yielded an EC50 value of approximately 83 nanomolar, while a similar previously published and independent in vitro test of remdesivir on the same mammalian cells yielded an EC50 of 770 nanomolar. Heparin yielded an EC50 of 2.1 micromolar, or about one-third as active as remdesivir, and a non-anticoagulant analog of heparin yielded an EC50 of 5.0 micromolar, about one-fifth as active as remdesivir.

A separate test found no cellular toxicity in any of the compounds, even at the highest concentrations tested.

"What interests us is a new way of getting at infection," said Robert Linhardt, a Rensselaer professor of chemistry and chemical biology who is collaborating with Dordick to develop the decoy strategy. "The current thinking is that the COVID-19 infection starts in the nose, and either of these substances could be the basis for a nasal spray. If you could simply treat the infection early, or even treat before you have the infection, you would have a way of blocking it before it enters the body."

Dordick added that compounds from seaweed "could serve as a basis for an oral delivery approach to address potential gastrointestinal infection."

In studying SARS-CoV-2 sequencing data, Dordick and Linhardt recognized several motifs on the structure of the spike protein that promised a fit compatible with heparin, a result borne out in the binding study. The spike protein is heavily encrusted in glycans, an adaptation that protects it from human enzymes which could degrade it, and prepares it to bind with a specific receptor on the cell surface.

"It's a very complicated mechanism that we quite frankly don't know all the details about, but we're getting more information," said Dordick. "One thing that's become clear with this study is that the larger the molecule, the better the fit. The more successful compounds are the larger sulfated polysaccharides that offer a greater number of sites on the molecules to trap the virus."

Molecular modeling based on the binding study revealed sites on the spike protein where the heparin was able to interact, raising the prospects for similar sulfated polysaccharides.

"This exciting research by Professors Dordick and Linhardt is among several ongoing research efforts at CBIS, as well as elsewhere at Rensselaer, to tackle the challenges of the COVID-19 pandemic through novel therapeutic approaches and the repurposing of existing drugs," said CBIS Director Deepak Vashishth.

"Sulfated polysaccharides effectively inhibit SARS-CoV-2 in vitro" was published in Cell Discovery with the support of the National Research Foundation of Korea. At Rensselaer, Dordick and Linhardt were joined in the research by Paul S. Kwon, Seok-Joon Kwon, Weihua Jin, Fuming Zhang, and Keith Fraser, and by researchers at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology in Cheongju, Republic of Korea, and Zhejiang University of Technology in Hangzhou, China.


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